Rhipicephalus (Boophilus) microplus é um parasita que infesta bovinos causando grandes perdas na pecuária. O método convencional para o controle é através do uso de produtos químicos. Esses produtos causam a seleção de carrapatos resistentes a acaricidas e a poluição do meio-ambiente. Uma abordagem alternativa tem sido testada, o qual inclui o uso de vacinas. Entretanto, o sucesso dessa estratégia é dependente da caracterização de antígenos do carrapato. A Glicogênio Sintase Quinase-3β (GSK-3β) é uma serina\treonina quinase que está envolvida no metabolismo do glicogênio, durante a embriogênese do carrapato. O estudo da embriogênese do carrapato é fundamental no desenvolvimento de novas metodologias propostas para o controle desses vetores. A interferência na embriogênese pode resultar em um decréscimo na viabilidade dos ovos ou até em uma letalidade precoce. Nesse trabalho, a região codificadora da GSK-3β do carrapato foi obtida através do 5’RACE, 3’RACE. A transcrição relativa do gene da GSK-3β em ovário de carrapato foi maior quando comparado com intestino e corpo gorduroso, sugerindo que a GSK-3β está envolvida no desenvolvimento de oócitos. Na embriogênese a transcrição relativa do gene da GSK-3β começou no 1º dia de postura com um aumento gradual até 15º dia. No 18º dia ocorre um declíneo e depois a transcrição relativa do gene aumentou novamente, indicando que a GSK-3β teria alguma função relacionada com o final de embriogênese. A transcrição relativa do gene da GSK-3β em células embrionárias do carrapato (BME26) aumentou com o tratamento de insulina. Quando tratadas com tirfostin (inibidor do receptor de insulina), SB216763 (inibidor específico da GSK-3), e wortimanina (inibidor da PI3K) a transcrição relativa do gene foi semelhante ao controle. O alsterpaullone (inibidor específico da GSK-3) inibiu o desenvolvimento dos embriões tanto em fêmeas injetadas com o inibidor como em fêmeas alimentadas artificialmente, sugerindo que a GSK-3β seria crucial para o desenvolvimento embrionário. / Rhipicephalus (Boophilus) microplus is a parasite that infests bovines causing losses in cattle production. The conventional method for control is the use of synthetic chemical products. These products cause the selection of acaricideresistant ticks and pollution of the environment. A range of alternative approaches have been taken, which include the use of vaccine. However, the success of this strategy is dependent on the characterization of the tick antigens. The Glycogen Synthase Kinase (GSK-3β) is a serine/threonine kinase that is involved in glycogen metabolism during tick embryogenesis. The tick embryogenesis studies have played a fundamental role in designing new methodologies proposed for the control of these vectors. Interference on embryogenesis can result in the decrease of the egg’s viability or even in early lethality. In this work, the full length cDNA encoding the GSK-3β protein of the tick has been obtained by 5'-RACE and 3'- RACE. The relative transcription of GSK-3β gene in ovaries was higher when compared with gut and fat body, suggesting that GSK-3β was involved in the oocytes development. In the embryogenesis the relative transcription of the GSK- 3β gene started on 1st day with gradual increase until a peak at 15th day post oviposition. In 18th day occured a decline and after the relative transcription increase again. Probably the GSK-3β has some function related with final embryogenesis. The relative transcription of GSK-3β gene in cells BME26 when treated with insulin increased. When treated with tyrphostin, wortimanin and SB216763 did not increase. The alsterpaullone, GSK-3β specific inhibitor, blocks the embryo development of females ticks injected with the inhibitor and with artificial capillary feeding method, suggesting that GSK-3β could have a crucial function in the embryo development.

O ambiente é um sistema dinâmico que está sempre mudando e a capacidade de reconhecimento dessas modificações é uma característica crucial para a vida. A família gênica RLK (do inglês Receptor-Like Kinase) engloba as proteínas receptoras do tipo quinase que estão aptas a reconhecer sinais ambientais, através de seu domínio extracelular, e ativar uma cascata de sinalização por modificações pós-traducionais em outras proteínas utilizando a atividade de fosforilação de seu domínio quinase. A subfamília WAK (do inglês The Wall-Associated Kinase) pertence a família gênica RLK, sendo que algumas proteínas desta subfamília foram identificados associados fisicamente à parede celular, sugerindo estes genes como fortes candidatos para agir como sensores, ligando diretamente o ambiente extracelular com o citoplasma e desencadeando sinais intracelulares. Os genes WAK formam uma grande subfamília em arroz, com 130 genes descritos para a subespécie japonica, em comparação aos 27 genes WAK descritos para arabidopsis. A ausência de dados sobre a expansão desta subfamília e suas implicações nas plantas justifica uma análise evolutiva e estrutural entre os membros da subfamília WAK de arabidopsis e arroz, com uma comparação mais extensiva entre os genomas das subespécies de arroz indica e japonica. Quando a organização e os resíduos conservados do domínio quinase das WAKs foram comparados com a superfamília de proteínas quinases de eucariotos, a identificação de dois grupos distintos de WAKs tornou- se evidente em arabidopsis e arroz. Um grupo é formado somente por OsWAKs que provavelmente se expandiu depois da separação entre monocotiledônea- dicotiledônea, os quais derivaram para a classe de quinases não-RD. O outro grupo corresponde à classe RD-quinase, sendo esta a classe de quinase mais frequente entre os eucariotos, formado por ambos os genes AtWAK e OsWAK. Além disso, com os resultados de comparação entre os genomas das subespécies indica e japonica foi possível identificar uma grande variação com relação aos domínios das proteínas e ao padrão de expressão entre os genes OsWAK dessas subespécies. O conjunto de resultados sugere que as WAKs constituem duas subfamílias evolutivamente relacionadas, mas independentes: OsWAK-RD e WAK-nonRD. O reconhecimento desta divisão poderá contribuir para a compreensão das funções e regulação das WAKs. / The environment is a dynamic system, which is always changing and the recognition of its modifications is a crucial feature for life. The RLK is a gene family of receptor quinase in plants that are able to recognize the environment signals, through its extracellular domain, and activating a signal cascade through the post-translational modifications of others protein using the phosphorylation activity from the quinase domain. The Wall-Associated Kinase (WAK) is a subfamily from RLK, with some members identified as associated to the cell wall, suggesting these genes are strong candidates to act as sensors directly linking the extracellular environment to the citoplasm and triggering intracellular signals. The WAK is a large subfamily in rice genome, with 130 genes being described in japonica, compared to the twenty-seven in A. thaliana. The absence of data about this gene subfamily expansion and their implications for plants, justify an evolutionary and structural analysis of A. thaliana and O. sativa members of the WAK subfamily, with a more extensive comparison between genomes of japonica and indica rice subspecies. When the organization of plant WAK domains and conserved residues are compared with those of other eukaryotes protein kinase superfamilies, the identification of two distinct groups of WAKs become evident in Arabidopsis and Rice. One group corresponds to a cluster containing just OsWAK that should have expanded after the monocot-dicot separation, which evolved to form a non-RD kinase class. The other group corresponds to the classical RD-kinases with both AtWAK and OsWAK representatives. Moreover, by comparing OsWAK from indica and japonica subspecies was possible to identify a large divergence in the protein domain features and gene pattern expression. We propose that plant WAKs constitutes two evolutionary related but independent subfamilies: the WAK-RD and the WAK- nonRD. The recognition of this division would contribute to the understanding of WAK function and regulation.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pos-Graduação em Farmacologia. / Made available in DSpace on 2012-10-24T01:51:51Z (GMT). No. of bitstreams: 0Bitstream added on 2013-07-16T20:19:24Z : No. of bitstreams: 1 251558.pdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5)

O ambiente é um sistema dinâmico que está sempre mudando e a capacidade de reconhecimento dessas modificações é uma característica crucial para a vida. A família gênica RLK (do inglês Receptor-Like Kinase) engloba as proteínas receptoras do tipo quinase que estão aptas a reconhecer sinais ambientais, através de seu domínio extracelular, e ativar uma cascata de sinalização por modificações pós-traducionais em outras proteínas utilizando a atividade de fosforilação de seu domínio quinase. A subfamília WAK (do inglês The Wall-Associated Kinase) pertence a família gênica RLK, sendo que algumas proteínas desta subfamília foram identificados associados fisicamente à parede celular, sugerindo estes genes como fortes candidatos para agir como sensores, ligando diretamente o ambiente extracelular com o citoplasma e desencadeando sinais intracelulares. Os genes WAK formam uma grande subfamília em arroz, com 130 genes descritos para a subespécie japonica, em comparação aos 27 genes WAK descritos para arabidopsis. A ausência de dados sobre a expansão desta subfamília e suas implicações nas plantas justifica uma análise evolutiva e estrutural entre os membros da subfamília WAK de arabidopsis e arroz, com uma comparação mais extensiva entre os genomas das subespécies de arroz indica e japonica. Quando a organização e os resíduos conservados do domínio quinase das WAKs foram comparados com a superfamília de proteínas quinases de eucariotos, a identificação de dois grupos distintos de WAKs tornou- se evidente em arabidopsis e arroz. Um grupo é formado somente por OsWAKs que provavelmente se expandiu depois da separação entre monocotiledônea- dicotiledônea, os quais derivaram para a classe de quinases não-RD. O outro grupo corresponde à classe RD-quinase, sendo esta a classe de quinase mais frequente entre os eucariotos, formado por ambos os genes AtWAK e OsWAK. Além disso, com os resultados de comparação entre os genomas das subespécies indica e japonica foi possível identificar uma grande variação com relação aos domínios das proteínas e ao padrão de expressão entre os genes OsWAK dessas subespécies. O conjunto de resultados sugere que as WAKs constituem duas subfamílias evolutivamente relacionadas, mas independentes: OsWAK-RD e WAK-nonRD. O reconhecimento desta divisão poderá contribuir para a compreensão das funções e regulação das WAKs. / The environment is a dynamic system, which is always changing and the recognition of its modifications is a crucial feature for life. The RLK is a gene family of receptor quinase in plants that are able to recognize the environment signals, through its extracellular domain, and activating a signal cascade through the post-translational modifications of others protein using the phosphorylation activity from the quinase domain. The Wall-Associated Kinase (WAK) is a subfamily from RLK, with some members identified as associated to the cell wall, suggesting these genes are strong candidates to act as sensors directly linking the extracellular environment to the citoplasm and triggering intracellular signals. The WAK is a large subfamily in rice genome, with 130 genes being described in japonica, compared to the twenty-seven in A. thaliana. The absence of data about this gene subfamily expansion and their implications for plants, justify an evolutionary and structural analysis of A. thaliana and O. sativa members of the WAK subfamily, with a more extensive comparison between genomes of japonica and indica rice subspecies. When the organization of plant WAK domains and conserved residues are compared with those of other eukaryotes protein kinase superfamilies, the identification of two distinct groups of WAKs become evident in Arabidopsis and Rice. One group corresponds to a cluster containing just OsWAK that should have expanded after the monocot-dicot separation, which evolved to form a non-RD kinase class. The other group corresponds to the classical RD-kinases with both AtWAK and OsWAK representatives. Moreover, by comparing OsWAK from indica and japonica subspecies was possible to identify a large divergence in the protein domain features and gene pattern expression. We propose that plant WAKs constitutes two evolutionary related but independent subfamilies: the WAK-RD and the WAK- nonRD. The recognition of this division would contribute to the understanding of WAK function and regulation.

As proteínas-cinases ativadas por mitógenos (MAPKs) participam de rotas de transdução de sinais universais em eucariotos e compõem cascatas de fosforilação que levam as células a responder a estímulos extracelulares. Em plantas, MAPKs estão associadas a processos de desenvolvimento e na reposta a hormônios e a estresses bióticos e abióticos. Em trabalhos anteriores de nosso grupo, o gene Egmpk5 de Eucalyptus grandis foi clonado e seu padrão de expressão foi caracterizado em plantas submetidas a diferentes tratamentos. Ainda, plantas de Nicotiana tabacum SR1 foram transformadas com Egmpk5 sob regulação do promotor CaMV 35S para futuro estudo de função do gene. No presente trabalho, foi avaliada mais amplamente a estrutura, a expressão e o produto deste gene. Análises in silico revelaram que Egmpk5 apresenta-se como cópia única no genoma, está organizado em seis éxons e seus cinco íntrons possuem sítios canônicos de splicing de RNA. O produto deduzido deste gene apresenta em sua sequência a assinatura do domínio proteína-cinase e os motivos de ligação a ATP e de ativação/dupla fosforilação, indicando a possibilidade de ser uma proteína funcional. Árvore filogenética foi construída pelo método de Máxima Verossimilhança utilizando o algoritmo MUSCLE para alinhamento das sequências e um valor de bootstrap de 500 repetições com sequências peptídicas similares à proteína deduzida EgMPK5 e permitiu a identificação de MAPKs de outras plantas com função já comprovada na sinalização da divisão celular e na resposta a estresses abióticos, ferimento e patógenos. Análise de RT-qPCR mostrou a expressão de Egmpk5 em níveis comparáveis em raízes, caules e folhas de plantas de E. grandis tratadas com água, e foi detectado um aumento de sua expressão em folhas tratadas com ácido abscísico (ABA) e em todos os órgãos tratados com solução de cloreto de sódio a 200 mM. O estudo da região promotora de Egmpk5 revelou um grupo de possíveis elementos de ação cis relacionados a respostas a estresses. Seis linhagens transformadas de tabaco que tiveram seu estado transgênico confirmado por PCR foram desafiadas com tratamentos de seca e cloreto de sódio, e linhagens mais tolerantes foram identificadas. Ao final destas diversas análises, os resultados obtidos sugerem a participação de Egmpk5 em respostas a estresses abióticos. / Mitogen-activated protein kinases (MAPKs) are part of phosphorylation cascades found in all eukaryotes and are responsible for transducing extracellular stimuli into intracellular responses. In plants, MAPK cascades are involved in growth and development processes and have roles in the response to hormones and biotic and abiotic stresses. In our previous studies, the Egmpk5 gene from Eucalyptus grandis was cloned and its expression profile was characterized in plants subjected to different treatments. Also, Nicotiana tabacum SR1 plants were transformed with Egmpk5 under the control of the CaMV 35S promoter for further function studies. In the present study the structure, expression profiles and product of this gene were further characterized. In silico analyses revealed that the Egmpk5 gene is present as a single copy in the E. grandis genome, and that its structure comprises six exons and five introns with conserved sites for transcript splicing. The deduced product of this gene presents the protein kinase domain signature, ATP-binding site and activation/dual phosphorylation motifs in its structure. A phylogenetic tree was built with sequences similar to the deduced EgMPK5 peptide and lead to the identification of plant MAPKs that have had proven activity in cell division signaling and in the response to abiotic stresses, wounding and pathogens. RT-qPCR analysis showed equal expression of Egmpk5 in roots, stems and leaves of plants treated with water and we detected an increase of expression in leaves treated with abscisic acid (ABA) and also increase in expression in all three organs upon treatment with 200 mM sodium chloride. Analysis of the promoter region of Egmpk5 revealed a group of putative cis-acting elements related to stress responses. Six transformed tobacco lines were confirmed by PCR and were assayed with drought and sodium chloride treatments for the identification of more tolerant individuals. After all analyses performed, results allowed us to suggest that Egmpk5 is involved in abiotic stresses responses.

Rhipicephalus (Boophilus) microplus é um parasita que infesta bovinos causando grandes perdas na pecuária. O método convencional para o controle é através do uso de produtos químicos. Esses produtos causam a seleção de carrapatos resistentes a acaricidas e a poluição do meio-ambiente. Uma abordagem alternativa tem sido testada, o qual inclui o uso de vacinas. Entretanto, o sucesso dessa estratégia é dependente da caracterização de antígenos do carrapato. A Glicogênio Sintase Quinase-3β (GSK-3β) é uma serina\treonina quinase que está envolvida no metabolismo do glicogênio, durante a embriogênese do carrapato. O estudo da embriogênese do carrapato é fundamental no desenvolvimento de novas metodologias propostas para o controle desses vetores. A interferência na embriogênese pode resultar em um decréscimo na viabilidade dos ovos ou até em uma letalidade precoce. Nesse trabalho, a região codificadora da GSK-3β do carrapato foi obtida através do 5’RACE, 3’RACE. A transcrição relativa do gene da GSK-3β em ovário de carrapato foi maior quando comparado com intestino e corpo gorduroso, sugerindo que a GSK-3β está envolvida no desenvolvimento de oócitos. Na embriogênese a transcrição relativa do gene da GSK-3β começou no 1º dia de postura com um aumento gradual até 15º dia. No 18º dia ocorre um declíneo e depois a transcrição relativa do gene aumentou novamente, indicando que a GSK-3β teria alguma função relacionada com o final de embriogênese. A transcrição relativa do gene da GSK-3β em células embrionárias do carrapato (BME26) aumentou com o tratamento de insulina. Quando tratadas com tirfostin (inibidor do receptor de insulina), SB216763 (inibidor específico da GSK-3), e wortimanina (inibidor da PI3K) a transcrição relativa do gene foi semelhante ao controle. O alsterpaullone (inibidor específico da GSK-3) inibiu o desenvolvimento dos embriões tanto em fêmeas injetadas com o inibidor como em fêmeas alimentadas artificialmente, sugerindo que a GSK-3β seria crucial para o desenvolvimento embrionário. / Rhipicephalus (Boophilus) microplus is a parasite that infests bovines causing losses in cattle production. The conventional method for control is the use of synthetic chemical products. These products cause the selection of acaricideresistant ticks and pollution of the environment. A range of alternative approaches have been taken, which include the use of vaccine. However, the success of this strategy is dependent on the characterization of the tick antigens. The Glycogen Synthase Kinase (GSK-3β) is a serine/threonine kinase that is involved in glycogen metabolism during tick embryogenesis. The tick embryogenesis studies have played a fundamental role in designing new methodologies proposed for the control of these vectors. Interference on embryogenesis can result in the decrease of the egg’s viability or even in early lethality. In this work, the full length cDNA encoding the GSK-3β protein of the tick has been obtained by 5'-RACE and 3'- RACE. The relative transcription of GSK-3β gene in ovaries was higher when compared with gut and fat body, suggesting that GSK-3β was involved in the oocytes development. In the embryogenesis the relative transcription of the GSK- 3β gene started on 1st day with gradual increase until a peak at 15th day post oviposition. In 18th day occured a decline and after the relative transcription increase again. Probably the GSK-3β has some function related with final embryogenesis. The relative transcription of GSK-3β gene in cells BME26 when treated with insulin increased. When treated with tyrphostin, wortimanin and SB216763 did not increase. The alsterpaullone, GSK-3β specific inhibitor, blocks the embryo development of females ticks injected with the inhibitor and with artificial capillary feeding method, suggesting that GSK-3β could have a crucial function in the embryo development.

Rhipicephalus (Boophilus) microplus é um parasita que infesta bovinos causando grandes perdas na pecuária. O método convencional para o controle é através do uso de produtos químicos. Esses produtos causam a seleção de carrapatos resistentes a acaricidas e a poluição do meio-ambiente. Uma abordagem alternativa tem sido testada, o qual inclui o uso de vacinas. Entretanto, o sucesso dessa estratégia é dependente da caracterização de antígenos do carrapato. A Glicogênio Sintase Quinase-3β (GSK-3β) é uma serina\treonina quinase que está envolvida no metabolismo do glicogênio, durante a embriogênese do carrapato. O estudo da embriogênese do carrapato é fundamental no desenvolvimento de novas metodologias propostas para o controle desses vetores. A interferência na embriogênese pode resultar em um decréscimo na viabilidade dos ovos ou até em uma letalidade precoce. Nesse trabalho, a região codificadora da GSK-3β do carrapato foi obtida através do 5’RACE, 3’RACE. A transcrição relativa do gene da GSK-3β em ovário de carrapato foi maior quando comparado com intestino e corpo gorduroso, sugerindo que a GSK-3β está envolvida no desenvolvimento de oócitos. Na embriogênese a transcrição relativa do gene da GSK-3β começou no 1º dia de postura com um aumento gradual até 15º dia. No 18º dia ocorre um declíneo e depois a transcrição relativa do gene aumentou novamente, indicando que a GSK-3β teria alguma função relacionada com o final de embriogênese. A transcrição relativa do gene da GSK-3β em células embrionárias do carrapato (BME26) aumentou com o tratamento de insulina. Quando tratadas com tirfostin (inibidor do receptor de insulina), SB216763 (inibidor específico da GSK-3), e wortimanina (inibidor da PI3K) a transcrição relativa do gene foi semelhante ao controle. O alsterpaullone (inibidor específico da GSK-3) inibiu o desenvolvimento dos embriões tanto em fêmeas injetadas com o inibidor como em fêmeas alimentadas artificialmente, sugerindo que a GSK-3β seria crucial para o desenvolvimento embrionário. / Rhipicephalus (Boophilus) microplus is a parasite that infests bovines causing losses in cattle production. The conventional method for control is the use of synthetic chemical products. These products cause the selection of acaricideresistant ticks and pollution of the environment. A range of alternative approaches have been taken, which include the use of vaccine. However, the success of this strategy is dependent on the characterization of the tick antigens. The Glycogen Synthase Kinase (GSK-3β) is a serine/threonine kinase that is involved in glycogen metabolism during tick embryogenesis. The tick embryogenesis studies have played a fundamental role in designing new methodologies proposed for the control of these vectors. Interference on embryogenesis can result in the decrease of the egg’s viability or even in early lethality. In this work, the full length cDNA encoding the GSK-3β protein of the tick has been obtained by 5'-RACE and 3'- RACE. The relative transcription of GSK-3β gene in ovaries was higher when compared with gut and fat body, suggesting that GSK-3β was involved in the oocytes development. In the embryogenesis the relative transcription of the GSK- 3β gene started on 1st day with gradual increase until a peak at 15th day post oviposition. In 18th day occured a decline and after the relative transcription increase again. Probably the GSK-3β has some function related with final embryogenesis. The relative transcription of GSK-3β gene in cells BME26 when treated with insulin increased. When treated with tyrphostin, wortimanin and SB216763 did not increase. The alsterpaullone, GSK-3β specific inhibitor, blocks the embryo development of females ticks injected with the inhibitor and with artificial capillary feeding method, suggesting that GSK-3β could have a crucial function in the embryo development.

O ambiente é um sistema dinâmico que está sempre mudando e a capacidade de reconhecimento dessas modificações é uma característica crucial para a vida. A família gênica RLK (do inglês Receptor-Like Kinase) engloba as proteínas receptoras do tipo quinase que estão aptas a reconhecer sinais ambientais, através de seu domínio extracelular, e ativar uma cascata de sinalização por modificações pós-traducionais em outras proteínas utilizando a atividade de fosforilação de seu domínio quinase. A subfamília WAK (do inglês The Wall-Associated Kinase) pertence a família gênica RLK, sendo que algumas proteínas desta subfamília foram identificados associados fisicamente à parede celular, sugerindo estes genes como fortes candidatos para agir como sensores, ligando diretamente o ambiente extracelular com o citoplasma e desencadeando sinais intracelulares. Os genes WAK formam uma grande subfamília em arroz, com 130 genes descritos para a subespécie japonica, em comparação aos 27 genes WAK descritos para arabidopsis. A ausência de dados sobre a expansão desta subfamília e suas implicações nas plantas justifica uma análise evolutiva e estrutural entre os membros da subfamília WAK de arabidopsis e arroz, com uma comparação mais extensiva entre os genomas das subespécies de arroz indica e japonica. Quando a organização e os resíduos conservados do domínio quinase das WAKs foram comparados com a superfamília de proteínas quinases de eucariotos, a identificação de dois grupos distintos de WAKs tornou- se evidente em arabidopsis e arroz. Um grupo é formado somente por OsWAKs que provavelmente se expandiu depois da separação entre monocotiledônea- dicotiledônea, os quais derivaram para a classe de quinases não-RD. O outro grupo corresponde à classe RD-quinase, sendo esta a classe de quinase mais frequente entre os eucariotos, formado por ambos os genes AtWAK e OsWAK. Além disso, com os resultados de comparação entre os genomas das subespécies indica e japonica foi possível identificar uma grande variação com relação aos domínios das proteínas e ao padrão de expressão entre os genes OsWAK dessas subespécies. O conjunto de resultados sugere que as WAKs constituem duas subfamílias evolutivamente relacionadas, mas independentes: OsWAK-RD e WAK-nonRD. O reconhecimento desta divisão poderá contribuir para a compreensão das funções e regulação das WAKs. / The environment is a dynamic system, which is always changing and the recognition of its modifications is a crucial feature for life. The RLK is a gene family of receptor quinase in plants that are able to recognize the environment signals, through its extracellular domain, and activating a signal cascade through the post-translational modifications of others protein using the phosphorylation activity from the quinase domain. The Wall-Associated Kinase (WAK) is a subfamily from RLK, with some members identified as associated to the cell wall, suggesting these genes are strong candidates to act as sensors directly linking the extracellular environment to the citoplasm and triggering intracellular signals. The WAK is a large subfamily in rice genome, with 130 genes being described in japonica, compared to the twenty-seven in A. thaliana. The absence of data about this gene subfamily expansion and their implications for plants, justify an evolutionary and structural analysis of A. thaliana and O. sativa members of the WAK subfamily, with a more extensive comparison between genomes of japonica and indica rice subspecies. When the organization of plant WAK domains and conserved residues are compared with those of other eukaryotes protein kinase superfamilies, the identification of two distinct groups of WAKs become evident in Arabidopsis and Rice. One group corresponds to a cluster containing just OsWAK that should have expanded after the monocot-dicot separation, which evolved to form a non-RD kinase class. The other group corresponds to the classical RD-kinases with both AtWAK and OsWAK representatives. Moreover, by comparing OsWAK from indica and japonica subspecies was possible to identify a large divergence in the protein domain features and gene pattern expression. We propose that plant WAKs constitutes two evolutionary related but independent subfamilies: the WAK-RD and the WAK- nonRD. The recognition of this division would contribute to the understanding of WAK function and regulation.

As proteínas-cinases ativadas por mitógenos (MAPKs) participam de rotas de transdução de sinais universais em eucariotos e compõem cascatas de fosforilação que levam as células a responder a estímulos extracelulares. Em plantas, MAPKs estão associadas a processos de desenvolvimento e na reposta a hormônios e a estresses bióticos e abióticos. Em trabalhos anteriores de nosso grupo, o gene Egmpk5 de Eucalyptus grandis foi clonado e seu padrão de expressão foi caracterizado em plantas submetidas a diferentes tratamentos. Ainda, plantas de Nicotiana tabacum SR1 foram transformadas com Egmpk5 sob regulação do promotor CaMV 35S para futuro estudo de função do gene. No presente trabalho, foi avaliada mais amplamente a estrutura, a expressão e o produto deste gene. Análises in silico revelaram que Egmpk5 apresenta-se como cópia única no genoma, está organizado em seis éxons e seus cinco íntrons possuem sítios canônicos de splicing de RNA. O produto deduzido deste gene apresenta em sua sequência a assinatura do domínio proteína-cinase e os motivos de ligação a ATP e de ativação/dupla fosforilação, indicando a possibilidade de ser uma proteína funcional. Árvore filogenética foi construída pelo método de Máxima Verossimilhança utilizando o algoritmo MUSCLE para alinhamento das sequências e um valor de bootstrap de 500 repetições com sequências peptídicas similares à proteína deduzida EgMPK5 e permitiu a identificação de MAPKs de outras plantas com função já comprovada na sinalização da divisão celular e na resposta a estresses abióticos, ferimento e patógenos. Análise de RT-qPCR mostrou a expressão de Egmpk5 em níveis comparáveis em raízes, caules e folhas de plantas de E. grandis tratadas com água, e foi detectado um aumento de sua expressão em folhas tratadas com ácido abscísico (ABA) e em todos os órgãos tratados com solução de cloreto de sódio a 200 mM. O estudo da região promotora de Egmpk5 revelou um grupo de possíveis elementos de ação cis relacionados a respostas a estresses. Seis linhagens transformadas de tabaco que tiveram seu estado transgênico confirmado por PCR foram desafiadas com tratamentos de seca e cloreto de sódio, e linhagens mais tolerantes foram identificadas. Ao final destas diversas análises, os resultados obtidos sugerem a participação de Egmpk5 em respostas a estresses abióticos. / Mitogen-activated protein kinases (MAPKs) are part of phosphorylation cascades found in all eukaryotes and are responsible for transducing extracellular stimuli into intracellular responses. In plants, MAPK cascades are involved in growth and development processes and have roles in the response to hormones and biotic and abiotic stresses. In our previous studies, the Egmpk5 gene from Eucalyptus grandis was cloned and its expression profile was characterized in plants subjected to different treatments. Also, Nicotiana tabacum SR1 plants were transformed with Egmpk5 under the control of the CaMV 35S promoter for further function studies. In the present study the structure, expression profiles and product of this gene were further characterized. In silico analyses revealed that the Egmpk5 gene is present as a single copy in the E. grandis genome, and that its structure comprises six exons and five introns with conserved sites for transcript splicing. The deduced product of this gene presents the protein kinase domain signature, ATP-binding site and activation/dual phosphorylation motifs in its structure. A phylogenetic tree was built with sequences similar to the deduced EgMPK5 peptide and lead to the identification of plant MAPKs that have had proven activity in cell division signaling and in the response to abiotic stresses, wounding and pathogens. RT-qPCR analysis showed equal expression of Egmpk5 in roots, stems and leaves of plants treated with water and we detected an increase of expression in leaves treated with abscisic acid (ABA) and also increase in expression in all three organs upon treatment with 200 mM sodium chloride. Analysis of the promoter region of Egmpk5 revealed a group of putative cis-acting elements related to stress responses. Six transformed tobacco lines were confirmed by PCR and were assayed with drought and sodium chloride treatments for the identification of more tolerant individuals. After all analyses performed, results allowed us to suggest that Egmpk5 is involved in abiotic stresses responses.

As proteínas-cinases ativadas por mitógenos (MAPKs) participam de rotas de transdução de sinais universais em eucariotos e compõem cascatas de fosforilação que levam as células a responder a estímulos extracelulares. Em plantas, MAPKs estão associadas a processos de desenvolvimento e na reposta a hormônios e a estresses bióticos e abióticos. Em trabalhos anteriores de nosso grupo, o gene Egmpk5 de Eucalyptus grandis foi clonado e seu padrão de expressão foi caracterizado em plantas submetidas a diferentes tratamentos. Ainda, plantas de Nicotiana tabacum SR1 foram transformadas com Egmpk5 sob regulação do promotor CaMV 35S para futuro estudo de função do gene. No presente trabalho, foi avaliada mais amplamente a estrutura, a expressão e o produto deste gene. Análises in silico revelaram que Egmpk5 apresenta-se como cópia única no genoma, está organizado em seis éxons e seus cinco íntrons possuem sítios canônicos de splicing de RNA. O produto deduzido deste gene apresenta em sua sequência a assinatura do domínio proteína-cinase e os motivos de ligação a ATP e de ativação/dupla fosforilação, indicando a possibilidade de ser uma proteína funcional. Árvore filogenética foi construída pelo método de Máxima Verossimilhança utilizando o algoritmo MUSCLE para alinhamento das sequências e um valor de bootstrap de 500 repetições com sequências peptídicas similares à proteína deduzida EgMPK5 e permitiu a identificação de MAPKs de outras plantas com função já comprovada na sinalização da divisão celular e na resposta a estresses abióticos, ferimento e patógenos. Análise de RT-qPCR mostrou a expressão de Egmpk5 em níveis comparáveis em raízes, caules e folhas de plantas de E. grandis tratadas com água, e foi detectado um aumento de sua expressão em folhas tratadas com ácido abscísico (ABA) e em todos os órgãos tratados com solução de cloreto de sódio a 200 mM. O estudo da região promotora de Egmpk5 revelou um grupo de possíveis elementos de ação cis relacionados a respostas a estresses. Seis linhagens transformadas de tabaco que tiveram seu estado transgênico confirmado por PCR foram desafiadas com tratamentos de seca e cloreto de sódio, e linhagens mais tolerantes foram identificadas. Ao final destas diversas análises, os resultados obtidos sugerem a participação de Egmpk5 em respostas a estresses abióticos. / Mitogen-activated protein kinases (MAPKs) are part of phosphorylation cascades found in all eukaryotes and are responsible for transducing extracellular stimuli into intracellular responses. In plants, MAPK cascades are involved in growth and development processes and have roles in the response to hormones and biotic and abiotic stresses. In our previous studies, the Egmpk5 gene from Eucalyptus grandis was cloned and its expression profile was characterized in plants subjected to different treatments. Also, Nicotiana tabacum SR1 plants were transformed with Egmpk5 under the control of the CaMV 35S promoter for further function studies. In the present study the structure, expression profiles and product of this gene were further characterized. In silico analyses revealed that the Egmpk5 gene is present as a single copy in the E. grandis genome, and that its structure comprises six exons and five introns with conserved sites for transcript splicing. The deduced product of this gene presents the protein kinase domain signature, ATP-binding site and activation/dual phosphorylation motifs in its structure. A phylogenetic tree was built with sequences similar to the deduced EgMPK5 peptide and lead to the identification of plant MAPKs that have had proven activity in cell division signaling and in the response to abiotic stresses, wounding and pathogens. RT-qPCR analysis showed equal expression of Egmpk5 in roots, stems and leaves of plants treated with water and we detected an increase of expression in leaves treated with abscisic acid (ABA) and also increase in expression in all three organs upon treatment with 200 mM sodium chloride. Analysis of the promoter region of Egmpk5 revealed a group of putative cis-acting elements related to stress responses. Six transformed tobacco lines were confirmed by PCR and were assayed with drought and sodium chloride treatments for the identification of more tolerant individuals. After all analyses performed, results allowed us to suggest that Egmpk5 is involved in abiotic stresses responses.