L’interaction d’un ligand avec un récepteur à sept domaines transmembranaires (7TMR) couplé aux protéines G, mène à l’adoption de différentes conformations par le récepteur. Ces diverses conformations pourraient expliquer l’activation différentielle des voies de signalisation. Or, le lien entre la conformation et l’activité du récepteur n’est pas tout à fait claire. Selon les modèles classiques pharmacologiques, comme le modèle du complexe ternaire, il n’existe qu’un nombre limité de conformations qu’un récepteur peut adopter. Afin d’établir un lien entre la structure et la fonction des récepteurs, nous avons choisi dans un premier temps, le récepteur de chimiokine CXCR4 comme récepteur modèle. Ce dernier, est une cible thérapeutique prometteuse, impliqué dans l’entrée du VIH-1 dans les cellules cibles et dans la dissémination de métastases cancéreuses. Grâce au transfert d’énergie par résonance de bioluminescence (BRET) nous pouvons détecter les changements conformationnels des homodimères constitutifs de CXCR4 dans les cellules vivantes. En conséquence, nous avons mesuré les conformations de mutants de CXCR4 dont les mutations affecteraient sa fonction. Nous montrons que la capacité des mutants à activer la protéine Galphai est altérée suite au traitement avec l’agoniste SDF-1. Notamment, ces mutations altèrent la conformation du récepteur à l’état basal ainsi que la réponse conformationnelle induite suite au traitement avec l’agoniste SDF-1, l’agoniste partiel AMD3100 ou l’agoniste inverse TC14012. Ainsi, différentes conformations de CXCR4 peuvent donner lieu à une activation similaire de la protéine G, ce qui implique une flexibilité des récepteurs actifs qui ne peut pas être expliquée par le modèle du complexe ternaire (Berchiche et al. 2007). Également, nous nous sommes intéressés au récepteur de chimiokine CCR2, exprimé à la surface des cellules immunitaires. Il joue un rôle important dans l’inflammation et dans des pathologies inflammatoires telles que l’asthme. CCR2 forme des homodimères constitutifs et possède différents ligands naturels dont la redondance fonctionnelle a été suggérée. Nous avons étudié le lien entre les conformations et les activations d’effecteurs (fonctions) de CCR2. Notre hypothèse est que les différents ligands naturels induisent différentes conformations du récepteur menant à différentes fonctions. Nous montrons que les réponses de CCR2 aux différents ligands ne sont pas redondantes au niveau pharmacologique et que les chimiokines CCL8, CCL7 et CCL13 (MCP-2 à MCP-4) sont des agonistes partiels de CCR2, du moins dans les systèmes que nous avons étudiés. Ainsi, l’absence de redondance fonctionnelle parmi les chimiokines liant le même récepteur, ne résulterait pas de mécanismes complexes de régulation in vivo, mais ferait partie de leurs propriétés pharmacologiques intrinsèques (Berchiche et al. 2011). Enfin, nous nous sommes intéressés au récepteur de chimiokine CXCR7. Récemment identifié, CXCR7 est le deuxième récepteur cible de la chimiokine SDF-1. Cette chimiokine a été considérée comme étant capable d’interagir uniquement avec le récepteur CXCR4. Notamment, CXCR4 et CXCR7 possèdent un patron d’expression semblable dans les tissus. Nous avons évalué l’effet de l’AMD3100, ligand synthétique de CXCR4, sur la conformation et la signalisation de CXCR7. Nos résultats montrent qu’AMD3100, tout comme SDF-1, lie CXCR7 et augmente la liaison de SDF-1 à CXCR7. Grâce au BRET, nous montrons aussi qu’AMD3100 seul est un agoniste de CXCR7 et qu’il est un modulateur allostérique positif de la liaison de SDF-1 à CXCR7. Aussi, nous montrons pour la première fois le recrutement de la beta-arrestine 2 à CXCR7 en réponse à un agoniste. L’AMD3100 est un ligand de CXCR4 et de CXCR7 avec des effets opposés, ce qui appelle à la prudence lors de l’utilisation de cette molécule pour l’étude des voies de signalisation impliquant SDF-1 (Kalatskaya et al. 2009). En conclusion, nos travaux amènent des évidences qu’il existe plusieurs conformations actives des récepteurs et appuient les modèles de structure-activité des récepteurs qui prennent en considération leur flexibilité conformationnelle. / Ligand binding to 7TMRs is thought to induce conformational changes within the receptor that translate into activation of downstream effectors. The link between receptor conformation and activity is still poorly understood, as current models of receptor activation fail to take an increasing amount of experimental data into account. Classical pharmacological models such as the ternary complex model are based on the concept that receptors can only adopt a limited number of conformations. To clarify structure-function relationships in 7TMRs, first we studied chemokine receptor CXCR4. This receptor is an important drug target, involved in HIV-1 entry and cancer metastasis. Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) allows us to directly probe conformational changes within pre-formed CXCR4 homodimers in live cells. Using BRET, we measured the conformation of CXCR4 mutants and we also monitored their function by measuring their ability to induce Galphai activation. The analyzed mutants had substitutions in locations which are pivotal molecular switches for receptor conformation and activation. We show that agonist induced Gi activation is altered for most mutants. These mutations also alter CXCR4’s conformation at basal conditions (in absence of ligand) and in the presence of the agonist, SDF-1, the partial agonist, AMD3100 and the inverse agonist, TC14012. Moreover, different conformations of active receptors were detected in the presence of SDF-1, suggesting that different receptor conformations are able to trigger Galphai activity. These data provide biophysical evidence for different active receptor conformations, that cannot be explained by classical models of receptor function (Berchiche et al. 2007). Furthermore, the second part of our work focused on chemokine receptor CCR2. Mainly expressed on immune cells, CCR2 is involved in many inflammatory and vascular diseases. This receptor binds seven natural ligands that have been referred to as redundant. We set out to explore whether the different chemokine ligands of CCR2 receptor induce different conformational changes leading to different functional consequences. Our results show that the different natural ligands of CCR2 are not pharmacologically redundant. Moreover, chemokines CCL8, CCL7 and CCL13 (MCP-2 to MCP-4) are partial agonists of CCR2, at least in the systems we used. Our results support the validity of models for receptor-ligand interactions in which different ligands stabilize different receptor conformations also for endogenous receptor ligands, demonstrating that these natural ligands are not pharmacologically and functionally redundant (Berchiche et al. 2011). As the third part of this work, we studied chemokine receptor CXCR7, the alternative receptor for SDF-1. Until recently, CXCR4 was the only receptor known to bind SDF-1. Moreover, the expression patterns are similar for receptors CXCR4 and CXCR7. Therefore, we investigated the conformational and functional consequences of the synthetic inhibitor of CXCR4, AMD3100, on CXCR7. We show that AMD3100 also binds the alternative SDF-1 receptor, CXCR7. SDF-1 or AMD3100 alone trigger beta-arrestin recruitment to CXCR7, which we identify as a previously unreported signalling pathway of CXCR7. In addition, AMD3100 has positive allosteric effects on SDF-1 binding to CXCR7, on SDF-1-induced conformational rearrangements in the receptor dimer as measured by BRET, and on SDF-1-induced beta-arrestin recruitment to CXCR7. The finding that AMD3100 not only binds CXCR4, but also to CXCR7, with opposite effects on the two receptors, call for caution in the use of this compound as a tool to dissect SDF-1 effects on the respective receptors in vitro and in vivo. Finally, these data provide biophysical evidence for different active receptor conformations, and support models of 7TMR structure-activity relationships that take conformational heterogeneity into account.

La débitmétrie au laser à effet Doppler (LDF) constitue une méthode prometteuse et non-invasive pour l'étude du débit sanguin local dans l'œil. Cette technique est basée sur un changement de fréquence subi par la lumière lors du mouvement des globules rouges dans les vaisseaux. Une nouvelle sonde LDF a été testée pour sa sensibilité à évaluer la circulation rétinienne/choroïdienne sous des conditions hypercapniques et en présence de diverses substances vasoactives ou suivant la photocoagulation des artères rétiniennes chez le rat. Après dilatation pupillaire, la sonde LDF a été placée en contact avec la cornée de rats anesthésiés et parallèle à l'axe optique. L'hypercapnie a été provoquée par inhalation de CO2 (8% dans de l'air médical), alors que les agents pharmacologiques ont été injectés de façon intravitréenne. La contribution relative à la circulation choroïdienne a été évaluée à la suite de la photocoagulation des artères rétiniennes. Le débit sanguin s'est trouvé significativement augmenté à la suite de l'hypercanie (19%), de l'adénosine (14%) ou du nitroprusside de sodium (16%) comparativement au niveau de base, alors que l'endothéline-1 a provoqué une baisse du débit sanguin (11%). La photocoagulation des artères rétiniennes a significativement diminué le débit sanguin (33%). Des mesures en conditions pathologiques ont ensuite été obtenues après l'injection intravitréenne d'un agoniste sélectif du récepteur B1 (RB1). Ce récepteur des kinines est surexprimé dans la rétine des rats rendus diabétiques avec la streptozotocine (STZ) en réponse à l'hyperglycémie et au stress oxydatif. Les résultats ont montré que le RB1 est surexprimé dans la rétine chez les rats diabétiques-STZ à 4 jours et 6 semaines. À ces moments, le débit sanguin rétinien/choroïdien a été significativement augmenté (15 et 18 %) après l'injection de l'agoniste, suggérant un effet vasodilatateur des RB1 dans l'œil diabétique. Bien que la circulation choroïdienne contribue probablement au signal LDF, les résultats démontrent que le LDF représente une technique efficace et non-invasive pour l'étude de la microcirculation rétinienne in-vivo en continu. Cette méthode peut donc être utilisée pour évaluer de façon répétée les réponses du débit sanguin pendant des modifications métaboliques ou pharmacologiques dans des modèles animaux de maladies oculaires. / Laser Doppler Flowmetry (LDF) is a promising, non-invasive technique to assess local ocular blood flow. This technique is based on a Doppler frequency shift of the backscattered light due to the movement of the red blood cells in the vessels. A new LDF probe was tested for its sensitivity to assess the retinal/choroidal blood flow variations in response to hypercapnia, diverse vasoactive agents and following retinal arteries photocoagulation in the rat. After pupil dilation, a LDF probe was placed in contact to the cornea of anesthetised rats in the optic axis. Hypercapnia was induced by inhalation of CO2 (8% in medical air) while pharmacological agents were injected intravitreously. The relative contribution of the choroidal circulation to the LDF signal was determined after retinal artery occlusion by photocoagulation. Blood flow was significantly increased by hypercapnia (19%), adenosine (14%) and sodium nitroprusside (16%) as compared to baseline values while endothelin-1 decreased blood flow (11%). Photocoagulation of retinal arteries significantly decreased blood flow level (33%). Measurements in pathological conditions were then obtained after intravitreal injections of a B1R agonist. This kinin receptor is overexpressed in the retina of streptozotocin (STZ) diabetic rats in response to hyperglycaemia and oxidative stress. Data showed that B1R was upregulated in the STZ-diabetic retina at 4 days and 6 weeks. At these time points, retinal/choroidal blood flow was significantly increased (15 and 18 %) upon injection of the agonist, suggesting a vasodilatory effect of B1R in the diabetic eye. Although choroidal circulation most likely contributes to the LDF signal in this setting, the results demonstrate that LDF represents a suitable in vivo non-invasive technique to monitor online relative changes of retinal microcirculation. This technique could be used for repeatedly assessing blood flow reactivity to metabolic or pharmacologic challenges in rodent models of ocular diseases.

Les maladies cardiovasculaires (MCV) demeurent au tournant de ce siècle la principale cause de mortalité dans le monde. Parmi les facteurs de risque, l’hypercholestérolémie et l’obésité abdominale sont directement liées au développement précoce de l’athérosclérose. L’hypercholestérolémie familiale, communément associée à une déficience des récepteurs des lipoprotéines de basse densité (LDLR), est connue comme cause de maladie précoce d’athérosclérose et de calcification aortique chez l’humain. La subtilisine convertase proprotéine/kexine du type 9 (PCSK9), membre de la famille des proprotéines convertases, est trouvée indirectement associée aux MCV par son implication dans la dégradation du LDLR. Chez l'humain, des mutations du gène PCSK9 conduisent soit à une hypercholestérolémie familiale, soit à une hypocholestérolémie, selon que la mutation entraîne un gain ou une perte de fonction, respectivement. Il demeure incertain si les individus porteurs de mutations causant un gain de fonction de la PCSK9 développeront une calcification aortique ou si des mutations entraînant une perte de fonction provoqueront une obésité abdominale. Dans cette étude, nous avons examiné : 1) l’effet d’une surexpression de PCSK9 dans le foie de souris sur la calcification aortique ; 2) les conséquences d’une déficience en PCSK9 (Pcsk9 KO), mimant une inhibition pharmacologique, sur le tissu graisseux. Nous avons utilisé un modèle de souris transgénique (Tg) surexprimant le cDNA de PCSK9 de souris dans les hépatocytes de souris et démontrons par tomographie calculée qu’une calcification survient de façon moins étendue chez les souris PCSK9 Tg que chez les souris déficientes en LDLR. Alors que le PCSK9 Tg et la déficience en LDLR causaient tous deux une hypercholestérolémie familiale, les niveaux seuls de cholestérol circulant ne parvenaient pas à prédire le degré de calcification aortique. Dans une seconde étude, nous utilisions des souris génétiquement manipulées dépourvues de PSCK9 et démontrons que l’accumulation de graisses viscérales (adipogenèse) apparaît régulée par la PCSK9 circulante. Ainsi, en l’absence de PCSK9, l’adipogenèse viscérale augmente vraisemblablement par régulation post-traductionnelle des récepteurs à lipoprotéines de très basse densité (VLDLR) dans le tissu adipeux. Ces deux modèles mettent en évidence un équilibre dynamique de la PCSK9 dans des voies métaboliques différentes, réalisant un élément clé dans la santé cardiovasculaire. Par conséquent, les essais d’investigations et d’altérations biologiques de la PCSK9 devraient être pris en compte dans un modèle animal valide utilisant une méthode sensible et en portant une attention prudente aux effets secondaires de toute intervention. / Cardiovascular disease (CVD) is the leading cause of death in the 21st century. Among risk factors, hypercholesterolemia and abdominal obesity are directly linked to premature development of atherosclerosis. Familial hypercholesterolemia, commonly due to low-density lipoprotein receptor (LDLR) deficiency, is known to cause premature atherosclerosis and aortic calcification in humans. Proprotein convertase subtilisin/kexin 9 (PCSK9), a member of the proprotein convertase family, is indirectly associated with CVD through enhanced LDLR degradation. Mutations in the human PCSK9 gene lead to either familial hypercholesterolemia or hypocholesterolemia, depending on whether the mutation causes a gain or a loss of function, respectively. It is uncertain if individuals carrying mutations causing a gain-of-function of PCSK9 will develop aortic calcification or whether loss-of-function mutations will lead to abdominal obesity. In this thesis, we investigated: 1) the effect of PCSK9 overexpression on aortic calcification; 2) the consequences of PSCK9 deficiency, mimicking pharmacological inhibition of PCSK9 on fat tissue. We employed a transgenic (Tg) mouse model overexpressing mouse PCSK9 and illustrated by micro-computerized tomography that calcification occurs to a lesser extent in PCSK9 Tg mice than in LDLR-deficient mice. While both PCSK9 Tg and LDLR deficiency caused familial hypercholesterolemia, circulating cholesterol levels alone could not dictate the degree of aortic calcification. In another study, we used genetically modified mice lacking PCSK9 and demonstrated that visceral fat accumulation (adipogenesis) is regulated by circulating PCSK9. Thus in the absence of PCSK9, visceral adipogenesis increases likely via post-translational regulation of very-low-density lipoproteins receptors (VLDLR) in the adipose tissue. In conclusion, these two studies highlight the dynamic balance of PCSK9 in different metabolic pathways, making it a key element in cardiovascular health. Consequently, attempts to survey and/or alter PCSK9 biology should be performed in a valid animal model using sensitive methods and with careful attention to side effects of any given intervention.

Les estrogènes jouent un rôle primordial dans le développement et le fonctionnement des tissus reproducteurs par leurs interactions avec les récepteurs des estrogènes ERα et ERβ. Ces récepteurs nucléaires agissent comme facteurs de transcription et contrôlent l’expression des gènes de façon hormono-dépendante et indépendante grâce à leurs deux domaines d’activation (AF-1 et AF-2). Une dérégulation de leur activité transcriptionnelle est souvent à l’origine de pathologies telles que le cancer du sein, de l’endomètre et des ovaires. Alors que ERα est utilisé comme facteur pronostic pour l’utilisation d’agents thérapeutiques, l’importance de la valeur clinique de ERβ est encore controversée. Toutefois, des évidences récentes lui associent un pouvoir anti-tumorigénique en démontrant que sa présence favorise l’inhibition de la progression de ces cancers ainsi que l’efficacité des traitements. En combinaisons avec d’autres études, ces observations démontrent que bien que les deux isoformes partagent une certaine similitude d’action, les ERs sont en mesure d’exercer des fonctions distinctes. Ces différences sont fortement attribuables au faible degré d’homologie observé entre certains domaines structuraux des ERs, comme le domaine AF-1, ce qui fait en sorte que les différents sites de modifications post-traductionnelles (MPTs) présents sur les ERs sont très peu conservés entre les isoformes. Or, l’activité transcriptionnelle ligand-dépendante et indépendante des ERs est hautement régulée par les MPTs. Elles sont impliquées à tous les niveaux de l’activation des ERs incluant la liaison et la sensibilité au ligand, la localisation cellulaire, la dimérisation, l’interaction avec l’ADN, le recrutement de corégulateurs transcriptionnels, la stabilité et l’arrêt de la transcription. Ainsi, de par leur dissimilitude, les ERs seront différemment régulés par la signalisation cellulaire. Comme un débalancement de plusieurs voies de signalisation ont été associées à la progression de tumeurs ER-positives ainsi qu’au développement d’une résistance, une meilleure compréhension de l’impact des MPTs sur la régulation spécifique des ERs s’avère essentielle en vue de proposer et/ou développer des traitements adéquats pour les cancers gynécologiques. Les résultats présentés dans cette thèse ont pour objectif de mieux comprendre les rôles des MPTs sur l’activité transcriptionnelle de ERβ qui sont, contrairement à ERα, très peu connus. Nous démontrons une régulation dynamique de ERβ par la phosphorylation, l’ubiquitination et la sumoylation. De plus, toutes les MPTs nouvellement découvertes par mes recherches se situent dans l’AF-1 de ERβ et permettent de mieux comprendre le rôle capital joué par ce domaine dans la régulation de l’activité ligand-dépendante et indépendante du récepteur. Dans la première étude, nous observons qu’en réponse aux MAPK, l’AF-1 de ERβ est phosphorylé au niveau de sérines spécifiques et qu’elles jouent un rôle important dans la régulation de l’activité ligand-indépendante de ERβ par la voie ubiquitine-protéasome. En effet, la phosphorylation de ces sérines régule le cycle d’activation-dégradation de ERβ en modulant son ubiquitination, sa mobilité nucléaire et sa stabilité en favorisant le recrutement de l’ubiquitine ligase E6-AP. De plus, ce mécanisme d’action semble être derrière la régulation différentielle de l’activité de ERα et ERβ observée lors de l’inhibition du protéasome. Dans le second papier, nous démontrons que l’activité et la stabilité de ERβ en présence d’estrogène sont étroitement régulées par la sumoylation phosphorylation-dépendante de l’AF-1, processus hautement favorisé par l’action de la kinase GSK-3. La sumoylation de ERβ par SUMO-1 prévient la dégradation du récepteur en entrant en compétition avec l’ubiquitination au niveau du même site accepteur. De plus, contrairement à ERα, SUMO-1 réprime l’activité de ERβ en altérant son interaction avec l’ADN et l’expression de ses gènes cibles dans les cellules de cancers du sein. Également, ces recherches ont permis d’identifier un motif de sumoylation dépendant de la phosphorylation (pSuM) jusqu’à lors inconnu de la communauté scientifique, offrant ainsi un outil supplémentaire à la prédiction de nouveau substrat de la sumoylation. En plus de permettre une meilleure compréhension du rôle des signaux intracellulaires dans la régulation de l’activité transcriptionnelle de ERβ, nos résultats soulignent l’importance des MPTs dans l’induction des différences fonctionnelles observées entre ERα et ERβ et apportent des pistes supplémentaires à la compréhension de leurs rôles physiopathologiques respectifs. / Estrogens play a pivotal role in reproductive physiology through direct interaction with the estrogen receptors ERα and ERβ, which belong to the nuclear hormone receptor family of ligand-activated transcription factors. Harbouring two activation domains (AF-1 and AF-2), gene expression can be controlled by ERs either in a hormone-dependent and/or independent manner. Disruption of ER transcriptional regulation is associated with pathological events such as breast and endometrial cancers. While ERα is considered a strong predictive factor in endocrine therapy of reproductive cancers, the clinical value of ERβ is still debated, although greater expression of ERβ has been associated with a favourable outcome since recent evidence has associated ERβ with anti-tumorigenic properties and a better response to anti-estrogenic compounds. Along with others studies, those individual outcomes indicate that even though the two receptors can exert similar roles by sharing resemblances in terms of structure and general response to hormone, they can also carry out distinct functions. These variations can be attributed to the fact that most of the structural domains shared by ERs exhibit a low level of homology, especially at the AF-1 domain. Consequently, the majority of the post-translational modifications sites (PTMs) on ERs are not shared between both isoforms. In fact, ligand-induced and ligand-independent activities of ERs are critically influenced by PTMs. PTMs controls the multiple aspects of ER-dependent activation by modulating ERs ligand binding, specificity, cellular localization, dimerization, interaction with their cognate DNA response element, combinatory recruitment of transcriptional coregulators, stability and transcriptional arrest. Hence, by their discrepancies, ERs will be differently influenced by the cellular environment. Furthermore, as the deregulation of different signalling pathway in cancers is associated with ER-dependant tumour progression and in the acquisition of a therapeutic resistant phenotype, it is crucial to understand the how PTMs affect ERs transactivation in order to eventually propose and/or develop adequate treatment. The results presented in this thesis were carried out with the objective of gaining a better understanding of PTM’s roles on ERβ transcriptional control which, as opposed to ERα, remain unclear. We demonstrate here a dynamic regulation of ERβ by phosphorylation, ubiquitination and sumoylation. Furthermore, as all the newly identified PTM are located within de AF-1 domain of ERβ, our results highlight the key role of this domain in the regulation of ligand-dependent and independent transcriptional properties of this receptor. The first study shows that in response to MAPK, specific serine residues in the AF-1 of ERβ are phosphorylated and play an important role in the regulation of ERβ ligand-independent activity by the ubiquitin-proteasome pathway. In fact, the activation-degradation cycle of ERβ induced by MAPK is regulated upon phosphorylation of these serines coordinating ERβ ubiquitination, subnuclear mobility and stability by promoting the recruitment of the ubiquitin ligase E6-AP. Moreover, this molecular process plays part in the differential regulation of ERα and ERβ activity upon proteasome inhibition. In the second paper, we demonstrate that ERβ activity and stability in presence of estrogen is closely regulated by the phosphorylation-dependent sumoylation of the AF-1 domain, amplified by GSK-3 action. SUMO-1 attachment prevents ERβ degradation by competing with ubiquitin at the same acceptor site and dictates ERβ transcriptional inhibition, as opposed to ERα, by altering estrogen-responsive target promoter occupancy and gene expression in breast cancer cells. Furthermore, these findings uncover a novel phosphorylated sumoylation motif (pSuM) and offer a valuable tool to predict novel SUMO substrates under protein kinase regulation. In combination to our better understanding on how intracellular signals controls ERβ transcriptional activity, our results highlight the significant role of PTMs in ERs isoforms discrepancies and allows supplementary comprehension of their respective physiopathologicals roles.

HYAL-1 (hyaluronidase-1) appartient à la famille des hyaluronidases connues pour leur rôle dans la dégradation de l’acide hyaluronique. L’expression de HYAL-1 est élevée dans de nombreux type de cancers, notamment dans le cancer de la prostate, de la vessie, des reins et du sein où il est impliqué dans la croissance tumorale et les métastases. Récemment notre laboratoire a aussi démontré une expression élevée de HYAL-1 dans le cancer épithélial de l’ovaire (CEO) de type mucineux et à cellules claires, expression qui est inversement corrélée à celle du récepteur de l’oestrogène alpha (REα). Cependant, malgré le fait que le rôle de HYAL-1 dans le cancer soit bien établit, le mécanisme de sa régulation reste encore inconnu. Le REα est un facteur de transcription qui suite à sa liaison avec son ligand va réguler l’expression de plusieurs gènes. Le REα ainsi stimulé par l’hormone va activer la transcription de ces gènes cibles mais il est connu maintenant qu’une grande partie des gènes régulés par le REα sont en réalité réprimés par ce récepteur. Dans ce travail nous proposons d’étudier le mécanisme de la régulation du gène HYAL-1 par le REα dans le CEO à cellules claires et dans le cancer du sein. L’expression ectopique du REα dans la lignée TOV21G (RE-) de même que le traitement de la lignée MCF-7 (RE+) avec de l’oestrogène a induit une diminution du niveau d’expression de l’ARN m de HYAL-1. Ces résultats nous ont permis de confirmer que HYAL-1 est un gène cible du REα. Il est aussi connu que le REα peut exercer son action par différents mécanismes d’action, entre autres en interagissant avec une séquence d’ADN appelée élément de réponse à l’oestrogène (ERE), retrouvé sur le promoteur des gènes cibles ou bien indirectement par des interactions protéine-protéine en se liant à d’autres facteur de transcription tels que Sp1. Après avoir identifiés de telles séquences sur le promoteur proximal de HYAL-1, (1 ERE proximal à -900 pb, 3 distaux à -32350 pb, 48430, -50130 pb du site d’initiation de la transcription) en plus des 2 Sp1 connus (-60 et – 1020pb), nous avons démontrés par immunoprécipitation de la chromatine que le REα est recruté sur le promoteur de HYAL-1 au niveau de l’ERE proximal -900 pb et du distal -32350 pb de même que sur le site Sp1 -1020 pb. De plus, l’activité biologique de l’ERE -900 pb et du ii Sp1-1020pb à été confirmée par des essais de gènes rapporteurs à la luciférase. Avec son rôle connu dans la tumorigenèse, l’identification de HYAL-1 comme gène cible du REα pourrait être une avenue intéressante pour le traitement des cancers hormono-indépendants. / HYAL-1 (hyaluronidase-1) belongs to the hyaluronidase family of enzymes that degrade hyaluronic acid. HYAL-1 expression is elevated in many types of cancers including prostate, bladder, liver and breast cancer where it is involved in tumor growth and metastasis. In accordance to these observations, our group has also demonstrated high expression of HYAL-1 in clear cell and mucinous epithelial ovarian cancer (EOC) subtypes which was inversely correlated to that of estrogen receptor alpha (ERα). However, despite the fact that the role of HYAL-1 in cancer is well established, the mechanism of its regulation is still unknown. ERα is a transcriptional factor that regulates target-gene expression following ligand binding. Upon hormone stimulation, activated ERα will upregulate transcription of many target genes. However, it has been recently well documented that a large number of ERα responsive genes are in fact repressed. In this work we propose to study the mechanism by which ERα regulates HYAL-1 expression in clear cell EOC subtype as well as in breast cancer. The ectopic expression of ERα in TOV21G cell line (ERα -) and estrogen treatment of MCF-7 cells (ERα +) decreased HYAL-1 mRNA expression and allowed us to confirm that HYAL-1 is an ERα target gene. It is also known that ERα may exert its action through different mechanisms of action including interacting with a DNA sequence called estrogen response element (ERE) found in the promoter of target genes or indirectly by protein-protein interactions by binding to other transcription factor such as Sp1. Having identified such sequences in the proximal promoter of HYAL-1, (one proximal ERE -900 bp, 3 distals at -32350, -48430, -50130 bp from the start site of transcription) in addition to the two known Sp1 (-60 and -1020pb), we have demonstrated by chromatin immunoprecipitation that ERα is recruited at the HYAL-1 promoter at the ERE sites -900 pb and -32350 pb as well as at the Sp1 site -1020. Furthermore, the biological activity of the proximal ERE -900 and Sp1 -1020 sites were further confirmed by luciferase reporter gene assay. Given its known role in tumorigenesis, identification of HYAL-1 as an ERα target may provide an interesting approach for the treatment of hormono-independent cancer.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Les neutrophiles sont généralement considérés résistants aux glucocorticoïdes. Cependant, peu d’études comparant l’effet de ces drogues sur les neutrophiles et les autres leucocytes sanguins (monocytes, lymphocytes et éosinophiles) ont été rapportées. Dans notre étude, nous avons évalué la réponse aux glucocorticoïdes de ces deux populations cellulaires chez le cheval et l’homme. Les cellules, préalablement isolées du sang de 6 chevaux et 4 sujets humains sains, ont été incubées pendant 5 h en présence de lipopolysaccharide (LPS; 100 ng/mL) seul ou combiné avec de l’hydrocortisone, de la prednisolone ou de la dexaméthasone (10-8M et 10-6M). L’expression d’ARNm pour l’IL-1β, le TNF-α, l’IL-8, la glutamine synthétase et le récepteur α des glucocorticoïdes (GR-α) a été quantifiée par qPCR. Les neutrophiles équins ont également été incubés pendant 20 h en présence de ces 3 glucocorticoïdes et la survie cellulaire a été évaluée par cytométrie de flux et microscopie optique. Nous avons démontré que les glucocorticoïdes inhibaient l’expression des gènes pro-inflammatoires induite par le LPS pour les deux populations cellulaires chez les deux espèces étudiées. L’expression de la glutamine synthétase était également significativement augmentée par les glucocorticoïdes chez les neutrophiles et les autres leucocytes sanguins équins. De manière générale, l’intensité de la réponse aux glucocorticoïdes s’est avérée similaire dans les 2 populations leucocytaires et chez les deux espèces. Les glucocorticoïdes augmentaient également la survie des neutrophiles équins, phénomène également rapporté dans d’autres espèces. Ainsi, les glucococorticoïdes exercent des effets d’intensité comparable sur les neutrophiles et les autres leucocytes sanguins. Nous spéculons que la faible réponse à la corticothérapie observée lors de maladies inflammatoires chroniques neutrophiliques comme l’asthme sévère ou la Maladie Pulmonaire Obstructive Chronique (MPOC) ne s’explique pas par une corticorésistance intrinsèque des neutrophiles. / Neutrophils are generally considered resistant to glucocorticoids compared to other inflammatory cells. However, there are few studies comparing the effects of glucocorticoids in neutrophils and those of other blood leukocytes (monocytes, lymphocytes and eosinophils). In our study, we assessed glucocorticoid-responsiveness in equine and human peripheral blood neutrophils and in neutrophil-depleted leukocytes. Cells were isolated from 6 healthy horses and 4 human healthy subjects. They were incubated for 5 h with or without lipopolysaccharide (LPS; 100 ng/mL) alone or combined with hydrocortisone, prednisolone or dexamethasone (10-8M and 10-6M). IL-1β, TNF-α, IL-8, glutamine synthetase and Glucocorticoid Receptor α (GR-α) mRNA expression was quantified by qPCR. Equine neutrophils were also incubated for 20 h with or without the three glucocorticoids and cell survival was assessed by flow cytometry and light microscopy. We found that glucocorticoids down-regulated LPS-induced pro-inflammatory mRNA expression in both cell populations and species. These drugs also significantly increased glutamine synthetase gene expression in both equine cell populations. The magnitude of glucocorticoid response was generally similar in both cell populations and species. As reported in other species, glucocorticoids significantly increase the survival in equine neutrophils. Based on these results, it appears that glucocorticoids exert effects of similar magnitude on neutrophils and on other blood leukocytes. We speculate that the poor response to glucocorticoids observed in some chronic neutrophilic human diseases such as severe asthma or Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) is not explained by an inherent attenuated response of neutrophils to these drugs.

La rétinopathie diabétique est associée à plusieurs changements pathologiques du lit vasculaire rétinien, incluant l’ouverture de la barrière hémato-rétinienne, l’inflammation vasculaire et la modification du débit sanguin. Récemment, il a été proposé que le récepteur B1 des kinines, qui est surexprimé dans la rétine diabétique, puisse être impliqué dans le développement de ces altérations vasculaires. Ainsi, cette thèse présente les effets de traitements pharmacologiques avec des antagonistes du récepteur B1 sur la perfusion rétinienne, la perméabilité vasculaire, l’infiltration des leucocytes (leucostasie), l’expression de médiateurs de l’inflammation et la production d’anion superoxyde dans la rétine du rat rendu diabétique avec la streptozotocine (STZ). Les résultats obtenus montrent que l’application oculaire (10 µl d’une solution à 1%, deux fois par jour pendant 7 jours) de LF22-0542, un antagoniste hydrosoluble du récepteur B1, bloque significativement l’hyperperméabilité vasculaire, la leucostasie, le stress oxydatif et l’expression génique de médiateurs de l’inflammation (B1R, iNOS, COX-2, VEGF-R2, IL-1β et HIF-1α) dans la rétine chez le rat à 2 semaines de diabète. L’administration orale (3 mg/kg) d’un antagoniste non-peptidique et sélectif pour le récepteur B1, le SSR240612, entraîne une diminution du débit sanguin rétinien 4 jours après l’induction du diabète mais n’a aucun effet sur la réduction de la perfusion rétinienne à 6 semaines. Le récepteur B1 joue donc un rôle protecteur au tout début du diabète en assurant le maintien d’un débit sanguin normal dans la rétine; un effet qui n’est toutefois pas maintenu pendant la progression du diabète. Ces données présentent ainsi la dualité du récepteur B1 avec des effets à la fois protecteurs et délétères. Elles suggèrent aussi un rôle important pour le récepteur B1 dans l’inflammation rétinienne et le développement des altérations vasculaires. Le récepteur B1 pourrait donc représenter une nouvelle cible thérapeutique pour le traitement de la rétinopathie diabétique. / Diabetic retinopathy is associated with retinal vascular changes, including blood retinal barrier breakdown, vascular inflammation and blood flow alterations. It has been proposed that kinin B1 receptor, which is upregulated in the diabetic retina, could be involved in the development of these pathological features of diabetic retinopathy. In a rat model of diabetes induced by Streptozotocin (STZ), the effects of kinin B1 receptor antagonists on retinal perfusion, vascular permeability, leukostasis, gene expression of inflammatory mediators and production of superoxide anion in the retina were evaluated. The results show that in 2-week diabetic rats, topical ocular application of the water soluble kinin B1 receptor antagonist LF22-0542 (10 µl of 1% solution, twice per day) for a 7-day period reverses vascular hyperpermeability, leukostasis, oxidative stress and gene expression of inflammatory mediators (B1R, iNOS, COX-2, VEGF-R2, IL-1β and HIF-1α) in the retina. Single oral administration (3 mg/kg) of SSR240612, a selective non-peptide B1 receptor antagonist, induces a decrease of retinal blood flow in 4-day diabetic rats but has no effect on retinal blood flow reduction present at 6 weeks of diabetes. Therefore, B1 receptor has a protective role in early diabetes by preserving a normal blood flow in the retina. These data suggest that B1 receptor exerts protective and adverse effects in the diabetic retina. They also support a key role for B1 receptor in retinal inflammation and the development of vascular alterations. B1 receptor could therefore represent a promising therapeutic target for the treatment of diabetic retinopathy.