La transplantation de cellules souches de muscle possède un grand potentiel pour la réparation à long terme du muscle dystrophique. Cependant, la croissance ex vivo des cellules souches musculaires réduit de manière significative l'efficacité de leur greffe puisque le potentiel myogénique est considérablement réduit lors de la mise en culture. La voie de signalisation Notch a émergé comme un régulateur majeur des cellules souches musculaires (MuSCs) et il a également été décrit que la sur-activation de Notch est crucial pour le maintien du caractère souche des MuSC. Cette découverte pourrait être traduite comme un bénéfice thérapeutique potentiel. Des MuSCs murines ont été fraîchement isolées et ensemencées sur des boîtes de culture recouverte de Dll1-Fc, le domaine extracellulaire de Delta-like-1 est fusionné au fragment Fc humain, afin d'activer la voie de signalisation Notch et avec un IgG hu-main comme contrôle. Nous avons utilisé le rAAV afin d’exprimer le Dll1 spécifique-ment dans les muscles de souris. Les souris P3 ont été traitées avec de l’AAV pendant 3 semaines et 6 semaines afin d’étudier l'effet de Dll1 au cours du développement postnatal. Afin d’étudier le processus de régénération, l'AAV a également été injecté dans les muscles de souris mdx alors que les souris de type sauvage ont été utilisées comme contrôle. Un potentiel caractère souche supérieur (marquée avec le Pax7) est observé dans les cultures des MuSCs qui sont recouverte de Dll1-Fc par rapport à leurs homologues contrôles, par contre le taux de proliférer est réduit. Au cours du développement postnatal, la sur-activation de la voie de signalisation Notch par Dll1 sur les fibres musculaires a été en mesure d'élargir le pool des cellules Pax7+, cependant elle entraîne une diminution de la masse musculaire avec réduction de la taille des fibres et ceci sans affecter l'accumulation des myonuclei. Dans les MuSCs quiescentes (de type sauvage), la sur-activation de la voie de signalisation Notch ne présente pas de réel effet. La surexpression de Dll1 dans le muscle mdx a diminué la masse musculaire et agrandit le pool de cellules souches musculaires, ce-pendant le taux de régénération n'a pas été affecté. L’augmentation des MuSCs est attribuée à une différenciation entravée des cellules souches musculaires. En étudiant la stimulation de la voie de signalisation Notch dans les MuSCs à la fois in vitro et in vivo, nous démontrons que sur-activation de Notch préserve le caractère souche des cellules via l’inhibition de la prolifération et de la différenciation myogénique des MuSCs. / Muscle stem cell transplantation possesses great potential for long-term repair of dys-trophic muscle. However expansion of muscle stem cells ex vivo significantly reduces their engraftment efficiency since the myogenic potential is dramatically lost in culture. The Notch signaling pathway has emerged as a major regulator of muscle stem cells (MuSCs) and it has recently been discovered that high Notch activity is crucial for maintaining stemness in MuSCs. This feature might be exploited and developed into a novel therapeutic approach.Murine MuSCs were freshly isolated and seeded on culture vessels coated with Dll1-Fc, which fused Delta-like-1 extracellular domain with human Fc, to activate Notch sig-naling and with human IgG as a control. The rAAV gene delivery system was em-ployed to express Dll1 in murine muscles. P3 mice were treated with AAV for 3 weeks and 6 weeks to investigate the effect of Dll1 during postnatal development. To investi-gate the regeneration process, AAV were injected into mdx muscles whereas wild-type mice were used as control.Higher potential stemness (marked by Pax7 positivity) was observed in MuSCs grow-ing on a Dll1-Fc surface as compared to their counterparts on the control surface, while their proliferation rate was reduced. During postnatal development, overstimulation of Notch signaling by Dll1 on the mus-cle fibers was able to enlarge the Pax7+ cell pool, while also resulting in decreased muscle mass and smaller muscle fibers without affecting the accretion of myonuclei into the fiber. In quiescent (wild-type) MuSCs, overstimulation of Notch signaling did not have any discernible effect. Overexpression of Dll1 in mdx muscle decreased the muscle mass and enlarged the muscle stem cell pool, while muscle regeneration re-mained unaffected. By investigating Notch stimulation in MuSCs both in vitro and in vivo, we demonstrate that high Notch activity preserves stemness via inhibition of MuSCs proliferation and myogenic differentiation. Our findings point out that the Dll1 molecule, as a canonical Notch ligand, might have a therapeutic potential in cell-based therapies against muscu-lar dystrophies.

La régénération musculaire implique des interactions fonctionnelles entre différents types de cellules mononucléées. Parmi elles, citons les progéniteurs myogéniques (MPs), qui fusionnent pour générer de nouvelles myofibres en réponse à une blessure, et les cellules immunitaires qui envahissent les muscles endommagés. Des dépôts transitoires fibrotiques et d’adipocytes sont observés dans les muscles en régénération qui cependant persistent dans la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) et au cours du vieillissement. Nous avons démontré que les progéniteurs fibro-adipogéniques (FAPs) exprimant le marqueur de surface PDGFRα, contribueraient au développement des dépôts non myogéniques dans les muscles sains. En effet, ces progéniteurs se différencient en adipocytes blancs fonctionnels, bien qu’étant insensibles à l’insuline, et génèrent des myofibroblastes. Quant à la fibrose des muscles DMD, elle se formerait à partir de la différenciation à la fois des MPs et des FAPs. Dans les muscles sains, les FAPs stimulent la myogenèse des MPs au cours de la régénération, alors que les myotubes et les macrophages pro-inflammatoires inhibent l’adipogenèse et la fibrogenèse des FAPs. Pour les progéniteurs âgés ou dystrophiques, les interactions cellulaires entre les FAPs et les MPs sont perturbées. De manière intéressante, la régulation des FAPs DMD ou âgés peut être restaurée en remplaçant les MPs DMD ou âgés par des MPs jeunes et sains. Nos résultats montrent que les muscles humains contiennent des progéniteurs fibro-adipogéniques qui jouent un rôle central dans la régulation de l’homéostasie musculaire en interagissant avec les progéniteurs myogéniques et les macrophages / Muscle regeneration involves functional interactions between different types of mononuclear cells including myogenic progenitors (MPs) and macrophages. Following injury, damaged muscles are invaded by immune cells and MPs fuse to generate new myofibres. Transient fibrotic and adipocyte deposits are observed in regenerating muscles, which however persist in Duchenne muscular dystrophy (DMD) and during aging. We demonstrated that fibro-adipogenic progenitors (FAPs) expressing the PDGFRα surface marker would contribute to the development of non-myogenic deposits in healthy muscles. Indeed, these progenitors differentiate into functional white adipocytes that have the feature to be insulino-resistant, and give rise to myofibroblastes. Intramuscular fibrosis in DMD patients could be formed from both FAPs and MPs differentiation. In healthy muscles, FAPs stimulate myogenesis of MPs during regeneration, while myotubes and pro-inflammatory macrophages inhibit the adipogenesis and fibrogenesis of FAPs. Cellular interactions between FAPs and MPs are disrupted for DMD or aged progenitors. Interestingly, they are restored if aged or DMD FAPs are replaced by healthy and young MPs. Our results show that the human muscles contain fibro-adipogenic progenitors that play a crucial role in the control of muscle homeostasis by interacting with myogenic progenitors and macrophages

La poly(ADP-ribosyl)ation est une modification post-traductionnelle de protéines catalysée par les Poly(ADP-ribose) polymérases (PARPs, 17 membres). Depuis 2011, le laboratoire décortique les propriétés biologiques de PARP3 qui est désormais bien décrite pour son rôle dans la réparation des cassures double-brin de l’ADN, la mitose et la transition épithélio-mésenchymateuse. Ces recherches combinées aux données de la littérature semblent indiquer que les fonctions de PARP3 sont très étendues et participent aussi à des processus physiologiques. Ainsi, mes travaux de thèse révèlent une nouvelle fonction clé de PARP3 dans la différenciation des cellules souches neurales et musculaires. Nous avons observé une forte augmentation de l’expression de PARP3 au cours de la neurogénèse, la gliogenèse et la myogénèse. En l’absence de PARP3, la différenciation des cellules souches neurales (NSPC) en astrocytes et neurones est perturbée et les souris PARP3KO présentent une incapacité à régénérer le tissu cérébral au niveau du striatum après ischémie hypoxique. Concernant les cellules musculaires, la disruption de PARP3 (Crispr/Cas9) empêche toute différenciation des myoblastes C2C12 en myotubes et conduit à une désoganisation du cytosquelette, une dégénérescence mitochondriale et une répression de gènes de l’identité. La réexpression de PARP3 catalytiquement active restaure la capacité de différenciation des C2C12. Enfin, nous avons identifié de nouvelles protéines cibles de PARP3 qui permettent de suspecter un rôle dans l’autophagie et le métabolisme énergétique au cours de la différenciation cellulaire. L’ensemble de ces résultats nous ont permis de découvrir que PARP3 a un rôle central dans la différenciation cellulaire et d’ouvrir de solides pistes de recherche afin d’identifier les mécanismes mis en jeu. / Poly (ADP-ribosyl)ation is a post-translational modification of proteins catalysed by Poly (ADP-ribose) polymerases (PARPs, 17 members). Since 2011, the laboratory has been dissecting the biological properties of PARP3 which is now well described for its role in the repair of DNA double-strand breaks, in mitosis and in epithelial-mesenchymal transition. This investigation combined with data from the literature suggests that PARP3 functions are very wide and could participate in physiological processes. Thus, my thesis work reveals a new key function of PARP3 in neural and muscular stem cell differentiation. We observed a strong increase in PARP3 expression during neurogenesis, gliogenesis and myogenesis. In the absence of PARP3, the differentiation of neural stem cells (NSPCs) into astrocytes and neurons is impaired and PARP3KO mice display an inability to regenerate brain tissue in the region of the striatum after hypoxic ischemia. Regarding muscle cells, PARP3 disruption (Crispr/Cas9) prevents C2C12 myoblast differentiation into myotubes and leads to cytoskeleton disorganisation, mitochondrial degeneration, and repression of identity genes. The reexpression of a catalytically active PARP3 restores the C2C12 differentiation capacity. Finally, we have identified new PARP3 target proteins that suggest a role in autophagy and energetic metabolism during cell differentiation.Together, these results reveal that PARP3 has a central role in cell differentiation and opens solid lines of research to identify the mechanisms involved.

La sarcopénie est définie comme la diminution de la masse et de la force musculaires squelettiques au cours du vieillissement.Dans ce contexte, l’objectif principal de cette thèse était d’évaluer l’action régulatrice de la vitamine D sur le dialogue entre cellules immunitaires et musculaires et son implication dans les capacités de régénération du muscle âgé.Dans un premier temps, nous avons étudié in vitro la différenciation des cellules musculaires de la lignée L6 co-cultivée ou non avec des cellules immunitaires (PBMC : cellules mononuclées du sang périphérique), et en présence ou non de LPS. Ce modèle a permis d’établir que les PBMC stimulaient bien la différenciation musculaire. La réponse pro-inflammatoire induite par le LPS inhibait l’expression des marqueurs de différenciation. Même en présence de LPS, la stimulation de l’expression ce des marqueurs dans les L6 co-cultivées était conservée. De plus, l’environnement pro-inflammatoire induit par le LPS dans les co-cultures inhibait l’expression musculaire des marqueurs de la voie de la régénération, comme Notch. Nous avons ensuite utilisé le même système de co-cultures afin de déterminer si la vitamine D, ici la 25(OH)D, pouvait moduler les sécrétions cytokiniques des PBMC et ainsi modifier l’expression des marqueurs de différenciation musculaires. Le traitement des co-cultures à la 25(OH)D n’a modifié ni le profil de sécrétion cytokinique des PBMC, ni l’expression des marqueurs de différenciation des L6.Dans un deuxième temps, nous avons étudié à l’aide d’un modèle de rats âgés déplétés en vitamine D les mécanismes pouvant contribuer à l’atrophie musculaire observée. Nous avons mis en évidence que l’activité de la voie de signalisation Notch, voie clé du processus de régénération, ainsi que la prolifération musculaire étaient diminuées chez ces rats, et ceci même en absence de lésion. Nous avons ensuite évalué l’effet du statut en vitamine D sur un processus aigu de régénération au cours de vieillissement chez le rat. L’analyse de cette expérimentation, actuellement en cours, a déjà permis de mettre en évidence qu’au cours du vieillissement, la prolifération musculaire suite à une lésion est diminuée, d’autant plus si le rat âgé est carencé en vitamine D. Le même résultat a été retrouvé pour l’expression d’une cible de la voie Notch (Hes1). En outre, l’expression des marqueurs de différenciation semblaient être altérée chez les animaux âgés résultant probablement en un retard et/ou une inefficacité du processus de différenciation, en particulier chez les rats âgés déplétés en vitamine D. En revanche, la supplémentation en vitamine D ne semblait pas avoir d’effet sur la régénération musculaire du rat âgé.En conclusion, in vitro, la 25(OH)D ne modifiait pas l’expression des marqueurs de différenciation des cellules musculaires co-cultivées avec des cellules immunitaires. En revanche in vivo, la déplétion en vitamine D semblerait aggraver l’effet de l’âge sur la régénération musculaire.La diminution de la capacité de régénération musculaire est un facteur contribuant au développement de la sarcopénie. Ce travail a permis de montrer que le maintien d’un statut optimal en vitamine D serait nécessaire à la conservation des capacités de régénération musculaire. Il semble donc important de maintenir des statuts optimaux en vitamine D afin de limiter l’atrophie musculaire au cours du vieillissement. / One of the most striking effects of ageing is an involuntary loss of skeletal muscle mass known as sarcopenia. The development of sarcopenia appears to be multifactorial and includes anabolic resistance to dietary amino acids and sedentary lifestyle. The diminished ability of aged muscle to self-repair is also a key factor of sarcopenia. During the regeneration process, immune and muscle cells work in a cross-talk leading to an optimal muscle cell proliferation and differentiation. However, with aging, the immune response is impaired, possibly contributing to the reduction in the capacity of regeneration.Muscle and immune cells are both targets of vitamin D action. This vitamin modulates muscle cell proliferation and differentiation and stimulates the anti-inflammatory response of immune cells. With age, vitamin D insufficiencies or deficiencies develop.In this context, the main objective of this thesis was to evaluate the regulatory action of vitamin D on the cross-talk between immune and muscle cells and its implication in the ability of skeletl muscle to regenerate during aging.Initially, we studied in vitro the differentiation of L6 muscle cells co-cultured with or without immune cells (PBMC: peripheral blood mononuclear cells), and in with or without of LPS. From this model, PBMC stimulated muscle cell differentiation. The pro-inflammatory response induced by LPS inhibited the expression of muscle differentiation markers in muscle cells. Of note, these markers were stimulated even in presence of LPS. In addition, the LPS-associated pro-inflammatory environment inhibited the Notch signaling pathway, the key pathway of muscle regeneration process, in L6 cells co-cultured with PBMC. We then used the same system of co-cultures to determine whether vitamin D, in its 25 (OH)D form, could modulate PBMC cytokine secretion and thereby could alter the expression of markers of muscle differentiation. Unfortunately, the treatment of co-culture with 25 (OH) D has changed neither the profile of PBMC cytokine secretion nor the expression of differentiation markers in L6 cells.Secondly, we investigated in a model of old rats the mechanisms that contribute to muscle atrophy following vitamin D depletion. We have demonstrated that the activity of the Notch signaling pathway, as well as muscle proliferation were reduced in old vitamin D-depleted rats, even in the absence of lesions. Then we evaluated the effect of the vitamin D status on an acute muscle regeneration process, i.e. muscle infusion of notexin in old rats. This ongoing experiment has already highlighted that during aging, muscle proliferation is reduced after injury, especially if age is associated with a vitamin D deficiency. In addition, during aging, the expression of differentiation markers was altered resulting in delayed and/or incomplete differentiation process, in particular in vitamin D-depleted old rats. However, vitamin D supplementation seemed to have no beneficial or deleterious effects on muscle regeneration in aged rats.In conclusion, in vitro 25 (OH) D was unable to modulate the differentiation of muscle cells co-cultured with immune cells. However, in vivo, vitamin D depletion appeared to worse the effect of ageing on muscle regeneration.The diminished ability of aged muscle to self-repair is a factor of sarcopenia. Our work has demonstrated the importance of maintening optimal vitamin D status to preserve muscle regeneration capacity and thus to limit muscle atrophy during aging.

Les protéines d’échafaudage de la famille Elmo forment des complexes avec les facteurs d’échange de nucléotides de la guanine (GEF) de la famille des protéines Dock. Globalement, le complexe Elmo/Dock est caractérisé par une régulation conformationnelle, où au niveau basal il se retrouve dans un état fermé, en raison de la présence de sites de contact bloquant la liaison des interacteurs d’Elmo et la fonction GEF de Dock qui permet l’activation de Rac1. Une fois dans un état activé, le complexe adoptera une conformation ouverte et les sites de liaison d’Elmo seront disponibles. Par exemple, il a été démontré que la liaison des GTPases RhoG ou Arl4A au domaine RBD d’Elmo induit le recrutement du complexe à la membrane cellulaire. Le domaine DHR-2 étant alors accessible, celui-ci assurera l’activation spécifique de la GTPase Rac1 afin d’induire, entre autres, le remodelage du cytosquelette d’actine. Divers processus cellulaires seront alors d clench s, tels que la migration cellulaire, la phagocytose et la fusion des cellules musculaires (nommées myoblastes). Dans le cadre de cette thèse, nous avons étudié par l’entremise de deux objectifs l’importance de la régulation conformationnelle d’Elmo. Pour le premier objectif, nous avons étudié la régulation conformationnelle d’Elmo durant la myogenèse. La formation de fibres multi-nuclées est fondamentale pour l’établissement du muscle squelettique. Durant ce processus, la fusion des myoblastes est une étape clé pour permettre le développement et la régénération musculaire. Afin d’étudier les fonctions d’Elmo in vivo dans ce contexte, nous avons généré une série de modèles de souris. Tout d’abord, via la génération de souris double knock-out pour Elmo1 et Elmo2 (Elmo1KOElmo2cKO), nous avons démontré la fonction essentielle d’Elmo durant la fusion des myoblastes embryonnaires. En effet, uniquement des myofibres mononuclées sont observées suite à l’inactivation génétique d’Elmo1 et Elmo2. Par la suite, nous avons également généré des lignées de souris knock-in, où des mutations ont été introduites dans des domaines spécifiques d’Elmo2 afin d’induire sa conformation ouverte (Elmo2EID) ou fermée (Elmo2RBD). Nous avons ainsi démontré qu’en présence d’Elmo2EID, la capacité de fusion est augmentée et des fibres musculaires plus larges sont développées. De plus, la régénération musculaire est plus efficace chez ces souris. À l’opposé, lorsqu’Elmo2 a perdu l’activité de son domaine RBD (Elmo1KOElmo2RBD), des fibres musculaires plus étroites sont retrouvées chez les jeunes souris adultes ainsi qu’une régénération du muscle moins efficace. Finalement, nous avons démontré que l’augmentation de l’activité de la voie Elmo2-Dock1-Rac1, directement via le contrôle de la régulation conformationnelle d’Elmo2, améliore les phénotypes dystrophiques retrouvés chez les souris DysferlinKO, un modèle récapitulant la dystrophie musculaire des ceintures de type 2B (LGMD2B). Ainsi, pour la première fois, nous avons établi la possibilité d’exploiter la fusion des myoblastes en tant que thérapie régénérative pour des maladies musculaires. Pour le deuxième objectif, nous avons étudié Elmo3 dans un cas clinique dans le cadre d’une collaboration internationale. Plus précisément, des mutations bi-alléliques dans le gène Elmo3 ont été identifiées chez un jeune patient atteint d’une déficience intellectuelle. En effectuant des études biochimiques et fonctionnelles, nous avons démontré que ces mutations ont un impact sur l’activation de Rac1, sans toutefois influencer l’interaction entre les protéines du complexe Elmo3/Dock1. Cette étude apporte les premières évidences de fonctions biologiques pour Elmo3. Pour conclure, nos études ont permis de souligner l’importance d’un control approprié de la régulation conformationnelle d’Elmo. En effet, en manipulant cette régulation dans un modèle de muscle squelettique, via l’introduction d’une mutation maintenant la protéine dans une conformation ouverte, cela a permis un effet positif sur la fusion des myoblastes et sur la régénération musculaire, menant à l’amélioration des phénotypes de dystrophie musculaire.   l’opposé, la présence chez l’humain de mutations dans Elmo peut également affecter l’activation de Rac1 par Dock1, contribuant ainsi à une déficience intellectuelle chez le porteur. / The scaffold proteins Elmo forms a complex with guanine nucleotide exchange factors (GEFs) of the Dock family. The Elmo/Dock complex is characterized with a conformational regulation and at the basal level, the complex is found in a closed state, owing to the presence of contact sites blocking the binding of Elmo interactors and the GEF activity of Dock for the activation of Rac1. In their activated state, the complex adopts an open conformation and Elmo binding sites will be available. For example, binding of the GTPases RhoG or Arl4A to the RBD domain of Elmo has been shown to induce the recruitment of the complex at the cell membrane. Likewise, the DHR- 2 domain of Dock being available, the GTPase Rac1 will then be specifically activated by Dock and thus induce the remodeling of the actin cytoskeleton. Various cellular processes will then be triggered, such as cell migration, phagocytosis and muscle cell (named myoblast) fusion. In this thesis, we have emphasized the importance of the conformational regulation of Elmo by achieving two objectives. For the first objective, we studied the conformational regulation of Elmo during myogenesis, i.e. during the establishment of skeletal muscle. The formation of multinucleated myofibers is fundamental for skeletal muscle. During this process, myoblast fusion is a key step to allow the development as well as the regeneration of the muscle. In order to study Elmo in this in vivo context, we generated a series of mouse models. First, through the generation of double knockout mice for Elmo1 and Elmo2 (Elmo1KOElmo2cKO), we demonstrated the essential function of Elmo during embryonic myoblast fusion. Indeed, only mononucleated myofibers are observed following the genetic inactivation of Elmo1 and Elmo2. Subsequently, we also generated knockin mouse lines, where mutations were introduced in specific domains of Elmo to induce its opened (Elmo2EID) or closed (Elmo2RBD) conformation. Thus, we have demonstrated that when Elmo2EID is expressed, the fusion capability is increased and the myofibres are larger. Moreover, muscle regeneration is more efficient in these mice. At the opposite, when Elmo2 has lost its RBD activity (Elmo1KOElmo2RBD), smaller myofibers are observed as well as a less efficient muscle regeneration. Finally, we demonstrated that increasing the Elmo-Dock1-Rac1 pathway activity, directly through the control of the conformational regulation of Elmo, leads to the improvement of the dystrophic phenotypes found in DysferlinKO mice, a mouse model of the limb-girdle muscular dystrophy type 2B (LGMD2B). Thus, for the first time, we have established the possibility of exploiting myoblast fusion as a regenerative therapy for muscle diseases. For the second objective, we studied Elmo3 in a clinical case, as part of an international collaboration. More specifically, biallelic mutations in Elmo3 gene have been identified in a young patient with intellectual disability. Through biochemical and functional studies, we have shown that the mutations have an impact on the activation of Rac1, without however affecting the interaction between the proteins of the Elmo3/Dock1 complex. This study provides the first evidence of biological functions for Elmo3. In conclusion, our study has emphasis the relevance of the proper control of the conformational regulation of Elmo. In fact, by manipulating this regulation in a skeletal muscle model, through the introduction of a specific mutation promoting the open conformation of Elmo, it promotes myoblast fusion and induce a more efficient muscle regeneration, thus improving the dystrophic phenotypes. In contrast, the presence of human mutations in Elmo can also affect the activation of Rac1 by Dock1, hence contributing to intellectual disability in the carrier.