L'activation chronique du stress du réticulum endoplasmique (RE) est une caractéristique commune à de nombreux cancers. De façon générale, toutes perturbations susceptibles d'induire une altération de l'homéostasie protéique activent un stress du RE. Afin de s'adapter, les cellules mettent en place une réponse nommée UPR pour Unfolded Protein Response. Ce programme d'adaptation est relayé par trois protéines localisées dans la membrane du RE (i) la protéine IRE1 (Inositol Requiring Enzyme 1) (ii) le facteur de transcription ATF6 (Activating Transcription Factor 6) (iii) la protéine kinase PERK (PKR-like Endoplasmic Reticulum Kinase). Parmi ces protéines, IRE1 est la seule à être conservée au cours de l'évolution. Elle possède deux activités enzymatiques, sérine/thréonine kinase et endoribonucléase. Sa cible la plus connue est l'ARNm de XBP1 (X-box Binding Protein 1) qui subit un épissage non conventionnel cytoplasmique conduisant à un décalage de phase. Ainsi, l'ARNm est traduit en un facteur de transcription actif, XBP1s (s,spliced). Le rôle de l'UPR a été particulièrement étudié dans les cancers solides. En revanche, les connaissances actuelles sur le rôle précis du stress du RE en général, et de la voie IRE1/XBP1 en particulier dans hémopathies malignes sont extrêmement parcellaires. Une étude clinique démontre que l'expression de XBP1s est corrélée à un meilleur pronostic chez les patients atteints de leucémies aiguës myéloïdes (LAMs). Cependant aucune étude fonctionnelle ne permet actuellement d'expliquer cette corrélation. Afin d'appréhender le rôle de XBP1, nous avons donc mis en place un modèle d'expression inductible dans des cellules leucémiques. L'étude de ce modèle a permis de mettre en évidence une chimiosensibilité accrue à l'aracytine, la doxorubicine et l'étoposide dans les cellules exprimant XBP1s. Nous avons pu démontrer que l'activation spécifique de la voie XBP1 active une réponse apoptotique et inhibe la croissance tumorale dans un modèle de xénogreffe. De façon à caractériser les mécanismes moléculaires sous-jacents et de mettre en évidence de nouvelles cibles, nous avons réalisé une expérience d'immunoprécipitation de la chromatine suivi d'un séquençage. Nous avons pu ainsi identifier le long ARN non codant MIR22HG, précurseur du microARN 22 comme étant une cible directe de XBP1. De nombreuses cibles caractérisées de ce microARN se classent dans la catégorie des oncogènes. Parmi ces cibles la Sirtuine 1 est surexprimée chez les patients et jouerait un rôle pro-survie dans la réponse aux dommages à l'ADN intervenant ainsi dans la résistance au traitement. Ces résultats suggèrent que le microARN 22 pourrait être un marqueur prédictif de la réponse au traitement dans les LAMs. Dans un second temps, nous avons étudié la régulation de XBP1 par un oncogène majeur, FLT3-ITD (Fms-Like Tyrosine kinase-3 receptor - Internal Tandem Duplication) et mis en évidence un mécanisme de rétrocontrôle inattendu entre ces deux acteurs, suggérant ainsi que l'expression de XBP1 peut être dérégulée dans les LAM. Ainsi l'ensemble de nos résultats permet d'appréhender le rôle et la régulation de XBP1 dans leucémies aiguës myéloïdes et pourrait, à terme, permettre de développer de nouveaux biomarqueurs utiles dans la prise en charge des patients atteints de LAM. / Endoplasmic reticulum stress activation is a common feature of cancer cells. Generally, endoplasmic reticulum (ER) stress is triggered by any situation inducing an accumulation of misfolded proteins in the ER. To cope with these perturbations, cells set off a conserved and adaptive intracellular signaling known as UPR or Unfolded Protein Response. UPR involves the activation of three sensors which are transmembrane proteins of ER (i) IRE1 (Inositol Requiring Enzyme 1), (ii) ATF6 (Activation Transcription Factor 6) and (iii) PERK (PKR-like Endoplasmic Reticulum Kinase). IRE1 is the most conserved branch of the three pathways and signals through two catalytic domains: a kinase and an RNAse L like endoribonucleolytic domains. Its most described target is the mRNA of the transcription factor XBP1 (X-box Binding Protein). IRE1 participates to the non-conventional splicing of XBP1 mRNA (XBP1s,spliced) leading to a frameshift and the expression of a potent transcription activator. In solid tumors, the implication of ER stress has been well characterized; however, the current knowledge on the precise role of the UPR in hematological malignancies, notably in leukemia, is extremely poor. A clinical study conducted by Schardt et al. highlighted a correlation between XPB1s activation and a favorable prognosis in acute myeloid leukemia (AML). Firstly, in order to decipher on the role of XBP1, we set up a model enabling the inducible expression of XBP1s in leukemic cells. In this model, XBP1s expression potentiates the effect of chemotherapeutic treatments, aracytine, doxorubicin and etoposide. We also report that XBP1s expression induces apoptosis and inhibits tumor growth in xenograft model. In order to characterize molecular mechanism and new targets, we perform a chromatin immunoprecipitation followed by sequencing. We thus identify the long non-coding MIR22HG, precursor of the microRNA 22 as a direct XBP1 target gene. Many miR-22 targets are classified as oncogenes. Among these targets, Sirtuin 1 is overexpressed in AML patients and could act as a pro-survival factor upon DNA damages, causing drug resistance. These results suggest that miR-22 could be a potent chemotherapeutic response biomarker in AML patients. Secondly, we study XBP1 regulation by the major AML oncogene FLT3-ITD (Fms-Like Tyrosine kinase-3 receptor - Internal Tandem Duplication) and highlight an unexpected feedback mechanism suggesting that XBP1 expression could be deregulated in AML. Taken together these results enable a better understanding of the role and regulation of XBP1 in acute myeloid leukemia and could, in the longer term, enable the development of new useful biomarkers in the management of patients.

Les bactéries intracellulaires Wolbachia ont développé une vaste gamme d’interactions symbiotiques, du parasitisme reproductif au mutualisme chez les arthropodes terrestres et les nématodes filaires, devenant ainsi les endosymbiotes les plus répandus sur terre. Bien qu’elles se développent lentement dans les cultures cellulaires d’insectes pour lesquelles les marqueurs sont limités et qu’elles ne sont génétiquement pas manipulables, il existe un intéret croissant de déchiffrer leur mode de vie intracellulaire pour 2 raisons. Premièrement, Wolbachia intervient dans le développement et la transmission des arbovirus et deuxièmement, les filarioses lymphatiques sont traitables grâce à la susceptibilité des Wolbachia qui infectent les nématodes filaires aux antibiotiques. Au début de ce projet, j’ai infecté 2 lignées cellulaires de Drosophila melanogaster qui sont transcriptomiquement divergentes par une même souche de Wolbachia pouvant naturellement infecter Drosophila melanogaster. J’ai utilisé ces 2 lignées cellulaires qui sont différentiellement permissive à l’infection pour explorer l’interaction de Wolbachia avec le réticulum endoplasmique. Les observations par microscopie à fluorescence en temps réel et par microscopie électronique prouvent que cet organite est une source de membranes pour Wolbachia et possiblement, une source de nutriments. Pourtant, les analyses d’expression génique et les approches d’immunofluorescence démontrent que Wolbachia n’induit ni un stress au niveau du réticulum endoplasmique ni une protéolyse via la voie de signalisation ERAD suggérant dès lors, que Wolbachia subvertissent d’autres mécanismes pour assurer leur besoin en acides aminés. Au cours de ce projet, j’ai commencé à mettre en place une technique pour transformer Wolbachia par biolistique. La validation de cette technique de transformation a ouvert la voie vers l’optimisation de la procédure de sélection des transformants pour enfin pouvoir génétiquement manipuler Wolbachia. / The intracellular bacteria Wolbachia have developed a wide range of symbiotic interactions, from being opportunistic reproductive parasites to mutualists with terrestrial arthropods and filarial nematode species, making them the most common endosymbionts on earth. The discovery that they interfere with arboviruses development and transmission by mosquito vectors and that filarial diseases can be cured by targeting Wolbachia, have created a strong interest in deciphering the mechanisms underlying their intracellular lifestyle. However, being obligate intracellular endosymbionts, Wolbachia remain genetically intractable. They grow slowly in insect cell cultures, for which markers are limited. Despite these obstacles, and to limit cell line-specific phenotypes, I chose to infect 2 Drosophila melanogaster cell lines presenting different sets of expressed genes, with a unique Wolbachia strain, naturally hosted by Drosophila melanogaster. Using these 2 cell lines that are differently permissive to the infection, I explored the interaction of Wolbachia with the endoplasmic reticulum (ER). Through fluorescence time-lapse confocal and electron microscopy observations, I provide strong evidence that this organelle is the source of membrane for Wolbachia, and possibly a source of nutrients. However, gene expression analyses and immunofluorescence approaches demonstrate that Wolbachia do not induce ER stress nor an increased ERAD- induced proteolysis, suggesting; unlike previously reported, that Wolbachia salvage amino acids by other subversion mechanisms. Additionally, I pioneered biolistic bombardement of Wolbachia-infected cells and the validation of this transformation technique has paved the way towards optimization of transformant selection steps and ultimately to the genetic engineering of Wolbachia.

La contraction du muscle cardiaque et squelettique est activée par la libération du calcium (Ca²[indice supérieur +]) du réticulum sarcoplasmique (RS), en réponse à la dépolarisation du sarcolemme pendant la propagation du potentiel d'action (PA) le long des tubules transverses (tubules T). Ce processus s'appelle le couplage excitation-contraction (couplage EC). Le couplage EC dans le muscle cardiaque est différent de celui squelettique en ce sens qu'il nécessite du Ca²[indice supérieur +] extracellulaire ce qui n'est pas le cas dans le couplage EC dans le muscle squelettique. Le but de mon projet de Maîtrise a été principalement de développer et de perfectionner une nouvelle méthode de mesure de la concentration totale de Ca²[indice supérieur +] dans le muscle cardiaque et le muscle squelettique ([Ca[indice inférieur T]]MUSCLE) de différentes espèces (rats, souris et grenouilles); dont la plus grande fraction est emmagasinée à l'intérieur du RS. Cette mesure quantitative a pour objectif à long terme, dans le cas du muscle cardiaque de comprendre les résultats apparemment contradictoires concernant le mécanisme principal de couplage EC et dans le cas du muscle squelettique, de confirmer que la concentration totale de Ca²[indice supérieur +] dans la préparation des cellules isolées correspond au niveau physiologique. De surcroît, dans ce dernier cas, la [Ca[indice inférieur T]]MUSCLE dans les fibres musculaires squelettiques de grenouille obtenu avec la technique de EGTA-Rouge de phénol effectué par Pape et al. (1995) est similaire à celle obtenue à partir de cette nouvelle méthode dans le muscle squelettique entier. Les résultats obtenus en relation avec le poids du muscle sur les souris C57BL6 montrent qu'il y a une grande dépendance du contenu total de Ca²[indice supérieur +] sur le poids du muscle. En effet, le poids du muscle varie de 12.7 mg à 5.2 mg ce qui correspond à 1.34 mM et 4.14 mM respectivement. Ces résultats suggèrent la possibilité d'un mécanisme pour la régulation du [Ca[indice inférieur T]]MUSCLE où le plus petit muscle augmente [Ca[indice inférieur T]]MUSCLE afin d'augmenter sa force spécifique (force normalisée pour la grandeur) pour produire une force similaire aux muscles plus grands. La calséquestrine est une protéine qui tamponne le Ca²[indice supérieur +] à l'intérieur du RS est la source principale de Ca²[indice supérieur +] impliquée dans le couplage EC. En effet, Fenelon et al. (2012) ont estimé que 95% du Ca²[indice supérieur +] dans le RS est lié, avec 5% dans le forme libre (i.e. Ca²[indice supérieur +]), et que plus de 80% du Ca²[indice supérieur +] lié paraît être associé avec la calséquestrine. La raison principale pour développer cette nouvelle méthode a été d'évaluer si le contenu total de Ca intracellulaire est largement réduit dans les muscles KO en CSQ afin de mieux résoudre la controverse sur ce sujet. Contrairement à nos attentes [Ca[indice inférieur T]]MUSCLE a été proche de 2mM dans les muscles contrôles, ce qui est proche de la moyenne mesurée pour les muscles KO en CSQ. Notre hypothèse est qu'il y a une "uprégulation" d'une ou plusieurs protéines de liaison de Ca²[indice supérieur +] dans le RS.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le facteur de transcription Androgen Induced-bZIP (AlbZIP) est un membre de la famille ATF/CREB, plus précisément de la sous-famille CREB3. Sa découverte remonte au début des années 2000 où sa régulation par les androgènes fut démontrée, de même que son expression abondante dans le tissu prostatique. À l'image des facteurs ATF/CREB, AlbZIP possède un domaine d'activation de la transcription en N-terminal, un domaine bZIP et un domaine transmembranaire lui permettant de s'ancrer dans la membrane du reticulum endoplasmique. La structure et la localisation d'AIbZIP suggèrent qu'il puisse être clivé par le mécanisme Regulated Intramembrane Proteolysis (RIP) un mécanisme de clivage auquel sont soumis des facteurs ATF/CREB tels qu'ATF6. Ce clivage survient suite à un stress du reticulum endoplasmique (RE) qui peut être causé par différents stimuli qui perturbent l'homéostasie du RE. Les travaux présentés dans cette thèse visent l'identification de la fonction d'AIbZIP dans le stress du reticulum endoplasmique des cellules prostatiques cancéreuses. Mes objectifs étaient de découvrir des stimuli capables d'induire son clivage et d'identifier et de caractériser ses cibles transcriptionnelles suite à sa translocation au noyau. J'ai d'abord modifié le système d'expression inductible RheoSwitch et j'ai caractérisé son effet sur les cellules prostatiques cancéreuses LNCaP. Ce système s'est avéré être un outil efficace puisqu'il n'affecte pas le phénotype des LNCaP et il a été essentiel à la réalisation des travaux sur AlbZIP. J'ai ensuite mis en évidence le clivage d'AIbZIP par des agents qui causent une diminution de la concentration calcique au RE. Le système RheoSwitch modifié a permis de produire des cellules exprimant une forme active recombinante d'AIbZIP qui ont servi à la réalisation de micropuces Affymetrix. Ces puces ont permis l'identification des gènes cibles d'AIbZIP tel que le facteur de transcription CREB3. AlbZIP active l'expression de CREB3 par le biais d'éléments de réponse similiares à ERSE et CRE situés dans le promoteur du gène. Lors du traitement des cellules LNCaP avec l'ionophore de calcium A23187, on observe successivement le clivage d'AIbZIP, l'induction de l'expression de CREB3 et son clivage, ce qui suggère une chronologie dans l'activation des deux facteurs. La réponse au stress débute donc avec la forme active d'AIbZIP, suivie d'une co-existence des formes nucléaires d'AIbZIP et CREB3 pour se terminer par la présence de CREB3. CREB3 est en mesure d'activer sa propre transcription. Le stress causé par A23187 est en mesure d'activer AlbZIP et CREB3 qui se trouvent alors seuls ou simultanément au noyau. Il est donc possible qu'ils partagent des cibles communes, tout en ayant leurs cibles uniques, ce qui devra être élucidé pour clarifier leurs rôles respectifs dans la réponse au stress des LNCaP.

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative incurable. Environ 10% des cas de SLA sont familiaux (SLAF) et 90% sont sporadiques (SLAS). À l'heure actuelle, des mutations dans les gènes SOD1 et TARDBP demeurent parmi les principales causes de SLAF. Plusieurs évidences tendent à attribuer aux facteurs environnementaux une place de plus en plus importante dans l'identification de causes probables de la SLAS. Cependant, notre compréhension des mécanismes menant à des anomalies dans ces gènes ou à l’exposition à divers facteurs environnementaux et à la mort des neurones moteurs reste limitée. À ce jour, aucun traitement efficace n’a encore été décrit pour la SLA. C’est pourquoi le développement d’une immunothérapie avec des anticorps anti-SOD1 mal repliée spécifiques nous permettra de mieux comprendre les mécanismes et les causes environnementales susceptibles d’être impliqués dans la SLAS. Ceci ouvrira de nouvelles perspectives diagnostiques et thérapeutiques pour le traitement de cette maladie encore incurable. / Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease. About 10% of cases are familial (FALS) and 90% are sporadic (SALS). Currently, mutations in SOD1 and TARDBP genes are among the main causes of FALS. Many evidences suggest that environmental factors can be an important element in the identification of probable SALS causes. However, our comprehension of mechanisms leading to mutations in these genes or exposure to different environmental factors, to the death of motor neurons is still limited. Currently, there is not efficient cure for ALS. The development of an immunotherapy with specific anti-misfolded SOD1 antibodies will therefore help us to understand the mechanisms and environmental factors that may be involved. This can lead to new perspectives for early diagnosis and prognosis, and new therapeutic approaches for this yet incurable disease.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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