Submitted by Alison Vanceto (alison-vanceto@hotmail.com) on 2017-02-21T12:43:27Z No. of bitstreams: 1 DissMCD.pdf: 3338735 bytes, checksum: a38bd4887b4213867a0c295a634f94c1 (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ronisp@ufscar.br) on 2017-04-24T11:24:18Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissMCD.pdf: 3338735 bytes, checksum: a38bd4887b4213867a0c295a634f94c1 (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ronisp@ufscar.br) on 2017-04-24T11:24:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissMCD.pdf: 3338735 bytes, checksum: a38bd4887b4213867a0c295a634f94c1 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-24T11:31:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissMCD.pdf: 3338735 bytes, checksum: a38bd4887b4213867a0c295a634f94c1 (MD5) Previous issue date: 2016-08-08 / Não recebi financiamento / Although effective, current vaccinations against rabies, one of the most lethal infectious diseases in the world, present security issues of administration and production costs. In this scenario, modern biotechnology has become a source of new alternatives of great interest for vaccine production. The main antigen capable of conferring neutralizing immune response against infection by rabies virus is the glycoprotein of rabies virus (RVGP), which the production by recombinant DNA technology has been developed by researchers at the Viral Immunology Laboratory (LIV) of the Butantan Institute of São Paulo using various expression systems in Drosophila melanogaster S2 cells. One of the latest developments is S2MtRVGP-H-His cell line, obtained by stable transfection with plasmids containing cDNA from other components of RVGP and histidine tag to facilitate purification, both under control of the inducicle metallothionein promoter. This work aims to study the kinetic characteristics of cell growth and production of recombinant glycoprotein rRVGP rabies virus strain of Drosophila melanogaster S2MtRVGP-H-His, in order to evaluate the potential of a bioreactor with agitation induced by waves (Wave) for the scale-up production of rRVGP. The first stage of the study, involving batch cultures in 20 mL Schott bottle with commercial culture medium Sf900-III, allowed us to determine the optimal temperature of cultivation (28ºC), time of induction of expression (72 h), the specific growth rate ranging from 0.022 to 0,034 h-1; maximum cell density 1.82×107 cel.mL-¹ and rRVGP produced from 0.07 to 0.99 μg.mL-1. Based on these results, was started the second part of the study performed in the Single-use Wave bioreactor, involving batch cultures with 650 mL of Sf900-III, with 60% of dissolved oxygen and pH ranging without control from 6.2 to 7.0. The culture in the bioreactor showed maximum specific growth rate of 0,035 h-1, maximum cell density was 1.1×107cel.mL-¹ and RVGP produced 0.85 μg.mL-1. The production of large scale rRVGP with S2MtRVGP-H-His cells using the Wave bioreactor has shown to be viable, reproducible and with high potential to scale-up. / Embora eficazes, as vacinas atuais contra a raiva, uma das doenças infecciosas mais letais do mundo, apresentam problemas relacionados com a segurança de administração e o custo de produção. Nesse contexto, a biotecnologia moderna se torna uma fonte de alternativas inovadoras de grande interesse para produção de vacinas. O principal antígeno capaz de conferir uma resposta imunológica neutralizante contra o vírus rábico é a glicoproteína do vírus da raiva (RVGP), cuja produção por tecnologia de DNA recombinante vem sendo desenvolvida por pesquisadores do Laboratório de Imunologia Viral (LIV) do Instituto Butantan de São Paulo, utilizando vários sistemas de expressão em células de Drosophila melanogaster S2. Um dos mais recentes desenvolvimentos é a linhagem S2MtRVGP-H-His, obtida mediante transfecção estável com plasmídeos contendo entre outros componentes o cDNA da RVGP e a cauda de histidina para facilitar a purificação, ambos sob controle do promotor indutível da metalotioneína. O presente trabalho tem como objetivo o estudo de características cinéticas de crescimento celular e de produção de glicoproteína recombinante do vírus da raiva rRVGP da linhagem de Drosophila melanogaster S2MtRVGP-H-His com vistas a avaliação do potencial de um biorreator com agitação induzida por ondas (waves) para escalonamento da produção de rRVGP. A primeira etapa dos trabalhos, envolvendo cultivos em batelada em frasco Schott com 20 mL de meio de cultura comercial Sf900-III, permitiu a determinação da temperatura ideal (28ºC), o tempo apropriado de indução da expressão (72 h) e das velocidades específicas de crescimento de 0,022-0,034 h-1, densidade celular máxima de 1,82×107 cel.mL-¹ e rRVGP produzida de 0,07-0,99 μg.mL-1. Com base nesses resultados, iniciou-se a segunda parte dos trabalhos com cultivos em biorreator Wave utilizando 650 mL de meio Sf900-III, com concentração média de oxigênio dissolvido de 60% da saturação com ar e pH variando sem controle de 6,2-7,0. O cultivo no biorreator apresentou velocidade específica máxima de crescimento de 0,035 h-1, densidade celular máxima de 1,1×107 cel.mL-¹ e rRVGP produzida de 0,85 μg.mL-1. A produção da rRVGP em larga escala com células S2MtRVGP-H-His utilizando o biorreator Wave mostrou ser uma alternativa viável, reprodutível e com grande potencial de escalonamento.

Orientador: Jane Megido / Banca: Hélio Langoni / Banca: Maria Luiza Carrieri / Banca: Marcos Bryan Heinemann / Banca: Paulo Eduardo Brandão / Resumo: O controle da raiva é mundialmente reconhecido como um dos grandes desafios mundiais. As diferentes variantes virais isoladas das diversas espécies animais apresentam características imunogênicas distintas assim como na sequência de nucleotídeos, o que permite sua classificação em variantes e genótipos. Além disso, diferenças na patogenicidade também foram observadas através de inoculação experimental em camundongos e cultivo celular. Os mecanismos pelos quais o vírus rábico (RABV) infecta um indivíduo e se perpetua na natureza ainda não foram totalmente esclarecidos. Entretanto alguns fatores que levam ao sucesso da infecção já foram estabelecidos, entre os mais importantes podemos citar a capacidade de induzir a apoptose das células de defesa e preservar a integridade e funcionalidade dos neurônios. Estes eventos são mediados por citocinas que regulam diversos genes envolvidos nesse complexo processo ainda pouco compreendido. Considerando a diversidade de linhagens virais circulantes e a complexidade dos eventos envolvidos na neuroinvasão do RABV o presente projeto avaliou os genes mais importantes envolvidos na expressão gênica do processo de resposta immune inata e adaptativa após infecção e avaliou a patogenicidade de diferentes amostras virais através da inoculação experimental em camundongos SPF (Specific Pathogen Free) realizando a quantificação viral por qRT-PCR e imunofluorescência das amostras coletadas / Abstract: Rabies control is considered a worldwide challenge. Different virus strains (RABV) are isolated from different species, they have distinct immunogenic characteristics as well in their nucleotides sequence, allowing their classification into variants and genotypes. Furthermore, differences in pathogenicity have also been observed through experimental inoculation in mice and cell cultures. The mechanisms by which RABV infects an individual and perpetuated the infection in nature have not been fully clarified. However some factors that lead to successful infection are already established, among the most important we can mention the ability to induce apoptosis of T cells and maintain the integrity and functionality of neurons. These events are mediated by cytokines that regulate several genes involved in this complex process still poorly understood. Considering the diversity of viral strains circulating and the complexity of events involved in the neuroinvasiveness of RABV this project aims to study the gene expression pathway, innate and adaptative immune response and pathogenicity of different virus strain by means of experimental inoculation in mice, clinical evaluation and avaliating viral replication by DFA and qRT-PCR / Doutor

Orientador: Jane megid / Banca: Hélio Langoni / Banca: Paulo Eduardo Brandão / Banca: Marcos Bryan Heinemann / Resumo: A raiva é uma doença infecciosa letal que mata mais de 55 mil pessoas por ano em todo o mundo, embora a morte possa ser evitada se um tratamento pósexpositivo baseado no uso de vacina anti-rábica e imunoglobulinas for aplicado a tempo. Após o aparecimento dos sinais clínicos, não existe qualquer terapia eficaz disponível. As citocinas e quimiocinas são cruciais no desenvolvimento da resposta imune do hospedeiro. Este estudo teve como objetivo avaliar a expressão gênica de citocinas e quimiocinas relacionadas à resposta imune e também avaliar a eficácia da terapia com siRNAs em camundongos inoculados com virus de cão ou de morcego. Os resultados demonstraram que o perfil de expressão de citocinas e quimiocinas foi intrínseco 'a variante viral e a produção precoce destas sugere ser mais importante do que seus níveis de expressão para a sobrevivência na raiva. Em relação à avaliação da terapia com siRNAs, embora nenhuma diferença tenha sido observada na taxa de letalidade entre os grupos tratados e não-tratados, a avaliação clínica de animais inoculados com a variante de cão mostrou menor severidade da doença clínica no grupo tratado quando comparado ao seu controle, associado a uma baixa expressão do gene N e de todos os marcadores imunológicos avaliados aos 5 dias. Os resultados deste estudo forneceram alguma evidência da eficácia da terapia com siRNA em infecções causadas pela variante de cão, a despeito da causada pela variante de morcego / Abstract: Rabies is a lethal infectious disease that kills more than 55 thousand persons per year worldwide although death can be avoided if a post-exposure prophylaxis based in anti-rabies vaccine and immune globulins can be applied on time. After the onset of clinical signs, there is no effective therapy available. Cytokines and chemokines are crucial for host immune response development. This study had as purpose to evaluate the gene expression of cytokines and chemokynes related to the immune response and also to evaluate the efficacy of siRNAs therapy in mice inoculated with dog or bat virus. Results demonstrated that the gene expression profile was intrinsic to virus variant and the precocious production seemed to be more important than their expression levels for rabies survival. Therapy with siRNAs therapy showed no difference in the lethality rate between treated groups and controls but clinical evaluation of animals inoculated with dog variant showed less severity of clinical disease in the treated group compared with control, also associated with a low expression of N gene and of all immune markers evaluated at 5 days. Results provided some evidence of the efficacy of siRNAs therapy in infections due to dog variant but not due to bat variant in the present study / Mestre

Vírus da raiva provenientes de 23 morcegos de espécies hematófagas, frugívoras e insetívoras foram caracterizados geneticamente pelo seqüenciamento completo da região que codifica a nucleoproteína N. A análise filogenética das seqüências, incluindo lyssavirus e isolados de morcegos do Chile e Estados Unidos, mostrou que os diferentes isolados do vírus da raiva foram de modo geral segregados em quatro grupos genéticos distintas: morcegos hematófagos, morcegos insetívoros 1, 2 e 3. Os morcegos insetívoros 1 constituiram-se por isolados de Eptesicus furinalis: BR-EF1, BR-EF2, BREF3, BR-EF-4, BR-EA1 e BR-NL2; os morcegos insetívoros 2 consistiram de isolados de Molosssus spp: BR-MM1, BR-MM2 e BR- MA1 e os morcegos insetívoros 3 isolados de Nictinomops laticaudatus: BR-NL1 e BR-NL3. A homologia de nucleotídeos entre cada grupo de morcegos insetívoros 1, 2 e 3 foi maior que 99%, 97% e 99%, respectivamente. O grupo de morcegos hematófagos foi representado pelos isolados de: 3 morcegos hematófagos Desmodus rotundus (BR-DR1, BR-DR2 e BR-DR3); 5 morcegos frugívoros Artibeus lituratus BR-AL1, BR-AL2, BR-AL3, BR-AL4 e Artibeus planirostris BRAP1; 2 morcegos insetívoros (BR-MR1 e BR-EA2) e 2 de espécies não identificadas (BR-BAT1 e BR-BAT2). Entre as amostras seqüenciadas foram selecionadas cinco (BR-EF1, BR-NL1, BR-AL3, BR-MM1, BR-DR1) e um isolado de cão (BR-C) para os estudos de patogenicidade em camundongos albinos suíços inoculados pela vias intracerebral (IC) e intramuscular (IM). Todas as amostras quando inoculadas em camundongos pela via IC apresentaram-se patogênicas, provocando a morte dos mesmos num período de 4 a 14 dias pós-inoculação. No entanto, 500DLIC50 das mesmas amostras inoculadas pela via IM levaram a uma mortalidade de camundongos de: 60% (BR-DR1); 50% (BR-C, BR-NL); 40% (BR- AL3); 9,5% (BR-MM1); 5,2% (BR-EF10). As mesmas amostras foram utilizadas para a verificação de proteção cruzada, conferida por vacina comercial de uso animal, de camundongos que receberam uma ou duas doses de vacina pela via subcutânea (SC) e desafiados pelas vias IC e IM. Camundongos inoculados com duas doses de vacina foram protegidos quando desafiados pela via IC, com todas as amostras testadas. Quando os camundongos receberam uma dose da mesma vacina houve proteção parcial daqueles desafiados com as amostras de vírus PV e BR-C. Houve proteção de 100% dos camundongos desafiados pela via IM, com exceção daqueles vacinados com uma dose de vacina e desafiados com a amostra PV que apresentaram um índice de 66% de sobreviventes. Os resultados indicam a possibilidade de existir variantes do vírus da raiva espécies específicas circulando em morcegos. Sugerem ainda, que espécies de morcegos hematófagos, frugívoros e insetívoros compartilham o mesmo polimorfismo de vírus. A vacina comercial contra a raiva contendo vírus inativado e de uso veterinário protegeu os camundongos contra o desafio com as diferentes amostras testadas, sugerindo que as vacinas usualmente utilizadas são efetivas no tratamento profilático da raiva transmitida por morcegos, apesar da marcada diferença de neurovirulência dos diferentes isolados quando inoculados em camundongos pela via IM. / Twenty-three rabies viruses isolated from hematophagous, frugivorous and insectivorous bats were characterized genetically by complete sequencing of the region coding the nucleoprotein N. The phylogenetic analysis of the sequences, including the lyssavirus and the bat isolates from Chile and USA revealed that the isolates were segregated into four distinct genetic lineages: those related to the vampire bats and to the insectivorous bats 1, 2 and 3. The isolates related to the insectivorous bats 1 were from the Eptesicus furinalis: BR-EF1, BR- EF2, BREF3, BR-EF-4, BR-EA1 e BR-NL2; those of the insectivorous bats2 included the isolates from Molosssus spp: BR-MM1, BR-MM2 and BR-MA1 and the group 3, by the isolates from the Nictinomops laticaudatus: BR-NL1 and BR-NL3. The homology among each group of the insectivorous bats 1, 2 and 3 were greater than 99%, 97% and 99%, respectively. The lineage related to vampire bats was represented by three isolates from the D. rotundus (BR-DR1, BR-DR2 e BR-DR3); five from the fruit bats Artibeus lituratus (BR-AL1, BR-AL2, BR-AL3, BR-AL4) and Artibeus planirostris (BRAP1); two from insectivorous bats (BR-MR1 and BR-EA2) and two from unidentified species (BR-BAT1 and BR-BAT2). Among the sequenced amples, five bat isolates (BR-EF1, BR-NL1, BR-AL3, BR-MM1, BR- DR1) and one dog isolate (BR-C) were selected for the study of their pathogenicity in Swiss mice, inoculating through intracerebral (IC) and intramuscular (IM) routes. All the isolates, when inoculated via IC, were pathogenic, provoking death in 4 - 14 post inoculation days. However, mice inoculated with 500ICLD50 of the same isolates through IM route were found with different death rates: 60.0% (BR-DR1); 50.0% (BR-C, BR-NL); 40.0% (BR-AL3); 9.5% (BR-MM1) and 5.2% (BR-EF10). The same isolates were used for the assessment of cross protection conferred by a commercial vaccine of veterinary use. The mice were vaccinated subcutaneously, receiving either one or two shots of vaccine, and challenged through IC and IM routes. Mice receiving two shots were protected against all the isolates, when challenged intracerebrally. Mice receiving one shot were found only partially protected against the challenge with the fixed PV strain and BR-C isolate. Mice challenged intramuscularly showed 100.0% of protection, with the exception of those vaccinated with one dose and challenged with PV strain, which were found with 66.0% of survivors. These results indicate the possibility of the existence of rabies virus variants circulating in different species of bat population. The data also suggest that the vampires, frugivorous and insectivorous bats share the same lineage of rabies viruses. The commercial vaccine has protected the mice against the challenge with different rabies virus isolates, suggesting that the vaccines usually employed in the field are effective, although some marked difference in neurovirulence by IM inoculation was found among the isolates tested.

Analisou-se 54 amostras de vírus da raiva isoladas de diferentes espécies animais e de seres humanos do Estado do Maranhão, inicialmente pelas técnicas tradicionais de imunofluorescência direta (IFD) e de inoculação intracerebral em camundongos (ICC), com o objetivo de realizar um estudo de epidemiologia da doença. No reteste, todas as amostras foram positivas na IFD e 19 resultaram negativas à ICC. O comportamento biológico dos isolados foi estudado em camundongos, revelando um período de incubação entre 7 e 17 dias, com sinais clínicos variados e duração média de 4 dias. Para a avaliação da patogenicidade, foram selecionadas cinco amostras do estudo, oriundas de diferentes espécies, como vírus de desafio nos camundongos imunizados com uma vacina comercial de vírus inativado. Os resultados do desafio indicaram que a proteção conferida pela vacina foi baixa para todas as amostras. A presença de anticorpos no soro dos camundongos vacinados foi demonstrada em diferentes períodos de vacinação. A tipificação antigênica de quatro amostras de vírus foi realizada pela imunofluorescência indireta (IFI) utilizando um painel de anticorpos monoclonais (MAbs) procedentes do Canadian Food and Inspection Agency, Ottawa, Canadá, identificando o perfil correspondente à variante de morcego hematófago Desmodus rotundus. Na caracterização genética com base nos genes que codificam a glicoproteína G e nucleoproteína N, observou-se que os isolados foram divididos em dois grupos genéticos independentes associados a ciclos endêmicos distintos. Esses resultados permitem concluir que no Estado do Maranhão circulam pelo menos duas variantes do vírus da raiva, mantidas por carnívoros terrestres e morcegos hematófagos. Destaca-se que houve variação regional entre as amostras isoladas em diferentes áreas geográficas. Além disso, foram constatados hospedeiros inesperados nos clados formados. Também, não houve variação temporal nas amostras pesquisadas. / Fifty four rabies virus samples isolated from different animal species and humans, diagnosed positive by means of the direct fluorescent antibody test (dFA) and mouse inoculation test (MIT) in the State of Maranhão were selected for an epidemiologic study. In the retest, all these samples were dFA-positive, but 19 were negative by the MIT. The biologic behavior of these samples was assessed in mice by intracerebral inoculation and the incubation period was between 7 and 17 days, showing varied clinical signs with an average duration of 4 days. For the evaluation of the pathogenicity, five rabies viruses isolated from different species were selected, and used as the challenge viruses to be inoculated into mice been vaccinated previously with an inactivated commercial rabies vaccine. The results of the challenge experiments indicated low protection of the vaccine against the challenge viruses. The presence of rabies antibody was demonstrated in the sera of vaccinated mice taken at different intervals after vaccination. The antigenic typing was performed in four samples by using the indirect fluorescent antibody test (IFI) with a panel of monoclonal antibodies (MAbs) provided by the Canadian Food and Inspection Agency, Ottawa, Canada, and the profile identified was closely related to that of the Desmodus rotundus vampire bat. The genetic characterization based on genes coding the glycoprotein G and nucleoprotein N genes indicated that isolates were divided into two independent genetic groups associated to distinct endemic cycles. With the results obtained, we conclude that in the State of Maranhão there are circulating at least two distinct variants of rabies viruses, maintained by terrestrial carnivores and vampire bats. Regional variation among the isolates taken from different geographic areas has been found. And the rabies virus isolates grouped into clades were associated with unusual host species and no temporal variation was observed among the isolates.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_lorena_leonardo_souza.pdf: 798251 bytes, checksum: b0213429356f32517eb7b25ac76b2eeb (MD5) Previous issue date: 2009-12-17 / The rabies virus has two major antigens: the nucleoprotein, a conserved internal protein antigenically and genetically and glycoprotein, a protein responsible for the external adsorption of virus two the host cell and induction of neutralizing antibodies. The development of recombinant DNA technology has opened a new perspective on the control of rabies, since recombinant vaccines have residual pathogenicity and are produced with the antigenic proteins of the virus, without their presence. Furthermore, recombinant proteins can be expressed in order to be used in diagnosis. The objective of this study was to review the literature about rabies, cloning and express the nucleoprotein and glycoprotein of rabies virus using the system Pichia pastoris and evaluate the antigenicity and the immunogenicity of these proteins by Dot blotting, SDS page, Western blotting and ELISA. Glycoprotein synthetic antigen proved to be recognized by anti-rabies from animals experimentally infected with rabies virus strain CVS. And recombinant nucleoprotein expression was confirmed by the techniques of Dot blotting and Western blotting to be recognized by monoclonal anti-histidine. Thus, we conclude that the cloning and expression of synthetic glycoprotein and cloinig and expression nucleoprotein rabies virus by the yeast P. pastoris has been effective, which makes these products an alternative for the production of immunobiological. / O vírus da raiva apresenta dois antígenos principais: a nucleoproteína, uma proteína interna conservada antigênica e geneticamente e a glicoproteína, uma proteína externa responsável pela adsorção do vírus à célula hospedeira e pela indução da produção de anticorpos neutralizantes. O desenvolvimento da tecnologia do DNA recombinante iniciou uma nova perspectiva no controle da Raiva, já que vacinas recombinantes não têm patogenicidade residual e são produzidas com as proteínas antigênicas do vírus, sem sua presença. Além disso, as proteínas recombinantes podem ser expressas com a finalidade de serem usadas em diagnóstico. O objetivo deste trabalho foi clonar e expressar a glicoproteína e a nucleoproteína do vírus da raiva utilizando o sistema Pichia pastoris e avaliar a antigenicidade e imunogenicidade destas proteínas através do Dot blotting, SDS page, Western blotting, inibição da imunofluorescência e ELISA. A glicoproteína demonstrou ser antigênica ao ser reconhecida por anticorpos anti-rábicos provenientes de animais experimentalmente infectados com o vírus rábico cepa CVS. A nucleoproteína recombinante teve sua expressão confirmada pelas técnicas de Dot blotting e Western blotting ao ser reconhecida por anticorpos monoclonais anti-histidina. Podemos concluir que a levedura P. pastoris é um sistema eficiente para clonagem e expressão da nucleoproteína e glicoproteína do vírus rábico.

Dados da Organização Mundial da Saúde (OMS) mostram que a raiva é um problema de saúde pública podendo acarretar sérios prejuízos ambientais e econômicos, a despeito da existência de vacinas eficazes de uso humano e veterinário. Segundo seu último informe, estima-se que no mundo em torno de 55.000 pessoas por ano morrem de raiva. O cão permanece como principal transmissor da raiva para o homem e também como principal vítima da doença. Nos países que conseguiram controlar a raiva em animais domésticos, o vírus se mantém circulante na natureza por meio dos animais silvestres, sendo os morcegos apontados como a segunda espécie transmissora da raiva a humanos. Os Lyssavirus têm sido detectados em morcegos, em diversos continentes, sendo identificados como transmissor em dez das onze espécies de Lyssavirus. Fósseis de morcego mostram sua presença há 50 milhões de anos. Mas somente em 1911, Carini relacionou pela primeira vez a raiva aos morcegos, levantando a hipótese destes serem os transmissores da doença a outros animais. Há registros de que o vírus da raiva foi isolado em pelo menos 41 das 167 espécies de morcegos brasileiras, sendo que a maioria dessas espécies está relacionada a atividades humanas com a presença destes animais próximos ao local de trabalho e moradia das pessoas. Os morcegos hematófagos Desmodus rotundus são encontrados do norte do México até a costa norte do Chile, região central da Argentina e costa do Uruguai e com exceção do Chile. Esta espécie de morcego tem sido apontada como reservatório natural do vírus da raiva nesta região. Alguns pesquisadores observaram que a raiva em morcegos não hematófagos precede a raiva bovina e em animais de estimação, sugerindo que os morcegos não hematófagos podem ser o elo entre a raiva silvestre e a raiva urbana e o fato de se detectar a variante mantida por morcegos hematófagos Desmodus rotundus em cães e gatos mostra que o papel deste morcego no ciclo da raiva não está limitado à raiva silvestre. As características dos Lyssavirus adaptados a morcegos têm mostrado diferenças quando comparadas à raiva relacionada aos carnívoros, confirmando a necessidade do desenvolvimento de metodologias que permitam estudos complementares mais precisos a respeito da biologia e epidemiologia da raiva em quirópteros. A escassez de dados na literatura, até o momento, a respeito do genoma completo da variante do vírus da raiva mantida por populações de morcegos hematófagos Desmodus rotundus, deixa uma lacuna no entendimento da epidemiologia molecular deste vírus. A importância epidemiológica desta espécie na transmissão da raiva é inquestionável. Neste estudo foi sequenciado e analisado, o genoma da variante do vírus da raiva mantido por populações de morcego hematófago Desmodus rotundus isolado de um morcego hematófago Desmodus rotundus. A amostra, procedente de área endêmica no Estado de São Paulo, foi filogeneticamente comparada com o genoma da amostra padrão para a espécie viral 1 - Rabies virus e outras amostras pertencentes ao ciclo aéreo ou terrestre de transmissão, disponíveis no GenBank, identificando possíveis padrões de diferenciação, próprios do ciclo aéreo, e em alguns casos relacionados somente à variante estudada. / Data from the World Health Organization (WHO) show that rabies is a public health problem which can cause serious environmental and economic damage, despite the existence of effective vaccines for human and veterinary use. According to WHO latest report, estimated that worldwide around 55,000 people per year died of rabies. The dog remains the main transmitter of rabies to humans as well as the main victim of the disease. In countries that were successful in controlling rabies in domestic animals, the virus is still circulating in nature by wild animals and the bats are seen as the second species transmitting rabies to humans. The Lyssavirus have been detected in bats in several continents and is identified as a transmitter in ten of eleven species of Lyssavirus. Bat fossils show their presence for 50 million years. But only in 1911, in the first time Carini related to rabies at bats, raising the possibility of these being the transmitters of the disease to other animals. Reports show that the Rabies virus was isolated in at least 41 of the 167 species of bats in Brazil, with the majority of these species is related to human activities with the animals living near the local job and houses of people. The vampire bat Desmodus rotundus is found from northern Mexico to northern Chile coast, central coast of Argentina and Uruguay and with the exception of Chile. This bat species has been identified as a natural reservoir of the Rabies virus in this region. Some researchers observed that rabies into non-hematophagous bats precedes the bovine rabies and in pets, suggesting that the non-hematophagous bats may be the link between wildlife rabies and urban rabies and the fact that detect the variant maintained by vampire bats Desmodus rotundus in dogs and cats shows that the role of bat rabies in the cycle is not limited to wildlife rabies. The characteristics of Lyssavirus bat adapted have been shown differences when compared to rabies related to the carnivores, confirming the need to develop methods that enable more accurate follow-up studies about the biology and epidemiology of rabies in bats. The paucity of data in the literature to date about the complete genome of the Rabies virus variant maintained by populations of vampire bats Desmodus rotundus leaves a gap in understanding the molecular epidemiology of this virus and the epidemiological importance of this species in the transmission of Rabies virus is unquestionable. In this study we sequenced and analyzed the genome of the Rabies virus variant maintained by populations of bat Desmodus rotundus isolated from a bat Desmodus rotundus. The sample, coming from an endemic area in São Paulo, was phylogenetically compared with the genome of the standard sample for spcies 1 - Rabies virus and other samples belonging to the Terrestrial and Aerial cycles of transmission, available in GenBank, to identify possible patterns of differentiating themselves Aerial cycle and in some cases linked only to variant studied.

Analisou-se 54 amostras de vírus da raiva isoladas de diferentes espécies animais e de seres humanos do Estado do Maranhão, inicialmente pelas técnicas tradicionais de imunofluorescência direta (IFD) e de inoculação intracerebral em camundongos (ICC), com o objetivo de realizar um estudo de epidemiologia da doença. No reteste, todas as amostras foram positivas na IFD e 19 resultaram negativas à ICC. O comportamento biológico dos isolados foi estudado em camundongos, revelando um período de incubação entre 7 e 17 dias, com sinais clínicos variados e duração média de 4 dias. Para a avaliação da patogenicidade, foram selecionadas cinco amostras do estudo, oriundas de diferentes espécies, como vírus de desafio nos camundongos imunizados com uma vacina comercial de vírus inativado. Os resultados do desafio indicaram que a proteção conferida pela vacina foi baixa para todas as amostras. A presença de anticorpos no soro dos camundongos vacinados foi demonstrada em diferentes períodos de vacinação. A tipificação antigênica de quatro amostras de vírus foi realizada pela imunofluorescência indireta (IFI) utilizando um painel de anticorpos monoclonais (MAbs) procedentes do Canadian Food and Inspection Agency, Ottawa, Canadá, identificando o perfil correspondente à variante de morcego hematófago Desmodus rotundus. Na caracterização genética com base nos genes que codificam a glicoproteína G e nucleoproteína N, observou-se que os isolados foram divididos em dois grupos genéticos independentes associados a ciclos endêmicos distintos. Esses resultados permitem concluir que no Estado do Maranhão circulam pelo menos duas variantes do vírus da raiva, mantidas por carnívoros terrestres e morcegos hematófagos. Destaca-se que houve variação regional entre as amostras isoladas em diferentes áreas geográficas. Além disso, foram constatados hospedeiros inesperados nos clados formados. Também, não houve variação temporal nas amostras pesquisadas. / Fifty four rabies virus samples isolated from different animal species and humans, diagnosed positive by means of the direct fluorescent antibody test (dFA) and mouse inoculation test (MIT) in the State of Maranhão were selected for an epidemiologic study. In the retest, all these samples were dFA-positive, but 19 were negative by the MIT. The biologic behavior of these samples was assessed in mice by intracerebral inoculation and the incubation period was between 7 and 17 days, showing varied clinical signs with an average duration of 4 days. For the evaluation of the pathogenicity, five rabies viruses isolated from different species were selected, and used as the challenge viruses to be inoculated into mice been vaccinated previously with an inactivated commercial rabies vaccine. The results of the challenge experiments indicated low protection of the vaccine against the challenge viruses. The presence of rabies antibody was demonstrated in the sera of vaccinated mice taken at different intervals after vaccination. The antigenic typing was performed in four samples by using the indirect fluorescent antibody test (IFI) with a panel of monoclonal antibodies (MAbs) provided by the Canadian Food and Inspection Agency, Ottawa, Canada, and the profile identified was closely related to that of the Desmodus rotundus vampire bat. The genetic characterization based on genes coding the glycoprotein G and nucleoprotein N genes indicated that isolates were divided into two independent genetic groups associated to distinct endemic cycles. With the results obtained, we conclude that in the State of Maranhão there are circulating at least two distinct variants of rabies viruses, maintained by terrestrial carnivores and vampire bats. Regional variation among the isolates taken from different geographic areas has been found. And the rabies virus isolates grouped into clades were associated with unusual host species and no temporal variation was observed among the isolates.

Rabies is a fatal but preventable neurotropic disease of potentially all mammals. The disease is caused by lyssaviruses. Rabies is recognized as the 10th most common lethal infectious disease in the world, rendering it one of the most feared zoonotic diseases known to man. Nevertheless, rabies can be prevented by application of pre- or post exposure treatments. Rabies vaccines have been available since the time of Pasteur, more that one hundred years ago. Since, vaccine research focused on the development of safer and more effective vaccines. Topics of current interest in the field of rabies vaccinology were addressed in this study. A primary concern regarding the disease is human mortalities, in the range of 60 000, reported every year. Most of these are linked to exposure to rabid dogs. In addition, a great number of post exposure treatments are administered each year at great costs. Despite availability of efficacious biologics, several factors influence the optimal use and accessibility of these agents in the countries of interest, with cost and availability being the major contributing factors. A proven approach is mass oral vaccination of target animals, such as dogs, which indirectly infers protection to susceptible hosts, including man. Currently available vaccines present several disadvantages of use though, including issues of safety or doubtful stability. Safer but effective alternative vaccines that could be used in oral baits would be valuable. Here the use of two candidate host restricted poxvirus vaccine vectors were explored, particularly also in regard to oral innocuity. The construction, convenient isolation and use of a recombinant Lumpy skin disease virus (Neethling strain) expressing rabies virus glycoprotein in a mouse model were investigated. In addition, a recombinant Modified Vaccinia virus Ankara expressing rabies virus glycoprotein was prepared and tested as a vaccine in mice, dogs and raccoons. In both cases it was clear that the severe attenuation of these viruses did affect the efficacy of the recombinant vaccines in the non-permissive hosts. With the recombinant MVA a clear dosage effect could be shown, and equivalent humoral responses could only be attained at much higher titers of vaccine virus as with replication competent counterparts. Secondly, the cross-protection of rabies vaccines across the spectrum of lyssaviruses was addressed. Lyssaviruses can be divided into two groups based on sequence analysis and pathogenesis. Viruses belonging to the so-called phylogroup II, are the Mokola, Lagos and West Caucasian Bat viruses. Classic rabies biologics fail to fully protect against the viruses attributed to a lack of cross-neutralization. Here, cross-protection and cross-reactive immune responses induced by recombinant vaccinia viruses expressing rabies, Mokola or West Caucasian Bat virus glycoproteins, in single or dual combinations, were investigated. As expected, there was a lack of cross-protection of rabies and Mokola glycoprotein vaccines. There was also a clear lack of cross-protection of West Caucasian Bat virus glycoprotein vaccine and rabies and Mokola viruses. The dual antigen expressing vaccines did not appear to offer any additional protective effect in the tested model. The Mokola virus glycoprotein vaccines induced neutralizing antibody responses that significantly cross-neutralized Lagos Bat virus. / Thesis (PhD (Microbiology))--University of Pretoria, 2006. / Microbiology and Plant Pathology / unrestricted

Células HEK293T e Huh7 foram adaptadas em meios livres de soro fetal bovino (SFM). Parâmetros metabólicos e de crescimento foram avaliados, além da expressão gênica heteróloga, utilizando um sistema de expressão que produz pseudo-partículas (ppHCV), derivadas do vírus da Leucemia Murina (MLV) e da Hepatite C (HCV). A adaptação foi realizada através de diluição sequencial para SFM. A linhagem HEK293T foi adaptada em dois SFM: Hybridoma-SFM e CHO-S-SFMII, a linhagem Huh7 foi adaptada nos quatro SFM escolhidos. O consumo de substratos para cada linhagem foi diferente entre os SFM, apesar de o crescimento celular ter sido semelhante. Para a análise da expressão gênica, três vetores foram co-transfectados em células HEK293T. Foi observado que para a produção de ppHCV, o tempo de coleta foi de 48 horas. O método de co-transfecção por lipofectamina produziu mais cópias de vírus, sendo que quantificações de 5,30x103 cópias RNA/μL foram encontradas para vírus produzidos em células adaptadas no meio Hybridoma-SFM através de qRT-PCR. Estas ppHCV foram usadas para infectar células Huh7, células infectadas produziram cerca de 10 ng de proteína recombinante/106 células. / HEK 293-T and Huh7 cells were adapted in serum free mediu (SFM). Metabolic and growth parameters were assessed, as well as heterologous gene expression, using an expression system that produces pseudo-particles (ppHCV), derived from the murine leukemia virus (MLV), and Hepatitis C (HCV). The adaptation was performed by sequential dilution in SFM. The HEK- 293T line was adapted in two SFM: Hybridoma-SFM and CHO-S-SFMII, the Huh7 line was adapted in four chosen SFM. The consumption of substrates were different for each line in SFM, while cell growth was similar. For the analysis of gene expression, three vectors were co-transfected into HEK-293T cells. It was observed that for the production of ppHCV, the collection time was 48 hours. The method of co-transfection with lipofectamine produced more copies of the virus into the cells, 5,30 x103 RNA copies/μL were found to virus produced in the cells adapted in Hybridoma- SFM, by qRT-PCR. These ppHCV were used to infect Huh 7, infected cells produced around 10 ng recombinant protein /106 cells.