Neste trabalho, foram analisados alguns sistemas bioquímicos relacionados ao estresse oxidativo em diferentes tecidos de moluscos bivalves, em resposta a diferentes tipos de estresse ambiental, com o intuito de se verificar a possibilidade de utilização destes sistemas em programas de biomonitoramento do ambiente marinho, assim como verificar a influência de variações em parâmetros ambientais não relacionados à poluição sobre esses sistemas. Mexilhões Perna perna e Mytella guyanensis coletados em ambientes poluídos apresentaram níveis significativamente maiores de lesões em DNA e lipídeos que animais coletados em local limpo. Além disso, mexilhões expostos a metais apresentaram também maiores níveis de lesões em DNA e lipídeos. Estes dados indicam que as lesões analisadas nos mexilhões apresentaram uma boa resposta aos diferentes contaminantes, o que sugere sua utilização como biomarcadores da contaminação ambiental marinha. Entretanto, outros fatores tais como os ciclos de exposição ao ar, sazonalidade e variações de salinidade também ocasionaram oscilações nos níveis de lesões em DNA e lipídeos. Estes dados sugerem que deve-se ter especial atenção às condições de coleta em estudos de biomonitormanento ambiental, uma vez que variações ambientais não controladas em fatores abióticos podem influenciar nos resultados obtidos Em mexilhões expostos a diferentes metais em laboratório por diferentes períodos, foram estudadas as atividades de algumas enzimas antioxidantes tais como a catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx), glutationa peroxidase específica para hidroperóxidos de lipídeos (PHGPx), glutationa S-transferase (GST), níveis de glutationa reduzida (GSH) e de peroxidação lipídica. Algumas oscilações foram observadas nestes parâmetros, em relação à susceptibilidade dos tecidos à peroxidação lipídica. As maiores correlações foram observadas entre a atividade da PHGPx e os níveis de peroxidação lipídica, indicando um possível papel protetor da PHGPx contra lesões oxidativas às membranas, como também sua modulação pelos metais. Níveis de serotonina (5HT) e dopamina (DOPA) foram também avaliados em glândulas digestivas e tecido muscular de mexilhões P. perna, onde verificou-se que os metais causaram depleção dos níveis de 5HT e DOPA. No caso específico de tecidos musculares, uma diminuição dos níveis destes dois compostos poderia ser devido à contração tônica das valvas dos mexilhões em resposta a presença dos metais, uma vez que estes dois compostos estão envolvidos no relaxamento muscular dos mexilhões. Quando mexilhões foram expostos ao ar, constatamos também uma diminuição nos níveis de 5HT e DOPA no músculo, o que provavelmente estava associado à contração muscular para o fechamento das valvas, evitando assim a dessecação. Ao serem re-submersos, os níveis voltaram aos anteriores (similares aos controles), o que indicaria o relaxamento dos músculos com a conseqüente abertura das valvas. Nenhuma diferença foi observada nas glândulas digestivas. Pequenas variações foram também observadas nos níveis de 5HT e DOPA, entre mexilhões coletados em diferentes horários do dia, indicando o papel destes dois compostos no controle dos ritmos biológicos. Sendo assim, oscilações nos níveis destes dois compostos em função da exposição a metais pesados podem comprometer também os ritmos biológicos destes animais. Ainda, em estudos adicionais foi caracterizado por cromatografia líquida de alta performance acoplado à espectrometria de massas (HPLC/MS) e por ressonância magnética nuclear de próton e carbono, o produto de oxidação da melatonina pelo oxigênio singlete, o AFMK. Como parte deste estudo, comprovamos a hipótese de que a reação de nitrilas com peróxido de hidrogênio em meio alcalino gera oxigênio singlete, em estudos de monitoramento das emissões de luz bi e monomoleculares do oxigênio singlete, e pela detecção do produto acetamida por HPLC/MS. Por fim, um novo método de detecção de melatonina e AFMK com alta especificidade e sensibilidade por HPLC/MS foi desenvolvido. / In this work, some biochemical systems were evaluated in different tissues of bivalve mollusks, in response to different stress, in order to verify the possibility of use of these systems as pollution bioindicators in marine environmental monitoring studies, as well as to verify the influence of environmental variations not related to pollution on these systems. Mussels Mytella guyanensis and Perna perna collected in polluted environments presented higher levels of DNA and lipid damage, compared to mussels from a reference site. Mussels exposed to different metals also presented high levels of DNA and lipid damage. These data indicates that the lesions evaluated in mussels showed good responses to the contaminants, suggesting its use as biomarkers of marine contamination. On the other hand, other environmental variations such as air exposure cyvles, seasonality and variations in salinity also caused changes in the levels of DNA and lipid damage, indicating that the collection procedure of mussels, including observations of the environment conditions, should be considered for better interpretation of the results. In mussels exposed to different metal at different time intervals, the activities of the antioxidant enzymes catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx), phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase (PHGPx), and glutathione S-transferase (GST), as well as the levels of reduced glutathione (GSH) and lipid peroxidation were evaluated. Some oscillations were observed in these parameters, related to the susceptibility of the digestive gland to lipid peroxidation. Major relationships were observed between the activity of PHGPx and the levels of lipid peroxidation, suggesting a protective role of PHGPx against lipid peroxidation and its modulation by metals. The levels of serotonin (5HT) and dopamine (DOPA) were also evaluated in digestive gland and muscle tissues of the mussels, being observed 5HT and DOPA depletion in both tissues. In muscle tissues, this would be related to the tonic catch contraction of muscle fibers in response to the metal exposure, since 5HT and DOPA are involved in this process. Experiments of exposure of mussels to air and re-submersion were also done to verify the effects on 5HT and DOPA levels. When mussels were exposed to air, decreases in 5HT and DOPA were observed, and when mussels were re-submersed, the levels back to the control values, which would also be related to the muscle contraction. No differences were observed in digestive glands. Little variations in 5HT and DOPA levels were observed between mussels collected at different times of the day, indicating a role of these compounds in the control of biological rithms. Additional studies were done, were the oxidative melatonin product by singlet molecular oxygen was characterized by high performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry (HPLC/MS), and proton and carbon nuclear magnetic resonance. The chraracterized product was the kynurenine N1-acetyl-N2-formyl-5-methoxykynuramine (AFMK). Along this study, the theory that the reaction of nitriles with hydrogen peroxide in alkaline solutions were confirmated through monitoring of the ligh emmited by singlet oxygen and the detection of the product formed (acetamide). Also, a new method for the simultaneous detection of melatonin and AFMK with high specificity and sensibility by HPLC/MS were developed.

Nesse trabalho enfatizamos o uso de marcadores bioquímicos de estresse oxidativo em microalgas como sinalizadores precoces de exposição a agentes xenobióticos. A curva de crescimento e a taxa de crescimento diário (µ) foram determinadas através do monitoramento in vivo da fluorescência da clorofila. Baseado nos protocolos de testes toxicológicos in vitro, usando microalgas expostas por 48h, determinou-se a concentração efetiva que inibiu 50% de µ (IC50). Culturas de M. polymorphus, com concentração inicial de 1 X 106 células.mL-1, foram submetidas separadamente ao IC50 de oxiflurfeno (OxF) e benzo[a]pireno (BaP) por 48h sendo, posteriormente, coletadas para a análise de cinética enzimática em espectrofotômetro. As análises tanto dos níveis de MDA como dos níveis de GSH/GSSG e Asc- foram feitas em HPLC usando detectores de fluorescência e detectores coulométricos flow-through respectivamente. Além disso, os ensaios sobre a excreção/liberação de H2O2 in vivo foram feitos em um luminômetro usando-se a técnica do luminol. Os valores de IC50 para o OxF e BaP foram de 0,24 µg.L-1 e 0,99 µg.L-1 respectivamente. Os resultados das análises enzimáticas, obtidos nos ensaios com OxF, ao serem comparadas com controles, mostram aumentos para SOD (150 ± 7 e 32 ± 6 USOD.mg.prot-1), seguidos por aumentos menores para CAT (6,5 ± 0,7 e 3,9 ± 0,5 U.mg.prot.-1) e APx (1,01 ± 0,06 e 0,82 ± 0,05 U.mg.prot.-1) respectivamente. Nas culturas expostas ao BaP os resultados, comparados ao controle, mostraram maior atividade de CAT (35,7 ± 1,3 e 4,0 ± 0,9 U.mg.prot.-1) e APx (4,95 ± 0,06 e 0,86 ± 0,03 U.mg.prot.-1) enquanto a SOD foi menos pronunciada (105 ± 6 e 35 ± 5 USOD.mg.prot.-1). As análises das enzimas GR e DHAR quando comparadas ao controle (0,78 ± 0,07 e 0,43 ± 0,08 U.mg.prot.-1 respectivamente) apresentaram-se inibidas em quase 50% quando sob a ação de OxF e não apresentaram variações na presença de BaP. As análises de GST comparadas aos controles, tiveram menor atividade nos grupos sob OxF (176 ± 28 e 73 ± 18 ) frente ao BaP (402 ± 67 e 71 ± 24). Os resultados em HPLC revelaram níveis de MDA elevados nos dois grupos, especificamente 9 e 5 vezes o valor dos controles para as amostras expostas ao OxF e ao BaP respectivamente. Os resultados de GSH mostram diminuição de GSHtotal frente aos controles, em quase 40% sob ação do OxF e mais de 50% nas culturas com BaP. Além disso, a percentagem de GSH na forma de GSSG comparada ao GSHtotal (%IR Índice redox) foi de 60 e 75% nos grupos com OxF e BaP respectivamente. Nos valores obtidos nas análises de Asc- os resultados apontam diminuição em 45% sob OxF e pouco mais de 15% na presença de BaP. As análises de excreção/liberação in vivo de H2O2 mostram acentuada liberação nas células expostas ao OxF quando comparadas ao tratamento com BaP. A observação dos valores de IC50, mostra uma maior toxicidade de OxF quando comparada ao BaP e os resultados das análises das enzimas antioxidantes nos revelam que M. polymorphus usa diferentes estratégias frente aos agentes tóxicos. Tendo em vista a inibição de CAT e APx, as células sob exposição ao OxF utilizam a eliminação direta de H2O2 no meio e, eliminação via ação da GST. No entanto, tal situação parece não diminuir os níveis de lipoperoxidação, mesmo com consumo excessivo de Asc. As culturas expostas ao BaP evitam a evolução de H2O2 via atividade enzimática preferencial e os níveis baixos de GSH denotam a utilização de GST em processos de conjugação de xenobióticos. / The use of biochemical oxidative stress biomarkers in microalgae, as early watches during xenobiotic exposure are emphasized. The growth curve and the diary cells population increase rate (µ) were determined by chlorophyll fluorescence in vivo monitoring. Applying toxicological in vitro tests protocols and using microalgae exposed for 48h, we have determined the effective concentration that provoked 50% of µ inhibition (IC50). M. polymorphus cultures in an initial cellular concentration of 1 X 106 cell.mL-1 were separately submitted to IC50 oxyfluorfen (OxF) and benzo[a]pyrene (BaP) during 48h and, after that, they were gathered to the kinetics enzymatic assay using spectrophotometer. The levels of MDA and the levels of GSH/GSSG plus Asc- were determined in the HPLC system coupling to the fluorescence and coulometric flow-through detectors, respectively. Additionally, in vivo H2O2 excretion/releasing assays were done using a luminometer associated to the luminol technique. The IC50 obtained in the OxF and BaP tests brought out the values 0.24 µ.L-1 and 0.99 µg.L-1 respectively. The results from the enzymatic analyses in the culture under OxF exposure, when compared to the controls, have shown increases in the SOD activities (150 ± 7 and 32 ± 6 USOD.mg.prot-1) followed by minor results to CAT (6.5 ± 0.7 and 3.9 ± 0.5 U.mg.prot.-1) and APx activities (1.01 ± 0.06 and 0.82 ± 0.05 U.mg.prot.-1), respectively. On the other hand, in cultures under BaP treatment, the results compared to the control have shown an increase of CAT (35.7 ± 1.3 and 4.0 ± 0.9 U.mg.prot.-1) and APx activities (4.95 ± 0.06 and 0.86 ± 0.03 U.mg.prot.-1) followed by minor SOD activities (105 ± 6 and 35 ± 5 USOD.mg.prot-1). The results from enzymatic analyses of GR and DHAR under OxF exposure presented around 50% of controls value (0.78 ± 0.07 and 0.43 ± 0.08 U.mg.prot.-1respectively). Contrarily, the culture under BaP treatment didnt show any variation compared to the controls. Instead, GST analyses - in the culture under OxF treatment - have shown minor activity (176 ± 28 and 73 ± 18) facing the cell cultures under BaP exposure (402 ± 67 and 71 ± 24), when compared to the controls. In the cultures under OxF and BaP treatment, HPLC analyses displayed an increase of 9 and 5 fold, respectively, in the MDA levels. The results of GSH in cultures under OxF have shown a decrease of 40% GSHtotal when compared to the control, and more than 50% in cultures under BaP treatment. In addition, the percentage of GSH in the GSSG form compared to GSHtotal (%RI Redox index) was 60 and 75% in the OxF and BaP groups, respectively. In the results obtained in analyses of Asc- there are a decrease of 45% in cultures under OxF and a little bit more than 15% in cultures under BaP treatment. The analyses of in vivo H2O2 excretion/releasing have shown pronounced freeing in the cell under OxF exposure when compared with BaP cultures. The results of IC50 value point to an increased toxicity in cells under OxF treatment in comparison to BaP cultures. On the other hand the results of antioxidant enzymes have shown us different strategies used by M. polymorphus facing the toxic agents. Having in mind the inhibition of CAT and APx, the cells under OxF exposure adopt the direct elimination of H2O2 in the culture medium and via GST activity. However, this situation seems not reduce the lipoperoxidation levels, not even, under the exceedingly Asc- consuming. Cultures exposed to BaP avoid H2O2 evolution de mainly via enzymatic activity and the lower levels of GSH pointing to the activity of GST during xenobiotic conjugation process.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:07:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Catia Ciencia Animal 2011.pdf: 762064 bytes, checksum: bf88768cc40c5c8bee991ff416b2a29d (MD5) Previous issue date: 2011-08-03 / The function of antioxidants is control the free radicals to improve the quality of fresh and cryopreserved semen. The objective this work was to study the effect of antioxidants catalase, α-tocopherol and sodium pyruvate added in bull semen in order to control the reactive oxygen species and improve sperm quality after cryopreservation. Were used six adult Nelore bulls previously selected from other animals by evaluation of body condition and andrological examination. Semen was collected and immediately evaluated for motility and vigor at the laboratory. After, the semen were diluted with Tris-egg yolk-glycerol medium with the antioxidants molecules in different concentrations. The work was divided into four experimental groups: Group 1 (control without addition of antioxidants), Group 2 (with catalase antioxidant in three concentrations 20 IU, 80 IU and 200 IU), Group 3 (with α-tocopherol antioxidant in the concentrations of 50 mM, 100 mM and 150 mM) and Group 4 (with sodium pyruvate antioxidant in the concentrations of 1.5 mM, 3.5 mM and 5 mM). After semen thawing the computerized analysis (CASA) of motility, plasm membrane, and acrosome integrity, mitochondrial activity and measurement of thiobarbituric acid reactive substances (TBARS). It was observed that the antioxidants had no significant effect on most parameters measured, but the lower antioxidants concentrations were more efficient than the control group for the total motility, progressive motility, average path velocity, and plasm membrane integrity parameters. In the TBARS evaluation was observed lower lipid peroxidation when higher antioxidants concentrations were used. Thus more research is needed to determine the functionality of sperm, as well as indentify the optimal concentration of the antioxidants that benefits all sperm parameters after thawing. / Os antioxidantes têm como função neutralizar os efeitos dos radicais livres proporcionando uma melhor qualidade do sêmen fresco e criopreservado. O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito da adição dos antioxidantes catalase, α-tocoferol e piruvato de sódio no sêmen bovino visando um controle das espécies reativas de oxigênio para melhorar a qualidade espermática pós-criopreservação. Foram utilizados seis touros adultos da raça Nelore selecionados previamente entre outros animais por meio da avaliação de condição corporal e exame andrológico. O sêmen foi coletado e imediatamente avaliado quanto a motilidade e vigor no laboratório. Em seguida, o sêmen foi diluído com o meio Tris-gema-glicerol com as moléculas antioxidantes nas diferentes concentrações. O trabalho foi estruturado em quatro grupos experimentais: Grupo1 (controle sem adição de antioxidantes); grupo 2 (com antioxidante catalase em três concentrações 20 UI, 80 UI e 200 UI); grupo 3 (com antioxidante α-tocoferol nas concentrações de 50 μM, 100 μM e 150 μM) e o grupo 4 (com antioxidante piruvato de sódio nas concentrações de 1.5 μM, 3.5 μM e 5 μM). Após a descongelação foram realizadas as análises computadorizada (CASA) da motilidade, da integridade de membrana plasmática, de integridade acrossomal, da atividade mitocondrial e mensuração de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). Observou-se que os antioxidantes não tiveram efeito significativo na maioria dos parâmetros avaliados, porém nas menores concentrações tiveram melhor resultado comparando-se com o grupo controle para os parâmetros de motilidade total, motilidade progressiva, velocidade de trajeto e integridade de membrana. Em relação a avaliação de TBARS observou-se que as maiores concentrações dos antioxidantes têm menor peroxidação lipídica. Desta forma, tornam-se necessárias mais pesquisas em relação a avaliação funcional dos espermatozóides, bem como a identificação da concentração ideal que beneficie todos os parâmetros espermáticos pós-descongelação.

Neste trabalho foram investigados os mecanismos e o perfil cinético de processos nitrosativos do ponto de vista da nitrosação do indicador 4,5-diamino fluoresceina (DAF2) em células do tipo RAW 264.7. Também foi investigado o papel que ferro lábil (LIP) exerce em tais processos. O estudo cinético mostrou que a nitrosação do DAF2 é dependente de superóxido intracelular e se processa por dois mecanismos distintos denominados nitrosilação oxidativa e nitrosação. Observou-se que o perfil cinético da nitrosaçao do DAF2 sofre uma transição passando de dependente para independente com relação à concentração de NO, quando a concentração de NO se aproxima de 100-110nM. Este perfil está relacionado com a dinâmica de recombinação entre NO e O2¯ que dispara todo o processo de nitrosação do DAF2. No trabalho fica claro que processos nitrosativos que ocorrem pelos mesmos mecanismos podem apresentar perfis cinéticos completamente diferentes dependendo da localização onde ocorre a recombinação entre NO e O2¯. O ponto mais interessante foi a constatação de que quelantes permeáveis à membranas biológicas estimulam a nitrosação do DAF2 intracelular. Este efeito é decorrente da remoção de LIP intracelular que, surpreendementemente, apresenta papel antinitrosativo nas condições experimentais estudadas. O papel incomum antinitrosativo apresentado por LIP é analizado do ponto de vista da reação entre LIP e ONOO¯ que tem como produto nitrito, uma espécie não nitrosante. Estes resultados podem alterar a forma como LIP é visto em processos oxidativos e nitrosativos. / In this work, we investigated the mechanisms and kinetic profiles of nitrosative processes using fluorescent indicator 4,5-diaminofluorescein (DAF2) in RAW 264.7 cells. The labile iron pool (LIP) influence in nitrosative processes was also evaluated. Intracellular DAF2 nitrosation is superoxide dependent and proceeds by two distinct mechanisms: Oxidative nitrosylation and nitrosation. The former mechanism is the most relevant under all experimental conditions tested. Interestingly, the DAF2 nitrosation rate increases linearly with NO concentration of up 100-110 nM but thereafter undergoes a sharp transition and becomes insensitive to NO. This peculiar kinetic behavior has never been reported and it is linked with NO and superoxide recombination dynamics. When NO reaches a concentration capable to outcompete superoxide dismutase for superoxide, the rate of DAF2 nitrosation becomes insensitive to NO. The most striking finding is the LIP´s influence in nitrosative processes. LIP removal by cell membrane permeable metal chelantors increases DAF2 nitrosation rate significantly, suggesting tha LIP can act as an anti-nitrosant species. This increase is probably related with LIP´s direct reaction with peroxynitrite, wich produces non-nitrosant species like nitrite. This controversial LIP´s anti-nitrosative role in cellular systems is rather interesting since it can change the way we understand it´s role in nitrosative and oxidative processes.

Submitted by Neusa Fagundes (neusa.fagundes@unioeste.br) on 2018-08-24T13:49:29Z No. of bitstreams: 2 Adrieli_Toledo2018.pdf: 1064570 bytes, checksum: b4b7ab870d6f9388d0d57ae7ea9c766d (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-24T13:49:29Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Adrieli_Toledo2018.pdf: 1064570 bytes, checksum: b4b7ab870d6f9388d0d57ae7ea9c766d (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2018-03-05 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Scientific researches with Brazilian native species have aroused a growing interest in the search for active compounds with biological potential. The fruit species Eugenia involucrata DC. (Myrtaceae), known as “cerejeira-do-mato”, is popularly used in the form of tea with antidiarrheal and digestive action. In the literature, although researches with the fruit because to its commercial value, studies with the leaves of the species are scarce, being few data related to the biological activities of this plant. Therefore, the objective of this work was to identify the chemical components of the essential oil by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) and to perform the phytochemical exploration of the plant extracts through colorimetric visualization and / or precipitate formation. In addition, the antimicrobial activity by the broth microdilution technique and the antioxidant activity by the 2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl (DPPH) method were evaluated. In the analysis of the essential oil by GC-MS 28 compounds were identified, all sesquiterpenes, corresponding to 89.41% of the essential oil. The antimicrobial activity of the oil was observed for all Gram-positive bacteria tested and for yeast C. albicans. The essential oil presented a reduction capacity of DPPH up to 66.81%, evidencing its antioxidant potential. The phytochemical prospection of the extracts detected the presence of saponins, steroids, flavonoids and tannins. The antimicrobial and antioxidant activities were observed in all extracts tested. The extracts that presented the best results were: methanolic with antimicrobial activity between 3.12 and 25 mg.mL-1 and antioxidant percentage of 95.85% in the concentration of 1.0 mg.mL-1; and the ethanolic with antimicrobial activity between 3.12 and 50 mg.mL-1 and antioxidant activity of 92.84% in the concentration of 1.0 mg.mL-1. It is suggested that the biological activities found for the essential oil are related to its major compounds: elixene (26.53%), β-caryophyllene (13.16%), α-copaene (8.41%) and germacrene D (7.17%). Regarding the extracts, due to the proven presence of flavonoids and tannins, it is suggested that these phenolic compounds are related to the activities found. / As pesquisas científicas com espécies nativas brasileiras têm despertado um crescente interesse na busca por compostos ativos com potencial biológico. A espécie frutífera Eugenia involucrata DC. (Myrtaceae), conhecida por cerejeira-do-mato, é popularmente usada na forma de chá com ação antidiarreica e digestiva. Na literatura, apesar de pesquisas com o fruto devido ao seu valor comercial, estudos com as folhas da espécie são escassos, sendo encontrados poucos dados relacionados as atividades biológicas dessa planta. Diante disso, este trabalho objetivou identificar os componentes químicos do óleo essencial por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) e realizar a prospecção fitoquímica dos extratos vegetais por meio da visualização colorimétrica e/ou na formação de precipitado. Além disso, foi avaliada a atividade antimicrobiana pela técnica de microdiluição em caldo e a atividade antioxidante pelo método do 2,2-difenil-1-picril-hidrazila (DPPH). Na análise do óleo essencial por CG-EM identificou-se 28 compostos, todos sesquiterpenos, correspondendo a 89,41% do óleo essencial. A atividade antimicrobiana do óleo foi observada para todas as bactérias Gram-positivas testadas e para a levedura C. albicans. O óleo essencial apresentou capacidade redutora de radicais DPPH de até 66,81%, evidenciando seu potencial antioxidante. A prospecção fitoquímica dos extratos detectou a presença de saponinas, esteroides, flavonoides e taninos. As atividades antimicrobiana e antioxidante foram observadas em todos os extratos testados. Os extratos que apresentaram os melhores resultados foram: metanólico com atividade antimicrobiana entre 3,12 e 25 mg.mL-1 e percentual antioxidante de 95,85% na concentração de 1,0 mg.mL-1; e o etanólico com atividade antimicrobiana entre 3,12 e 50 mg.mL-1 e atividade antioxidante de 92,84% na concentração de 1,0 mg.mL-1. Sugere-se que as atividades biológicas encontradas para o óleo essencial estejam relacionadas aos seus compostos majoritários: elixeno (26,53%), β-cariofileno (13,16%), α-copaeno (8,41%) e germacreno D (7,17%). Referente aos extratos, devido a comprovada presença de flavonoides e taninos, sugere-se que estes compostos fenólicos estejam relacionados as atividades encontradas.

Peroxinitrito (ONOO- + ONOOR), o produto da reação controlada por difusão do óxido nítrico com o ânion radical superóxido, tem recebido muita atenção como possível mediador dos efeitos deletérios associados a uma superprodução de óxido nítrico. O peroxinitrito é um potente oxidante que é capaz de oxidar e nitrar várias biomoléculas cujos mecanismos contribuímos para esclarecer. Particularmente relevante foi demonstrar inequívocamente, por EPR de fluxo, que a rápida reação entre peroxinitrito e o biologicamente abundante dióxido de carbono, produz dióxido de nitrogênio e ânion radical carbonato em rendimentos de aproximadamente 35%. Sugerimos então, que o peroxinitrito deveria atuar na maioria dos ambientes biológicos através de seus radicais derivados que produziriam radicais de biomoléculas. Consubstanciamos essa sugestão pelo estudo da oxidação dos biotióis cisteína, glutationa e BSA-cys34 por peroxinitrito e peroxinitrito/dióxido de carbono. Também, demonstramos que a reação entre o nitróxido tempol e os radicais derivados do peroxinitrito é uma etapa relevante para que o tempol redirecione a reatividade do peroxinitrito de nitração para nitrosação de biomoléculas. Finalmente, demonstramos que existem outras potenciais fontes biológicas de dióxido de nitrogênio e anion radical carbonato como a atividade peroxidásica da enzima superóxido dismutase e a enzima xantina oxidase. / Peroxynitrite (ONOO- + ONOOR), which is formed by the diffusion-controlled reaction between nitric oxide and superoxide anion, has been receiving increasing attention as a mediator of the deleterious effects associated with an overproduction of nitric oxide. Peroxynitrite is a strong oxidant that is able to oxidize and nitrate a variety of biotargets by mechanisms that this work has contributed to establish. Particularly relevant, was the unequivocal demonstration by rapid flow EPR that the rapid reaction between peroxynitrite and the biologically ubiquitous carbon dioxide produces nitrogen dioxide and carbonate radical anion in yields of around 35%. This led us to suggest that in most biological environments peroxynitrite would act through its derived radicals that would oxidize biomolecules to radicals. This hypothesis was clearly supported by our studies of biothioI (cysteine, glutathioneand BSA-cys34) oxidation by peroxynitrite and peroxynitrite/carbon dioxide. In addition, we demonstrated that the reaction between the nitroxide tempol and peroxynitrite-derived radicals is an important step of the mechanism by which tempol diverts peroxynitrite reactivity from nitration to nitrosation of biomolecules. Finally, we demonstrated that there are other potential sources of nitrogen dioxide and carbonate radical anion such as the peroxidase activity of the enzyme Cu,Zn-superoxide dismutase and the enzyme xanthine oxidase turnover.

O tempol (TP) tem se mostrado um eficiente protetor em modelos inflamatórios. Os mecanismos de proteção contra espécies reativas de oxigênio foi bastante estudado mas sua interação com espécies reativas de nitrogênio ainda permanece pouco explorada. Recentemente, propusemos que o TP re-direciona a nitração de fenol mediada por peroxintrito (PN)/CO2 para nitrosação, pela sua reação com o radical CO3•‾. O produto desta reação, o cátion oxamônio, oxidaria PN para O2 e •NO. Este último produziria uma espécie nitrosante (N2O3) pela reação com o radical derivado do PN, •NO2 [Bonini e col. (2002) Chem. Res. Tox. 15: 506]. Para examinar se este mecanismo poderia operar in vivo, estudamos os efeitos do TP na reatividade do PN/CO2 frente a albumina (BSA) e macrófagos. Os efeitos do TP se apresentaram dependentes de sua concentração e da concentração de Cys. Apesar do TP não se mostrar catalítico, ele inibiu a oxidação de Cys (20-50%) e nitração de Tyr (70-90%) da BSA e aumentou a nitrosação de Cys (200-400%). No caso dos macrófagos tratados com PN/CO2, o tempol também inibiu a nitração (90%) e aumentou a nitrosação (300%). Assim, em condições fisiológicas, concentrações sub-estequiométricas de TP seriam capazes de redirecionar a reatividade dos radicais derivados PN, de oxidação de Cys proteica e nitração de Tyr para nitrosação de Cys. Desta forma, o TP poderia inibir a injúria em inflamações. / Tempol has been shown to protect animals from oxidative stress conditions. Tempol\'s protective mechanisms against reactive oxygen species have been extensively studied but its interactions with reactive nitrogen species remain little explored. Recently, we proposed that tempol diverts peroxynitrite/CO2 mediated phenol nitration to nitrosation by reacting with CO3•‾ to produce tempol oxamonium cation that oxidizes peroxynitrite to O2 and •NO. The latter produces a nitrosating species by reacting with peroxynitrite-derived •NO2 [Bonini et al. (2002) Chem. Res. Toxicol. 15: 506]. To examine wether this mechanism operates in biological environments, we studied the effects of tempol on peroxynitrite/CO2 reactivity towards a protein, BSA, and cells, macrophages. Tempol\'s effects were dependent on its own and BSA-cys concentration. Although not a true catalyst, it inhibited BSA-cys oxydation (20-50%) and BSA-tyr nitration (70-90%) while increasing BSA-cys nitrosation (200-400%). In the case of macrophages treated with peroxynitrite/CO2, tempol also inhibited protein-tyr nitration (90%) and increased protein-cys nitrosation (300%). Then, under physiological conditions, a substoichiometric amount of tempol is able to divert peroxynitrite-derived radicais reactivity from protein-cys oxidation and protein-tyr nitration to protein-cys nitrosation. This may be the mechanism by wich tempol inhibits injury in inflammatory conditions.

A lipoperoxidação gera diversas espécies carbonílicas altamente reativas dentre as quais se destacam acroleína (ACR), malondialdeído (MDA), 4-hidroxi-2-hexenal (HHE) e 4-hidroxi-2-nonenal (HNE). A principal via endógena de metabolização desses compostos é através de conjugação com glutationa por ação da glutationa-S-tranferase. Contudo, diversos trabalhos têm mostrado que dipeptídeos contendo histidina, tal como a carnosina (CAR), também podem formar conjugados com aldeídos e auxiliar na detoxificação desses compostos. Em nosso trabalho adutos de CAR com ACR, HHE, HHEd5, HNE e HNEd11 foram sintetizados, purificados e caracterizados. A reação da CAR com ACR foi estudada em detalhes. Resultados mostraram que a carnosina reage com acroleína formando 03 produtos principais: m/z = 265, m/z = 283 e m/z = 303, sendo este último mais estável e mais abundante. Dados de RMN H1, COSY e HSQC permitiram elucidar a estrutura dessa molécula (m/z = 303) e propor uma rota de reação. Em seguida, uma metodologia baseada em cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas do tipo \"Ion Trap\" (ESI+ HPLC/MS-MS) foi desenvolvida e validada para quantificação simultânea dos adutos sintetizados. Pelo método desenvolvido é possível quantificar com precisão 25 pmol de CAR-HHE, 1 pmol de CAR-ACR e 1 pmol de CAR-HNE com um coeficiente de variação de aproximadamente 10 % e acurácia de 98 % (HHEd5 e HNEd11 foram usados como padrão interno). Análise em urina de adultos não fumantes mostraram que os produtos sintetizados estão presentes na urina de humanos em concentrações de 3,6 ± 1,4; 2,3 ± 1,5 e 1,3 ± 0,5 nmol / mg de creatinina, respectivamente para CAR-ACR, CAR-HHE e CAR-HNE. Em ratos transgênicos SODG93A modelo para esclerose lateral amiotrófica (ELA), a suplementação da dieta dos animais com 35 ± 5 mg carnosina/animal/semana melhorou a manutenção do peso e a sobrevida dos animais. Análises dos adutos sintetizados em amostras de músculo sugerem que a metabolização de aldeídos esteja comprometida nesses animais e que a carnosina poderia funcionar como \"scavenger\" para esses compostos. Esses resultados comprovam que dipeptídeos de histidina atuam na detoxificação de compostos carbonílicos e participa de suas vias de excreção. Além disso, a caracterização da estrutura e desenvolvimento de método sensível de detecção abre a possibilidade de utilização desses adutos como biomarcadores de estresse redox e exposição a aldeídos. / Lipid peroxidation generates reactive carbonyl species, including 4-hydroxy-2-nonenal (HNE), acrolein (ACR), 4-hydroxy-2-hexenal (HHE) and malondialdehyde (MDA). One major pathway of aldehyde detoxification in vivo is through conjugation with glutathione catalyzed by glutathione-S-transferases or, alternatively, by conjugation with endogenous histidine containing dipeptides, such as carnosine (CAR). The reaction of CAR with ACR was investigated in an effort to assess its possible biological role. One stable adduct was isolated by reverse-phase HPLC and characterized on the basis of extensive spectroscopic measurements. The proposed reaction route for product formation involves the reaction of the CAR amino group with ACR via a Schiff base formation followed by dehydration and cyclization through Michael addition in the imidazole ring forming an instable compound with m/z = 265. The subsequent reaction with another molecule of ACR followed by cyclization gives rise to the final product with m/z = 303.A highly sensitive method involving HPLC-MS analysis was developed for the simultaneous accurate quantification of CAR- ACR, CAR-HHE and CAR-HNE adducts in human urinary samples from non-smoking adults. This methodology permits quantification of 10 pmol CAR-HHE and 1 pmol of CAR-ACR and CAR-HNE. Adduct levels in urine were 3.6 ± 1.4, 2.3 ± 1.5, 1.3 ± 0.5 nmol/mg of creatinine, respectively to CAR-ACR, CAR-HHE and CAR-HNE. In SODG93A transgenic rats model to amyotrophic lateral sclerosis (ALS), the food supplementation of the animals with 35 ± 5 mg carnosine/animal/week improve de body weight and the life span of the ALS treated group. Analysis of the synthesized adducts in muscle sample showed suggest than aldehyde metabolization is compromised in this animals and that may be carnosine work like a scavenger for these compounds. Our results indicate that carnosine adduction can be an important detoxification route of α,β -unsaturated aldehydes. Moreover, carnosine adducts quantification may be useful as redox stress indicator in vivo.

Acetoacetato (AA) e 2-metilacetoacetato (MAA) são compostos β-cetoácidos acumulados em diversas desordens metabólicas como no diabetes e na isoleucinemia, respectivamente. Examinamos o mecanismo de oxidação aeróbica de AA e MAA iniciada por intermediários reativos de mioglobina de coração de cavalo (Mb) gerados pela adição de H2O2. Uma rota quimioluminescente que envolve um intermediário dioxetânico cuja termólise gera espécies α-dicarbonílicas (metilglioxal e biacetilo) foi proposta e estudada. Emissão de luz ultra fraca acompanha a reação, e sua intensidade aumenta linearmente pelo aumento da concentração tanto de Mb (10-500 µM) quando AA (10-100 mM). Estudos de consumo de oxigênio mostraram que MAA é, como esperado, quase uma ordem de grandeza mais reativo que AA. Estudos de EPR com captação de spin, utilizando MNP, possibilitaram detectar adutos de MAA atribuíveis a um radical centrado no Cα (aN = 1.55 mT) e ao radical acetila (aN = 0.83 mT). O sinal do radical acetila é totalmente suprimido por sorbato, um conhecido e eficiente supressor de espécies tripletes, o que é consistente com uma rota reacional envolvendo um intermediário dioxetânico. Clivagem-α da ligação carbonila-carbonila do produto biacetilo triplete produziria, de fato, radicais acetila. Além disso, utilizando AA como substrato para Mb/H2O2, um sinal de EPR atribuível ao aduto MNP-AA• (aN = 1.46 mT e aH = 0.34 mT) foi observado e confirmado por efeito isotópico. O consumo de oxigênio e o rendimento de compostos α-dicarbonílicos foram dose-dependentes à concentração de AA ou MAA (1-50 mM) bem como à concentração de H2O2 adicionado às misturas de reação contendo Mb (até 1:10 quando medido o consumo de oxigênio, e até 1:25 quando medido o rendimento de compostos α-dicarbonílicos) e tert-butilhidroperóxido (até 1:200). Os perfis de pH (5,8-7,8) para consumo de oxigênio e rendimento de compostos α-dicarbonílicos mostraram maiores rendimentos para baixos valores de pH, indicativo de ferrilMb formada no ciclo peroxidático da proteína. Avaliando os níveis de lesão de Mb, os β-cetoácidos diminuíram o nível de desorganização protéica na estrutura secundária e terciária elicitada por H2O2. Ainda, houve maior preservação da estrutura primária da proteína, sendo que MAA protegeu mais em comparação a AA, embora quando utilizado este último composto, foi mostrado que há acetilação dose-dependente de Mb. Acetoacetato aumentou a velocidade de descoramento da hemeproteína, provavelmente por ataque de espécies tripletes geradas no sistema. Músculos de rato, plantar e sóleo, expostos ex vivo a concentrações citotóxicas de glicose oxidase (GOX, gera H2O2 em fluxo), foram protegidas pelos ésteres etílicos AAE e MAAE. Foi detectado biacetilo no meio intracelular em músculos expostos a MAAE e GOX. A concentração deste composto α-dicarbonílico é claramente relacionada à abundância de Mb em cada um dos tipos de músculos estudados. Em resumo, Mb tratada com metabólitos β-cetoácidos (AA e MAA) gera radicais centrados em carbono e produtos α-dicarbonílicos altamente reativos no estado triplete. Experimentos realizados com tecido muscular ex vivo sugerem que esta reação possivelmente ocorra in vivo. Levantamos a hipótese de que a geração de espécies carbonílicas reativas e seus adutos em condições de desbalanço metabólico possam contribuir para a compreensão das bases moleculares de desordens cetogênicas. / Acetoacetate (AA) and 2-methylacetoacetate (MAA) are β-ketoacids accumulated in several metabolic disorders such as diabetes and isoleucinemia, respectively. Here we examine the mechanism of AA and MAA aerobic oxidation initiated by the reactive enzyme intermediates formed by the reaction of muscle horse myoglobin (Mb) with H2O2. A chemiluminescent route involving a dioxetane intermediate whose thermolysis yields triplet α-dicarbonyl species (methylglyoxal and diacetyl) is envisaged. Accordingly, the ultraweak light emission that accompanies the reaction increases linearly by raising the concentration of both Mb (10-500 µM) and AA (10- 100 mM). Oxygen uptake studies revealed that MAA is, expectedly, almost one order of magnitude more reactive than AA. EPR spin-trapping studies with MNP detected spin adducts from MAA attributable to an α-carbon-centered radical (aN = 1.55 mT) and to an acetyl radical (aN = 0.83 mT). As the acetyl radical signal is totally suppressed by sorbate, a well-known efficient triplet species quencher, the dioxetane hypothesis seems to be reliable. The α-cleavage of the carbonyl-carbonyl bond of a putative excited triplet diacetyl product would, in fact, leads to an acetyl radical. Furthermore, using AA as substrate for Mb/H2O2, an EPR signal assignable to a MNP-AA• adduct (aN = 1.46 mT and aH = 0.34 mT) was observed and confirmed by isotope effect. Oxygen consumption and α-dicarbonyl yield were also dependent on AA or MAA concentrations (1-50 mM) as well as on the concentration of peroxide added to the Mb-containing reaction mixtures: H2O2 (up to 1:10 when measuring oxygen uptake and up to 1:25 when measuring the α-dicarbonyl yield) and t-butOOH (up to 1:200). The pH profiles (5.8-7.8) of oxygen consumption and α-dicarbonyl yield show higher reaction rates at lower pHs, indicative of a ferrylMb intermediate. Evaluating Mb lesion, both β-ketoacids reduced disorganization of the secondary and tertiary protein structure elicited by H2O2. Therefore, Mb primary structure was more preserved, and MAA was more protective than AA. Moreover using the later compound, it was shown that Mb acetylation is dose-dependent. Acetoacetate increased the rate of the hemeprotein bleaching, probably due to the attack of triplet products generated in the system. Plantaris and soleous rat muscles exposed to damaging concentrations of glucose oxidase (GOX, generates H2O2 in flux), was cytoprotected by AAE and MAAE. Intracellular diacetyl was detected in muscle samples exposed to MAAE and GOX. The α-dicarbonyl concentration is clearly related to the Mb abundance in the muscle types. In summary, Mb treated with peroxides reacts with β-ketoacid metabolites (AA and MAA), yielding carbon-centered radicals and highly reactive α-dicarbonyl products in the triplet state. Experiments carried out ex vivo with muscle tissue showed that this reaction possibly occurs in vivo. A new route for generation and accumulation of carbonyl reactive species and adducts is here proposed to occur in unbalanced metabolic situations, such as is the case of ketogenic disorders.

O consumo de álcool vem sendo associado a um aumento do risco de câncer e a uma situação de estresse oxidativo. Os metabólitos responsáveis por tais processos permanecem em discussão. Neste trabalho, caracterizamos novos metabólitos radicalares do etanol e examinamos suas interações com ácidos nucléicos. Primeiramente, demonstramos que os radicais 1-hidroxietila e 2-hidroxietila produzidos durante a oxidação do etanol por sistemas Fenton alquilam DNA e RNA in vitro produzindo os adutos 8-(1-HE)Gua e 8-(2-HE)Gua, respectivamente. Esses adutos foram sintetizados e caracterizados quimicamente. Também, demonstramos que acetaldeído, o principal metabólito do etanol, é oxidado por sistemas Fenton, peroxinitrito, xantina oxidase, partículas submitocondriais e ratos a radicais acetila e metila. Esses radicais foram caracterizados e seus mecanismos de formação elucidados, pelo menos in vitro. A possibilidade do radical 1-hidroxietila alquilar ácidos nucléicos in vivo foi também examinada. Inesperadamente, o aduto 8-(1-HE)Gua foi detectado em RNA e DNA do fígado de ratos controle e seus níveis não foram significativamente alterados após administração aguda de etanol. Esses resultados sugerem que os radicais 1-hidroxietila, acetila e metila são importantes metabólitos do etanol in vivo mas atacam preferencialmente outras biomoléculas que não ácidos nucléicos. / Alcohol consumption has been associated with increased cancer risk and an oxidative stress condition. Ethanol metabolites responsible for these processes remain debatable. Here, we characterized novel radical metabolites of ethanol and examined their interactions with nucleic acids. First, we demonstrated that the 1-hydroxyethyl and 2-hydroxyethyl radical produced from ethanol oxidation by Fenton systems alkylated DNA and RNA in vitro to produce 8-(1HE)Gua and 8-(2-HE)Gua, respectively. Both adducts were synthesized and structurally characterized. Next, we demonstrated that acetaldehyde, the main ethanol metabolite, is oxidized by Fenton systems, peroxynitrite, xanthine oxidase, submitochondrial particles and whole rats to acetyl and methyl radicals. These radicals were characterized and their production mechanisms in vitro elucidated. The possibility of the 1-hydroxyethyl radical alkylating nucleic acids in vivo was also examined. Unexpectedly, the adduct 8-(1-HE)Gua was detected in RNA and DNA from liver of control rats and their levels were not increased by acute ethanol treatment. Overall, the results suggest that the radicals 1-hydroxyethyl, acetyl and methyl are important ethanol metabolites in vivo but they preferentially attack biomolecules other than nucleic acids.