DE LA TESI:Les vasculitis són processos clínico-patològics caracteritzats per la inflamació dels vasos sanguinis. Poden presentar-se com una entitat primària o complicar el curs d'una altra malaltia, especialmente infeccions, neoplàsies o malalties del teixit connectiu (artritis reumatoide, lupus eritematós sistèmic, malaltia de Sjögren). Com a conseqüència de la lesió dels vasos sanguinis pot aparèixer isquèmia i/o hemorràgia en els òrgans irrigats pels vasos afectats. L'espectre clínic de les vasculitis és molt ampli, ja que depèn del teixit o òrgan afectat i de l'extensió del procés. Aquesta varietat clínica comporta dificultats en el diagnòstic, amb el subsegüent retard en la instauración del tractament. De la mateixa manera, el pronòstic també és molt variable, tant entre els diferents tipus de vasculitis com a nivell individual.El maneig de les vasculitis és complex, ja que el tractament que actualmente s'utitlitza és agressiu i inespecífic, i s'ha de valorar el risc d'efectes indesitjats i el benefici que es pot obtenir. Tot i que els corticoids i els fàrmacs immunosupresors han suposat una gran millota en el pronòstic d'aquests malalts, les complicacions del tractament (bàsicament infeccions, neoplàsies, osteoporosis, diabetes i hipertensió arterial) comporten una morbilitat important. A més, els malalts no sempre reponen al tractament i sovint apareixen recidives en abandonar-lo. Per tot plegat, el que es vol aconseguir és un tractament el màxim d'específic i individualitzat en cada cas, però això no és possible sense un coneixement precís i profund de la patógena d'aquestes malalties. Justament, l'objectiu de la present tesi ha estat aportar nous coneixements sobre els mecanismes que contribuyesen al desenvolupament d'infiltrats inflamatoris en les vasculitis, amb la idea que en un futur contribueixin a millorar el tractament i el pronòstic dels malalts afectats per aquestes patologies. L'estudi està centrat en la poliarteritis nudosa (PAN) i l'arteritis de cèll.lules gegants (ACG) perquè són representatives de dos tipus diferents de vasculits (de vas mitjà i vas gran respectivamente) i perquè l'expressió de les molècules d'adhesió cel.lular, que és el que s'estudia en la present tesi, mai no s'ha investigat anteriorment en grups grans i homogenis d'aquestes vasculitis.

La resistencia bacteriana a los antimicrobianos, y en particular la producción de ß- lactamasas plasmídicas de espectro extendido (BLEE), es un grave problema descrito principalmente en cepas de origen clínico. Sin embargo, no existen muchos datos sobre la prevalencia y la capacidad de difusión de estas resistencias en otros ambientes. Por ello, los objetivos de esta Tesis se enmarcan en un amplio proyecto coordinado cuya finalidad ha sido el estudio de la prevalencia de BLEE, cefamicinasas y carbapenemasas en diversos ambientes, determinar la transmisibilidad de estas resistencias y, finalmente, identificar y caracterizar los plásmidos que las codifican. En este trabajo, en primer lugar se han estudiado 107 cepas procedentes de granjas de aves, de cerdos y de conejos, siendo todas ellas Escherichia coli, a excepción de una cepa de Enterobacter cloacae. No se ha encontrado ninguna cepa portadora de la resistencia a carbapenémicos, aunque si se describe la presencia de la ß-lactamasa plasmídica CMY-2 y de una gran diversidad de enzimas BLEE. Además, el 93% de las cepas fueron resistentes a dos o más de los antibióticos no ß-lactámicos probados. En las granjas de aves, la enzima CTX-M-14 y la cefamicinasa CMY-2 han sido las más frecuentes. Por el contrario, en las de cerdos la enzima CTX-M-1 ha sido la más prevalente. Se describe, por primera vez, la presencia de las enzimas TEM-52 y SHV-2 en las granjas de aves, la enzima SHV-5 en las de cerdos y la enzima CMY-2 en las de conejos. Los resultados obtenidos ponen de manifiesto que las granjas de animales actúan como un reservorio de genes de BLEE y CMY-2. Asimismo, se ha determinado el grupo filogenético y el estatus ExPEC de las 106 cepas de E. coli aisladas de granjas de animales. La mayoría de las cepas han sido definidas como comensales al pertenecer a los filogrupos A y B1. Aunque una proporción significativa de cepas procedentes de granjas de aves pertenece a los filogrupos B2 y D, ambos vinculados a cepas patógenas. Por el contrario, en granjas de cerdos las cepas mayoritarias han sido las pertenecientes al filogrupo A. Del total de las cepas estudiadas, sólo 10 se han caracterizado como ExPEC, presentando éstas una media de nueve factores implicados en la virulencia. La gran mayoría de estas cepas proceden de granjas de aves, pertenecen al filogrupo D y codifican la enzima CMY-2. Además, cabe enfatizar el hecho no descrito hasta el momento, de que dos de las tres cepas aisladas de conejos han sido caracterizadas como ExPEC.En segundo lugar, se han seleccionado 111 cepas de enterobacterias, aisladas de granjas de animales, de alimentos, de muestras clínicas, de muestras fecales de portadores sanos, de brotes alimentarios y de aguas residuales y se ha estudiado la transmisibilidad de las BLEE y CMY-2. Más del 70% de dichas cepas transfirieron por conjugación estas resistencias. Además, un 29,2% de las cepas transconjugantes obtenidas presentaron resistencias a los antibióticos no ß-lactámicos. Por otra parte, las enzimas CTX-M-1, CTX-M-32, CTX-M-14a, familia SHV y CMY-2 fueron las que se transfirieron con una mayor frecuencia.Finalmente, se han caracterizado los plásmidos conjugativos, presentes en las 111 cepas que codificaban BLEE y CMY-2. Para ello, se ha determinado su peso molecular mediante electroforesis en campo pulsante, y se ha identificado el grupo de incompatibilidad al cual pertenecen. Esta identificación se ha llevado a cabo mediante hibridación con sondas frías por dot blot y Southern blot y por PCR y secuenciación. Los resultados obtenidos indican que hay una clara concordancia entre los plásmidos que, aún procediendo de diversos ambientes, presentan características muy similares como son la enzima que codifican, el grupo de incompatibilidad al que pertenecen y, en ciertos casos su tamaño. Así, la extensa mayoría de los plásmidos que codifican de la enzima CTX-M-14a, pertenece al grupo IncK. De igual forma, las enzimas del grupo CTX-M-1 se han localizado en plásmidos IncN. La enzima CMY-2 se ha transferido en plásmidos de alto peso molecular portadores de dos replicones, IncQ e IncA/C2. En cambio, la enzima CTX-M-9 se ha vehiculizado en plásmidos con grupos Inc muy variados, aunque cabe destacar el hecho de que tres de ellos pertenecen al IncHI2. / Bacterial resistance mediated by extended spectrum ß-lactamases (ESBL) is a great concern that has been described mainly in clinical strains. However, there is no so much data about the prevalence and capacity of diffusion of this type of resistances in other environments.Therefore, the objectives of the present Thesis have been to study the prevalence of ESBL, plasmidic class C ß-lactamase and carbapenemases in diverse environments, to determine the transmissibility of these resistances and, finally, to identify and characterize the plasmid that codify these resistances. First of all, in this work it have been studied 107 strains from poultry, pig and rabbit farms, being all of them Escherichia coli but one Enterobacter cloacae strain. None strains have carried resistance to carbapenemics, although it have been described the CMY-2 enzyme and a great variety of ESBL. Moreover, the 93% of the strains showed resistance to two o more non-ß-lactam antibiotics tested. In poultry farms, the enzymes CTX-M-14 and CMY-2 were the most frequent. By the contrary, in pig farms, the enzyme CTX-M-1 was the most prevalent. To the best of our knowledge, this is the first time that it is described the enzymes TEM-52 and SHV-2 in poultry farms, the enzyme SHV-5 in pig farms and the CMY-2 in rabbit farms. The results obtained here; show that animal farms act as a reservoir or ESBL and CMY-2 genes. Moreover, it have been determined the phylogenetic group and the ExPEC status of the 106 E. coli strains. The majority of the strains have been identified like commensal even though they belong to the groups A and B1. However, a high percentage of the strains coming from poultry farms belong to the phylogenetic groups B2 and D, being both groups associated to pathogenic strains. By the contrary, in pig farms the majority of the strains derive from the phylogenetic group A. Only, ten strains have been characterized as ExPEC, carrying these strains nine virulence markers of average. The majority of the ExPEC strains derived form poultry farms been associated to the phylogenetic group D and codifying the enzyme CMY-2. It is important to denote that two of the three strains isolated from rabbit farms are ExPEC.Secondly, it has been selected 111 strains from Enterobacteriaceae, isolated from several environments: animal farms, food, food-borne outbreaks, community, clinical patients and human sewage and it has been studied the transmissibility of the ESBL and CMY-2. More than 70% of these strains transferred by conjugation these resistances. Moreover, a 29.2% of the transconjugant strains showed resistance to non-ß-lactam antibiotics. The enzymes CTX-M-1, CTX-M-32, CTX-M-14a, the family SHV and CMY-2 were the most transferable.Finally, it have been characterized the conjugative plasmids carrying ESBL of CMY-2 of the 111 strains. To do that, it have been determined the molecular weight of the plasmids by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) and their incompatibility group have been identified. The identification of the incompatibility group have been done by dot blot, Southern blot, PCR and sequencing. The results obtained show that there are a high degree of correlation among the Inc group to which the plasmids belong, the enzyme that they encode, and their size. So, the majority of plasmids that codify the enzyme CTX-M-14a belong to IncK group. Similarly, the enzymes of the group CTX- M-1 have been located in IncN plasmids. The plasmidic class C ß-lactamase, CMY-2, have been transferred in plasmids with high molecular weigh carrying the replicons IncQ and IncA/C2. By contrast, conjugative plasmids codifying of the enzyme CTX-M- 9 belong to different Inc groups, although three of them pertain to IncHI2.

INTRODUCCIÓ:El diagnòstic precoç del càncer de pròstata actualment es realitza amb la valoració del tacte rectal (TR) i l'antigen prostàtic específic (PSAt), havent de considerar habitualment la biòpsia prostàtica en els casos de PSA elevat i/o TR sospitós. Aquests mètodes són poc específics, el que suposa un alt ràtio de biòpsies negatives, sobretot en un determinat interval de PSA, en el que es sobreposen l'hiperplàsia benigna de pròstata i el càncer prostàticOBJECTIUS:1)Avaluar la utilitat clínica de la ressonància magnètica endorectal amb espectroscòpia (RME) i determinar la seva aportació i millora en el diagnòstic del càncer de pròstata comparativament amb el PSAt, ràtio de PSA, tacte rectal (TR) i ressonància magnètica sense espectroscòpia (RM). 2) Objectivar la capacitat de la RME per reduir el nombre de biòpsies en pacients candidats a estudi per càncer de pròstata. 3) Valorar el comportament metabòlic de la pròstata en la glàndula perifèrica i central amb o sense càncer de pròstata.METODOLOGIA:S'han analitzat prospectivament amb RME 54 pacients amb PSA total (PSAt) > 3ng/ml i/o PSA ràtio <20. S'ha realitzat estudi de RME amb bobina endorectal realitzant seqüències potenciades en T2 i posterior seqüència específica amb espectroscòpia. Posteriorment s'ha realitzat biòpsia prostàtica transrectal sota guia ecogràfica en tots els pacients i cirurgia en els casos indicats per càncer de pròstata. S'han analitzat les variables tacte rectal (TR), PSAt, PSA ràtio, RM, RME i índex metabòlic colina+creatina/citrat (CC/Ci) en la pròstata de forma global i per octants comparativament amb el resultat de la biòpsia o la prostatectomia en la zona perifèrica i central.Els poders predictius de les diferents variables -tant considerades individualment com combinades entre elles mitjançant models de regressió logística binària- s'han valorat a partir de l'estimació de les àrees sota les corresponents corbes ROC (Receiver Operating Characteristic).RESULTATS:La mitjana de PSA ràtio de 16.44 dels pacients amb biòpsia negativa és significativament major (p<0.01) que la mitjana de 11.14 dels pacients amb biòpsia positiva.L'estimació de l'índex de validesa del TR, PSAt, PSA ràtio, RM i RME per a la diagnosi del càncer de pròstata de la unitat prostàtica, calculat a partir de l'àrea sota la corba ROC, va resultar de 0.57, 0.66, 0.82, 0.86 i 0.90 respectivament. El model predictiu basat en afegir les variables PSA ràtio, RM i el quocient CC/Ci va mostrar l'índex de validesa major de 0.95, estimat a partir de l'àrea sota la corba ROC. Per aquest model predictiu de les tres variables s'hagués estalviat el 44% de les biòpsies amb l'11% de biòpsies innecessàries i amb un 100% de sensibilitat (p=0.20).L'estimació de l'índex de validesa de la RM i RME per a la diagnosi del càncer de pròstata de la glàndula perifèrica, calculat a partir de l'àrea sota la corba ROC, va resultar de 0.76 i 0.91 respectivament. El model predictiu basat en afegir la RME a la RM va mostrar l'índex de validesa de 0.92 estimat a partir de l'àrea sota la corba ROC en la glàndula perifèrica. La mitjana de CC/Ci de 0.5 dels pacients amb biòpsia negativa és significativament menor (p<0.01) que la mitjana de 1.0 dels pacients amb diagnosi positiva de la glàndula perifèrica. L'estimació de l'índex de validesa de la RM i RME per a la diagnosi del càncer de pròstata de la glàndula central, calculat a partir de l'àrea sota la corba ROC, va resultar de 0.66 i 0.89 respectivament. El model predictiu basat en afegir la RME a la RM va mostrar l'índex de validesa de 0.92 estimat a partir de l'àrea sota la corba ROC en la glàndula central. La mitjana de CC/Ci de 0.6 dels pacients amb biòpsia negativa és significativament menor (p<0.01) que la mitjana de 1.3 dels pacients amb diagnosi positiva de la glàndula central.CONCLUSIONS:La RM amb espectroscòpia és una tècnica útil per detectar el càncer de pròstata en pacients amb PSA elevat i millora de forma significativa la seva detecció respecte a la RM convencional i els paràmetres convencionals del TR i PSAt. La utilització de la RME conjuntament amb la RM i els paràmetres clínics del ràtio de PSA permeten millorar el valor predictiu en la detecció del càncer de pròstata, i pot ser una eina útil per poder ser inclosa en l'algoritme de diagnòstic en pacients amb sospita de càncer de pròstata.La RME permet estalviar un nombre significatiu de biòpsies innecessàries quan el resultat de la tècnica és negatiu de sospita de càncer de pròstata.L'índex metabòlic CC/Ci és significativament superior en el càncer de pròstata que en la glàndula normal, tant en la zona central com la perifèrica. / "Usefulness of magnetic resonance with spectroscopy for the early diagnosis of prostate cancer"INTRODUCTION:The current methods used for the diagnosis of prostate cancer are digital rectal examination (DRE) and prostate specific antigen (PSA). Prostatic biopsy is commonly performed in patients with elevated PSA and/or abnormal DRE. Those methods have low specificity, which represents a high rate of negative biopsies, especially within a certain PSA range, as prostate cancer and benign prostatic hyperplasia overlaps.OBJECTIVES:Evaluate the clinical role of magnetic resonance with spectroscopy (MRSI) and estimate the incremental value for the early diagnosis of prostate cancer comparing MRSI with the PSA, PSA ratio, DRE and conventional MR. 2) Analyze the ability of MRSI to reduce the number of biopsies for patients candidates to be evaluated for prostate cancer. 3) Estimate the metabolic behavior of the peripheral and central gland in patients with and without prostate cancer. METHOD:Fifty four consecutive patients with PSA > 3ng/ml and/or PSA ratio <20 were prospectively studied with MRSI. MR spectroscopy was performed with endorectal coil using T2-weighted images and a specific spectroscopy sequence, followed by transrectal biopsy guided with ultrasound in all patients and elected surgery in patients diagnosed with prostate cancer. The variables DRE, PSA, PSA ratio, MR, MRSI and the metabolic ratio choline+creatine/citrate (CC/Ci) for the prostate as a whole unit and by octants were analyzed and compared with the biopsy or prostatectomy results for the peripheral and central gland.Predictive values of the different variables -either considered individually as combined between them on a model of binary logistic regression- have been evaluated from the estimated areas under the ROC (Receiver Operating Characteristic) curves RESULTS:The mean PSA ratio of 16.44 for patients with negative biopsy results is statistically higher (p<0.01) than the mean of 11.14 for patients with positive biopsy.The estimated probability of DRE, PSA, PSA ratio, MR and MRSI for the diagnosis of prostate cancer for the prostate as a whole unit, calculated with the areas under the ROC curves, was 0.57, 0.66, 0.82, 0.86 and 0.90 respectively. The predictive model incorporating together the variables PSA ratio, MR and the CC/Ci ratio resulted with the higher area under the ROC curve of 0.95. For this predictive model with the three variables, 44% of the biopsies would be avoided with 11% of unnecessary biopsies would be performed and with a 100% of sensitivity (p=0.20). Estimated probability of MR and MRSI for the diagnosis of prostate cancer for the peripheral gland, calculated with the areas under the ROC curves, was 0.76 and 0.91 respectively. The predictive model incorporating together the variables MR and MRSI resulted with an area under the ROC curve of 0.92 for the peripheral gland. The mean CC/Ci ratio of 0.5 for patients with negative biopsy results is statistically lower (p<0.01) than the mean of 1.0 for patients with positive biopsy in the peripheral gland.Estimated probability of MR and MRSI for the diagnosis of prostate cancer for the central gland, calculated with the areas under the ROC curves, was 0.66 and 0.89 respectively. The predictive model incorporating together the variables MR and MRSI resulted with an area under the ROC curve of 0.92 for the central gland. The mean CC/Ci ratio of 0.6 for patients with negative biopsy results is statistically lower (p<0.01) than the mean of 1.3 for patients with positive biopsy in the central gland.CONCLUSIONS:MR with spectroscopy is a useful technique to detect prostate cancer in patients with elevated PSA and improves significantly its detection related to MR and the current methods of PSA and DRE. The combined use of MRSI with the PSA ratio allows to improve the predictive value for prostate cancer detection; and could be a useful technique to be included in the diagnosis algorithm for patients suspected for prostate cancer.MRSI allows to avoid a significant number of unnecessary biopsies whenever there is a negative result for suspected prostate cancer using the technique.The metabolic CC/Ci ratio is significantly higher for prostate cancer than in the normal gland, both in the central and in the peripheral gland.

En la práctica clínica diaria, la vía de administración más utilizada es la vía oral. No obstante, esta vía presenta ciertos inconvenientes, dificultad de deglución en algunos casos, pero principalmente, la potencial presencia de un efecto de primer paso tanto a nivel gástrico, duodenal y mayoritariamente hepático. Los fármacos administrados por vía oral y que sufren un efecto de primer paso, conlleva una disminución de su biodisponibilidad en magnitud que repercute en el rendimiento terapéutico del mismo. Este hecho unido a la dificultad de obtener principios activos nuevos capaces de que con ellos se obtengan mejoras terapéuticas dentro de un grupo farmacológico, ha llevado a la industria farmacéutica a diseñar nuevas formas farmacéutica que puedan administrarse por una vía alternativa a la vía oral. Dentro de este marco de actuación, la vía bucal constituye una muy buena alternativa a la vía oral, principalmente, porque está muy bien irrigada, lo que facilita la absorción del fármaco, y porque evita el efecto de primer paso que pueden sufrir los fármacos administrados por vía oral. De acuerdo con la bibliografía publicada sobre este tema, la mucosa de cerdo es la más representativa en lo que a absorción de fármacos se refiere, a la mucosa humana. No obstante, la metodología experimental requiere controlar una serie de factores para obtener resultados que sean un fiel reflejo del proceso (manipulación de la mucosa, temperatura de conservación, integridad de la pieza anatómica, etc.). El control de estos factores forma parte también del objetivo de la presente tesis. La comprobación práctica de la utilidad del modelo que se pretende desarrollar para estudiar el paso de fármacos a través de mucosa bucal, se llevará a cabo empleando como fármacos una serie de betabloqueantes debido a que está demostrado que estos fármacos sufren un efecto de primer paso. Se pone de manifiesto que se presentan diferencias estadísticamente significativas entre las cantidades de fármaco permeadas a los tiempos prefijados, y entre los parámetros de permeación. A fin de hacer más operativos los estudios de permeación de fármacos a través de mucosa de cerdo, también se ha llevado a cabo un estudio comparativo empleando mucosa fresca y congelada. El fármaco estudiado ha sido el propranolol por ser uno de los betabloqueantes más empleados en la práctica clínica. Los perfiles de permeación del propranolol a través de mucosa fresca y congelada resultaron ser muy similares, no presentándose diferencias estadísticamente significativas en el proceso de permeación. En otro orden de cosas, de acuerdo con los resultados obtenidos, ningún betabloqueante proporciona un flujo que logre alcanzar las concentraciones plasmáticas de fármaco en estado de equilibrio estacionario. No obstante, si se adiciona a la formulación una sustancia con acción penetrante, por ejemplo, un 5% de ácido oléico que permite aumentar aproximadamente 10 veces el valor del flujo, probablemente, con el metoprolol, oxprenolol y propranolol, se alcanzarían concentraciones terapéuticas en estado de equilibrio estacionario. Del trabajo realizado en esta Tesis, se pone de manifiesto que la vía bucal es una buena alternativa a la vía oral y que mediante una formulación apropiada se aumentaría el rendimiento terapéutico de los fármacos. / In recent decades, biopharmaceutical and pharmacokinetic studies have been focused on the investigation of new routes of drug delivery. This would be the case of buccal administration which provides direct access of the drug into the systemic circulation. That route of administration avoids the first-pass hepatic effect and also produces much better patient compliance. The present study focuses on the transmucosal penetration of a series of beta blockers because these drugs, in general, have a high first-pass effect. Different experiments were carried out with porcine buccal mucosa, because of its similarity with human buccal mucosa. Results of the studies reflect statistically significant differences between the permeated amounts of the assayed beta blockers and their permeation parameters. Other important aspect, investigated during the work was the comparison of drug permeation through buccal mucosa using fresh and frozen mucosa, with the aim of facilitating the operational methodology. In those experiments, propranolol was used as a reference drug for being one of the most widely used beta-blockers in clinical practice. The permeation profiles of propranolol through fresh and frozen mucosa were very similar. No statistically significant differences could be demonstrated in the permeation process. According to the results, and the pharmacokinetic characteristics of each drug, no betablocker achieved therapeutic plasma concentrations after transmucosal penetration. However, and according the bibliography, the addition of an enhancer to the formulation, for example 5% of oleic acid, could increase about 10 times the flow rate, and that increase, would allow to some betablockers to reach therapeutic steady state plasma concentrations. The present work shows that buccal administration could be a good alternative to the oral route if an appropriate formulation is developed and would enhance the therapeutic performance of drugs.

The study deals with the synthesis and biological activity of 4 different antitumours: Tetrahydro-[1,4]-dioxanisoquinolines, combretastatin A-4, dioxancarbazoles and resveratrol analogues. This study describes the synthesis strategy and multi-step synthesis of these potential antitumour compounds. Various tetrahydroisoquinolines were synthesized, five of which were biologically tested and have a promising K-Ras inhibition activity. Two of them show a high antiangiogenesis activity, one of which also presents antiosteoporosis properties. Two pirazolone derivatives were synthetized and biologically tested, one of which shows a very high K-Ras inhibition, antiangiogenesis and antiosteoporosis activity and inhibits the G2 cell cycle phases and subphases. Two azoledione combretastatin A-4 derivatives were also synthesized and will be biologically tested. Two dioxancarbazoles were prepared and biologically tested, one of which shows a high K-Ras and angiogenesis inhibition. Finally, four resveratrol analogues were synthesized and biologically tested. Their biological results show a moderate and selective K-Ras inhibition on the studied cell lines. In the future, the rest of the synthesized compounds are to be biologically tested. Further CDKs and topoisomerase II inhibition trials as well as toxicity studies will be carried out. / El estudio trata de la síntesis y la actividad biológica de 4 antitumorales diferentes: Análogos de tetrahidro-[1,4]-dioxanisoquinolinas, de combretastatina A-4, de dioxancarbazol y del resveratrol. El estudio describe la estrategia sintética y la síntesis multietapas de esos compuestos potencialmente antitumorales. Varias tetrahidroisoquinolinas fueron sintetizadas, cinco de ellas fueron probadas biológicamente y presentan una actividad de inhibición de la proteína K-Ras prometedora. Dos de esos compuestos presentan una actividad anti antiangiogénica elevada y uno presenta actividades de antiosteoporosis. Dos derivados de pirazolona fueron sintetizados y probados biológicamente, uno de ellos muestra una inhibición muy elevada de la K-Ras, de antiangiogénesis y de antiosteoporosis e inhibe la fase G2 del ciclo celular y sus subfases. Se han preparado dos derivados de azolediona combretastatina A-4 que se evaluarán biológicamente. Se sintetizaron dos derivados de dioxancarbazol, uno de ellos presenta una actividad alta de la K-Ras y de antiangiogénesis. Finalmente, se prepararon y evaluaron biológicamente cuatros análogos del resveratrol. Los resultados biológicos muestran una inhibición moderada y selectiva de la K-ras en las líneas celulares estudiadas. Próximamente, el resto de los compuestos sintetizados se evaluarán biológicamente. Ensayos adicionales de inhibición de CDKs, de topoisomerasa II y de toxicidad serán llevados a cabo.

Tesi realitzada a l'Institut de Química Avançada de Catalunya (IQAC-CSIC) / En los últimos años, se han dedicado numerosos esfuerzos al desarrollo de nuevos fármacos inhibidores de la entrada del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (HIV-1) en la célula huésped. La principal ventaja de este tipo de inhibidores es que actúan como profilácticos, es decir pueden evitar la infección primaria y la integración del genoma viral en el genoma de la célula huésped. Esto implica una reducción del riesgo de sufrir efectos secundarios, y además, se evita el establecimiento y el mantenimiento de reservorios virales latentes. Estudios recientes han demostrado que pacientes coinfectados por los virus GBV-C y HIV-1, tienen una progresión más lenta de la enfermedad del SIDA (Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida) así como una mayor supervivencia. Los estudios realizados, hasta el momento, indican que existe un mecanismo múltiple por el que la infección del GBV-C ejerce un “efecto protector” en los pacientes infectados con HIV-1. Empleando un modelo de co-infección, se ha observado que el virus GBV-C puede inhibir la replicación del HIV-1 así como la entrada de este último en las células. Según los estudios publicados ciertas regiones peptídicas de las glicoproteínas estructurales E1 y E2 del GBV-C presentan un efecto inhibidor frente al virus del HIV-1, y parece ser que interaccionan con el péptido de fusión de la glicoproteína de envoltura gp41 del virus (PF-HIV-1). Teniendo en cuenta dichos resultados, uno de los objetivos de esta tesis doctoral es el diseño y la síntesis de derivados peptídicos pertenecientes a la región (22-39) de la proteína de envoltura E1 del virus GBV-C (E1P8), la cual en estudios previos ha mostrado una cierta actividad inhibitoria del virus del HIV-1. Se pretende mejorar la actividad antiviral del dominio peptídico E1P8 y así abordar el diseño de nuevos péptidos inhibidores de la entrada del virus del HIV-1. Se pretende evaluar el efecto de los diferentes aminoácidos en la estructura primaria de la secuencia nativa, y de su carga neta, en la actividad anti-HIV-1 del péptido E1P8. Con esta finalidad, se ha realizado un “scanning” posicional mediante la síntesis de 23 péptidos lineales, análogos del E1P8, en los que se ha sustituido cada uno de los aminoácidos de la secuencia original por alanina, y cambiado la carga neta del péptido mediante la sustitución de aminoácidos cargados por aminoácidos neutros. A continuación, se ha llevado a cabo el diseño y la síntesis de nuevas formas de presentación peptídica (varios lipopéptidos y un péptido cíclico). El estudio de la interacción entre los derivados peptídicos del E1P8 y el PF-HIV-1 se ha realizado mediante ensayos biofísicos, utilizando modelos de membrana. Para ello, se han utilizado técnicas fluorimétricas, Balanza de Langmuir, Microscopia de fluorescencia, Dicroísmo Circular y Resonancia de Plasmón Superficial. La actividad biológica de los péptidos se ha estudiado utilizando ensayos celulares y ensayos de inhibición de replicación del virus HIV-1. Los resultados obtenidos permiten concluir que tanto la estructura primaria como la carga neta de E1P8 son esenciales para su actividad anti-HIV-1. Los lipopéptidos interaccionan con el PF-HIV-1 e inhiben la infección del HIV-1 con una mayor actividad que la secuencia nativa. El péptido E1P8 ciclado es el que presenta la mejor actividad inhibitoria del virus HIV-1, por lo que podría considerarse como punto de partida para el diseño de péptidos derivados del GBV-C con aplicación en futuras terapias anti-HIV-1. / Interest in the use of synthetic peptides as inhibitors of HIV-1 fusión and entry is growing significantly, given that they are applicable in combined therapies or when resistance to other antiretroviral drugs is seen and that they act before the virus enters the cell. Recently it has been shown that the coinfection with GBV-C virus and HIV-1 has been associated with slower progression of the illness. Several studies have been published to propose different models of interaction between GBV-C and HIV-1. One of the proposed mechanisms by which GBV-C modulates HIV-1 infection involves inhibiting HIV-1 replication in vitro by GBV-C proteins. In our hands, certain peptide sequences of the E1 envelope protein of the GBV-C virus, as E1P8, inhibit HIV-1 entry, and appear to interact with HIV-1 fusion peptide (FP-HIV-1). Based on these findings, the aim of present thesis is to carry out the design and synthesis of peptides, derivatives of the P8 region of the envelope protein E1 GBV-C, as HIV-1 inhibitors. In order to perform a systematic trial on the structure-activity relationship of these sequences, E1P8 peptide analogues were analyzed in which each of the amino acid residues was replaced by L-Ala. The influence of the total net load of the peptides on the activity through the replacement of residues loaded with neutral amino acids was also studied. Then, the design and synthesis of new strategies of peptide presentation as lipopeptides and cyclic peptide also was performed. The study of interaction between peptide derivatives E1P8 GBV-C and FP-HIV-1 is carried out through biophysical assays with membrane models, cellular assays and finally testing with HIV-1 infection. The results indicate that the primary structure and the net charge of E1P8 influence the activity of the peptide. Lipopeptides interact with FP-HIV-1 and inhibit HIV-1 infectivity better than the native sequence. Although the cyclic E1P8 presents higher inhibitory activity of HIV-1, suggesting that this peptide could be best candidate for use in future antiviral therapies.

La presente Tesis Doctoral, presentada como compendio de publicaciones, tiene como objetivo general la aplicación de diversas técnicas computacionales al estudio de los determinantes moleculares que subyacen en la interacción ligando-receptor. Para ello, se han definido dos líneas de investigación, una de desarrollo metodológico y otra de aplicación. En el capítulo metodológico se incluye un único manuscrito (Juárez-Jiménez et. al., J. Phys. Chem. B, 2014) en el que extiende la metodología Multinivel desarrollada por Forti et. al. (J. Chem. Theory Comput. 2012) al uso de campos de fuerza de mecánica clásica. Dicho estudio es relevante de cara a optimizar la exploración de las preferencias conformacionales de fármacos y otras pequeñas moléculas orgánicas. En concreto, se evalúa el uso de campos de fuerza clásicos para llevar a cabo un muestreo a bajo nivel de teoría de las preferencias conformacionales de moléculas tipo feniletilamina y se comprueba que los resultados obtenidos son consistentes con los datos experimentales descritos en la bibliografia y con los resultados obtenidos con la implementación original del método, donde se empleaba el hamiltoniano semiempírico RM1. En segundo lugar, la nueva implementación del método se utiliza para predecir las preferencias conformacionales del antibiótico estreptomicina, obteniéndose resultados similares a los obtenidos experimentalmente por resonancia magnética nuclear, si bien sugerentes de posibles mejoras en la metodología. El capítulo de aplicación incluye tres publicaciones (Bolea et. al. J. Med. Chem. 2011; Juárez Jiménez et. al. BBA Proteins and Proteomics, 2014 y Viayna et. al. J. Med. Chem. 2014), obtenidas a partir de una colaboración multidisciplinar entre diversos grupos de diseño, síntesis y evaluación farmacológica de compuestos de potencial interés en la enfermedad de Alzheimer. Concretamente, se describe el desarrollo de dos familias de fármacos multipotentes: compuestos iMAO-iAChE y compuestos iBACE-1-iAChE, centrándose la discusión en la elucidación de los modos de unión y las relaciones estructura-actividad de dos series de compuestos multipotentes a sus principales dianas terapéuticas mediante la combinación de técnicas de modelización molecular, tales como el docking y la dinámica molecular. En el primer caso, se describen modelos de unión a AChE y MAO de compuestos híbridos donepezilo-PFN9601, abordándose en detalle los determinantes moleculares de las relaciones estructura-actividad y proponiéndose las causas estructurales del diferente comportamiento cinético observado para el mismo inhibidor en MAO A y en MAO B. Con el fin de mejorar el perfil farmacológico de los inhibidores, también se describe, mediante el empleo de compuestos selectivos MAO A, los determinantes moleculares de la selectividad entre las isoformas A y B que muestran algunos inhibidores de MAO. En el segundo caso, la modelización molecular ha permitido proponer un modo de unión a BACE-1 de compuestos híbridos huprina Y-rheína. Dicho modo de unión, sitúa la unidad de huprina Y en el sitio catalítico, mientras que sugiere que la unidad de rheína quedaría acomodada en un sitio de unión diferente al sitio catalítico, que hasta la fecha no ha sido explorado mediante técnicas de diseño racional de fármacos. Ello abre la puerta al desarrollo de nuevos compuestos que interaccionen con BACE aprovechando dicho centro de unión. / The aim of this doctoral thesis is to use computational techniques to explore the molecular determinants that underlie the ligand-receptor interaction. To this end, it has been elaborated as a compendium of publications following two main research lines. First, the expansion of the Multilevel strategy previously developed in the research group (Forti et. al. J. Chem. Theo. Comput. 2012) to explore the conformational preferences of drug-like molecules. Second, the development of new multitarget directed ligands (MTDL) of potential therapeutic interest against Alzheimer’s disease. The extension of the Multilevel strategy is mainly focused in assessing the suitability of classical force fields as an alternative to the originally implemented RM1 semiempirical Hamiltonian and to investigate the performance of the technique for charged molecules. To this end, the conformational preferences of a set of phenylethyl amines are evaluated with both approximations and the results are compared with experimental data obtained by means of nuclear magnetic resonance techniques, reaching similar conclusions in both cases. Streptomycin is also used as a test case to further test the new implementation of the technique. The results are also consistent with experimental results, but also highlight some aspects that could be improved in future revisions of the methodology. The development of MTDL against Alzheimer’s disease is a multidisciplinary effort in the framework of collaborations with experimental research groups (Bolea et. al. J. Med. Chem. 2011; Juárez Jiménez et. al. BBA Proteins and Proteomics, 2014 y Viayna et. al. J. Med. Chem. 2014). Using several molecular modelling techniques, we disclose putative binding modes to their main therapeutic targets for two families of MTDL: iAChE-iMAO and iAChE-BACE-1. The discussion of structure-activity relationships allows us to rationalize the molecular determinants that justify the isoform selectivity between isoforms A and B of MAO. Furthermore, they also allow us to disclose how compounds bind to BACE-1 taking advantage of an exosite previously unexploited in rational drug design, which pave the way for the development of novel drug candidates.

This work had the objective to achieve the knowledge of the dosimetric quantities related to chest and abdomen computed tomography (CT) examinations of pediatric patients, in Belo Horizonte city. The reason of this work is based on the fact that the probability of health detriment in children, which it may be caused by radiation, is higher than in adults. Besides, although in many countries the knowledge and control of patient doses is a normal procedure, this safety culture does not exist in Brazil. Another objective of this work was to compare the dosimetric quantity values with the Diagnostic Reference Levels (DRLs); when it was needed, an optimization process was applied and the quality of the diagnostic image obtained with the optimized technical parameters was analyzed. This study was carried out in five hospitals, where the weighted air kerma index (Cw), the volumetric air kerma index (Cvol), the air kerma length product (PKL,CT), the Effective Dose (E) and the Normalized Effective Dose (En) were determined; three methods were adopted for measurements: the ionization chamber inside a chest pediatric phantom, radiochromic films and the CT-EXPO software. The optimization process was applied to a single hospital through variations in the current (mA) and voltage (kV) of the x-ray tube for the protocols used for abdomen CT examinations. The analysis of the quality of the diagnostic image was done by Normal Distribution and ROC analysis; spatial resolution analysis was used through MTF determination and the noise level was judged in terms quantitative and qualitative. Results of the dosimetric quantities showed that they significantly differed between single-slice and multi-slice tomography units, but their values were always below the recommended DRLs. The optimized values of the dosimetric quantities obtained after the optimization process showed that it was possible to reduce the radiation exposure of pediatric patient without losing the image quality, despite the low dose values found. Dose values very lower than DRLs might induce to an unjustified practice of increasing the dose for improving the image diagnostic quality; the results showed that if it was done there was not a relevant change in the quality. Based on the results of this work, it was possible to state that the dosimetric quantity values in the studied pediatric tomographic procedures were lower than DRLs, but there was still room of optimization for patient protection and to maintain an adequate image diagnostic quality in computed tomography. / Este trabalho teve como um dos objetivos o conhecimento das grandezas dosimétricas em exames de tomografia computadorizada pediátrica do tórax e do abdômen na cidade de Belo Horizonte. A justificativa para este objetivo está no fato da probabilidade de efeitos danosos à saúde, causados pela radiação, ser maior em crianças que em adultos e, diferentemente de outros países onde o conhecimento e controle dos valores das doses é fato normal, esta cultura de segurança ainda não existe no Brasil. Outro objetivo deste trabalho foi confrontar os valores das grandezas dosimétricas com os Níveis de Referência em Diagnóstico (NRD), aplicando, quando necessário, o processo de otimização e fazendo uma análise da qualidade diagnóstica das imagens obtidas com os parâmetros técnicos otimizados. O estudo foi realizado em cinco hospitais, sendo as grandezas Índice Ponderado de Kerma no Ar (Cw), Índice Volumétrico de Kerma no Ar (Cvol), Produto Kerma-Comprimento (PKL,CT), Dose Efetiva (E) e Dose Efetiva Normalizada (En) obtidas por meio de três métodos distintos: com uma câmara de ionização e um objeto simulador de tronco pediátrico, com filmes radiocrômicos e com o software CT-EXPO. O processo de otimização, aplicado em apenas um hospital, consistiu de sugestões para variações na corrente (mA) e da tensão (kV) do tubo no protocolos para a obtenção de exames de tomografia do abdômen. A metodologia para a análise da qualidade diagnóstica foi feita a partir da Distribuição Normal e Análise ROC, ambas de cunho inédito, pela análise da resolução espacial através da obtenção da MTF e julgamento quantitativo e qualitativo do ruído. Os resultados obtidos para as grandezas dosimétricas mostraram uma diferença significativa entre tomógrafos singleslice e multi-slice, mas com valores abaixo do NRD recomendado. Os valores obtidos com o processo de otimização indicaram que é possível reduzir a exposição do paciente pediátrico à radiação, mesmo quando as doses são consideradas baixas, não acarretando na perda em qualidade diagnóstica. A obtenção de doses com valores muito inferiores aos NRD pode induzir ao aumento da exposição à radiação, na tentativa de ganho na qualidade diagnóstica da imagem; porém, os resultados das análises mostraram que não houve ganho significativo na qualidade da imagem, tornando o procedimento uma prática não justificada. Com base nos resultados, foi possível afirmar que as grandezas dosimétricas envolvidas em procedimentos tomográficos pediátricos estão abaixo dos NRD recomendados, porém que há espaço para o processo de otimização, preservando ainda mais a integridade física do paciente e mantendo a adequada qualidade diagnóstica da imagem tomográfica.

Este estudo permitiu a padronização da densidade mineral óssea (DMO) na extremidade distal do rádio de 36 cães adultos da raça Rottweiler, por meio da densitometria óptica radiográfica. Os membros foram radiografados juntamente com uma escala de referência confeccionada em alumínio. As radiografias foram digitalizadas e analisadas por um programa de computador para comparação de tonalidades de cinza entre as duas imagens da escala de referência (padrão e a radiografada junto ao osso). Posteriormente aos ajustes realizados nos tons da imagem, foram feitas as medições densitométricas no osso, cujos valores foram expressos em milímetros de alumínio (mmAl). Também foram estudadas correlações entre a DMO e o sexo, peso corpóreo e as medidas externas como o comprimento da coluna, altura do animal e circunferência na extremidade distal do membro em estudo. Os valores médios e os desvios-padrão da densidade mineral óssea na extremidade distal do rádio foram: para a região metafisária foi de 7,88 ± 0,89 mmAl, para a região diafisária 1 de 8,58 ± 0,80 mmAl e para região diafisária 2 de 9,00 ± 0,74 mmAl. / This study allowed the standardization of the bone mineral density (BMD) of the distal extremity of the radio of 36 dogs adults in Rottweiler breed by radiographic optic densitometry. The limbs of the animals were radiographed with scale of aluminum that served as a reference. The radiographies images were digitalized and analyzed by a computer program for comparison of gray tones between the standard image and the image of the reference scale radiographed with the bone. Afterwards the values of density were expressed in millimeters of aluminum. Also studied the correlations between BMD and the sex, weight and external measures as the length of spine, height of the animal and circumference the distal extremity of the limb in study. The mean values and standard deviations of the bone mineral density of the distal extremity of the radio were: for the metaphysary region the average of BMD of 7,88 ± 0,89 mmAl, the diaphysary region 1 the average of BMD of 8,58 ± 0,80 mmAl and for diaphysary region 2 of BMD of 9,00 ± 0,74 mmAl.

Orientador: Ney Lemke / Resumo: Os efeitos biológicos da radiação ionizante são causados pela deposição de energia no tecido. Efeitos de baixas doses de radiação ionizante induzem consequências de longo alcance, especialmente durante desenvolvimento intrauterino. Os riscos de exposição in utero permanecem controversos na literatura e nenhum efeito biológico é relatado em doses abaixo de 50 mGy. Modelos animais são frequentemente utilizados para investigação dos efeitos biológicos das radiações ionizantes pois permitem a manipulação de diversas configurações experimentais. Esse trabalho investigou o impacto da exposição intrauterina a baixa dose de radiação ionizante no desenvolvimento pós-natal de ratos. Ratas Wistar foram expostas a 15 mGy de raios X nos dias gestacionais 8 e 15, respectivamente o início e o fim da fase organogênese. Quatro animais machos foram selecionados de cada ninhada para o estudo. Nos recém-nascidos foram realizados o teste de abertura dos olhos e o teste de geotaxia negativa. Nas idades pós-natais de 30 e 70 dias, jovens e adultos, os animais foram testados no teste de campo aberto, no labirinto em cruz elevado e hole board. Avaliou-se o ganho de peso de todos os animais ao longo de todo experimento. Através dos resultados das avaliações identificou-se menor ganho de peso dos ratos expostos durante o desenvolvimento fetal quando adultos. Foram encontradas fortes evidências de alterações comportamentais e prejuízos no sistema nervoso central, também, observou-se comprometimento da c... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Low-dose ionizing radiation may induce far-reaching consequences in human, especially regarding intrauterine development. Many studies have documented that the risks of in utero irradiation remain controversial and no effect is reported at doses below 50 mGy. Animal models are often used to clarify the non-fully understood impact of intrauterine irradiation and allow the manipulation of several experimental setups, making possible the analysis of a wide range of end points. We investigated the impact of in utero low-dose X-ray irradiation on postnatal development in rat offspring through a set of well-established behavioral parameters and weight gain. We exposed pregnant Wistar to 15 mGy of X-rays, which is a low-dose value into diagnostic range that can be achieved in a single radiological exam, on gestational days 8 and 15 and control. Four male animals were select from each litter. At infant age, eye-opening test and negative geotaxis tests were performed. Animals were tested at postnatal ages 30 and 70 days in open field, elevated plus-maze, and hole board tests. We evaluated the weight gain of all animals throughout the experiment. Our results present difference between irradiated and non-irradiated: lower weight gain when adults, impairments in the central nervous system since infant phase, behavioral changes persisting later into life and impairment of motor coordination in irradiated animals. The present study found that even low-doses exposure, considered safe, durin... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor