Zugl.: Hannover, Univ., Diss., 2008

Zugl.: Erlangen, Nürnberg, Univ., Diss., 2008

Universiẗat, Diss., 2000--Kassel. / Erscheinungsjahr auf der Haupttitelstelle: 2000. Lizenzpflichtig.

Im Rahmen dieser Doktorarbeit sollte anknüpfend an die Ergebnisse aus vo-rangegangenen Untersuchungen der AG Tessmer, das von Büchner et al. [1] vorgestellte Modell zur DNA-Schadenserkennung, welches im Speziellen auf Daten zu den Glykosylasen hTDG und hOGG1 basierte, auf seine Allgemein-gültigkeit für DNA-Glykosylasen untersucht werden. Das Modell beschreibt den Prozess der Schadenserkennung als eine notwendige Übereinstimmung der passiven Biegung am Schadensort mit dem aktiven BiegungswinkeI der scha-densspezifischen Glykosylase. Ein wesentlicher Bestandteil dieser Arbeit war zudem die Etablierung einer automatisierten Messsoftware zur objektiven Biegewinkelmessung an DNA-Strängen in rasterkraftmikroskopischen Aufnah-men. Dies wurde mit verschiedenen Bildverarbeitungsprogrammen sowie einer in MATLAB implementierten Messsoftware erreicht und das Programm zudem auf die Biegewinkelmessung von proteininduzierten Biegewinkeln erweitert. Zur Anwendung kam die Methode der automatisierten Biegewinkelmessung sowohl an rasterkraftmikroskopischen Aufnahmen der Glykosylase MutY gebunden an ungeschädigter DNA als auch an Aufnahmen von DNA mit und ohne Basen-schaden. Neben oxoG:A und G:A, den spezifischen MutY-Zielschäden, wurden auch andere Basenschäden wie beispielsweise oxoG:C und ethenoA:T vermes-sen und zudem die von der Glykosylase MutY an ungeschädigter DNA induzier-te Biegung mit den Biegewinkeln der jeweiligen Zielschäden verglichen. Die Übereinstimmung in den Konformationen der Zielschäden und der Reparatur-komplexe auch für die Glykosylase MutY (wie bereits für hTDG und hOGG1 in oben genannter Arbeit gezeigt) erlauben ein verbessertes Verständnis der Schadenssuche und -erkennung durch DNA-Glykosylasen, indem sie die All-gemeingültigkeit einer Biegungsenergie-basierten initialen Schadenserkennung durch DNA-Glykosylasen unterstützen. Die etablierte Messsoftware kann zu-künftig an weiteren DNA-Schäden und den entsprechenden Protein-DNA-Komplexen ihre Anwendung finden und kann somit durch die effektive Gewin-nung objektiver Daten in großer Menge zur Stützung des Modells beitragen. / The focus of this thesis was to test the general applicability of a model for initial lesion detection by base excision repair (BER) glycosylases. This thesis built on previous results from the Tessmer laboratory on the human base excision re-pair (BER) glycosylases hTDG and hOGG1 (Büchner et al. [1]). Based on this work, a model for initial lesion detection by glycosylases had been proposed that describes the process of damage recognition as a necessary match of the passive bending at the point of damage with the active bending by the damage-specific glycosylase. An essential component of this work was also the estab-lishment of an automated measurement software for objective bend angle measurements on DNA strands in atomic force microscopy (AFM) images. This was achieved with various image processing programs and a custom written MATLAB software. In addition, the procedure was extended to the measure-ment of DNA bend angles in protein-DNA complexes. In particular, the automa-ted bend angle analsyis was applied to AFM images of the glycosylase MutY bound to non-specific DNA and MutY target lesions (oxoG:A and G:A), as well as other DNA damages (oxoG:C and ethenoA:T). In the analyses, DNA bending induced by MutY in undamaged DNA was measured and compared to bending at the respective target damage. Similarities in the conformations of target da-mage and repair complexes also for this additional glycosylase (as already shown for hTDG and hOGG1 in above mentioned work) allow an improved un-derstanding of DNA glycosylase damage search and recognition by supporting the general validity of bending energy-based initial damage detection by DNA glycosylases. In addition, the established measurement software can also be used to measure DNA bending by other protein systems in an unbiased manner and on a high-throughput scale. The software thus contributes to the effective acquisition of objective data.

Die Anwendung des Verfahrens der inversen Parameteridentifikation auf die Nanoindentation mit einer neuen Materialklasse (amorphe Legierungen) ist Hauptgegenstand der vorliegenden Arbeit. Um die Methode auf ihre Zuverlässigkeit hin zu überprüfen, werden darüber hinaus die drei Härtevergleichsplatten HV240, HV400 und HV720 sowie das oxidische Glas BK7, deren Nanoindentationsmessungen von Dipl.-Ing. André Clausner schon zu einem früheren Zeitpunkt vorgenommen wurden, zur Berechnung herangezogen. Die Auswahl der Materialien erfolgte so, dass diese einen möglichst großen Bereich von Y abdecken, von BK7 bis hin zu HV240. Damit soll gezeigt werden, dass das Verfahren der inversen Parameteridentifikation für einen großen Bereich von natürlich vorkommenden Materialien genutzt werden kann. Der Schwerpunkt liegt dabei auf der Bestimmung des Fließverhaltens, das durch die Parameter Fließgrenze1 Y und Verfestigungsexponent n erfolgt. Ziel ist es, in Zukunft auf weitere Experimente, die bisher zur Bestimmung der mechanischen Materialeigenschaften genutzt wurden und häufig zur Zerstörung der Proben führten, verzichten zu können. Für viele Gläser, z.B. BK7, sind derartige zerstörende Versuche nicht anwendbar, weil spröde Materialien splittern statt plastisch zu fließen. Dieser Arbeit liegt die Methode der Finiten-Elemente zugrunde, um eine inverse Parameteridentifikation zu realisieren. Sie wird hier eingesetzt, weil es sich bei plastischer Verformung um einen nichtlinearen Prozess2 handelt, der analytisch nicht mehr geschlossen gelöst werden kann. Die Simulationssoftware ANSYS R und ein Optimierungsmodul (SPC-OPT) der Fakultät für Maschinenbau dienen zur Berechnung. Bei der Simulation werden dabei ein zweidimensionales Modell und ein realitätsnahes dreidimensionales Modell eingesetzt.

Im Fokus dieser Arbeit stand der Aufbau einer auf DNA basierenden Nanostruktur. Der universelle Vier-Buchstaben-Code der DNA ermöglicht es, Bindungen auf molekularer Ebene zu adressieren. Die chemischen und physikalischen Eigenschaften der DNA prädestinieren dieses Makromolekül für den Einsatz und die Verwendung als Konstruktionselement zum Aufbau von Nanostrukturen. Das Ziel dieser Arbeit war das Aufspannen eines DNA-Stranges zwischen zwei Fixpunkten. Hierfür war es notwendig, eine Methode zu entwickeln, welche es ermöglicht, Funktionsmoleküle als Ankerelemente ortsaufgelöst auf eine Oberfläche zu deponieren. Das Deponieren dieser Moleküle sollte dabei im unteren Mikrometermaßstab erfolgen, um den Abmaßen der DNA und der angestrebten Nanostruktur gerecht zu werden. Das eigens für diese Aufgabe entwickelte Verfahren zum ortsaufgelösten Deponieren von Funktionsmolekülen nutzt das Bindungspaar Biotin-Neutravidin. Mit Hilfe eines Rasterkraftmikroskops (AFM) wurde eine zu einem „Stift“ umfunktionierte Rasterkraftmikroskopspitze so mit der zu deponierenden „Tinte“ beladen, dass das Absetzen von Neutravidin im unteren Mikrometermaßstab möglich war. Dieses Neutravidinmolekül übernahm die Funktion als Bindeglied zwischen der biotinylierten Glasoberfläche und dem eigentlichen Adressmolekül. Das somit generierte Neutravidin-Feld konnte dann mit einem biotinylierten Adressmolekül durch Inkubation funktionalisiert werden. Namensgebend für dieses Verfahren war die Möglichkeit, Neutravidin mehrmals zu deponieren und zu adressieren. Somit ließ sich sequenziell ein Mehrkomponenten-Feld aufbauen. Die Einschränkung, mit einem AFM nur eine Substanz deponieren zu können, wurde so umgangen. Ferner mußten Ankerelemente geschaffen werden, um die DNA an definierten Punkten immobilisieren zu können. Die Bearbeitung der DNA erfolgte mit molekularbiologischen Methoden und zielte darauf ab, einen DNA-Strang zu generieren, welcher an seinen beiden Enden komplementäre Adressequenzen enthält, um gezielt mit den oberflächenständigen Ankerelementen binden zu können. Entsprechend der Geometrie der mit dem AFM erzeugten Fixpunkte und den oligonukleotidvermittelten Adressen kommt es zur Ausbildung einer definierten DNA-Struktur. Mit Hilfe von fluoreszenzmikroskopischen Methoden wurde die aufgebaute DNA-Nanostruktur nachgewiesen. Der Nachweis der nanoskaligen Interaktion von DNA-bindenden Molekülen mit der generierten DNA-Struktur wurde durch die Bindung von PNA (peptide nucleic acid) an den DNA-Doppelstrang erbracht. Diese PNA-Bindung stellt ihrerseits ein funktionales Strukturelement im Nanometermaßstab dar und wird als Nanostrukturbaustein verstanden. / The main aim of this work was the development of a DNA-based nanostructure. The universal four-letter code of DNA allows addressing bonds at the molecular level. The chemical and physical property of DNA makes this macromolecule an ideal candidate as a construction element for nanostructures. The aim of this work was to span a DNA strand between two fixed points. For this purpose it was necessary to develop a method which makes it possible to deposit functional molecules as anchoring elements with highly spatial resolution on a surface. These molecules should be immobilized on the lower micrometer scale to meet the requirements of the desired nanostructure. The method that has been developed for this task, which enables to deposit functional molecules, uses the binding pair biotin-neutravidin. Using the tip of an atomic force microscope (AFM), which can be uses like a pen, it was possible to deposit neutravidin on the lower micrometer scale. This neutravidin molecule is the linking element between the biotinylated glass surface and the actual address molecule. The thus generated neutravidin field could then be functionalized with a biotinylated molecule by incubation. The method has been published as sequential spotting method because it enables a sequential functionalization of neutravidin after it has been deposited. It was so possible to build up a multi-component array. The limitation of being able to deposit only one single substance with an AFM has been circumvented. It also was necessary to create anchor elements in order to immobilize the DNA at defined positions. The processing of the DNA was carried out using molecular biological methods and aimed at generating a DNA strand, which at both ends has a complementary sequence for binding to the surface bound anchor elements. The defined structure is a result of the geometry of the fixed points, generated by the AFM. Using fluorescence microscopy, the constructed DNA nanostructure was detected. The proof of the interaction of DNA-binding molecules with the DNA structure was carried out by the binding of PNA (peptide nucleic acid), which is capable of binding to double stranded DNA. The PNA and its DNA-interaction is a functional building block in the nanometer scale and can be regarded as a promising nanostructure.

Die selbständige, gerichtete Bewegung von biologischen Zellen ist eine der grundlegendsten und komplexesten Erscheinungen der Natur. In höher entwickelten Lebewesen spielt die Zellbewegung eine wichtige Rolle, z.B. bei der Entwicklung des Organismus, bei der Funktion des Immunsystems aber auch bei der Metastase von Krebszellen. Die physikalischen Prozesse die dieser Fähigkeit zugrunde liegen, sind im Fokus dieser Arbeit. Um besser zu verstehen welche Prozesse im Einzelnen und in welcher Kombination den Zellen erlauben sich gerichtet fortzubewegen, wurde in der vorliegenden Arbeit ein representatives Modellsystem von motilen Zellen untersucht. Fischkeratozyten bewegen sich in vitro regelmäßig und gleichförmig, relativ schnell über die Substratfläche, und stellen aus physikalischer Sicht eine optimierte, sich selbständig bewegende Polymermaschine dar. Um Kräfte in der Bewegungsebene der Zellen zu untersuchen, wurde in der vorliegenden Arbeit eine neuartige, auf dem Rasterkraftmikroskop (RKM) basierende Methode entwickelt. Zusätzlich wurden hochaufgelöste, mit dem Phasenkontrastmikroskop aufgenommene Bilderserien analysiert und die Geschwindigkeitsverteilung in der Zelle durch Korrelationsalgorithmen bestimmt. Die Struktur des Polymernetzwerkes wurde in mit Fluoreszenzfarbstoff markierten Zellen untersucht, und elastische Eigenschaften wurden mit rheologischen RKM-Messungen bestimmt. Traktionskraftmessungen an elastischen Substraten runden das umfassende Bild ab. Durch Veränderung der molekularen Strukturen mit verschiedenen Chemikalien, die unterschiedliche Prozesse im Gesamtsystem stören, konnte nun ein Phasenraum der Kraftgenerierungsprozesse untersucht und unterschiedliche Effekte verschiedenen Prozessen eindeutig zugeordnet werden. Es wurde somit erstmalig experimentell bewiesen, dass die Polymerisation von Aktin die treibende Kraft am vorderen Rand der Zelle ist. Darüber hinaus wurde das Verhalten des Kraftaufbaus mit einem Model beschrieben, das Aufschluss über die Funktionsweise der darunterliegenden Aktinpolymerstrukturens gibt. Desweiteren wurde in der Mitte der Zelle, zwischen vorderem Rand und Zellkörper, erstmalig eine rückwärtsgerichtete Kraft gemessen, die wichtig ist um ein Kräftegleichgewicht zu erstellen. Ein Model das auf entropischen Kräften im Polymersystem basiert, beschreibt diese kontraktilen Kräfte und ordnet sie der Depolymerisation von Aktin zu. Die Bewegung des Zellkörpers wiederum basiert auf dem Zusammenspiel dieser beiden Mechanismen, sowie der Kontraktion von Aktin und Aktinbündeln durch molekulare Motoren. Eine umfassendes Charakterisierung über verschiedene lokale Mechanismen und ihrer Wechselwirkungen konnte somit erstellt werden, und damit das Verständnis der Kraftgenerierung zur Zellbewegung vertieft.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden elektrische Messungen auf nanoskopischer Skala an Ku- pferiodid (CuI) Dünnschichten und Kristallen mittels Rasterkraftmikroskopie durchgeführt. Der Schwerpunkt lag dabei auf polykristallinen Dünnschichten.
Dafür wurden polykristalline γ-CuI Filme mittels reaktiver Kathodenzerstäubung (Sputtern) hergestellt. Diese bestehen aus kristallinen Körnern im Nanometerbereich, welche durch Korngrenzen voneinander getrennt sind. Sowohl die Körner als auch die Korngrenzen beeinflussen den Stromfluss innerhalb der Schichten und an der Oberfläche. Zusätzlich treten Veränderungen der Leitfähigkeit aufgrund von Desorptions,- und Adsorptionseffekten auf. Im Rahmen dieser Arbeit konnte ein Verfahren entwickelt werden, mit dem die elektrischen Eigenschaften differenziert von den Oberflächeneigenschaften (Kornoberfläche bzw. Korngrenze) untersucht werden können. Damit wird eine Korrelation zwischen den Defektdichten und den daraus resultierenden elektrischen Eigenschaften erzeugt. Zusätzlich wurde ein neues Mess,- und Auswertungsverfahren entwickelt, mit dem große Mengen an Rasterkraftmikroskopiedaten aufgezeichnet und bearbeitet werden können. Dadurch war es möglich, Zusammenhänge zwischen der elektrischen Oberflächenleitung und externen Parametern wie der Umgebungstemperatur oder der angelegten Spannung aufzudecken. Dies führte zu tiefgreifenden Einblicken in die Mechanismen, welche die Oberflächenleitfähigkeit von Kupferiodid verstärken oder abschwächen. Um ein gesamtheitliches Bild der morphologischen und elektrischen Eigenschaften von Kupferiodid zu erhalten, wurden in dieser Arbeit verschiedene Messmethoden eingesetzt. Sowohl mikroskopische Messungen wie Rasterkraftmikroskopie und Transmissionselektronenmikroskopie als auch makroskopische Messungen größerer Bereiche der Dünnshicht wie Hall-Effekt Messungen und Röntgendiffraktometrie wurden zusammengetragen. So konnten Erkenntnisse über unterschiedlich strukturierte polykristalline Dünnschichten mit veränderten Korngrößen und -formen sowie über chemisch erzeugte Kristalle gewonnen werden. Von besonderer Bedeutung sind Untersuchungen, die Umwelteinflüsse wie Sauerstoffdiffusion, Wasseradsorption und -desorption sowie Oberflächenveränderungen durch Reibungskräfte während der Messung genauer bestimmen. Basierend auf diesen Ergebnissen wird ein Modell vorgestellt, welches die elektrischen Eigenschaften und das Leitungsverhalten der Oberflächen beschreibt. Mit Hilfe dieses Modells lassen sich auch die oben genannten Umwelteinflüsse, insbesondere der Einfluss der Sauerstoffadsorption, auf die elektrischen Eigenschaften der Kupferiodid Dünnschichtoberflächen erklären. Zusätzlich ist es damit möglich, die lokalen Unterschiede der Leitfähigkeit in Abhängigkeit von Defektdichten (Kornoberflächen und Korngrenzen) und den Einfluss von Temperatur, Wasser an der Oberfläche und Reibungskräften während der Messung zu erklären.:Contents 1  Introduction 2  Theoretical background 2.1 Material properties: Copperiodide 2.2  Defects in semiconductors 2.2.1  Defects in general 2.2.2  Surface states 2.2.3  Grain boundaries 3  Material characterization and fabrication 3.1  Atomic force microscopy (AFM) in general 3.1.1 Contact and non-contact mode 3.1.2 Deployed AFMs 3.1.3 Deployed probes 3.2  Nanoelectrical AFM Modes 3.2.1  Current probe AFM( cp-AFM) 3.2.2  Scanning capacitance microscopy 3.2.3  Kelvin probe force microscopy 3.2.4  Sequential atomic force microscopy and correlation with masks 3.3  Hall-effect measurement method according to van der Pauw 3.4  X-ray diffraction 3.5  Sample fabrication with sputtering 4  Experimental results 4.1 Sputtered thin films: copper iodide with triangular shaped grains 4.1.1  Temperature dependent growth 4.1.2  Morphology and twinning: Scanning electron microscopy and 
transmission electron microscopy 4.1.3  Sequential cp-AFM: Voltage 4.1.4  Voltage point spectroscopy 4.1.5 Time-dependent variations 4.1.6 Plasmatreatment 4.1.7 Sequential cp-AFM: Temperature 4.1.8 Sequential cp-AFM: Pressure 4.1.9 Scanning capacitance microscopy 4.2  Sputtered thin films: Copper iodide with isolated nano crystals 4.3  Micro crystals 4.4  Thin films fabricated by pulsed laser deposition 
 5  Proposed model of surface conductance 6  Supporting measurements and technical remarks 6.1  Current probe AFM 6.1.1 Influence of contact area 6.1.2 Independence from scan direction 6.1.3 Line shaped artefacts
 6.2  Sequential AFM 6.2.1 Independence from applied voltage 6.2.2 Drift of samples 
 6.3  Sequential scanning capacitance microscopy 6.4  Kelvin probe force microscopy 6.4.1 Tip sample distance dependency 6.4.2 Light and position on sample
 6.5  The deployed code and evaluation approach 7  Summary and outlook
 Abbreviations Bibliography List of Own and Contributed Articles / Abstract: Within the scope of this work, electrical investigations on a nanoscopic scale on copper iodide (CuI) thin films and crystals were carried out using atomic force microscopy. The focus was particularly on polycrystalline thin films.
For this purpose, γ-CuI films were fabricated by means of reactive sputtering. These consist of crystalline grains in the nanometre range, which are separated from each other by grain boundaries. Both, the grains and the grain boundaries influence the current within the sample and at the surface. In addition, changes in conductivity occur due to desorption and adsorption effects. In this work, a method has been developed which allows the investigation of electrical properties differentiated by surface characteristics (grain surface or grain boundary). This allows a correlation between the defect densities and the resulting electrical properties.
In addition, a new measurement and evaluation method was developed that allows large amounts of atomic force microscopy data to be recorded and processed. This made it possible to determine correlations between the electrical surface conduction and external parameters such as the temperature during the measurement and also the applied voltage. This led to profound insights into the mechanisms that enhance and attenuate the surface conductivity of copper iodide. In order to obtain an overall picture of the morphological and electrical properties of copper iodide, various measurement methods were used in this work. Microscopic measurements such as atomic force microscopy and transmission electron microscopy as well as macroscopic measurements of larger areas of the thin films such as Hall-effect measurements and X-ray diffraction were combined. Thus, it was possible to gather findings on differently structured polycrystalline thin films with various grain sizes and shapes and chemically fabricated millimetre sized crystals. Of particular importance are investigations that determine environmental influences such as oxygen diffusion and water adsorption/desorption as well as changes in the surface conduction due to frictional forces during the measurement. Based on these results, a model is presented which describes the electrical properties and the conduction behaviour of the surfaces. With the help of this model, the influence of the above mentioned environmental influences, in particular of oxygen adsorption, on the electrical properties of the copper iodide thin film surfaces can be explained. In addition, it is possible to explain the local differences in conductivity as a function of defect densities (grain surfaces/grain boundaries) and the influence of temperature during measurement, water on the surface and friction forces during measurement.:Contents 1  Introduction 2  Theoretical background 2.1 Material properties: Copperiodide 2.2  Defects in semiconductors 2.2.1  Defects in general 2.2.2  Surface states 2.2.3  Grain boundaries 3  Material characterization and fabrication 3.1  Atomic force microscopy (AFM) in general 3.1.1 Contact and non-contact mode 3.1.2 Deployed AFMs 3.1.3 Deployed probes 3.2  Nanoelectrical AFM Modes 3.2.1  Current probe AFM( cp-AFM) 3.2.2  Scanning capacitance microscopy 3.2.3  Kelvin probe force microscopy 3.2.4  Sequential atomic force microscopy and correlation with masks 3.3  Hall-effect measurement method according to van der Pauw 3.4  X-ray diffraction 3.5  Sample fabrication with sputtering 4  Experimental results 4.1 Sputtered thin films: copper iodide with triangular shaped grains 4.1.1  Temperature dependent growth 4.1.2  Morphology and twinning: Scanning electron microscopy and 
transmission electron microscopy 4.1.3  Sequential cp-AFM: Voltage 4.1.4  Voltage point spectroscopy 4.1.5 Time-dependent variations 4.1.6 Plasmatreatment 4.1.7 Sequential cp-AFM: Temperature 4.1.8 Sequential cp-AFM: Pressure 4.1.9 Scanning capacitance microscopy 4.2  Sputtered thin films: Copper iodide with isolated nano crystals 4.3  Micro crystals 4.4  Thin films fabricated by pulsed laser deposition 
 5  Proposed model of surface conductance 6  Supporting measurements and technical remarks 6.1  Current probe AFM 6.1.1 Influence of contact area 6.1.2 Independence from scan direction 6.1.3 Line shaped artefacts
 6.2  Sequential AFM 6.2.1 Independence from applied voltage 6.2.2 Drift of samples 
 6.3  Sequential scanning capacitance microscopy 6.4  Kelvin probe force microscopy 6.4.1 Tip sample distance dependency 6.4.2 Light and position on sample
 6.5  The deployed code and evaluation approach 7  Summary and outlook
 Abbreviations Bibliography List of Own and Contributed Articles

Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with atomic force microscope (AFM) has advanced our knowledge of the mechanical aspects of biological processes, and helped us take big strides in the hitherto unexplored areas of protein (un)folding. One such virgin land is that of membrane proteins, where the advent of AFM has not only helped to visualize the difficult to crystallize membrane proteins at the single-molecule level, but also given a new perspective in the understanding of the interplay of molecular interactions involved in the construction of these molecules. My PhD work was tightly focused on exploiting this sensitive technique to decipher the intra- and intermolecular interactions in membrane proteins, using bacteriorhodopsin and bovine rhodopsin as model systems. Using single-molecule unfolding measurements on different bacteriorhodopsin oligomeric assemblies - trimeric, dimeric and monomeric - it was possible to elucidate the contribution of intra- and interhelical interactions in single bacteriorhodopsin molecules. Besides, intriguing insights were obtained into the organization of bacteriorhodopsin as trimers, as deduced from the unfolding pathways of the proteins from different assemblies. Though the unfolding pathways of bacteriorhodopsin from all the assemblies remained the same, the different occurrence probability of these pathways suggested a kinetic stabilization of bacteriorhodopsin from a trimer compared to that existing as a monomer. Unraveling the knot of a complex G-protein coupled receptor, rhodopsin, showed the existence of two structural states, a native, functional state, and a non-native, non-functional state, corresponding to the presence or absence of a highly conserved disulfide bridge, respectively. The molecular interactions in absence of the native disulfide bridge mapped onto the three-dimensional structure of native rhodopsin gave insights into the molecular origin of the neurodegenerative disease retinitis pigmentosa. This presents a novel technique to decipher molecular interactions of a different conformational state of the same molecule in the absence of a high-resolution X-ray crystal structure. Interestingly, the presence of ZnCl2 maintained the integrity of the disulfide bridge and the nature of unfolding intermediates. Moreover, the increased mechanical and thermodynamic stability of rhodopsin with bound zinc ions suggested a plausible role for the bivalent ion in rhodopsin dimerization and consequently signal transduction. Last but not the least, I decided to dig into the mysteries of the real mechanisms of mechanical unfolding with the help of well-chosen single point mutations in bacteriorhodopsin. The monumental work has helped me to solve some key questions regarding the nature of mechanical barriers that constitute the intermediates in the unfolding process. Of particular interest is the determination of altered occurrence probabilities of unfolding pathways in an energy landscape and their correlation to the intramolecular interactions with the help of bioinformatics tools. The kind of work presented here, in my opinion, will not only help us to understand the basic principles of membrane protein (un)folding, but also to manipulate and tune energy landscapes with the help of small molecules, proteins, or mutations, thus opening up new vistas in medicine and pharmacology. It is just a matter of a lot of hard work, some time, and a little bit of luck till we understand the key elements of membrane protein (un)folding and use it to our advantage.

Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with atomic force microscope (AFM) has advanced our knowledge of the mechanical aspects of biological processes, and helped us take big strides in the hitherto unexplored areas of protein (un)folding. One such virgin land is that of membrane proteins, where the advent of AFM has not only helped to visualize the difficult to crystallize membrane proteins at the single-molecule level, but also given a new perspective in the understanding of the interplay of molecular interactions involved in the construction of these molecules. My PhD work was tightly focused on exploiting this sensitive technique to decipher the intra- and intermolecular interactions in membrane proteins, using bacteriorhodopsin and bovine rhodopsin as model systems. Using single-molecule unfolding measurements on different bacteriorhodopsin oligomeric assemblies - trimeric, dimeric and monomeric - it was possible to elucidate the contribution of intra- and interhelical interactions in single bacteriorhodopsin molecules. Besides, intriguing insights were obtained into the organization of bacteriorhodopsin as trimers, as deduced from the unfolding pathways of the proteins from different assemblies. Though the unfolding pathways of bacteriorhodopsin from all the assemblies remained the same, the different occurrence probability of these pathways suggested a kinetic stabilization of bacteriorhodopsin from a trimer compared to that existing as a monomer. Unraveling the knot of a complex G-protein coupled receptor, rhodopsin, showed the existence of two structural states, a native, functional state, and a non-native, non-functional state, corresponding to the presence or absence of a highly conserved disulfide bridge, respectively. The molecular interactions in absence of the native disulfide bridge mapped onto the three-dimensional structure of native rhodopsin gave insights into the molecular origin of the neurodegenerative disease retinitis pigmentosa. This presents a novel technique to decipher molecular interactions of a different conformational state of the same molecule in the absence of a high-resolution X-ray crystal structure. Interestingly, the presence of ZnCl2 maintained the integrity of the disulfide bridge and the nature of unfolding intermediates. Moreover, the increased mechanical and thermodynamic stability of rhodopsin with bound zinc ions suggested a plausible role for the bivalent ion in rhodopsin dimerization and consequently signal transduction. Last but not the least, I decided to dig into the mysteries of the real mechanisms of mechanical unfolding with the help of well-chosen single point mutations in bacteriorhodopsin. The monumental work has helped me to solve some key questions regarding the nature of mechanical barriers that constitute the intermediates in the unfolding process. Of particular interest is the determination of altered occurrence probabilities of unfolding pathways in an energy landscape and their correlation to the intramolecular interactions with the help of bioinformatics tools. The kind of work presented here, in my opinion, will not only help us to understand the basic principles of membrane protein (un)folding, but also to manipulate and tune energy landscapes with the help of small molecules, proteins, or mutations, thus opening up new vistas in medicine and pharmacology. It is just a matter of a lot of hard work, some time, and a little bit of luck till we understand the key elements of membrane protein (un)folding and use it to our advantage.