Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:05Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-04-25Bitstream added on 2014-06-13T20:49:57Z : No. of bitstreams: 1 fernandes_as_me_araiq.pdf: 568657 bytes, checksum: 5eb21bef70dd1eae7a9264be26bcd26c (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Nos organismos vivos aeróbios, processos fisiológicos produzem espécies reativas de oxigênio (ERO) como subprodutos ou com a finalidade de combater microorganismos invasores. Estas espécies têm sido estudadas, pois promovem mutações de DNA, processos de envelhecimento e várias patologias. A formação de espécies reativas e radicais livres são equilibradas naturalmente pela existência de compostos conhecidos como antioxidantes. Tais compostos na dieta, são agentes protetores do corpo humano na remoção dos radicais livres. Os cogumelos são fungos conhecidos, desde a antiguidade, devido sua utilização, pelo homem, como alimento de elevado valor nutritivo e terapêutico. Neste sentido, a busca por opções terapêuticas para diferentes patologias faz da pesquisa de produtos naturais um campo fértil em opções de moléculas com diferentes atividades biológicas. A relevância da pesquisa de produtos naturais proporciona a descoberta de novos fármacos e o estudo de cogumelos que apresentem substâncias que possam agir sobre as diferentes espécies oxidantes geradas em nosso organismo torna-se de grande importância. No estudo da avaliação do potencial antioxidante das amostras deve-se considerar que: um composto deve ser testado em concentrações disponíveis in vivo e ao avaliar os antioxidantes, deve-se utilizar pelo menos uma espécie relevante biologicamente. Deve-se perguntar como age o antioxidante, se ele age diretamente sobre a ERO ou ele inibe a sua geração e, ainda, se ele age indiretamente regulando defesas antioxidantes endógenas. Assim, este trabalho teve por objetivo a partição (usando técnicas cromatográficas como: CCD e CLAE) e validação, in vitro, das frações do cogumelo Agaricus blazei Murril como produtos antioxidantes (usando metodologias préestabelecidas, como: radical ABTS, radical DPPH, Radical Superóxido, TNB/HOCl e TNB/H2O2). / In aerobic living organisms, physiologic processes produce reactive oxygen species (ROS) as by-products or to fight against microorganisms. This species have being studied, whereas promotes DNA mutation, aging process and several pathologies. Reactive species and free radicals generation are equilibrated by antioxidants. Thus, these antioxidants in diets, are protector agent to the human body in removal of free radicals. Since antiquity the mushrooms are consumed as a high nutritional meal and therapeutic worth. In this manner, the search of new medicines turns natural products research an important option for discovering molecules with different biological activities. Natural products research is relevant for discovering molecules able to fight against oxidant species. In evaluating the antioxidant potential of substances, it is important to considerate: a compound should be tested at concentrations achievable in vivo and in assaying antioxidants, one should use biologically relevant ROS. It is important to know if it works directly over the oxidant or if it works by regulating endogenous antioxidants defenses. Thus, this work had as objective the partition (using chromatografic techniques, as: TLC and HPLC) and validation, in vitro, of the Agaricus blazei Murril mushroom fractions as antioxidant products (using préestablished methodologies, as: ABTS radical, DPPH radical, Superoxide radical, TNB/HOCl and TNB/H2O2). It was also evaluated, the presence of peroxidase and polyphenoloxidase enzymes. The evaluated fractions showed antioxidant activity similar to the patterns (trolox and uric acid) in removal of ABTS radical and DPPH radical, except for the hexanic fraction. In the TNB/HOCl system, the samples presented small activity (it wasn't possible to determi ne IC50), and your activities were very inferior to the patterns. In the TNB/H2O2 system, the samples didn't presented activity to kidnap H2O2.

Resumo: Nos organismos vivos aeróbios, processos fisiológicos produzem espécies reativas de oxigênio (ERO) como subprodutos ou com a finalidade de combater microorganismos invasores. Estas espécies têm sido estudadas, pois promovem mutações de DNA, processos de envelhecimento e várias patologias. A formação de espécies reativas e radicais livres são equilibradas naturalmente pela existência de compostos conhecidos como antioxidantes. Tais compostos na dieta, são agentes protetores do corpo humano na remoção dos radicais livres. Os cogumelos são fungos conhecidos, desde a antiguidade, devido sua utilização, pelo homem, como alimento de elevado valor nutritivo e terapêutico. Neste sentido, a busca por opções terapêuticas para diferentes patologias faz da pesquisa de produtos naturais um campo fértil em opções de moléculas com diferentes atividades biológicas. A relevância da pesquisa de produtos naturais proporciona a descoberta de novos fármacos e o estudo de cogumelos que apresentem substâncias que possam agir sobre as diferentes espécies oxidantes geradas em nosso organismo torna-se de grande importância. No estudo da avaliação do potencial antioxidante das amostras deve-se considerar que: um composto deve ser testado em concentrações disponíveis in vivo e ao avaliar os antioxidantes, deve-se utilizar pelo menos uma espécie relevante biologicamente. Deve-se perguntar como age o antioxidante, se ele age diretamente sobre a ERO ou ele inibe a sua geração e, ainda, se ele age indiretamente regulando defesas antioxidantes endógenas. Assim, este trabalho teve por objetivo a partição (usando técnicas cromatográficas como: CCD e CLAE) e validação, in vitro, das frações do cogumelo Agaricus blazei Murril como produtos antioxidantes (usando metodologias préestabelecidas, como: radical ABTS, radical DPPH, Radical Superóxido, TNB/HOCl e TNB/H2O2). / Abstract: In aerobic living organisms, physiologic processes produce reactive oxygen species (ROS) as by-products or to fight against microorganisms. This species have being studied, whereas promotes DNA mutation, aging process and several pathologies. Reactive species and free radicals generation are equilibrated by antioxidants. Thus, these antioxidants in diets, are protector agent to the human body in removal of free radicals. Since antiquity the mushrooms are consumed as a high nutritional meal and therapeutic worth. In this manner, the search of new medicines turns natural products research an important option for discovering molecules with different biological activities. Natural products research is relevant for discovering molecules able to fight against oxidant species. In evaluating the antioxidant potential of substances, it is important to considerate: a compound should be tested at concentrations achievable in vivo and in assaying antioxidants, one should use biologically relevant ROS. It is important to know if it works directly over the oxidant or if it works by regulating endogenous antioxidants defenses. Thus, this work had as objective the partition (using chromatografic techniques, as: TLC and HPLC) and validation, in vitro, of the Agaricus blazei Murril mushroom fractions as antioxidant products (using préestablished methodologies, as: ABTS radical, DPPH radical, Superoxide radical, TNB/HOCl and TNB/H2O2). It was also evaluated, the presence of peroxidase and polyphenoloxidase enzymes. The evaluated fractions showed antioxidant activity similar to the patterns (trolox and uric acid) in removal of ABTS radical and DPPH radical, except for the hexanic fraction. In the TNB/HOCl system, the samples presented small activity (it wasn't possible to determi ne IC50), and your activities were very inferior to the patterns. In the TNB/H2O2 system, the samples didn't presented activity to kidnap H2O2. / Orientador: Olga Maria Mascarenhas de Faria Oliveira / Coorientador: Maysa Furlan / Banca: Erna Elisabeth Bach / Banca: Mariza Pires de Melo / Mestre

A compreensão da fisiologia e dos mecanismos moleculares da sepse tem sido foco de muitos estudos. As infecções severas, como a sepse, são responsáveis por 10% do total de mortes registradas em Unidades de Tratamento Intensivo em todo o mundo. O desfecho da sepse ocorre devido a influência de fatores ambientais e genéticos, cuja expressão de variantes genéticas suportam ou não este desfecho. Muitos mecanismos estão envolvidos na sepse, incluindo a liberação de citocinas e a ativação de neutrófilos, de monócitos e de células endoteliais. Há associação entre superprodução de óxido nítrico, produção excessiva de radicais livres, depleção de antioxidantes, e déficit energético celular. Enzimas antioxidantes endógenas como a Superóxido Dismutase, a Glutationa Peroxidase e a Catalase protegem a célula do dano oxidativo. A enzima superóxido dismutase dependente de manganês é um potente antioxidante intracelular codificada por um gene (SOD2; 6q25-2) que tem sua expressão induzida por mediadores inflamatórios tais como interleucina 1, interleucina 4, interleucina 6, Fator de Necrose Tumoral – α, lipopolisacarídeos. O gene SOD2 apresenta um polimorfismo de mutação de base C47T no exon 2, o qual resulta na substituição do resíduo 16 (Ala16Val) pertencente ao peptídeo sinal da proteína. O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito diferencial das variantes - 9Ala e -9Val da superóxido dismutase dependente de manganês sobre as células mononucleares de sangue periférico humano (in vitro) durante um processo infeccioso (induzido por lipopolisacarídeos), investigando sua implicação: (I) na produção de Espécies Reativas; (II) na atividade e imuno-conteúdo da Superóxido Dismutase dependente de Manganês; (III) na atividade e imuno- conteúdo da Catalase; (IV) na atividade e imunoconteúdo da Glutationa Peroxidase; (V) na produção de nitrotirosina; (VI) na produção de nitrito/nitrato; (VII) na liberação de Fator de Necrose Tumoral - α; (VIII) na produção de Carboximetil-lisina; (IX) dienos conjugados; (X) no imuno-conteúdo da Poli (ADP ribose) Polimerase; (XI) no imuno-conteúdo do Receptor de Produtos Avançados de Glicação; (XII) no imuno-conteúdo da Proteína de Choque Térmico; (XIII) no imuno-conteúdo do Fator Nuclear κB; (XIV) no dano ao DNA celular; (XV) na determinação das defesas antioxidantes totais não enzimáticas. Os resultados demonstraram que o polimorfismo Ala-9Val participa na regulação do ambiente redox celular, e que o alelo 47C permite que as células no estado basal (sem lipopolisacarídeos) respondam com mais eficiência ao estresse oxidativo celular. Este alelo apesar de produzir mais espécies reativas também aumenta o mecanismo de defesa antioxidante. Porém, quando em uma doença que produza estresse oxidativo, no caso a sepse, o alelo 47C torna o ambiente intracelular pró-oxidativo podendo agravar a condição celular. Em suma, os dados aqui apresentados sugerem que o polimorfismo Ala-9Val é um alvo promissor para novos estudos com o objetivo de usar marcadores genéticos para direcionar a terapia necessária para cada paciente. / The understanding of the physiology and of molecular mechanisms of sepsis has been focus of many studies. The severe infections, as the sepsis, are responsible for 10% of total of deaths registered in Intensive Care Units all over the world. The outcome of sepsis happens due to influence of environmental and genetic factors, whose the expression of genetic variants supports or not this outcome. Many mechanisms are involved in sepsis, including the cytokines liberation and the neutrophils activation, of monocytes and of endothelial cells. There is association among overproduction of nitric oxide, excessive production of free radicals, depletion of antioxidants, and cellular energy deficit. Endogenous antioxidant enzymes as Superoxide Dismutase, Glutathione Peroxidase and Catalase protect the cell of oxidative damage. The manganese superoxide dismutase enzyme it is a potent antioxidant intracellular codified by a gene (SOD2; 6q25-2) that has her expression induced by the inflammatory mediators such as interleukin 1, interleukin 4, interleukin 6, tumor necrosis factor – α, lipopolysaccharide. The SOD2 gene presents a single-nucleotide polymorphism C47T in the exon 2, which results in the substitution of the residue 16 (Ala16 Val) belonging to the signal peptide of the protein. The aim of this work was to study the differential effect of the variants -9Ala and -9Val of manganese superoxide dismutase on the Peripheral Blood Mononuclears Cells human (in vitro) during an infectious process (induced by lipopolysaccharide), investigating her implication: (I) in the production of Reactive Species; (II) in the activity and immunocontent of Manganese Superoxide Dismutase; (III) in the activity and immunocontent of Catalase; (IV) in the activity and immunocontent of Glutathione Peroxidase; (V) in the nitrotyrosine production; (VI) in the nitrite/nitrate production; (VII) in the production of tumor necrosis factor - α; (VIII) in the production of carboxymethyl lysine; (IX) conjugated dienos; (X) in the immunocontent of the Poly (ADP-ribose) Polymerase; (XI) in the immunocontent of the Receptor for Advanced Glycation Endproducts; (XII) in the immunocontent of Heat Shock Protein; (XIII) in the immunocontent of the Nuclear Factor kappa B; (XIV) in the damage to cellular DNA; (XV) in the determination of the non-enzymatic antioxidant cellular defenses. The results demonstrated that the polymorphism Ala-9Val it participates in the regulation of the cellular redox environment, and that the 47C allele allows that the cells in the basal state (without lipopolysaccharide) they answer with more efficiency to the stress oxidative cellular. This allele in spite of producing more RS also increases the mechanism of antioxidant defense. However when in a disease that produces oxidative stress, in the case the sepsis, the 47C allele turns intracellular environmental pro-oxidative could worsen the cellular condition. In summary, the data presented here suggest that the polymorphism Ala- 9Val is a promising target for new studies with the goal of using genetic markers to guide therapy required for each patient.

A fotoquimioterapia (FQT) é uma técnica de tratamento de doenças graves, inclusive o câncer, que utiliza que utiliza compostos que, sendo introduzidos dentro de um organismo, não possuem alguma atividade contra ele e quando são excitados, através de luz na região espectral de 320 até 800 nm, produzem espécies reativas que induzem a morte celular. Dentre as formas desenvolvidas em FQT, a de maior destaque, e a que vem sendo mais utilizada em clínica, é a Terapia Fotodinâmica (TFD). Apesar das vantagens do uso da TFD, esta técnica possui limitações em sua eficiência, pois seu mecanismo está associado com à formação dos estados excitados do FS e do oxigênio molecular e, por isso, depende dos tempos de vida e rendimentos quânticos destes estados. Outro fator que limita a ampla aplicação da FQT na clínica é o alto custo dos FS utilizados atualmente. No grupo de fotobiofísica do Departamento de Física e Matemática da FCLRP-USP, tem-se trabalhado na busca de novos FS que possuam espécies reativas não excitados como, por exemplo, os radicais livres (peróxidos, ânion superóxido, radical hidroxila etc.), e que sejam mais viáveis economicamente em relação a outros FS já existentes no mercado. Os derivados de nitrofurano são fármacos já utilizados na rotina clínica que possuem as características promissoras para aplicação em FQT. Este trabalho dá continuidade à busca de novos FS. Escolhemos dentre inúmeros derivados de nitrofurano a Nitrofurantoína (NFT), que já é utilizada em clínica desde 1950, e que possui um custo baixo. Sua atividade fototóxica já foi documentada como reações fotoalérgicas em pacientes depois de ser administrada e nos estudos in vitro contra diversas linhagens das células neoplásicas. Contudo, os mecanismos e a dinâmica da fotoação da NFT não estavam ainda bem estabelecidas. Como objetivos gerais deste trabalho, definimos estudar a dinâmica da fotodecomposição da NFT e a liberação de radical NO em soluções aquosas, em função da composição do ambiente, tendo em vista analisar sua potencialidade para aplicação em fotoquimioterapia de diversas doenças, inclusive o câncer. Demonstramos que durante a sua fototransformação, a NFT libera o NO, e o rendimento do processo depende do estado de protonação da NFT. A liberação de NO se realiza por duas vias paralelas: liberação direta pela molécula de NFT e através da fotólise do seu fotoproduto. O estado tripleto da NFT apresenta tempo de vida (t) muito curto, provavelmente devido à participação ativa em formação de um dos fotoprodutos. Pelo fato de ser muito curto, é pouco provável que o estado T1 produza efetivamente, o oxigênio singleto. Assim, podemos associar a fotoatividade da NFT com a liberação de NO. Por fim, propusemos um esquema para a fotoliberação de NO pela fototransformação da NFT. / Photochemotherapy (PCT) is a technique applied in the treatment of serious diseases. For example in cancer, the PCT uses compounds that are introduced into an organism that do not have some activity against him, and that when are excited with light, in the spectral region from 320 to 800 nm, produces reactive species that induce the cell death. The photodynamic therapy (PDT) is the most widely used PCTtechnique in clinical applications. Despite the advantages of the use of PDT, this technique has efficiency limitations, because the PDT mechanism is associated with the formation of excited states in photosensitizer (PS) and in molecular oxygen and therefore, depends on the lifetimes and quantum yields of these states. Another limiting factor of the PDT in more PCT clinical applications is the high cost of the PS used today. The photo-biophysic group of the Department of Physics and Mathematics of the FFCLRP-USP has been working on searching of new PS without reactive species with exited states and cheaper than others PS on the market. For example, our group has investigated the free radicals: peroxide, superoxide anion, hydroxyl radical. This work continues the search for new PS. We chose the Nitrofurantoin (NFT), a nitrofuran derivative, which it is used in clinical applications since 1950 and have a low cost. The nitrofuran derivatives are drugs used in clinical applications with promising characteristics for applications in PCT. The photo-toxic activity of the NFT has been observed in photo-allergic reactions of patients and in vitro studies of several neoplastic cell lines. However, the NFT photo- action mechanisms and kinetics are not well established. The objective of this work was the study of the photo-decomposition dynamics of the NFT and the delivery of the NO radical in aqueous solutions depending on the composition of the environment, aiming to analyze its potential for application in PCT of several diseases, including cancer. In this work we demonstrated that during the photo-transformation, the NFT delivery NO and the yield of this process depends on the protonation state of the NFT. We observed that the NO delivery is made of two parallels ways: a direct delivery by NFT molecule and a delivery by photolysis of their photo-products. Probably due to the active participation in the photo-products formation we observed that the triplet state of NFT has very short lifetime (T) and therefore, it is not expected that the state T1 produces singlet oxygen. Thus, we can associate the NFT photo-activity with the NO delivery. Finally, this work proposes a scheme for NO photo-delivery using the NFT photo-transformation.

O objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade antioxidante de extrato de folhas de oliveira (EFO) (Olea europaea L.) por diferentes metodologias analíticas in vitro e in situ, para verificação de efeito em sistemas biológicos. O extrato foi obtido a partir de folhas secas de oliveira, previamente micronizadas, em metanol/água (80/20%) na proporção 1:20 (m/v), após remoção de compostos solúveis em n-hexano. Após liofilização, no EFO foi avaliado o poder redutor por Folin-Ciocalteau, conteúdo de flavonoides totais, teor de oleuropeina, poder de redução do íon férrico (FRAP) e atividade antioxidante sobre DPPHo, ABTSo+, ânion superóxido (O2o-), ácido hipocloroso (HOCl) e óxido nítrico (NOo). O extrato foi também avaliado quanto ao efeito protetor sobre danos oxidativos em eritrócitos humanos. O ácido ascórbico foi utilizado como referência. O experimento foi repetido seis vezes (n = 6) e os ensaios realizados em duplicata. O poder redutor do extrato e o conteúdo de flavonoides totais e oleuropeína foram 131,7 ± 9,4 mg equivalente de ácido gálico/g extrato seco (ms), 19,4 ± 1,3 mg equivalente de quercetina/g ms e 25,5 ± 5,2 mg oleuropeína/g ms, respectivamente. O ensaio de FRAP apresentou 281,8 ± 22,8 mg equivalente de trolox/g ms. O EFO foi efetivo na inibição dos radicais DPPHo e ABTSo+, dependente da concentração de extrato, com valores de IC50 de 13,8 ± 0,8 e 16,1 ± 1,2 µg/mL, respectivamente. Com relação à atividade antioxidante sobre espécies reativas de importância biológica, o EFO apresentou forte capacidade de inibição de O2o- (IC50 = 52,6 ± 2,1 µg/mL) e NOo (IC50 = 48,4 ± 6,8 µg/mL), quando comparado ao ácido ascórbico. Porém, a inibição de HOCl não foi tão eficiente (IC50 = 714,1 ± 31,4 µg/mL). O EFO inibiu a hemólise induzida em eritrócitos de maneira dependente da concentração (IC50 = 7,8 ± 1,1 µg/mL), assim como a peroxidação lipídica e a formação de meta-hemoglobina, com valores de IC50 de 38,0 ± 11,7 e 186,3 ± 29,7 µg/mL, respectivamente. Os resultados obtidos neste estudo sugerem que extrato de folhas de oliveira possui efetiva atividade antioxidante em sistemas biológicos, pelo efeito sequestrador de determinadas espécies reativas que participam dos processos bioquímicos, e pela prevenção de danos oxidativos em eritrócitos humanos. Portanto, sua ingestão pode estar relacionada com a prevenção de estresse oxidativo in vivo, com consequentes benefícios à saúde. / The aim of this study was to evaluate the antioxidant activity of olive leaf extract (OLE) (Olea europaea L.) by different in vitro and in situ analytical methodologies for determination of its effect in biological systems. The extract was obtained from dried olive leaves, previously micronized, in methanol/water (80/20%) in ratio 1:20 (w/v), after removal of n-hexane soluble compounds. After lyophilization, OLE was analyzed for reducing power by Folin-Ciocalteau, total flavonoid content, oleuropein content, ferric reducing antioxidant power (FRAP) and antioxidant activity against DPPHo, ABTSo+, superoxide anion (O2o-), hypochlorous acid (HOCl), and nitric oxide (NOo). The extract was also analyzed against oxidative damage in human erythrocytes. Ascorbic acid was used as reference. The experiment was repeated six times (n = 6) and the assays were performed in duplicate. The reducing power and total flavonoid and oleuropein contents of extract were 131.7 ± 9.4 mg galic acid equivalent/g dry extract (dw), 19.4 ± 1.3 mg quercetin equivalent/g dw, and 25.5 ± 5.2 mg oleuropein/g dw, respectively. The FRAP assay was 281.8 ± 22.8 mg trolox equivalent/g dw. The OLE was effective in inhibition of DPPHo and ABTSo+ radicals, in a concentration dependent manner, with IC50 values of 13.8 ± 0.8 and 16.1 ± 1.2 µg/mL, respectively. In relation to the antioxidant activity against reactive species of biological importance, the OLE showed high ability to inhibit O2o- (IC50 = 52.6 ± 2.1 µg/mL) and NOo (IC50 = 48.4 ± 6.8 µg/mL), when compared to ascorbic acid. However, inhibition of HOCl was not as efficient (IC50 = 714.1 ± 31.4 µg/mL). The OLE inhibited induced erythrocyte hemolysis in a concentration dependent manner (IC50 = 7.8 ± 1.1 µg/mL) as well as lipid peroxidation and the formation of methemoglobin, with IC50 values of 38.0 ± 11.7 and 186.3 ± 29.7 µg/mL, respectively. The results suggest that olive leaf extract has effective antioxidant activity in biological systems, based on its scavenging effect of certain reactive species that participate in biochemical processes, and the prevention of oxidative damage in human erythrocytes. So, the intake of olive leaf extract may be related to the prevention of in vivo oxidative stress, with health benefits.

A compreensão da fisiologia e dos mecanismos moleculares da sepse tem sido foco de muitos estudos. As infecções severas, como a sepse, são responsáveis por 10% do total de mortes registradas em Unidades de Tratamento Intensivo em todo o mundo. O desfecho da sepse ocorre devido a influência de fatores ambientais e genéticos, cuja expressão de variantes genéticas suportam ou não este desfecho. Muitos mecanismos estão envolvidos na sepse, incluindo a liberação de citocinas e a ativação de neutrófilos, de monócitos e de células endoteliais. Há associação entre superprodução de óxido nítrico, produção excessiva de radicais livres, depleção de antioxidantes, e déficit energético celular. Enzimas antioxidantes endógenas como a Superóxido Dismutase, a Glutationa Peroxidase e a Catalase protegem a célula do dano oxidativo. A enzima superóxido dismutase dependente de manganês é um potente antioxidante intracelular codificada por um gene (SOD2; 6q25-2) que tem sua expressão induzida por mediadores inflamatórios tais como interleucina 1, interleucina 4, interleucina 6, Fator de Necrose Tumoral – α, lipopolisacarídeos. O gene SOD2 apresenta um polimorfismo de mutação de base C47T no exon 2, o qual resulta na substituição do resíduo 16 (Ala16Val) pertencente ao peptídeo sinal da proteína. O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito diferencial das variantes - 9Ala e -9Val da superóxido dismutase dependente de manganês sobre as células mononucleares de sangue periférico humano (in vitro) durante um processo infeccioso (induzido por lipopolisacarídeos), investigando sua implicação: (I) na produção de Espécies Reativas; (II) na atividade e imuno-conteúdo da Superóxido Dismutase dependente de Manganês; (III) na atividade e imuno- conteúdo da Catalase; (IV) na atividade e imunoconteúdo da Glutationa Peroxidase; (V) na produção de nitrotirosina; (VI) na produção de nitrito/nitrato; (VII) na liberação de Fator de Necrose Tumoral - α; (VIII) na produção de Carboximetil-lisina; (IX) dienos conjugados; (X) no imuno-conteúdo da Poli (ADP ribose) Polimerase; (XI) no imuno-conteúdo do Receptor de Produtos Avançados de Glicação; (XII) no imuno-conteúdo da Proteína de Choque Térmico; (XIII) no imuno-conteúdo do Fator Nuclear κB; (XIV) no dano ao DNA celular; (XV) na determinação das defesas antioxidantes totais não enzimáticas. Os resultados demonstraram que o polimorfismo Ala-9Val participa na regulação do ambiente redox celular, e que o alelo 47C permite que as células no estado basal (sem lipopolisacarídeos) respondam com mais eficiência ao estresse oxidativo celular. Este alelo apesar de produzir mais espécies reativas também aumenta o mecanismo de defesa antioxidante. Porém, quando em uma doença que produza estresse oxidativo, no caso a sepse, o alelo 47C torna o ambiente intracelular pró-oxidativo podendo agravar a condição celular. Em suma, os dados aqui apresentados sugerem que o polimorfismo Ala-9Val é um alvo promissor para novos estudos com o objetivo de usar marcadores genéticos para direcionar a terapia necessária para cada paciente. / The understanding of the physiology and of molecular mechanisms of sepsis has been focus of many studies. The severe infections, as the sepsis, are responsible for 10% of total of deaths registered in Intensive Care Units all over the world. The outcome of sepsis happens due to influence of environmental and genetic factors, whose the expression of genetic variants supports or not this outcome. Many mechanisms are involved in sepsis, including the cytokines liberation and the neutrophils activation, of monocytes and of endothelial cells. There is association among overproduction of nitric oxide, excessive production of free radicals, depletion of antioxidants, and cellular energy deficit. Endogenous antioxidant enzymes as Superoxide Dismutase, Glutathione Peroxidase and Catalase protect the cell of oxidative damage. The manganese superoxide dismutase enzyme it is a potent antioxidant intracellular codified by a gene (SOD2; 6q25-2) that has her expression induced by the inflammatory mediators such as interleukin 1, interleukin 4, interleukin 6, tumor necrosis factor – α, lipopolysaccharide. The SOD2 gene presents a single-nucleotide polymorphism C47T in the exon 2, which results in the substitution of the residue 16 (Ala16 Val) belonging to the signal peptide of the protein. The aim of this work was to study the differential effect of the variants -9Ala and -9Val of manganese superoxide dismutase on the Peripheral Blood Mononuclears Cells human (in vitro) during an infectious process (induced by lipopolysaccharide), investigating her implication: (I) in the production of Reactive Species; (II) in the activity and immunocontent of Manganese Superoxide Dismutase; (III) in the activity and immunocontent of Catalase; (IV) in the activity and immunocontent of Glutathione Peroxidase; (V) in the nitrotyrosine production; (VI) in the nitrite/nitrate production; (VII) in the production of tumor necrosis factor - α; (VIII) in the production of carboxymethyl lysine; (IX) conjugated dienos; (X) in the immunocontent of the Poly (ADP-ribose) Polymerase; (XI) in the immunocontent of the Receptor for Advanced Glycation Endproducts; (XII) in the immunocontent of Heat Shock Protein; (XIII) in the immunocontent of the Nuclear Factor kappa B; (XIV) in the damage to cellular DNA; (XV) in the determination of the non-enzymatic antioxidant cellular defenses. The results demonstrated that the polymorphism Ala-9Val it participates in the regulation of the cellular redox environment, and that the 47C allele allows that the cells in the basal state (without lipopolysaccharide) they answer with more efficiency to the stress oxidative cellular. This allele in spite of producing more RS also increases the mechanism of antioxidant defense. However when in a disease that produces oxidative stress, in the case the sepsis, the 47C allele turns intracellular environmental pro-oxidative could worsen the cellular condition. In summary, the data presented here suggest that the polymorphism Ala- 9Val is a promising target for new studies with the goal of using genetic markers to guide therapy required for each patient.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Although selective, some herbicides cause injury in plants, resulting in uncontrolled production of reactive oxygen species. Nitric oxide (NO) is appointed as a reducer of the effects caused by oxidative stress in plants; however, their mitigation mechanisms are not yet clear. This study aimed to evaluate the nitric oxide protection mechanisms, provided by sodium nitroprusside (SNP), in the flooded rice cultivar Puitá INTA CL exposed to clomazone herbicide (360 g a.i. L-1), oxyfluorfen (240 g a.i. L-1), oxadiazon (250 g a.i. L-1) and the formulated mixture of paraquat (200 g a.i. L-1) + diuron (100 g a.i. L-1) in vitro and in vivo. For this purpose, (i) leaf segments were pre-incubated with 0, 200 and 2000 μM of SNP and exposed to five herbicides concentrations, and the protective effect confirmed by the NO scavenger, carboxyPTIO, (ii) seeds were soaked by one and 10 hours in solution containing 200 μM of SNP and after sowing, clomazone (1.7 and 3.4 L ha-1 of c.p.) was applied in the post-seeding and the needle stage (iii) plants were treated with 200 and 2000 μM of SNP and sprayed with 1.0 L ha-1 of herbicides oxadiazon, oxyfluorfen + diuron and paraquat. The concentration of 200 μM of SNP has reduced, up to 14% the electrolyte leakage in rice leaf segments exposed to 755.9 μM of oxadiazon, as well as, the imbibition of seeds with 200 μM of SNP for 10 hours increased by 33.1% the total content of chlorophyll, maintaining the pigmentation of seedlings exposed to 3.4 L h-1 of clomazone, applied to the needle stage. When sprayed on the shoot, paraquat + diuron, oxyfluorfen and oxadiazon, respectively, caused the ions leakage of 89.8; 62.8 and 18.3%, while the pre-treatment of the plants with 2000 μM of SNP decreased by 11 and 25.4% the damage caused by the first two, however, there was not reduction in injury caused by oxadiazon. The pre-treatment with SNP minimized the oxidative stress caused by herbicides, by the reducing in the hydrogen peroxide levels and TBARS and by the increase in the pigments levels, reflecting on the lower activity of the enzymes SOD and POD, however, such changes are dependent on the SNP concentration, exposure time and the level of stress caused by herbicides. In the absence or low levels of stress, NO was toxic to plants. / Embora seletivos, alguns herbicidas causam injúrias nas plantas, resultando na produção descontrolada de espécies reativas de oxigênio. O óxido nítrico (NO) é apontado como um redutor dos efeitos causados pelo estresse oxidativo em plantas, entretanto, seus mecanismos de mitigação ainda não são claros. Este trabalho teve por objetivos avaliar os mecanismos de proteção do óxido nítrico, fornecido através de nitroprussiato de sódio (SNP), em plantas de arroz da cultivar Puita INTA CL, expostas aos herbicidas clomazone (360 g i.a. L-1), oxyfluorfen (240 g i.a. L-1), oxadiazon (250 g i.a. L-1) e à mistura formulada de paraquat (200 g i.a. L-1) + diuron (100 g i.a. L-1), in vitro e in vivo. Para tal, (I) segmentos foliares foram pré-incubados com 0, 200 e 2000 μM de SNP e expostos a cinco concentrações dos herbicidas, sendo o efeito protetor confirmado pelo seqüestrador de NO, carboxyPTIO, (II) sementes foram embebidas, por uma e 10 horas, em solução contendo 200 μM de SNP e após a semeadura, clomazone (1,7 e 3,4 L p.c. ha-1) foi aplicado em pós-semeadura e no ponto de agulha, (III) plantas foram tratadas com 200 e 2000 μM de SNP e pulverizadas com 1,0 L ha-1 dos herbicidas oxadiazon, oxyfluorfen e paraquat + diuron. A concentração de 200 μM de SNP reduziu, em até 14%, o extravasamento de eletrólitos em segmentos foliares de arroz expostos a 755,9 μM de oxadiazon, bem como, a embebição das sementes em 200 μM de SNP por 10 horas aumentou em 33,1% o teor de clorofila total, mantendo a pigmentação das plântulas expostas a 3,4 L ha-1 de clomazone, aplicado no ponto de agulha. Quando pulverizados na parte aérea das plantas, paraquat + diuron, oxyfluorfen e oxadiazon, respectivamente, causaram o extravasamento de 89,8; 62,8 e 18,3%, dos íons celulares, enquanto que as plantas pré-tratadas com 2000 μM de SNP apresentaram redução de 11 e 25,4% no dano causado pelos dois primeiros, contudo, sem redução na injúria causada por oxadiazon. O pré-tratamento com SNP minimizou o estresse oxidativo causado pelos herbicidas, através da redução dos níveis de peróxido de hidrogênio e Tbars e do aumento nos níveis de pigmentos, refletindo na menor atividade das enzimas SOD e POD, entretanto, tais alterações foram dependentes da concentração de SNP, tempo de exposição e do nível de estresse causado pelos herbicidas. Na ausência ou em baixos níveis de estresse, o NO mostrou-se tóxico às plantas.

Mangroves are the dominant vegetation in Everglades estuarine environment and are known to contain polyphenols such as tannins, which present similar fluorescence properties as some amino acid fluorophores. In the present study, gas chromatography–mass spectrometry (GC/MS) was used to quantify gallic acid, which is a normal monomer of polyphenols. The quantitative GC/MS analytical method was developed using gallic acid and tannic acid standards to quantify the false ‘protein-like’ fluorescence in DOM. The present study also compared the optical properties, reactive species (RS) production and radical scavenging ability of DOM from different regions of the Everglades and a correlation was observed between DOM composition and its photo-productivity. In general, the reactive species quantum yield decreased with increased DOM redox potential. The RS formation rates were controlled by the DOC and CDOM abundace. Normalized RS formation rates were shown to be influenced by DOM aromaticity and molecular weight characteristics

Fragile X Syndrome (FXS) is caused by the instability of a CGG-repeated tract at the 5’ end of the Fmr1 transcript. This instability causes silencing of the gene coding for FMRP. Higher levels of reactive oxygen species, lipid peroxidation, and protein oxidation within brain tissue have been found to be associated with the disease. These imbalances, along with altered levels of components of the glutathione system, provide evidence for increased oxidative stress. Astrocytes, glial cells within the brain, have many functions within neurodevelopment. Specifically, they regulate growth and synaptic contacts of neurons, regulate the level of excitability of synapses, and protect neurons at high levels of activity. To protect neurons from oxidative stress, astrocytes maintain oxidative homeostasis through their mitochondrial electron transport and antioxidant systems. This study examines the relationship between oxidative stress and FXS by assessing mitochondrial function and the antioxidant system of astrocytes. Using the Fmr1 knockout (KO) mouse model, mitochondrial respiration, and reactive oxygen species (ROS) production was analyzed in cultured cortical astrocytes. Astrocytes collected from male and female mice were analyzed under both normoxic and hypoxic conditions. In addition, western blots were conducted on both cortical tissue and cultured cortical astrocytes to determine potential differences in enzyme expression. Results indicate elevations of leak state respiration and ROS production in Fmr1 KO cultured cortical astrocytes alongside alterations in antioxidant and NADPH-oxidase expression. Characterization of mitochondrial function and the antioxidant system of astrocytes will be highly valuable to the understanding of glial roles during brain development and could provide future insight to direct clinically relevant studies of FXS and other neurodevelopment disorders. / Thesis / Master of Science (MSc) / Fragile X Syndrome (FXS) is the most common genetic cause of intellectual disability. It is characterized by the loss of FMRP, an important protein in brain development. Within the FXS brain there is evidence of oxidative stress. The cells that maintain oxidative homeostasis in the brain are astrocytes. Astrocytes are glial cells important for brain development. This thesis evaluated astrocytes' ability to maintain oxidative homeostasis in the FXS cortex. The findings of this thesis provide important insights into our understanding of FXS pathology and will help direct clinically relevant studies of FXS and other neurodevelopmental disorders.

Espécies reativas de oxigênio e nitrogênio controlam várias funções celulares, no entanto, quantidades excessivas destas espécies causam disfunções. Com o envelhecimento, há aumento da produção destas espécies, e de citocinas, que também exercem efeitos deletérios na musculatura esquelética, e da concentração plasmática de ácidos graxos. Contudo, a possível rassociação entre o aumento da produção de espécies reativas e de citocinas pelo músculo esquelético e da concentração plasmática de ácidos graxos não foi ainda investigada. O presente estudo teve como objetivo avaliar a modulação da produção muscular de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio e de citocinas pelo ácido palmítico e pela eletroestimulação moderada. O ácido palmítico aumentou a produção de superóxido (via mitocôndria e NADPH oxidase), óxido nítrico (via iNOS) e citocinas (IL-6 e CINC-2), além de ativar o NF-kB. A eletroestimulação aumentou a produção de superóxido (via mitocôndria e sistema xantina-xantina oxidase), óxido nítrico (via iNOS) e ativou o NF-kB. Não foi observado aumento de citocinas no protocolo de eletroestimulação. O ácido palmítico, portanto, controla a produção de espécies reativas e citocinas pelo músculo. A eletroestimulação, também aumenta a produção destas espécies. Assim, o estresse oxidativo muscular é controlado pela atividade contrátil e as concentrações de ácidos graxos plasmáticos. / Reactive oxygen and nitrogen species play a key role in several cell functions, however, high concentrations of these species cause cell dysfunction. High production of reactive species, and cytokines, which also induce skeletal muscle injury, and an increase of plasma concentration of fatty acids are observed in aging. However, an association between the augment in the production of reactive species and cytokines by skeletal muscle and of plasma fatty acid concentrations was not investigated yet. The aim of the present study was to evaluate the modulation of production of reactive oxygen and nitrogen species and of cytokines by palmitic acid and electrical stimulation muscle contraction. Palmitic acid increased the production of superoxide (through mitochondria and NADPH oxidase), nitric oxide (by iNOS), and citokynes (IL-6 and CINC-2), and induced NF-kB activation. The electrical stimulation-muscle contraction increased the production of superoxide (through mitochondria and xanthine-xanthine oxidase system), nitric oxide (by iNOS), and induced NF-kB activation. There was no change in the production of cytokines in the electrical stimulation protocol. In conclusion, palmitic acid raised the production of reactive oxygen and nitrogen species and cytokines by skeletal muscle. Electrical stimulation-muscle contraction also increased the production of these reactive species. Therefore, muscle oxidative stress is controlled by the muscle contractile activity and plasma fatty acid levels.