As células provenientes do epitélio olfatório apresentam capacidade regenerativa durante toda a vida, embora este mecanismo ainda não esteja completamente elucidado. O potencial de diferenciação de células-tronco provenientes do epitélio olfatório de cães sem raça definida (Canis familiaris Linnaeus, 1758) foi avaliado utilizando-se 12 cães adultos e 12 cães com 60 dias de vida intra-uterina, oriundos do Hospital Veterinário da FMVZ-USP. Após coletado, o epitélio olfatório foi submetido a protocolo histológico padrão para hematoxilina-eosina, azul de toluidina e PAS. O material fixado em glutaraldeído 2,5% foi processado para observação sob microscopia eletrônica de transmissão. O índice de proliferação nuclear foi medido para detecção de PCNA e Ki67 nuclear. Células foram expandidas em cultura em meio D-MEM/F-12 acrescido de Soro Fetal Bovino hyclone (CO2-95% à 37ºC) para caracterização e diferenciação celular (osteogênica, adipogência e neurogênica). O cultivo das células provenientes do epitélio olfatório de cães com 60 dias de vida intra-uterina mostrou maior evolução em cultura quando comparados aos animais adultos, sendo as primeiras utilizadas para execução dos protocolos de caracterização e diferenciação. As células em cultivo apresentaram expressão CD29 positiva e marcação positiva para OCT-4, citoqueratina 18 (Ck18) e vimentina. A diferenciação osteogênica demonstrou, ao final de 21 dias, células com morfologia típica, caracterizadas pela coloração de Alizarin Red e Von Kossa. A diferenciação adipogênica mostrou pouco número de células, apresentando grânulos adipogênicos, corados por Oil Red, contudo sem morfologia típica. A diferenciação neurogênica demonstrou células que expressaram marcação para GFAP, Neurofilamentos, Oligodendrócitos e βtubulina III. As células isoladas a partir do epitélio olfatório de cães com 60 dias de vida intra-uterina evidenciaram populações de células-tronco, determinadas pela expressão de marcadores específicos e diferenciação em outros tipos de tecido, devendo-se considerar este epitélio como uma fonte potencial para aquisição de células, particularmente progenitores neuronais, que possam somar aos estudos e seu uso em terapia celular. / Olfactory cells demonstrate regenerative capacity along life, although, its mechanism is still obscure. We evaluated the differentiation capacity of olfactory stem cell of mongrel dogs (Canis familiaris Linnaeus, 1758) in 12 adult dogs and 12 fetuses at term (60 days of pregnancy) from the Veterinary Hospital of FMVZ-USP. Following the sampling, the epithelia were submitted to standard histological process and stained with HE, toluidine blue and PAS. Samples fixed with 2.5% glutaraldehyde solution were processed for transmission electron microscopy. Proliferative index were obtained with the detection of PCNA and Ki67. Cells were kept in culture in D-MEM/F-12 medium supplemented with hyclone bovine fetal serum (CO2-95% at 37ºC) for characterization and cell differentiation (osteogenesis, adipogenesis, and neurogenesis). Cell culture of fetuses at term demonstrated higher evolution in comparison to adult animals, being submitted to the protocols of characterization and differentiation. Cell culture demonstrated positive reaction for CD29, OCT-4, Ck18 (citokeratin) and vimentin. Osteogenic differentiation demonstrated, 21 days, typical morphological cells characterized by Alizarin Red and Von Kossa staining. Adipogenic differentiation demonstrated less number of cells containing granules, stained with Oil Red, although being not typical shape. Neurogenic differentiation demonstrated positive staining for GFAP, Neurofilament, Oligodendrocyte and III β-tubulin. Cells isolated from epithelia of fetuses at term demonstrated population of stem cells determined by the expression of specific-staining and differentiation into other type of cells, which lead us to consider the olfactory epithelia as a source of potential stem cells particularly for neurogenic differentiation to be applied for further studies in cell therapy.

A cinética plasmática de uma emulsão lipídica, que se liga aos receptores de LDL, foi estudada em 23 pacientes com Doença Arterial Coronariana (DAC) e em 16 indivíduos sadios (não apresentaram lesões obstrutivas, nem irregularidades, após serem submetidos à cineangiocoronariografia). Foram selecionados 39 participantes, sendo 30 do sexo masculino e 9 do sexo feminino, na faixa etária de 30 a 84 anos, com índice de Massa Corpórea (IMC) entre 21 e 41 ( kg/m2 ) , divididos em 2 grupos: DAC e Sadio. Após jejum de 12 horas, foram coletadas amostras de sangue total para determinação dos níveis séricos de lipídios e apolipoproteínas. A seguir foram injetadas, endovenosamente, emulsões com marcação radioativa, constituídas por lípides puros (40 mg), trioleína (TG) 1 mg, oleato de colesterol (CE) 20 mg, colesterol (CL) 0,5 mg e os isótopos radioativos 14C-oleato de colesterol e 3H-colesterol. 3H-colesterol. A cada participante foi administrado um volume da emulsão, correspondente à atividade de 37 kBq para o isótopo 14C e de 74 kBq para o isótopo 3H. Amostras de sangue foram colhidas nos intervalos 0,08 , 1, 4, 10 e 24 h , após a aplicação da emulsão. O colesterol-éster e o colesterol livre foram isolados e tiveram suas radioatividades medidas em cintilador. As taxas fracionais de remoção do 14C-oleato de colesterol e do 3H-colesterol livre, foram estimadas por análise compartimental, com auxílio de um programa computacional. Observou-se que: - não há diferença entre os dois grupos, em relação à idade, porcentagem de indivíduos do sexo masculino e feminino e o IMC. Pacientes do grupo DAC apresentam níveis de HDL-colesterol (p=0,0005) e de apolipoproteína A 1 ( p=0,009), reduzidos em relação aos indivíduos do grupo Sadio. As taxas fracionais de remoção do 14C-oleato de colesterol não diferiram entre os grupos DAC e Sadio (0,107± 0,026 horas -1VS 0,064± 0,009 horas -1, p=ns ). A taxa fracional de remoção do 3H-colesterol livre foi maior no grupo DAC do que no Sadio (0,152±0,014 horas -10,096± 0,019 horas-1, p=0,032). A taxa fracional de remoção do 3H-colesterol livre correlacionou-se diretamente com os níveis plasmáticos de triglicérides (r=0,37, p=0,002) e inversamente com os de HDL-C(r=-0,47, p=0,002) e LDL-C (r= -0,35, p = -0,03). Não houve diferença significativas entre os perfis lipídicos e de apolipoproteínas dos pacientes do grupo DAC e os dos indivíduos do grupo Sadio / The plasma kinetics of a lipidic emulsion that binds to LDL receptors was studied in patients with coronary artery disease (CAD) and in control subjects without CAD as documented by coronary angiography. CAD group consistent in 23 subjects (20 male and 3 of female sex , 37-70 year 21-37 body mass index), whereas the healthy control group had 16 subjects (10 male,30-84 aged, 21-41 body mass index). The emulsion was prepared by ultrassonic irradiation of a lipid mixture in aqueous buffer and purified by a two-step ultracentrifugation procedure. The emulsion composition was lipids (40 mg), triglycerides (1 mg), cholestero! (0,5 mg), cholesterol oleate( 20 mg) and was labeled with C14 and 3H . The emulsion vvas injected intravenously into the subjects after a 12 h fast and plasma samples were colected at 0.08, 1, 4, 10 and 24 hour time periods after the injection for determination of the plasma decaying curves of the radioactive lipids. \\/\\lith this purpose, the plasma samp!es were lipid extracted and the lipids were separated by thin-Iayer chromatography. Radioactivity was counted in a liquid scintillation solution. The plasma Fractional Clearance Rate (FC R, in h -1 ) was estimated from the decaying curves by the method of minimum squares, with the aid of a computational software. The two study groups did not differ regarding age, sex, and BMI. The CAD group had smaller plasma HDL cholesterol and apolipoprotein (apo) A1 values, but LDL and VLDL cholesterol as well as apo B, were similar between the two groups. 14C-cholesteryl ester FCR-of the CAD group was not different from the controls (CAD: and Healthy:,p). However, 3H-cholesteroi FCR was greater in the CAD group than in the controls (0,152 ±0,014 h -1 vs 0,096± 0,019 h -1 ,p=0,032 ). 3H cholesterol FCR was positively correlated with triglyceride plasma concentration ( r=0,37, p=0,002) and negatively correlated with HDL (r= -0,47, p=0,002) and LDL (r= -0,35, p=0,03). Therefore, the emulsion particles were similarly removed from the circulation in both CAD and healthy groups. Disturbances of cholesterol esterification and removaI from the plasma of free-cholesterol are related with presence od CAD.

A nanoemulsão LDE tem composição lipídica semelhante à da LDL natural e é utilizada para estudos do metabolismo da LDL. Estudos anteriores mostraram que a LDE é captada pelas células pelo LDL-r, porém outros receptores podem estar envolvidos nesta captação, como LRP-1, CD36 e CD68. Os objetivos deste estudo foram: investigar a captação da LDE por células endoteliais, fibroblastos, monócitos, macrófagos e H292, identificar os receptores envolvidos na captação da LDE pelas mesmas células e avaliar os efeitos da modificação química da LDE sobre a estabilidade, captação celular, lipoperoxidação celular e citotoxicidade. A LDE marcada com [3H]-colesterol livre e [14C]-éster de colesterol foi incubada por 4 horas com as linhagens celulares. Após a incubação, foram realizados os testes de captação da LDE e competição da LDE com a LDL natural. A expressão dos receptores LDL-r, LRP, CD36 e CD68 foi avaliada pelos métodos de imunocitoquímica, citometria de fluxo e PCR real time. Para investigar os efeitos da modificação da LDE (LDE-CO), o éster de colesterololeato de colesterol (monoinsaturado), foi substituído por linoleato de colesterol (LDE-CL) (poliinsaturado) e por estearato de colesterol (LDE-CE) (saturado). Estas nanoemulsões foram submetidas a testes de estabilidade (tamanho, polidispersão, pH e peroxidação), captação celular, peroxidação lipídica celular e citotoxicidade. Nos resultados, foi observado que todas as células estudadas internalizaram o colesterol livre e éster de colesterol proporcionalmente às concentrações de LDE-CO incubadas com diferença de saturação entre elas, sendo o colesterol livre mais captado que o éster de colesterol da LDE-CO por todas as células estudadas. Além disso, os monócitos (THP-1) demonstraram maior captação de LDE-CO que as demais células. No estudo de competição com a LDL natural ocorreu uma diminuição da captação (r2-0,73), sugerindo que as duas partículas competem pelo mesmo receptor. A LDE-CO foi capaz de inibir a expressão protéica dos receptores LDL em HUVEC (3,98 vezes), monócito (6,25 vezes) e fibroblasto (3,70 vezes) e a expressão gênica em monócito e HUVEC. Por citometria de fluxo, a expressão protéica do LDL-r em H292 e fibroblasto diminuiu. Em HUVEC a LDE-CO aumentou a expressão protéica em 3,57 vezes, já em monócito, a LDE-CO diminuiu a expressão gênica e protéica (3,15 vezes) do LRP-1. Em macrófago e em H292, a LDE-CO aumentou a expressão gênica do LRP-1. A LDE-CO foi capaz de aumentar a expressão gênica e protéica (3,1 vezes) do CD36 em HUVEC, diminuir a expressão protéica (4,34 vezes) em macrófago e diminuir a expressão gênica e protéica (2,94 vezes) em H292. A LDE foi capaz de aumentar a expressão protéica (2,09 vezes) do CD68 em H292, e aumentar a expressão gênica em monócito e macrófago. A linhagem celular que apresentou maior taxa de sobrevivência na presença da LDE-CO foi o fibroblasto. Nas análises dos efeitos da modificação química da LDE, a LDE-oleato apresentou o tamanho e a lipoperoxidação menores que a LDE-linoleato e LDE-estearato. Nenhuma das LDEs apresentou modificação da estabilidade antes de 30 dias. As células apresentaram maior lipoperoxidação na presença de LDECL quando comparada à presença de LDE-CO e LDE-CE. A captação de [3H]-colesterol livre foi maior que de éster de colesterol das três LDEs por todas as células estudadas. A composição da LDE com oleato de colesterol foi a que apresentou características mais favoráveis em termos de tamanho de partículas e susceptibilidade à peroxidação. A captação celular do colesterol livre foi maior do que a do éster de colesterol em todas as linhagens estudadas das três LDEs, sugerindo que o colesterol livre possa dissociar-se da LDE e ser captado pelas células por vias não específicas. Os dados obtidos neste trabalho ajudam na compreensão dos mecanismos de captação e da influência da composição na estabilidade e adequação do sistema LDE e outros similares às suas potenciais aplicações terapêuticas ou diagnósticas. / With fat composition similar to natural LDL, the LDE nanoemulsion can be used to study the metabolism of LDL. Other studies have shown that LDE is uptaken by cells by LDL-r receptors. Other receptors such as LRP-1, CD36 and CD38 may also be involved in the uptake. The objectives of this study were to investigate the uptake of LDE by endothelial and tumor cells, fibroblasts, monocytes and macrophages, to identify those receptors involved in this process and to evaluate the effects on LDE uptake by changing its chemical composition. A labeled LDE with [3H]-cholesterol and [14C]- cholesteryl ester was incubated for 4 hours with cells, after which LDE uptake and competition tests were evaluated. LDL-r, LRP, CD36 and CD38 were evaluated by using immunocytochemistry methods, cytometric flow and real time PCR. To investigate the effects of LDE chemical composition modifications, cholesteryl oleate (LDE-CO) was replaced with cholesteryl linoleate (LDE-CL) and cholesterol stearate (LDE-CE). These were then tested for stability, cellular uptake, lipoperoxidation and citotoxitity. Results showed that all cells internalized [3H]-cholesterol and [14C]-cholesteryl ester proportionally to incubated LDE-CO concentrations albeit with some saturation differences. LDE-CO lipid uptake had a higher cholesterol uptake than the cholesteryl ester uptake. Furthermore, monocytes (THP-1) had a higher LDE-CO uptake than other cells. LDE-CO uptake decreased (r2 -0.73) in the presence of natural LDL, suggesting that these two particles may be competing for the same receptors. LDE-CO appeared to inhibit LDL protein receptor expression in HUVEC (3.98 times), in monocytes (6.25 times) and in fibroblasts (3.70 times), as well as the gene expression in monocytes and HUVEC. A decrease in LDL-r expression in both H292 and fibroblasts was also observed. LDE-CO increased the protein expression in HUVEC 3.75 times while in monocytes, it was able to decrease gene and protein expression of LRP-1, 3.15 times. In macrophages and H292, there was an increase in genetic expression of LRP-1. LDE-CO increased the CD36 in HUVEC gene and protein expressions 3.1 times, decreased the macrophage protein expression 4.34 times and decreased the H292 gene and protein expression 2.94 times. LDE increased protein expression 2.09 times in CD68 in H292 and increase gene expression in both monocytes and macrophages. Fibroblasts presented the highest survival rate in the presence of LDE-CO of all cells studied. The LDE chemical modification effect studies, presented smaller sized LDE-CO and less lipoperoxidation than LDE-CL and LDE-CE presented no stability modifications in less than 30 days. Cells presented higher lipoperoxidation in the presence of LDE-CL when compared to the presence of LDE-CO and LDE-CE. [3H]-cholesterol was greater than cholesteryl ester for all three LDE types in all the studied cells. LDE-CO presented favorable characteristics in terms of particle size and susceptibility to peroxidation. Cholesterol cell uptake was higher than that of cholesteryl ester for all LDEs of all the studied cells which suggests that that cholesterol may be capable of disassociating itself from LDE and being uptaken by cells through non-specific pathways. The results of this study can help to better understand the mechanisms of uptake by cells, the effects of stability and LDE system adequation for therapeutic and diagnostic applications.

Orientador: Valéria Helena Alves Cagnon Quitete / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T04:47:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Kido_LarissaAkemi_M.pdf: 14026607 bytes, checksum: 4b5dcdcd04b3cf312f7b62cb4cf2ac2b (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A senescência está associada a mudanças significativas no ambiente hormonal, sendo fator causador de alterações morfofuncionais na próstata. Os diferentes processos biológicos que ocorrem na próstata são regulados por polipeptídeos, dentre esses os fatores de crescimento do endotélio vascular (VEGF) e Endostatina, relacionados à angiogênese. Além disso, inibidores da enzima 5_ redutase-II, como a finasterida, tem papel importante no combate às doenças prostáticas. Assim, os principais objetivos desse estudo foram avaliar os efeitos estruturais e moleculares das terapias antiangiogênicas e da finasterida sobre a próstata ventral de camundongos durante a senescência. Noventa camundongos machos FVB de 18 e 52 semanas de idade foram divididos nos seguintes grupos: Jovem (JV) e Senil (SEN), os quais receberam injeções de Solução Fisiológica 0,9% (5 mL/Kg/dia s.c.); Finasterida (FIN): injeções de Finasterida (20 mg/Kg, s.c.); SU5416 (SU): SU5416 (6 mg/Kg, i.p.); TNP-470 (TNP): injeções de TNP-470 (15 mg/Kg, s.c.), e SU5416 + TNP-470 (SU+TNP): os mesmos tratamentos dos grupos SU e TNP. Após 21 dias de tratamento, amostras do lobo ventral da próstata foram coletadas e submetidas às análises morfológicas, imunohistoquímicas e Western Blotting. Os resultados demonstraram alterações moleculares e estruturais no microambiente prostático durante a senescência, como atrofia presença de células inflamatórias, e lesões proliferativas, as quais foram interrompidas e ou bloqueadas através dos tratamentos com as drogas antiangiogênicas e pela finasterida. Os resultados moleculares revelaram no grupo senil a diminuição das reatividades para AR e Endostatina, e aumento para ER-_, ER-_ e VEGF, quando comparados aos camundongos jovens. Os camundongos dos grupos tratados com finasterida, SU5416 e SU5416+TNP-470, quando comparados aos do grupo senil, demonstraram de forma geral diminuição das reatividades de VEGF e ER-_ e aumento de ER-_. Já o tratamento com TNP-470 foi marcado principalmente pela redução da reatividade e dos níveis protéicos de AR e ER-_, quando comparado aos grupos jovem e senil. Desta maneira, conclui-se que a senescência favoreceu a ocorrência de alterações estruturais e/ ou funcionais que sugerem o aparecimento de lesões malignas, em virtude do desequilíbrio na sinalização entre epitélio e estroma. O tratamento com finasterida, SU5416 e SU5416+TNP- 470 mostraram-se mais ativos na regulação dos processos proliferativos através da via estrogênica / Abstract: Senescence is associated with significant changes in the hormonal environment and is a cause of morphological and functional changes in the prostate. The different biological processes that occur in the prostate are influenced by different factors such as vascular endothelial growth factor (VEGF) and Endostatin, related to angiogenesis. Also, 5_-reductase inhibitors, such as finasteride, play an important role in treatment of prostatic diseases. Thus, the aims of this study were to evaluate the structural and molecular effects of antiangiogenic therapies and finasteride on the ventral prostate of mice during senescence. Ninety 52 and 18 week old male FVB mice, were divided into groups: Young (YNG) and Senile (SEN) groups, which received 0.9% saline (5 mL/kg/day sc) injections; Finasteride (FIN) group: Finasteride (20 mg/kg, sc); SU5416 (SU) group: SU5416 (6 mg/kg, ip) injections; TNP-470 (TNP) group: TNP-470 (15 mg/kg, sc) injections and SU5416+TNP-470 (SU+TNP470) group: The same treatment as the SU and TNP-470 groups. After 21 days of treatment, samples of the ventral lobe of the prostate were collected and analyzed for morphological, immunohistochemical and Western Blotting analyses. The results demonstrated structural and molecular changes in the prostatic microenvironment during senescence, such as atrophy, inflammatory cells, and proliferative lesions, which were interrupted and/or blocked by treatment with antiangiogenic drugs and finasteride. The molecular results revealed decreased reactivity for AR and Endostatin, and an increase for ER-_, ER-_ and VEGF in the senile group, when compared to young mice. The mice in the groups treated with finasteride, SU5416 and SU5416 + TNP-470, when compared to the senile group, showed in general decreased VEGF and ER-_ reactivities and increased ER-_ reactivity. The treatment with TNP-470 however, was marked mainly by reduced AR and ER-_ reactivity and protein levels, when compared to young and senile groups. Thus, it can be concluded that senescence contributed to the occurrence of structural and/or molecular alterations that suggest the onset of malignant lesions, due to the imbalance in the signaling between the epithelium and stroma. Treatments with finasteride, SU5416 and SU5416+TNP-470, were active in the regulation of proliferative processes by means of the estrogen pathways / Mestrado / Anatomia / Mestra em Biologia Celular e Estrutural

Orientadores: Sara Teresinha Olalla Saad, Carolina Louzão Bigarella / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-19T22:43:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Melo_RitadeCassiaCarvalho_M.pdf: 3664788 bytes, checksum: 419eef7eff318d29e3e09f23e8b10461 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A medula óssea é constituída por microambientes específicos denominados "nichos". O fator SDF-1 (Stromal derived factor-1) foi identificado como um importante fator quimioatrativo produzido por células estromais da medula óssea. Sua ação sobre seu receptor CXCR4 desempenha função primordial na migração, retenção e desenvolvimento dos progenitores hematopoiéticos na medula óssea. Células leucêmicas mielóides e linfóides expressam CXCR4 e aproveitam-se disso para acessar nichos medulares normalmente restritos ás células progenitoras, passando a residir em microambientes que propiciam sobrevivência e proliferação. Recentemente foi descoberto que o receptor CXCR7 é capaz de se ligar ao SDF-1. Ele é expresso em várias linhagens tumorais, mas em células hematopoiéticas seu papel é ainda pouco explorado. Em vista da escassez de dados na literatura o objetivo deste trabalho foi investigar a expressão e função de CXCR7 em síndromes mielodisplásicas e leucemias agudas. Neste estudo, foi mostrado que a expressão gênica de CXCR7 foi significativamente maior em leucemia linfoblástica aguda (LLA) em comparação com sindrome mielodisplásica (SMD), leucemia mielóide aguda (LMA) e indivíduos controles (p<0.0001, Mann-Whitney). A proteína CXCR7 também foi mais expressa em linhagens celulares linfoblástica T (Molt-4 e Jurkat) em comparação com linhagens mielóides. Em células linfoblásticas T, a localização subcelular de CXCR7 e CXCR4 por microscopia confocal e citometria de fluxo evidenciou CXCR7 mais próximo à membrana das células Molt-4 e mais frequentemente no citoplasma de células Jurkat enquanto CXCR4 está na membrana de ambas as linhas celulares. Curiosamente, notamos também que, depois da indução de SDF-1, células Molt-4 têm maior capacidade migratória comparada com Jurkat (mediana Molt 4 = 52,0 ± 5 vs Jurkat = 24,1 ± 3, p = 0,0079, teste de Mann-Whitney), que pode estar relacionado com a disponibilidade de membrana de CXCR7. Além disso, a inibição da CXCR7 ou CXCR4 resultou em mudanças significativas na resposta migratória de Molt4 e Jurkat (p<0,05 Mann-Whitney), no entanto, a inibição de ambos, CXCR7 e CXCR4 resultou em uma redução mais significativa na migração celular (p = 0.0079/Molt-4; p = 0.0043/Jurkat, Mann-Whitney). Uma vez que é bem estabelecido que células CD34+ de pacientes com SMD não são atraídas pelo gradiente de SDF-1, apesar de terem expressão normal de CXCR4, nos interessou investigar qual a localização de CXCR4 nas células SMD e se esta irresponsividade estava associada a CXCR7. Linhagens mielóides P39 e U937 foram usadas como modelo de SMD e LMA, respectivamente. Foram encontrados níveis similares de expressão de CXCR4 e CXCR7 em ambas as linhagens celulares, no entanto encontramos que CXCR4 está localizado no citoplasma de células P39 enquanto ele está na membrana das células U937. Uma vez que a proteína quinase C isotipo zeta (PKC'dzeta' está relacionada com a sinalização SDF-1/CXCR4 aumentando a expressão de CXCR4 e sua disponibilidade na membrana, resolvemos trabalhar também com células P39 hiperexpressando PKC'dzeta' (PKC'dzeta'wt). Este procedimento resultou na translocação de CXCR4 para a membrana de células P39, mas não alterou a localização subcelular de CXCR7. Ensaios de migração por tranwell mostraram que células P39 PKC'dzeta'wt apresentam maior capacidade de migração em relação a SDF-1 em comparação com células P39 controle (aumento de 35 vezes pcDNA3 PKC-'dzeta'-HA vs pcDNA3 transfectadas células P39, p = 0,0032, Mann-Whitney), sugerindo que a PKC'dzeta' restaura a capacidade quimiotática de células P39. Aumento da expressão de CXCR7, como aqui observado em células leucemicas linfoblásticas, é um fenômeno já descrito em uma variedade de linhagens de células tumorais sólidas, tais como cérebro, próstata e pulmão. Em tumores sólidos, CXCR7 principalmente aumenta a proliferação de células malignas. Estes resultados sugerem que a função biológica de CXCR7 depende tecido e órgãos que ele está localizado e que, na leucemia linfoblástica aguda pode ter um papel na migração de células, potencializando a resposta de CXCR4 a SDF-1 e, portanto, poderia contribuir para o recrutamente de células leucêmicas para nichos uma vez já ocupados por células-tronco hematopoéticas normais. Além disso, nossos resultados levam a crer que um defeito na via PKC'dzeta'/CXCR4 está envolvido com a irresponsividade de células SMD a SDF-1, gerando uma hematopoese ineficaz. E confirma dados que sugerem que PKC'dzeta' é uma proteína central na via de sinalização SDF-1/CXCR4, muito importante para a migração de células hematopoéticas malignas / Abstract: Bone marrow is constituted of specific microenvironments called "niches". The factor SDF-1 (stromal derived factor-1) was identified as an important chemoattractant factor produced by bone marrow cells. SDF-1 acts on its receptor CXCR4 and plays primordial function in migration, retention and development of hematopoietic progenitors in bone marrow. CXCR4 is expressed in leukemic cells and enables them to access marrow niches that normally are restricted to quiescent stem cells, thereby ensuring its protection from cell death resulting in a worse prognosis. Recently, CXCR7 was identified as another SDF-1-binding receptor, but its contribution to SDF-1 - mediated effects in hematopoietic cells is still poorly explored, even though the CXCR7 relationship with tumor progression in non-hematopoietic malignancies is well established. Given that there is little information regarding CXCR7 we investigated its function and expression in MDS and acute leukemias. This work, was showed that CXCR7 is significantly higher expressed in ALL compared to MDS, AML and control subjects (p<0.0001, Mann-Whitney test). CXCR7 protein is also higher expressed in lymphoblastic cell lines (Molt-4 and Jurkat) compared with myeloid cells. In lymphoblastic cell lines, the subcellular location of CXCR7 and CXCR4 by confocal microscopy and flow cytometry evidenced CXCR7 closer in the membrane of Molt-4 cells and more frequently in the cytoplasm of Jurkat cells whereas CXCR4 was in the membrane of both cell lines. Interestingly, we also noticed that, after SDF-1 induction, Molt-4 cells have higher chemotactic ability compared with Jurkat (median Molt 4=52.0 ± 5 vs Jurkat=24.1 ± 3, p=0.0079, Mann-Whitney test) which may be related with the membrane availability of CXCR7. In addition, the inhibition of CXCR7 or CXCR4 resulted in significant changes in Molt4 and Jurkat chemotactic response (p<0,05, Mann-Whitney test), however, the inhibition of both CXCR7 and CXCR4 resulted in a more significant reduction in cell migration (p=0.0079/Molt-4; p=0.0043/Jurkat, Mann-Whitney test). Since it is well established that CD34 + progenitor cells from patients with myelodysplastic syndromes (MDS) are not attracted by gradient of SDF-1 despite of having CXCR4 normal expression, we addressed if MDS cells have an abnormal localization of CXCR4 or association with CXCR7. P39 and U937 cell line were used as a model of MDS and AML, respectively. Similar expression levels of CXCR4 and CXCR7 in both cell lines however we found, by confocal microscopy and flow cytometry, that CXCR4 was localized in the cytoplasm of P39 cells while it was in the membrane of U937 cells. Since the protein quinase C (PKC'dzeta') is related to the SDF-1/CXCR4 signaling by increasing CXCR4 expression and its membrane availability, we decided to work with cells P39 overexpressing PKC'dzeta' (PKC'dzeta'wt). This procedure resulted in translocation of CXCR4 to the membrane of P39 cells but did not change the CXCR7 subcellular localization. Transwell chemotaxis assay showed that P39 cells overexpressing PKC'dzeta' displayed higher chemotactic ability upon SDF-1 treatment compared with control P39 (35 fold increase pcDNA3-PKC'dzeta'-HA vs pcDNA3-HA transfected P39 cells, p=0.0032; Mann-Whitney), suggesting that PKC'dzeta' restored the chemotactic capacity of P39 cells. Increased expression of CXCR7, as here observed in lymphoblastic leukemia cells, is a phenomenon already described in a variety of solid tumor cell lines such as brain, prostate and lung. In solid tumors, CXCR7 mainly increases the proliferation of malignant cells. These results suggest that the biological function of CXCR7 depends on its tissue and organ localization and that, in acute lymphoblastic leukemia may have a role in cell chemotaxis, potentiating CXCR4 response to SDF-1 and thus, could contribute for leukemia initiating cell recruitment to niches once occupied by normal hematopoietic stem cells. Furthermore, our results lead us to believe that a defect in the PKC'dzeta'/CXCR4 pathway is involved with the unresponsiveness of MDS cells to SDF-1, generating an ineffective hematopoiesis. It confirms data that suggest that PKC'dzeta' is a central protein in the SDF-1/CXCR4 signaling pathway, important for the migration of malignant hematoietic cells / Mestrado / Fisiopatologia Médica / Mestre em Ciências

Orientador: Gabriel Forato Anhê / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-21T11:52:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Faria_JulianadeAlmeida_M.pdf: 3166901 bytes, checksum: d6395a9feadc0393429b22df87066881 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: O aumento da produção hepática de glicose (PHG) é o principal componente que contribui para os elevados valores da glicemia de jejum em indivíduos obesos com Diabetes Mellitus tipo 2 (DM2). ...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The increase in hepatic glucose production (HGP) is the main component that contributes to high values of fasting glucose levels in obese individuals with diabetes mellitus type 2 (DM2). ...Note: The complete abstract is available with the full electronic document / Mestrado / Farmacologia / Mestra em Farmacologia

Orientador: Mario Jose Abdalla Saad / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-02T07:59:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carvalheira_JoseBarretoCampello_D.pdf: 29196532 bytes, checksum: 6adaf88914f9488a42fc234e6f8867f9 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: Insulina e leptina atuam de forma semelhante e aditiva para controlar a homeostase energética. Entretanto, a base molecular desse sinergismo permanece desconhecida. A insulina sinaliza através de um receptor tirosina quinase que fosforila e ativa seus substratos (IRSs - substratos do receptor de insulina), enquanto a leptina e sua proteína tirosina quinase associada JAK2 (Janus Kinase 2) medeiam a fosforilação e ativação do fator de transcrição STAT3 (Signal Transducer and Activator of Transcription). Para investigar se a insulina e a leptina ativam as mesmas vias de sinalização e para determinar se esses hormônios interagem em hipotálamo, ratos Wistar machos foram estudados após implante de cânula no terceiro ventrículo através de imunoprecipitação, immunoblotting e gel shift. A administração aguda intracerebroventricular (icv) de insulina resultou em aumento da fosforilação do receptor de insulina (IR), substrato 1 do receptor de insulina (JRS-l), substrato 2 do receptor de insulina (IRS-2) e MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase), além da associação entre os IRSs e a PI 3-quinase e a fosforilação em serina da Akt. A administração icv de leptina resultou na fosforilação em tirosina da JAK2, OBR, STAT3, IRS-1, IRS-2 e MAPK, bem como da associação entre os IRSs e a PI 3-quinase mas não foi observada a fosforilação da Akt. O estímulo simultâneo com os dois hormônios não aumentou a fosforilação do IRS-1, IRS-2, Akt e MAPK quando comparado com a administração isolada de insulina. Em contrapartida, a insulina induziu a fosforilação da JAK2 e do receptor de leptina (OBR) que, em presença de leptina, aumentou a interação entre o STAT3 e o OBR com conseqüente aumento da ativação do STAT3. A leptina ativou as vias de sinalização classicamente induzidas pela insulina no hipotálamo, e essas vias se intercruzaram, mas foram utilizadas de forma distinta que quando utilizadas pela insulina. Por outro lado a insulina modulou positivamente a via de sinalização da leptina. Esses resultados proporcionam uma base molecular para os efeitos coordenados da insulina e leptina no controle do apetite e peso corporal. Para demonstrar interdependência entre as vias de sinalização da insulina e leptina em hipotálamo de ratos, a transmissão do sinal de insulina em direção às vias da PI 3-quinase e MAPK foi comparada em hipotálamo de ratos zucker obesos (modelo animal de resistência insulina causado pela mutação do receptor de leptina) e controle. A infusão icv de insulina reduziu a ingestão alimentar de ratos controle, o que não foi observado nos animais obesos. Constatamos redução da fosforilação do IR, IRS-1, IRS-2, da associação entre a subunidade p85 da PI 3-quinase com as proteínas IRSs, bem como da fosforilação em serina da Akt no hipotálamo de ratos obesos comparado com os ratos magros. Em contraste, a insulina estimulou a fosforilação em tirosina da MAPK de forma similar em ratos magros e obesos. Assim, documentamos resistência à sinalização da insulina em tecidos hipotalâmicos de ratos Zucker obesos. Esses resultados fortalecem a hipótese de que a insulina tem suas ações anti-obesidade através da via da PI 3-quinase e que a diminuição do sinal por esta via no hipotálamo pode contribuir para o desenvolvimento de obesidade em estados de resistência à insulina. Originalmente, pensava-se que o hipotálamo era o único tecido a expressar a forma longa do receptor de leptina. Entretanto, evidências recentes sugerem que órgãos periféricos, entre eles o figado, também expressam a forma longa do receptor. Assim, na segunda parte deste estudo investigamos os efeitos rápidos e diretos da leptina em figado e determinamos se a leptina interage com a insulina nesse órgão. Em figado de ratos a injeção aguda de leptina ou insulina estimulou a fosforilação da JAK2, STAT3 e STAT5b. A leptina foi menos efetiva que a insulina em estimular as proteínas IRS e a associação destas com a PI 3-quinase. O tratamento simultâneo com os dois hormônios não modificou a fosforilação máxima do STAT3, IRS-l, IRS-2 e Akt, mas causou aumento significativo da fosforilação da JAK2 e do STAT5b quando comparado com a administração isolada de insulina ou leptina. Assim, detectamos uma inter-relação positiva nas vias de sinalização desses hormônios nas proteínas JAK2 e STAT5b em figado de ratos. Concluindo, estes estudos caracterizaram as vias de transmissão do sinal de leptina em hipotálamo e figado, evidenciando mecanismos para a integração da sinalização de insulina e leptina bem como a modulação destas vias em modelo animal de resistência à insulina e leptina nesses tecidos / Abstract: Insulin and leptin have overlapping effects in the control of energy homeostasis and glucose metabolism, but the molecular basis of this synergism is unknown. Insulin signals through a receptor tyrosine kinase that phosphorylates and activates the docking proteins IRSs (insulin receptor substrates), whereas the leptin receptor and its associated protein tyrosine kinase JAK2 (Janus kinase 2) mediate phosphorylation and activation of the transcription factor STAT3 (signal transducer and activator oftranscription). To investigate whether insulin and leptin share common intracellular signal transduction pathways and to determine whether these hormonal signaling systems modulate each other's action in rat hypothalamus male Wistar rats were studied after chronic implantation of an intracerebroventricular (i.c.v.) catheter into the third ventricle. Immunoprecipitation, immunoblotting and EMSA assays were used to examine the activation of insulin and leptin signaling molecules in the rat hypothalamus. Acute i.c.v. administration of insulin resulted in a time-dependent increase in tyrosine phosphorylation of the insulin receptor (IR), insulin receptor substrate 1 (IRS-1), insulin receptor substrate 2 (IRS-2) and MAPK (mitogen activated proein kinase), PI 3 kinase docking and serine phosphorylation of Akt. The i.c.v. administration of leptin resulted in tyrosine phosphorylation of JAK2, IRS-1, IRS-2 and MAPK and PI 3 kinase docking but no phosphorylation of Akt was observed. Simultaneous stimulation with both hormones did not increment tyrosine phosphorylation of IRS-1, IRS-2, Akt and MAPK when compared with isolated administration of insulin. In addition insulin induced JAK2 tyrosine phosphorylation and leptin receptor phosphorylation, which in the presence of leptin, augmented the interaction between STAT3 and this receptor. Insulin also increased the leptin-induced phosphorylation of STAT3 and its activation. Leptin rapidly activates classically insulin signaling pathways directly at the level of hypothalamus, and these pathways overlap with, but are distinct from, those engaged by insulin. On the other side, insulin modulates the leptin signal transduction pathway, and may provide a molecular basis for the coordinated effects of insulin and leptin in feeding behavior and weight control. To demonstrate the interdependence between insulin and leptin signaling in rat hypothalamus in vivo insulin signaling through the phosphatidylinositol 3-kinase (pI 3-kinase), mitogen-activated protein (MAP) kinase were compared in the hypothalamictissues of lean (Fa/?) and obese Zucker (falfa) rats (animal model of insulin resistance, which has a defect in the leptin receptor). Icv insulin infusion reduced food intake in Iean rats but no effect was observed in obese Zucker rats. Pretreatment with PI 3-kinase inhibitors prevents insulin-induced anorexia in lean rats. Insulin-stimulated tyrosine phosphorylation of insulin receptor (IR), IR substrates (IRS-1, IRS-2), the associations of p85 subunit of PI 3-kinase to the IRS proteins and serine phosphorylation of Akt in the hypothalamus of obese rats were significantly decreased compared with the lean rats. In contrast, insulin stimulated tyrosine phosphorylation of MAP kinase was similar in lean and obese rats. This segment of the study provides direct measurements of insulin signaIing in hypothalamic tissues, and document selective resistance to insulin signaling in the hypothalamus of obese Zucker rats at the molecular leveI. These findings have provided support for the hypothesis that insulin may have anti-obesity actions mediated by the PI 3-kinase pathway and that the impaired PI 3-kinase signal pathway in the hypothalamus may Iead to the development of obesity in insulin resistance and diabetic patients. Originally, it was thought that the hypothalamus was the only tissue expressing OBRb. However, recent evidence at the level of messenger RNA expression and cellular function suggest that peripheral organs including liver also express OBRb. Therefore the second part of the study was designed to investigate the rapid and potentially direct effects of leptin on signal transduction in liver and to determine whether insulin and leptin share common intracellular signal transduction pathways. Chronic leptin treatment markedly enhances the action of insulin on hepatic glucose production out of proportion to the body weight loss and increased insulin sensitivity. In the present experiments the cross-talk between insulin and leptin was evaluated in rat liver. Leptin, upon stimulation of JAK2 tyrosine phosphorylation, induced JAK2 coimmunoprecipitation with STAT3, STAT5b, IRS-1 and IRS-2. This phenomenon parallels the leptin-induced tyrosine phosphorylation of STAT3, STAT5b, IRS-1 and IRS-2. Acutely injected insulin stimulated a mild increase in tyrosine phosphorylation of JAK2, STAT3 and STAT5b. Leptin was less effective than insulin at stimulating IRSs phosphorylation and their associations with PI 3-kinase. Simultaneous treatment with both hormones promoted no change in maximal phosphorylation of STAT3, IRS-l, IRS-2 and Akt, but led to marked increase in tyrosine phosphorylation of JAK2 and STAT5b when compared with isolated administration of insulin or leptin. Thus, there is a positive cross-talk between insulin and leptin signaling pathways at the level of JAK2 and STAT5b in rat liver. We have characterized the leptin signaling pathway in hypothalamus and liver and demonstrate various mechanisms for the integration between insulin and leptin in these tissues. We have also showed that the cross-talk between these hormones is tissue dependent and that the effects of this interaction affects the energetic homeostasis and glucose metabolism in the various steps / Doutorado / Clinica Medica / Doutor em Clínica Médica

Orientador: Yuzo Iano / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Eletrica / Made available in DSpace on 2018-07-15T06:07:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 SarnoFilho_ElioPithon_M.pdf: 8017374 bytes, checksum: ef46de5c8bf3bb1132c5a327c99916cf (MD5) Previous issue date: 1989 / Resumo: Não informado / Abstract: Not informed. / Mestrado / Mestre em Engenharia Elétrica

Orientadores: Vera Lucia Gil da Silva Lopes, Maricilda Palandi de Mello / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-04T04:28:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Freitas_ErikaCristinaLopesBurronede_M.pdf: 6151764 bytes, checksum: 0f3baa2446e8049ec633d62c987a92a4 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Craniossinostose pode ser definida como a fusão prematura de uma ou mais suturas dos ossos chatos do crânio, afetando cerca de 0,4-1:1000 nascidos vivos. Mais de 100 síndromes diferentes com a presença de craniossinostose já foram descritas" sendo a maioria de transmissão autossômica dominante e expressividade variável. O diagnóstico clínico geralmente é dificultado pela sobreposição de sinais clínicos nas diversas síndromes. A morfogênese do crânio está relacionada a um complexo mecanismo de regulação gênica, do qual fazem parte os genes FGFR1, FGFR2, FGFR3, MSX2 e TWIST. Mutações nesses genes são causas conhecidas de craniossinostoses. Na intenção de se identificarem mutações nas principais regiões destes genes em indivíduos com craniossinostoses sindrômicas ou isoladas, 13 famílias e 8 casos isolados foram investigados. O protocolo de investigação incluiu avaliação dismorfológica e análise citogenética. A investigação molecular baseou-se num algoritmo previamente descrito e em revisão da literatura. Incluiu a busca pela mutação P252R do gene FGFR1, mutações nos exons 8 e 10 do gene FGFR2, a mutação P250R do gene FGFR3 , e mutações no exon 1 do gene TWIST. A mutação L154P no gene MSX2também foi investigada em indivíduos com forame parietal. Em um indivíduo com SSC foi encontrada uma alteração cromossômica envolvendo a região do gene TWIST (46, XX add 7(p21)). No gene FGFR2, mutações no exon 8" foram detectadas em 3/21, sendo que uma delas foi num caso de Apert, outra num caso de Pfeiffer tipo I e no terceiro, uma mutação nunca antes descrita na SSC (FGFR2 Q289P); mutações no exon 10 foram detectadas em 2/21, num caso de Crouzon e outro de Pfeiffer tipo 111.Uma família com SSC apresentava a mutação P250R no gene FGFR3 e 3 alterações foram encontradas no exon 1 do gene TWIST, sendo que todos os casos apresentavam SSC. Investigações no gene FGFR1 foram normais, assim como no gene MSX2. Dentre os indivíduos MCA, nenhuma alteração molecular foi encontrada nas regiões estudadas. Esse estudo reforça a heterogeneidade das craniossinostoses e sugere que sejam feitas investigações no gene FGFR2em casos de SSC. Futuros estudos poderão elucidar a etiologia dos casos de forame parietal e também dos casos MCA / Abstract: Craniosynostosis refers to the premature fusion of one or more of the cranial sutures, affecting about 0,4-1/1000 newborns. More than 100 distinct genetic syndromes with craniosynostosis have been described. Most of them exhibit autosomal dominant transmission and variable expressivity. Clinical diagnostic is also ofien difficulted by the overlapping features among different conditions. Maintenance of suture patency depends on regulating a complex array of factors, including FGFR1, FGFR2, FGFR3, MSX2 and TWIST. Mutations in these genes are know to cause craniosynostosis, the former by constitutive activation and the latter by haploinsufficiency. In order to identify mutations in the main regions of these genes in individuais with syndromic or isolated craniosynostosis, 13 families and 8 isolated cases were screened. The investigation protocol included dysmorphological evaluation and high resolution citogenetics analysis. Molecular investigation was based upon an algorrithm previously described and literature review. It included the P252R mutation of FGFR1, mutations in exon 8 and 10 of FGFR2 gene, P250R of FGFR3 gene, and mutations in exon 1 of TWIST gene. The mutation L154P in MSX2 were investigated in individuais with parietal foramina. One individual with SCS showed an chromosomal aberration involving the region of TWIST gene (46, XX add 7(p21». In FGFR2, mutations in exon 8 were detected in 4/21, including a previously undescribed one on SSC (FGFR2 Q289P); mutations in exon 10 were detected in 2/21. One family with SCS had a P250R FGFR3 mutation and 3 alterations in exon 1 of the TWIST gene. Investigations in FGFR1 were normal, as well as the MSX2 gene in individuais with parietal foramina. Among MCA individuais, no molecular abnormalities were found in the studied regions. This study reinforces the molecular heterogeneity of craniosynostosis and suggests the screening of FGFR2 gene as complementar step in SCS investigation. In the future, studies could elucidate the etiology of parietal foramina and MCA individuais herein evaluated. / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / Los fibroblastos cardiacos son células que cumplen un rol fundamental en el mantenimiento de la homeostasis de la matriz extracelular del corazón. Luego de un daño al miocardio, además, participan activamente del remodelado cardiaco como tal o diferenciándose a miofibroblasto, un fenotipo celular que presenta características que lo hacen apto para funciones de cicatrización. Se ha observado que luego de un daño al miocardio, el corazón está expuesto a un mayor tono adrenérgico con la finalidad de compensar la disfunción adquirida por la injuria del tejido. Estudios de nuestro laboratorio han demostrado que la estimulación β2-adrenérgica por Isoproterenol induce autofagia en fibroblastos cardiacos de rata adulta, un proceso degradativo que se ha reportado capaz de perder su equilibrio en diversas patologías cardiovasculares. Por esto, se vuelve interesante determinar si estos mismos estímulos son capaces de inducir autofagia en miofibroblastos cardiacos, células que aparecen sólo cuando hay daño al miocardio. Los resultados muestran que tanto fibroblastos como miofibroblastos cardiacos presentan receptores adrenérgicos sólo del subtipo β2. Miofibroblastos cardiacos presentaron mayor número de receptores β2-adrenérgicos y con mayor afinidad por sus ligandos que fibroblastos cardiacos. En ambos fenotipos celulares los receptores mencionados se encuentran funcionales. En cuanto a la autofagia, los estímulos clásicos inductores de autofagia (rapamicina y/o privación de nutrientes) y la estimulación β2-adrenérgica por Isoproterenol inducen autofagia en fibroblastos. De modo distinto, estos inductores no fueron capaces de inducir autofagia en miofibroblastos cardiacos de rata adulta, aunque se encontró que en condiciones basales presentaban mayor nivel de autofagia que los fibroblastos. Los resultados demuestran que los miofibroblastos cardiacos son resistentes a la inducción de autofagia por estimulación β2-adrenérgica, lo que puede abrir una puerta para el entendimiento del rol de este proceso en estados patológicos del corazón.