Glioblastoma multiforme (GBM) é o mais comum e mais maligno tumor cerebral. O péssimo prognóstico é parcialmente devido à baixa biodisponibilidade dos quimioterápicos no tecido tumoral, recorrência originada por células precursoras resistentes ao tratamento e um sistema imune comprometido. De fato, linfócitos regulatórios modulam o sistema imune para uma resposta pró-tumoral, tornando ainda mais difícil o tratamento. Nesse contexto, nanocápsulas lipídicas (LNCs) têm sido amplamente estudadas a fim de aumentar especificidade dos fármacos ao tecido tumoral. Metotrexato (MTX) e trans-resveratrol (RSV) possuem ação antitumoral já descrita, mas necessitam doses relativamente altas para ação anti-glioblastoma in vivo. O MTX também possui ação imunossupressora através do aumento de adenosina no meio extracelular. A Adenosina, por sua vez, pode modular tanto células efetoras quanto células regulatórias no microambiente tumoral. Dessa forma, a hipótese apresentada nessa tese é que o RSV e o MTX possam ser mais eficazes quando carreados por nanocápsulas em modelos de GBM. Além disso, buscamos avaliar se o MTX poderia interferir com enzimas do sistema purinérgico. Por fim, pesquisamos como a adenosina poderia modular linfócitos B e T através das enzimas CD39 e ecto-5’-NT/CD73. O RSV em nanocápsulas e o MTX em nanocápsulas (RSV-LNCs e MTX-LNCs) aumentaram a atividade anti-tumoral em relação aos compostos em solução, induzindo parada no ciclo celular e apoptose em células de GBM. O MTX diminuiu a expressão da proteína antiapoptótica BCL-2 e aumentou a caspase-3 ativa, levando as células de GBM à apoptose. Além disso, o MTX aumentou a expressão da enzima ecto-5’-NT/CD73 tanto em células de glioma quanto em linfócitos T presentes no microambiente dos gliomas. Esse aumento da expressão foi acompanhado da diminuição em linfócitos T efetores e T regulatórios. Também, demonstramos que linfócitos B que possuem alta expressão da enzima CD39, tem capacidade supressiva sobre linfócitos efetores. Em conjunto, os resultados apresentados nessa Tese apresentaram possíveis novas alternativas de tratamento e contribuíram para melhor compreender esse maligno câncer cerebral. / Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common and most malignant brain tumor. The awful prognosis is in part due to the low bioavailability of chemotherapy agents in the tumoral tissue, recurrence originated from treatment-resistant progenitor cells and an impaired immune system. Indeed, regulatory lymphocytes modulate the immune system toward a pro-tumoral response, turning the treatment even more difficult. In this sense, lipid-core nanocapsules (LNCs) have been widely studied to raise the drug specificity to the tumor. Methotrexate (MTX) and trans-resveratrol (RSV) have antitumoral activity, but need relatively high doses to the anti-glioblastoma outcome in vivo. MTX has immunosuppressive capability mediated by the increase of adenosine in the extracellular milieu. Adenosine in turn may modulate both effector and regulatory immune cells in the tumoral microenvironment. Thereby, the hypothesis presented is that RSV and MTX may have an antitumor improvement when loaded into LNCs in GBM models. Moreover, we sought to evaluate whether MTX could interfere with purinergic enzymes. Lastly, we evaluated how adenosine could modulate B- and T-lymphocytes through CD39 and ecto-5’NT enzymes. RSV- and MTX-loaded lipid-core nanocapsules (RSV-LNCs or MTX-LNCs) increased their antitumoral outcome in relation to the solution compounds, inducing both cell cycle arrest and apoptosis in GBM cells. MTX decreased the expression of the antiapoptotic protein BCL-2 and increased the active caspase-3, triggering glioblastoma cells to apoptosis. Furthermore, MTX increased the expression of ecto-5’-NT/CD73 in glioma cells and T lymphocytes of the glioma microenvironment. This up-regulation was followed by decreasing in T effector and T regulatory lymphocytes. Also, we further demonstrated that B lymphocytes with high expression of CD39 enzyme can suppress T efector lymphocytes. Also, we further demonstrated that B lymphocytes with high expression of CD39 enzyme can suppress T efector lymphocytes. Taken together, the results presented herein indicate newfound treatment approaches and new knowledge regarding to this deadliest brain tumor.

Introdução: leiomiomas uterinos são os tumores benignos mais prevalentes nas mulheres em idade fértil, ocorrem em cerca de 50% da população feminina e são a indicação mais frequente de histerectomia. A importância dos esteroides ovarianos na etiologia dos leiomiomas está bem estabelecida; contudo, as contribuições relativas dos estrógenos e da progesterona no crescimento dos leiomiomas ainda são controversas. Muitos estudos têm apresentado evidências de que a progesterona seria mais importante do que os estrógenos para o desenvolvimento destes tumores, e antiprogestágenos como a mifepristona podem tornar-se uma nova possibilidade de tratamento conservador. Ensaios clínicos têm sugerido que a mifepristona é efetiva no tratamento de leiomiomas, causando redução no tamanho dos tumores. Todavia, a recorrência da proliferação dos tumores após o fim do tratamento e os mecanismos de ação da mifepristona na regulação dos receptores de progesterona ainda não estão esclarecidos. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da mifepristona sobre a proliferação celular e a expressão gênica de receptores de progesterona A e B, em um modelo de cultura de células de miométrio e leiomioma, sob diferentes condições hormonais. Métodos: fragmentos de leiomioma e de miométrio adjacente foram obtidos de cinco pacientes submetidas à histerectomia. Foram padronizadas as culturas primárias de leiomioma e miométrio, e as células de cada tipo de tecido em cultura foram divididas em cinco grupos de tratamento: estradiol, estradiol e mifepristona, estradiol e progesterona, estradiol, progesterona e mifepristona e controle (etanol utilizado como veículo dos hormônios). Foi realizada análise imunocitoquímica para α-actina. A proliferação celular foi avaliada através de contagem em hemocitômetro e ensaio de MTT no tempo 7 (após o tratamento com mifepristona) e no tempo 9 (após a recuperação do tratamento). No dia 7, foi feita extração de RNA para avaliar a expressão de receptores de progesterona (PRs) A e B através de PCR em tempo real. Resultados: o estabelecimento do modelo de cultura de células foi confirmado através da coloração positiva para α-actina e pela observação de características morfológicas típicas de células musculares lisas. As técnicas de avaliação da proliferação celular, contagem e MTT, mostraram correlação positiva. O tratamento com estradiol aumentou a proliferação celular de ambos os tipos de tecido, em relação ao grupo controle. O tratamento com progesterona associada ao estradiol aumentou a proliferação das células de ambos tecidos, em relação ao tratamento com estradiol isoladamente e ao controle. Para os dois tratamentos, as células de leiomioma proliferaram mais do que as células de miométrio. No tempo 7, o tratamento com mifepristona associada ao estradiol inibiu a proliferação celular em leiomioma (42%) e no miométrio (23%), em comparação ao mesmo tecido tratado somente com estradiol. O tratamento com mifepristona em associação com estradiol e progesterona inibiu a proliferação celular em leiomioma (105%) e miométrio (56%), em comparação ao mesmo tecido tratado com estradiol e progesterona. No tempo 9, após a recuperação do tratamento com mifepristona, células de miométrio mostraram maior resposta proliferativa do que células de leiomioma. Todavia, o tratamento com mifepristona não foi capaz de inibir completamente a proliferação celular, visto que todos os grupos tratados mostraram aumento de proliferação do tempo 7 até o tempo 9. Foi demonstrada a expressão das duas isoformas de PRs, A e B, em miométrio e leiomioma in vitro; contudo, as comparações entre os grupos de tratamento não foram possíveis devido ao reduzido tamanho amostral. Conclusões: culturas primárias de células de miométrio e leiomioma são um modelo viável para avaliação da proliferação celular em diferentes condições hormonais, e o ensaio de MTT pode ser um bom método de avaliação. A mifepristona inibiu a proliferação celular em ambos os tipos de tecido, com o maior efeito quando associada ao estradiol e à progesterona e em células de leiomioma. Células de miométrio e leiomioma expressam as duas isoformas de PRs in vitro. Mais estudos são necessários para esclarecer o papel da mifepristona na regulação da expressão gênica e proteica dos PRs. / Introduction: uterine leiomyomata are the most common benign tumors in women of reproductive age, with an estimated incidence greater than 50% and being the most common indication for hysterectomy. Importance of ovarian steroids in the etiology of leiomyomas is well established; however, relative contributions of estrogens and progesterone in leiomyomas growth are still controversial. Many studies have presented evidences that progesterone is more important than estrogens for the development of these tumors, and antiprogestins like mifepristone have become a new possibility for conservative treatment. Clinical trials suggest that mifepristone is effective in treating leiomyomata, producing reduction of their size. However, recurrence of tumor proliferation after treatment and molecular mechanisms of mifepristone action in regulating progesterone receptors remains unknown. Therefore, the aim of this study was to evaluate the effect of mifepristone on cell proliferation and progesterone receptors A and B gene expression, in a model of leiomyoma and matched myometrium cell cultures under different hormonal conditions. Methods: human leiomyoma and matched myometrial tissues were obtained from five patients undergoing hysterectomy. Cells maintened in culture from each tissue were divided into 5 treatment groups: estradiol, estradiol and mifepristone, estradiol and progesterone, estradiol, progesterone and mifepristone, and control group (ethanol as a vehicle from hormones). Immunocytochemistry analysis for α-actin was performed. Cell proliferation was evaluated by hemocytometer counting and MTT assay at day 7 (after mifepristone treatment) and day 9 (after recovery from treatment). RNA extraction was performed at day 7 to evaluate progesterone receptors (PRs) A and B expression by real time PCR. Results: culture cell establishment was confirmed by positive staining for α-actin and by observed morphological characteristics from smooth muscle cells. Cell proliferation evaluating techniques, hemocytometer counting and MTT, showed positive correlations. Estradiol treatment increased cell proliferation for leiomyoma and myometrium cells compared to control group. Progesterone combined to estradiol increased cell proliferation in both cell types, compared to estradiol alone and control group. For both hormonal treatments, leiomyoma showed significantly higher proliferation than myometrial cells. At day 7, mifepristone treatment in association with estradiol inhibited cell proliferation in leiomyoma (42%) and myometrial cells (23%), compared to the same tissue treated with estradiol alone. Mifepristone treatment in association with estradiol and progesterone also inhibited cell proliferation in leiomyoma (105%) and myometrial cells (56%), compared to the same tissue treated with estradiol and progesterone. At day 9, after recovery from mifepristone treatment, myometrial cells showed greater proliferative response than leiomyoma cells. However, mifepristone treatment was not able to completely inhibit cell proliferation, whereas treated groups showed increased proliferation from day 7 to 9. We have found that two isoforms of PRs, A and B, were expressed in both myometrial and leiomyoma in vitro; however, comparisons between groups were not possible due to the small sample size. Conclusions: primary myometrial and leiomyomata cell cultures are a viable model for cell proliferation analysis under different hormonal conditions, and MTT assay could also be a good evaluation method. Mifepristone inhibited cell proliferation of both types of tissue, with maximum effect in association with estradiol and progesterone in leiomyoma cells. PRs A and B were expressed in myometrial and leiomyoma cells in vitro. Further investigation is needed to clarify whether mifepristone regulates gene and protein expression of PRs.

Sabe-se que o sistema canabinóide endógeno está envolvido com os processos de formação e evocação da memória. Agonistas dos receptores CB1 exibem diferentes efeitos conforme a via de infusão, seja ela sistêmica, seja local, atingindo estruturas específicas do encéfalo. Neste estudo pretendemos estabelecer o perfil farmacológico-comportamental e eletrofisiológico do agonista CP55,940 quando administrado no hipocampo dorsal de ratos, estrutura em que há poucos estudos prévios com este fármaco: diferente de outros agonistas como a WIN55,212 e mesmo a pouco seletiva anandamida, o CP55,940 restringe-se a receptores canabinóides e chega a ser mais potente que o Δ9-THC, embora não discrimine entre os receptores CB1 (central) e CB2 (periférico). Os fármacos foram infundidos bilateralmente, em diferentes concentrações, na área CA1 do hipocampo, imediatamente após o treino ou antes do teste na tarefa de Condicionamento Aversivo ao Contexto (CAC), visando estudar seus efeitos, respectivamente, na consolidação e na evocação da memória. A CP55,940 pós-treino foi amnéstica apenas na concentração de 5 μg/μl, e esse efeito foi revertido pelo antagonista AM251, seletivo para CB1, em concentração sem efeito próprio, comprovando tal efeito dever-se à ação sobre os receptores CB1. O mesmo efeito foi observado 24h após o treino, na infusão pré-teste, se bem que agora a CP55,940 foi efetiva também em concentrações mais baixas, sugerindo que os receptores desse sistema endógeno tenham ficado mais sensíveis a seus ligantes em função do aprendizado; a seletividade por CB1 neste caso, porém, não ficou claramente atestada pois o efeito de 5 μg/μl de CP55,940 só foi revertido com uma concentração maior de AM251. Na eletrofisiologia, uma concentração de CP55,940 comparável à efetiva sobre a CAC (10μM), não foi capaz de inibir a indução da LTP, já que a potenciação só se sustentou por cerca de 30min – não passou de uma LTP. Esses resultados reforçam e diversificam estudos anteriores, inclusive de nosso grupo, que comprovam a participação dos receptores CB1 na formação e/ou evocação de novas memórias aversivas, bem como possíveis alterações plásticas na densidade desses receptores em função da experiência cognitiva, embora não necessariamente mediadas por eventos sinápticos plásticos como a LTP. / The endogenous cannabiboid system is known to be involved memory formation and retrieval processes. CB1 agonists may cause different effects according to the administration pathway, be it systemic or local/intrastructure. Here we try to establish the behavioral-pharmacologic and electrophysiologic profile of the agonist CP55,940 infused into the rat dorsal hippocampus, a structure less studied with this drug: different from other agonists such as WIN55,212 or even the poorly selective anandamida, CP55,940 sticks only to cannabinoid receptors and is more potent than Δ9-THC, but does not distinguish between central CB1 and peripherical CB2 receptors. The drug was infused bilaterally in different concentrations into the CA1 area of the hippocampus, right after training or pre-test in the Context Fear Conditioning (CFC) task, in order to study its effects upon memory consolidation and retrieval, respectively. Post-training CP55,940 was amnestic only at 5 μg/μl, and the CB1-selective antagonist AM251 reverted this effect in a concentration without action per se, which proves that the original effect is mediated by CB1 receptors. The same amnestic effect was observed 24h after training, in the pretest infusion, only that now CP55,940 was affective also with lower concentrations, suggesting that these receptors are now more sensitive to its endogenous ligands due to learning; CB1-selectivity, however, is not clearly proven here since 5 μg/μl of CP55,940 was reverted only by a higher concentration of AM251. In electrophysiology, a concentration of CP55,940 compatible with that found effective upon CFC (10μM), was not able to block LTP induction, since the potentiation was not sustained for more than 30min – it was only a STP. These results teinforce and diversify previous findings, including some from our own lab, that prove the involvement of CB1 receptors in memory consolidation and/or recall, as well as possible plastic changes in receptor density due to the cognitive experience, despite not necessarily mediated by plastic synaptic events such as LTP.

Introdução: A Doença de Gaucher (DG) é causada pela atividade reduzida da enzima lisossomal glucocerebrosidase, o que leva ao acúmulo de glicocerebrosídeo nas células e a uma estimulação crônica do sistema imune. Células natural killer (NK) possuem um papel importante na resposta imune e sua atividade é alterada na DG. Os receptores KIR (Killer Immunoglobulin-like Receptors) regulam a atividade das células NK através da interação com moléculas de HLA (Human Leukocyte Antigen) de classe I das célulasalvo. Objetivo: Analisar a variabilidade dos genes KIR em uma coorte de pacientes com DG do Sul do Brasil, compará-las a um grupo controle e buscar associações com manifestações clínicas. Metodologia: Trinta e um pacientes com DG tipo I (24 com forma leve, 4 com forma moderada e 3 com forma grave) foram analisados e comparados a 250 controles saudáveis quanto a frequência dos genes HLA e KIR. Resultados/Discussão: Não houve diferença significativa nas frequências de variantes dos genes KIR entre os grupos. O alelo HLA B37 é mais frequente nos pacientes com DG do que no grupo controle (p=0,011). A idade de início dos sintomas mostrou associação com a combinação das variantes KIR2DL2 e KIR2DS2 com seu ligante HLA-C1 (p=0,038). Pacientes que apresentam a variante HLA-C2 parecem apresentar maior susceptibilidade a desenvolver bandas mono ou policlonais na eletroforese de proteínas (p=0,007, OR=21,3). Foi encontrada associação entre os alelos DR11 (p=0.008) e DR13 (p=0.011) e gravidade da doença. O alelo DR11 parece estar associado a comprometimento neurológico, enquanto o alelo DR13 ao desenvolvimento de osteonecrose. Conclusão: Nossos dados sugerem uma possível associação entre variantes dos genes KIR e HLA e a DG. Devem ser estudadas em outras coortes de pacientes já que parecem ser um fator modificador de fenótipo. / Background: Gaucher disease (GD) is caused by the reduced activity of a lysosomal enzyme glucocerebrosidase, which leads to the accumulation of glucocerebroside in the cells and a chronic stimulation of the immune system. Natural Killer (NK) cells play an important role in the immune response, and their activity is impaired in GD. Killer immunoglobulin-like receptors (KIR) regulate the activity of NK cells through an interaction with specific human leukocyte antigen (HLA) class I molecules on target cells. Objectives: To analyze the variability of KIR genes in a Southern Brazilian sample of GD patients, to compare it with controls, and to look for associations with clinical manifestations. Methodology: Thirty one GD type I patients (24 mild, 4 moderate, and 3 severe) were analyzed and compared to 250 healthy controls regarding the frequency of HLA and KIR genes. Results/Discussion: There was no significative difference in the frequencies of KIR gene variants between the groups. The HLA B37 allele is more frequent in patients with GD than in control group (p=0.011). The age of onset of symptoms was associated with KIR2DL2 and KIR2DS2 combination with the ligand HLA-C1 (p=0.038). Patients who have the HLA-C2 variant appear to have more mono/polyclonal bands in protein electrophoresis (p=0.007, OR=21.3). An association between the DR11 (p=0.008) and DR13 (p=0.011) alleles and disease severity was found. The DR11 allele appears to be associated with neurological impairment, while the DR13 allele to the development of osteonecrosis. Conclusion: Our data suggest a possible association between KIR genes and HLA genes and GD. They should be studied in other cohorts of GD patients as they seem to be a phenotype modifying factor.

A cafeína é a substância psicoestimulante mais consumida no mundo todo. Muitos estudos já foram realizados avaliando os seus benefícios sobre as funções cognitivas. Algumas evidências sugerem a participação do sistema colinérgico nos efeitos da cafeína, mas os estudos ainda são incipientes. O objetivo desse estudo foi verificar os efeitos da administração aguda de cafeína frente ao bloqueio dos receptores colinérgicos muscarínicos pela administração do antagonista não-seletivo escopolamina. Camundongos adultos machos receberam cafeína (10 mg/kg, i.p.) uma vez ao dia durante 4 dias. No quinto dia, a escopolamina (2 mg/kg, i.p.) foi administrada imediatamente após a sessão de treino na tarefa de reconhecimento de objetos. Na tarefa de esquiva inibitória a escopolamina foi administrada 15 minutos antes ou imediatamente após a sessão de treino para avaliar aquisição e consolidação da memória. Na tarefa de reconhecimento de objetos, a cafeína preveniu o comprometimento da memória de reconhecimento pela administração pós-treino de escopolamina. A cafeína também foi efetiva em prevenir o comprometimento da consolidação da memória de curta e longa duração pela administração póstreino de escopolamina. Entretanto, a cafeína só foi efetiva em prevenir o comprometimento da memória pela administração pré-treino da escopolamina quando o teste foi realizado 90 minutos após o treino (memória de curta duração). Esses resultados sugerem que os efeitos preventivos da cafeína observados em modelos de déficit mnemônico podem envolver a participação do sistema colinérgico. / Caffeine is the psychostimulant most consumed worldwide. Many studies have been performed evaluating its benefits on the cognitive functions. There is evidence to suggest the participation of cholinergic system on the effects of caffeine, but studies are still incipient. The aim of this study was to investigate the effects of acute administration of caffeine on memory impairment by the blockade of muscarinic cholinergic receptors. Adult male mice received caffeine (10 mg/kg, i.p.) once daily during 4 consecutive days. On the fifth day, the non selective antagonist for muscarinic receptors, scopolamine (2 mg/kg, i.p.) was administered immediately after training session on the novel object recognition task. In the inhibitory avoidance task, scopolamine was administered 15 minute s prior to or immediately after training session to evaluate acquisition and consolidation of memory. In the novel object recognition task caffeine was effective in preventing the impairment of short- and long-term memory consolidation by post training administration of scopolamine. In the inhibitory avoidance task, caffeine was effective in preventing short-term memory impairment by administration of scopolamine prior to training. When scopolamine was administered after training, caffeine was able to prevent both short- e long-term memory impairments. These results suggest that the preventive effects of caffeine against mnemonic deficits may involve participation of the cholinergic system.

Os nucleotídeos extracelulares modulam uma variedade de ações biológicas via ativação de receptores purinérgicos. Esses efeitos são controlados pela ação de ectonucleotidases, tais como as E-NTPDases e a ecto-5´-NT/CD73, as quais hidrolisam o ATP até adenosina no meio extracelular. Nas células imunes, o ATP pode atuar como uma molécula sinalizadora de perigo enquanto a adenosina, um produto da degradação do ATP, serve como um mecanismo que controla/limita a inflamação. Já, no sistema vascular, o ADP é um agonista fisiológico envolvido na hemostasia normal e na trombose. Considerando que os macrófagos são elementos chave para processos inflamatórios e quando estímulados exibibem um fenótipo pró-inflamatório/defesa (clássico/M1) ou antiinflamatório/reparatório (alterantivo/M2). O objetivo foi investigar a atividade e expressão das ectonuclotidases em diferentes fenótipos de macrófago e avaliar o efeito da homocisteína sobre essas enzimas em macrófagos e plaquetas.. As análises da diferenciação de macrófagos em fenótipo próinflamatório/ M1 e antiinflamatório/M2 revelaram presença igual de receptores purinérgicos. Entretanto, mudança no perfil das ectonucleotidases como E-NTPDase1, E-NTPDase3 e ecto-5’- nucleotidase foram encontradas, sugerindo que os macrófagos devem alterar a casacata purinérgica durante a ativação fenotípica. No fenótipo pró-inflamatório/M1 houve uma diminuição na hidrólise de ATP, sugerindo um acúmulo do mesmo, enquanto no fenótipo antiinflamatório/M2 as enzimas conduzem para uma progressiva diminuição nas concentrações de nucleotídeos (ATP) e aumento na disponibilidade de adenosina. Já os macrófagos expostos a homocisteína apresentaram uma polarização para o fenótipo pro-inflamatório (M1) e nossos achados sugerem o envolvimento da ENTPDase3 e da ecto-5’-nucleotidase em macrófagos nas complicações inflamatórias associadas a homocisteína. Nas plaquetas, as quais são elementos fundamentais no processo de trombogênese, a homocisteína causou uma diminuição na hifrólise de ADP. Essa elevação no nível de ADP ao redor das plaquetas devido a inativação das ectonucleotidases, causada pela homocisteína, deve estar contribuindo para o aumento do risco trombótico descrito em pacientes com hiperhomocisteinemia. Além disso, os animais que receberam homocisteína tiveram um aumento na agregação plaquetária induzida por ADP. Em conclusão, os resultados do presente estudo reforçam o envolvimento do sistema purinérgico em processos inflamatórios/trombóticos e apontam parar o desenvolvimeto de tratamentos para doenças inflamatórias/trobóticas. / Extracellular nucleotides modulate a variety of biological actions via purinergic receptor activation. These effects are modulated by ectonucleotidases, such as ENTPDases and ecto-5´- NT/CD73, which hydrolyze ATP to adenosine in the extracellular milieu. In the cells of the immune system, the ATP can act as danger signaling whereas adenosine, the ATP breakdown product, serves as a negative feedback mechanism to limit inflammation. Already, in the vasculare system, the ADP is a physiological agonist involved in normal hemostasis and thrombosis. Since, macrophages are key to inflammatory process, that depending on the microenvironmental stimulation exhibit proinflammatory/ defense (classical/M1) and antiinflammatory/reparatory (alternative/M2) phenotype. The objective of this study was investigate the activity and expression of the ectonuclotidases in differential macrophage phenotype and evaluate the homocysteine (Hcy) effects on theses enzymes in macrophages and platelets. . The analysis of differential macrophages in phenotype proinflamatory/ M1 and antiinflamatory/M2 showed the same expression to P1 and P2 purinoreceptors. However, change profile of the ectonucleotidases as E-NTPDase1, E-NTPDase3 and ecto-5’- nucleotidase enzymes in macrophages during phenotypic differentiation were found, suggesting that macrophages must alter the purinergic cascade during macrophages differentiation phenotypic. In the pro-inflamatory/M1 phenotype the ATP hydrolysis decreased, suggesting ATP accumulation. On the other hand, the antiinflamatory/M2 phenotype the enzymes lead to a progressive decrease in nucleotides (ATP) concentrations and an increase the adenosine availability. Already, the macrophages exposed to Hcy present a polarized pro-inflammatory profile (M1) and our findings suggest the involvement of the E-NTPDase3 and ecto-5’-nucleotidase in the inflammatory complications associates to homocysteine. In the Platelets, which are fundamental elements to the thrombogenesis process, the homocysteine decreased ADP hydrolysis. This elevation of ADP around of the platelets due inactivating of ectonucleotidase, probably by the indirect action of Hcy, may be contributing to increase thrombotic risk described in individuals with hyperhomocysteinemia. In addition, the animals that received Hcy treatment potentiate platelet aggregation induced by ADP. In conclusion, in the present study the results reinforce purinergic signaling involvement in inflammatory/thrombosis process and point to development of treatments to inflammatory/thrombotic diseases.

O principal objetivo dos experimentos apresentados nesta tese foi investigar o envolvimento dos receptores do peptídeo liberador de gastrina (GRPRs) hipocampais nos processos de extinção e reconsolidação da memória e em um modelo de amnésia associado à doença de Alzheimer. No Capítulo I foram avaliados os efeitos do bloqueio do GRPR na extinção da memória aversiva. Ratos Wistar machos foram treinados na tarefa de esquiva inibitória e retornaram repetidamente ao contexto da sessão de treino sem choque durante três dias seguidos. A infusão no hipocampo dorsal de um antagonista dos GRPRs ou anisomicina, inibidor da síntese protéica, imediatamente após a primeira sessão de teste inibiram a extinção da memória. Estas drogas não tiveram o mesmo desempenho nas sessões subseqüentes quando a primeira sessão da extinção (primeiro dia após o treinamento) foi omitida. Os resultados indicam que os GRPRs estão envolvidos na extinção da memória motivada por medo no hipocampo.No Capítulo II foi avaliado o possível papel do GRPR e do receptor de glutamato do tipo N-metil-D-aspartato (NMDAR) em processos associados à reconsolidação da memória. Os resultados mostraram que a inativação de GRPR pelo antagonista RC-3095 ou de NMDARs hipocampais pelo antagonista ácido aminofosfonopentanoico (AP5), após a reativação da memória, prejudica temporariamente a retenção. Entretanto, o prejuízo da memória induzido por RC-3095 ou AP5 pós-reativação foi transitório e voltou aos níveis dos ratos-controle em um teste subseqüente 3 dias após o treino. O efeito das drogas se deu apenas após a reativação da memória, e não na ausência da mesma. Estes resultados fornecem a primeira evidência que a inativação de GRPR após areativação pode prejudicar a memória. No Capítulo III nós investigamos o efeito da ativação dos GRPRs em um modelo de amnésia associado à doença de Alzheimer. Os ratos receberam infusão bilateral de bombesina, agonista GRPR, ou salina 10 min antes do treino na tarefa de esquiva inibitória, e peptídeo β-amilóide (25-35) ou água destilada imediatamente após o treino. A infusão intrahipocampal pós-treino do peptídeo β-amilóide (25-35) induziu um prejuízo significativo na retenção da memória na tarefa de esquiva inibitória. A infusão pré-treino de bombesina previniu o prejuízo da retenção da memória induzido pelo peptídeo β-amilóide (25-35). O resultado indica que os agonistas de GRPR podem previnir os prejuízos da memória causados pelo peptídeo β-amilóide (25-35) no hipocampo. / The main purpose of the research presented in this thesis was to evaluate the involvement of hippocampal gastrin-releasing peptide receptors (GRPRs) in extinction and reconsolidation of fear memory, as well as the effects of GRPR activation in a rat model of memory dysfunction associated with Alzheimer’s disease (AD). In Chapter 1, we evaluated the possible involvement of the GRPR in extinction of memory for aversive training. Male Wistar rats were trained in inhibitory avoidance (IA) conditioning and then returned repeatedly to the training context without shock on a daily basis for 3 days. Infusion of the GRPR antagonist RC-3095 or the protein synthesis inhibitor anisomycin into the CA1 area of the dorsal hippocampus immediately after the first extinction session blocked extinction. These drugs did not affect performance in subsequent sessions when the first extinction session (1 day after training) was omitted.The results provide the first evidence that hippocampal GRPRs are involved in memory extinction. In Chapter 2, we evaluated the possible role of hippocampal GRPRs and glutamate N-methyl-D-aspartate receptors (NMDARs) in reconsolidation-like processes. We show that inactivation of hippocampal GRPRs or NMDARs after memory reactivation temporarily disrupts retention of IA memory.Post-retrieval intrahippocampal infusion of the GRPR antagonist RC-3095 or the NMDAR antagonist aminophosphonopentanoic acid (AP5) produced an impairment of IA performance tested 2 days after training in rats. However, the memory impairment induced by postretrieval RC-3095 or AP5 was transient and recovered to levels of control rats in a subsequent test 3 days after training. The drug effects were only present after memory reactivation and not in the absence of reactivation. The findings provide the firstevidence that GRPR inactivation after memory retrieval can impair memory. In Chapter 3, we verified whether GRPR activation would affect IA memory retention in a rat model of memory dysfunction associated with AD. Rats were given bilateral infusions of the GRPR agonist bombesin or saline 10 min before IA training, and β-amyloid peptide (25- 35) or distilled water immediately after training. Posttraining intrahippocampal infusion of β-amyloid peptide (25-35) induced a significant impairment of IA retention. Pretraining infusion of an otherwise ineffective dose of bombesin prevented the β-amyloid peptide (25-35)-induced retention impairment. The result indicates that GRPR agonists can prevent memory impairments elicited by β-amyloid peptide (25-35) in the hippocampus.

Resumo não disponível

Apesar de representarem cerca de 50% de todas as células do encéfalo humano, as células da glia foram negligenciadas pela Doutrina do Neurônio, no início do século XX, por não serem excitáveis e por não se comunicarem como os neurônios. Durante um longo período, os estudos sobre os astrócitos se restringiam a suas funções de suporte do SNC. Atualmente se sabe que os astrócitos expressam receptores para uma variedade de neurotransmissores, como por exemplo, receptores colinérgicos nicotínicos, sugerindo possíveis mecanismos de resposta aos sinais enviados pela atividade neuronal, de modo variável e dinâmico, espontaneamente ou dependente da atividade neuronal e ativado pela alteração dos níveis intracelulares de Ca2+. Entretanto, os mecanismos específicos que explicam como essas células podem ser ativadas e qual sua contribuição para funcionamento do SNC ainda não estão totalmente esclarecidos. A secreção da proteína trófica S100B pelo astrócito pode ser um exemplo de comunicação celular, bem como também marcador biológico para diversas doenças. O nosso grupo já mostrou o envolvimento de diversos sistemas neuronais na modulação da secreção da proteína S100B. Um outro exemplo de comunicação é a liberação de gliotransmissores e a influência aguda astrocítica na transmissão sináptica. O objetivo dessa tese foi investigar se ativação do sistema colinérgico modula a secreção da proteína S100B em culturas primárias de astrócitos. Ainda, investigamos o uso da optogenética para o estudo da gliotransmissão em fatias de hipocampo. As culturas foram tratadas com inibidores da acetilcolinesterase (huperzina-A e tacrina), agonistas (acetiltiocolina, nicotina e carbacol) e antagonistas (mecamilamina e escopolamina) colinérgicos incubados durante 1 e 24 h. Os estudos em optogenética partiram primeiramente da caracterização do sistema cre/lox através da análise da expressão das proteínas de interesse, seletiva para astrócitos, por imunohistoquímica. Os resultados do primeiro estudo mostraram que a huperzina-A aumentou a secreção de S100B em culturas primárias de astrócitos, assim como o tratamento com nicotina; no segundo, discutiu-se as limitações metodológicas quanto a especificidade das proteínas e alteração da fisiologia dos astrócitos. Os resultados obtidos nessa tese ressaltam para a importância do conhecimento da fisiologia do astrócito, contribuindo para o entendimento de um possível mecanismo de ativação colinérgico dos astrócitos em promover secreção de S100B. Também é preciso ressaltar a relevância de novas metodologias que ajudam a descrever melhor o papel dos astrócitos na atividade sináptica. / Although about half of the brain cells are glial cells, the Neuron Doctrine has neglected them, at the beginning of 20th century, because they were not excitable and also, they were unable to communicate as neurons. For a long time, the studies about astrocytes functions were limited to trophic and metabolic support to neurons by which providing for the homeostasis of the nervous system. A variety of studies have been shown the expression of different neurotransmitters receptors in astrocytes, for instance, nicotinic receptors, suggesting the possibility of astrocytic response to neuronal activity. This response is variable and dynamic and mostly can be activated by changes at the intracellular calcium levels. However, the specific mechanisms of astrocytic Ca2+ excitability and how this process could contribute to CNS functioning are still unclear. The S100B secretion could be an example of cellular communication, as well as biomarker for diverse diseases. S100B is calcium binding protein, produced and secreted mainly by astrocytes. Our group has already demonstrated the relevance of various neuronal systems mediating the S100B secretion. Another astrocytic form of communication could be the release of gliotransmitters and the acute influence at synaptic transmission. The aim of this thesis was to investigate whether cholinergic system activation could modulate S100B secretion in primary astrocytes cultures. Moreover, we investigated the optogenetic properties as a tool for gliotransmission studies in hippocampal slices. The astrocytes cultures were treated with acetylcolinesterase inhibitors (huperzine-A and tacrine), agonists (acetylthiocholine, nicotine and carbachol) and antagonists (mecamylamine and scopolamine) for 1 and 24h. The optogenetic studies were conducted, firstly, from the cre/lox characterization of protein expression, selectively for astrocytes, by immunohistochemistry. The first study results showed that huperzine-A increased S100B secretion, as well as nicotine; in the second study, we have discussed the main methodological limitations concerning the protein specificity and astrocytes physiology changes. These results raise the importance of astrocytes functions investigations, especially S100B secretion, contributing for the first time to the understanding of astrocytes excitability likely trough nicotinic system activation. In addition, it is worthy to note that new methodologies are relevant and can help us in a better description of astrocytes role during synaptic activity and brain functioning.

Os primeiros dias de vida de um animal caracterizam uma fase crucial para seu desenvolvimento neuroanatômico e neurofisiológico, e intervenções nesse período podem gerar modificações neurais persistentes nos animais adultos. O procedimento de manipulação neonatal, que envolve uma breve separação dos filhotes da companhia de sua mãe nos primeiros dias de vida, gera alterações comportamentais características, como uma resposta de medo atenuada a ambientes novos, alterações no comportamento sexual e menor resposta a estresse. Adicionalmente, alguns estudos observaram maior consumo de alimento palatável nos animais manipulados, sem encontrar alteração no consumo da ração padrão. Este comportamento poderia ser resultado de alterações nos mecanismos hedônicos destes animais. Poucos estudos sobre manipulação neonatal e respostas hedônicas utilizam ratos fêmeas. Portanto, o objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito da manipulação neonatal sobre a reação facial afetiva à administração de soluções de sacarose em ratos fêmeas pré-púberes e adultas, manipuladas no período neonatal, comparadas com ratas não manipuladas, avaliando-se também o imunoconteúdo de tirosina hidroxilase e do receptor D2 da dopamina no núcleo accumbens. O protocolo de manipulação neonatal foi realizado dos dias 1 a 10 de vida, sendo o dia do nascimento considerado dia 0. Os animais foram colocados em um recipiente dentro de uma incubadora a 32°C por 10 min/dia, sem contato físico com a genitora. Somente fêmeas foram utilizadas para este trabalho. Foi realizado um teste de reatividade ao sabor, que consiste de filmagens das expressões faciais do animal em resposta à administração oral de solução, tendo sido utilizadas quatro concentrações de sacarose (0,03M; 0,1M; 0,3M; 1M) para os animais jovens e duas concentrações de sacarose (0,1M e 0,3M) para os animais adultos. Nos animais adultos o ciclo estral foi avaliado para correlacionar com os resultados dos testes comportamentais. Os resultados do presente estudo demonstraram uma maior reatividade ao sabor doce nos animais manipulados quando testados na fase pré-púbere. Esta resposta pode estar relacionada a modificações nos mecanismos hedônicos como resultado da manipulação neonatal. Porém, não foi encontrada diferença estatística para a reatividade ao sabor doce entre animais adultos dos grupos controle e manipulado. Adicionalmente, a avaliação do imunoconteúdo de receptor D2 e da enzima tirosina hidroxilase não revelou diferença estatística significativa entre os grupos controle e manipulado, tanto para os animais jovens quanto para os adultos. Estes resultados podem ser indicativos de que o sistema dopaminérgico não está relacionado com as modificações nas respostas hedônicas observadas nas fêmeas jovens. Concluindo, a manipulação neonatal gerou animais mais responsivos à sacarose na idade jovem, porém, estas alterações foram revertidas nos animais adultos. / The neonatal period is a crucial phase for the neuroanatomical and neurophysiological development, and interventions within this period can generate long-lasting neural modifications. Neonatal handling, consisting of a brief maternal separation, can result in behavioral alterations such as diminished neophobia, sexual behavior alterations and reduced stress response. Furthermore, these animals also ingest more palatable food than control animals, without alterations in the regular lab chow consumption. Such behavior could be a result of modifications within brain reward mechanisms. There have been only a few studies about neonatal handling and response to reward using female rats. Therefore, the purpose of the present study was to determine the effects of neonatal handling on affective facial reactions to sucrose solutions in peripubertal and adult female rats. We also examined nucleus accumbens enzyme tyrosine hydroxylase and dopamine D2 receptor immunocontent. Handling procedures were carried out from the 1st day to the 10th day after birth. The pups were placed in a small plastic box inside an incubator at 32°C for 10 min daily. Only female rats were used. Behavioral tests were performed during the peripuberty period and on adults. Orofacial reactions after sucrose solution delivery were recorded on a digital camera for the taste reactivity analysis. The peripubertal animals (~28 days) received four different sucrose concentrations (0,03M; 0,1M; 0,3M; 1M), while the adult animals (>60 days) received two sucrose concentrations (0,1M; 0,3M). Estrous cycle was accessed before tests in adult females for further analysis. The present results show that responsivity to sweet solutions in peripuberty was higher in animals handled during the neonatal period. This higher response could be due to modifications in reward mechanisms as a result of neonatal handling. No statistical difference was found for the adult animals when compared to non-handled. In addition, no statistical difference was found for tyrosine hydroxylase and dopamine D2 receptor immunocontent in both peripubertal and adult animals. Thus, it appears that the dopaminergic system is not related to the handling alterations in peripubertal hedonic responses. In conclusion, neonatal handled female rats show higher reward responses to sucrose solutions during peripuberty. However, this effect seems to be reverted in adult handled animals.