Analisamos a expressão de IL-10, IFN-<font face=\"symbol\">g e, seus receptores pelas células trofoblásticas de camundongos, citocinas anti e pró-inflamatórias. Cones ectoplacentários aos 7,5 dias de gestação foram cultivados por 48 h e em seguida tratados com 100 U/mL IFN-<font face=\"symbol\">g ou 10 <font face=\"symbol\">hg/mL IL-10. Após 6 h e 14 h, as amostras foram processadas para análise da expressão gênica por RT-PCR e protéica por imunohistoquímica, respectivamente. Grupos controle não receberam tratamento. IFN-<font face=\"symbol\">g aumentou a expressão de IL-10R1 mas não a de IL-10 nas células trofoblásticas. IL-10, ao contrário, aumentou a expressão de IFN-<font face=\"symbol\">g, mas diminuiu IFN-<font face=\"symbol\">gR<font face=\"symbol\">a e não alterou IFN-<font face=\"symbol\">gR<font face=\"symbol\">b. Reações imunohistoquímicas confirmaram os resultados de expressão gênica. Isto sugere que o trofoblasto pode participar da imunidade da interface materno-placentária aumentando a expressão de IFN-<font face=\"symbol\">g em situações em que no meio há aumento de citocinas anti-inflamatórias, o que deve ser o reflexo da necessidade e importância desta citocina para o sucesso da gestação. / Key cytokines such as IL-10 and IFN-<font face=\"symbol\">g, essential for immune response regulation, have also been found locally at maternal-placental interface during mouse pregnancy. Particularly, levels of IL-10 characterize an anti-inflammatory environment associated to the inhibition of T helper-1 lymphocytes (Th1) development and the proliferative stimulation of the B lymphocytes (humoral response). On the other hand, increases in IFN-<font face=\"symbol\">g profile prevent T helper-2 lymphocytes (Th2) activation leading to an inflammatory response that favors a Th1 response. The local production of these cytokines by NK uterine cells and T gd lymphocytes are relevant, but not exclusive. Thus, this study analyzed the potential contribution of the trophoblast in the maintenance of Th1/Th2 balance in the maternal-placental interface, represented, respectively by the expression of IL-10 and IFN-<font face=\"symbol\">g cytokines. The expression of the anti-inflammatory cytokine IL-10 and its receptor was evaluated in the presence of an inflammatory environment mimetized by IFN-<font face=\"symbol\">g addition to the culture medium. On contrary, the expression of the IFN-<font face=\"symbol\">g (and its receptor) was evaluated in the presence of IL-10 characterizing an anti-inflammatory condition. Mouse trophoblast cells were isolated from implantation sites at gestational day 7.5 and cultured in standard conditions. Gene and protein expression were determined by immunohistochemistry and RT-PCR. IL-10 and IFN-<font face=\"symbol\">g and their receptors were expressed in cultured trophoblast cells in the absence or presence of IFN-<font face=\"symbol\">g and IL-10, respectively. IFN-<font face=\"symbol\">g treatment increased IL-10R1 expression but do not alter IL-10 expression. On contrary, in the presence of IL-10 the IFN-<font face=\"symbol\">g expression increased significantly while the expression of its receptor decreased. These results suggest that a proinflammatory environment increases trophoblast responsiveness to IL-10 whereas an anti-inflammatory condition seems to reinforce the importance of IFN-<font face=\"symbol\">g expression at the maternal-placental interface, on the initial periods of gestation.

Os receptores glutamatérgicos metabotrópicos (mGluRs) estão envolvidos nos processos de plasticidade, neurodegeneração e neuroproteção. Avaliamos a expressão de mGluRs no sistema visual de ratos e pintos em diferentes tempos após enucleação ocular. Os animais foram avaliados pelo método de imuno-histoquímica, immunoblotting e RT-PCR, para detecção dos receptores mGluR1,2/3,5 e 7. Foi observado aumento da imunorreatividade (IR) de mGluR1, 5 e 7 no colículo superior, porém não foi observada diferença no núcleo geniculado lateral. Houve aumento na expressão protéica para mGluR1, 5 e 7 e aumento da expressão gênica para mGluR1,5 e 7; por outro lado, ocorreu uma diminuição de mGluR3. No TeO, foi observado aumento da IR para mGluR1 e 5 e diminuição para mGluR2/3. As análises de immunoblotting confirmaram o aumento observado de mGluR1 e diminuição de mGluR2/3. Os resultados indicam uma modulação diferencial na expressão gênica e protéica dos mGluRs, sugerindo a participação desses receptores em processos plásticos decorrentes de lesões no sistema visual adulto. / The metabotropic glutamate receptors (mGluRs) are involved in neuronal plasticity and neuroprotection. We analyzed the expression of mGluRs in the visual system of rats and chicks in several periods after ocular enucleation. The localization and expression of mGluR1, 5, 2/3 and 7 receptors were evaluated by standard immunoperoxidase, immunoblotting and real-time PCR protocols. The immunorreativity, protein and gene expression of mGluR1, 5 and 7 receptors in the superior colliculus showed an increase, whereas no changes were seen in the lateral geniculate nucleus. For mGluR3, gene expression was decreased. In the TeO, mGluR1 and 5 increased for all survival periods analyzed. Immunoblotting analyses confirmed the increases for mGluR1 and 5, decreases for mGluR2/3. These results indicate that the expression of mGluRs is regulated by the glutamatergic retinal input, and add data on a possible role of these receptors in neuroplasticity in adult animals.

Orientador: Valéria Helena Alves Cagnon Quitete / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-11-05T17:40:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Candido_EduardoMarcelo_D.pdf: 29056954 bytes, checksum: 56337986d8eaf83c84b1cf42b26d64df (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O objetivo do presente estudo foi caracterizar e comparar a estrutura e a biologia molecular dos receptores esteróides dos lobos prostáticos e da glândula de coagulação em ratos senis, submetidos a diferentes terapias hormonais exógenas, além de identificar os processos de proliferação e apoptose nesses órgãos. Trinta ratos da linhagem Sprague-Dawley com 10 meses de idade foram divididos em seis grupos experimentais e submetidos aos respectivos tratamentos: Grupo Senil/Controle (SC); Grupo Senil/Testosterona (ST); Grupo Senil/Estrógeno (SE); Grupo Castrado (CA); Grupo Castrado-Testosterona (CT); e Grupo Castrado-Estrógeno (CE). Após trinta dias de tratamento, os animais foram sacrificados e as amostras do lobo ventral (LV), lobo dorsal (LD) e glândula de coagulação (GC) foram coletados e processados para microscopia de luz, imunohistoquímica e Western Blotting. As concentrações séricas de hormônios esteróides em amostras sanguíneas também foram determinadas. Os resultados mostraram manutenção tecidual epitelial no LD e na GC após administração de testosterona (grupos ST). Já o LV apresentou espaçamento entre epitélio e estroma. Na administração de testosterona pós-castração (grupos CT), as respostas divergiram entre as glândulas analisadas. No LV tanto o epitélio quanto o estroma mantiveram-se alterados. O LD apresentou recuperação morfológica na comparação com o grupo CA. Já na GC, enquanto o epitélio mostrou sinais de recuperação, o estroma manteve características de hiperplasia e hipertrofia. A administração de estrógeno (grupos SE e CE) manteve ou pouco alterou a morfologia da GC, porém, provocou ampla desestruturação tecidual nos lobos ventral e dorsal, com geração de micro-ácinos, presença de NIPs e focos inflamatórios. A imunohistoquímica revelou diferenças quanto à imunorreatividade dos receptores androgênicos e estrogênicos em relação aos compartimentos epiteliais e estromal em todos os órgãos avaliados. O AR foi intensamente imunorreativo no epitélio dos lobos dorsal e ventral, situação oposta à observada nas glândulas de coagulação, onde o AR foi prevalentemente estromal. O ERa foi essencialmente estromal em todos os órgãos, enquanto que o ERb foi essencialmente encontrado no epitélio do lobo ventral e no estroma das glândulas de coagulação. No lobo dorsal, o ERb foi essencialmente estromal nos grupos SC e ST, com sua imunorreatividade alterando-se para epitelial nos grupos SE e CA, mostrando que esse receptor respondeu efetivamente à ação hormonal alterando sua localização. Assim, pode-se concluir que a terapia hormonal exógena, especialmente de testosterona, pode ser útil na manutenção tecidual prostática e que a imunorreatividade diferencial dos receptores hormonais pode sugerir uma forma lobo-específica de atuação dos hormônios sexuais na manutenção tecidual e promoção de patogênese prostática / Abstract: The aim of the present study was to characterize and compare the structure and the molecular biology of the steroid hormone receptors from prostatic lobes and coagulating gland in elderly rats submitted to different hormonal exogen therapies, besides identifying the apoptosis and proliferation processes in these organs. Thirty ten-month-old male rats were divided into six groups: Senile/Control group (SC); Senile/Testosterone group (ST); Senile/Estrogen group (SE); Castrated group (CA); Castrated-Testosterone group (CT); and Castrated-Estrogen group (CE). After 30-day treatment, the animals were sacrificed and the prostatic ventral lobe (VL), dorsal lobe (DL) and coagulating gland (CG) samples were collected and processed for light microscopy, immunohistochemistry and Western Blotting analyses. Serum steroid hormone concentrations in blood samples were also determined. The results showed epithelial tissue maintenance in DL and CG after testosterone administration (ST groups). However, the VL presented spacing between the epithelium and the stroma. After castration and testosterone administration, it was verified that both epithelium and stroma were changed in the VL. The DL showed morphological recovery in relation to the CA group. The CG showed signs of epithelial recovery in contrast to the glandular stroma, which maintained features of hyperplasia and hypertrophy. Estrogen administration (SE and CE groups) caused few changes in the CG morphology. However, the estrogen led to intense tissue disorganization in both VL and DL, showing microacini, prostatic intraepithelial neoplasia (PIN) and inflammatory foci. The immunohistochemical analysis showed intense AR immunoreactivity in the epithelium of the DL and VL, whereas AR immunoreaction was predominant in the stromal cells in the CG. ER? occurred preferentially in the stromal compartment in all the studied organs, while ER? was found preferentially in the VL epithelium and in the CG stroma. ER? immunoreactivity was predominantly stromal in the DL from SC and ST groups. In contrast, there was a change of the ER? reactivity to the epithelial cells in the DL from SE and CA groups. This fact showed that this hormone receptor actually was responsive to the hormonal action changing its localization. So, it could be concluded that hormonal exogen therapy, especially with testosterone, could be useful in prostatic tissue maintenance. In addition, the differential immunoreactivities of the hormonal receptors could suggest a lobe-specific way of action of the sex steroidal hormones in tissue maintenance and in the triggering of prostatic pathogenesis / Doutorado / Anatomia / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

O estresse provoca alterações significativas no metabolismo dos animais, provocando a liberação de hormônios glicocorticoides. Estas alterações do metabolismo têm efeito anabólico sobre o metabolismo proteico muscular, podendo afetar os processos bioquímicos de transformação do músculo em carne. O presente trabalho teve como objetivo geral (i) verificar as relações entre variáveis endócrinas e metabólicas associadas ao estresse e características indicadoras de qualidade da carne, em animais castrados e não-castrados; (ii) avaliar a expressão gênica dos receptores mineralocorticoide (MR) e glicocorticoide (GR) em variáveis endócrinas, metabólicas e relacionadas à qualidade da carne de bovinos Nelore castrados e não-castrados. Para tal, 130 animais foram abatidos entre os anos de 2009 e 2011. Amostras de sangue foram coletadas antes e depois do abate para mensuração das concentrações de ACTH e cortisol. Amostras do músculo Longissimus dorsi foram coletadas durante os abates para mensuração do glicogênio e lactato, bem como, para análises de expressão gênica (RT-qPCR). Para as análises de maciez, foram coletadas amostras maturadas por um, sete e 14 dias. Para expressão gênica foram determinados os genótipos dos animais para três marcadores relacionados ao MR (MR1_1, MR1_2 e MR1_3) e dois ao GR (GR2_1 e GR2_2), por meio de PCR em tempo real. Foi verificado que animais castrados apresentam pH 24 horas menores e carnes mais macias ao sétimo e 14º dias de maturação, bem como, concentrações de cortisol (in vivo e post mortem) e lactato significativamente superiores aos animais não-castrados. O marcador MR1_3 apresenta expressão gênica significativamente diferenciada. Os animais com genótipo GA apresentaram 57,27% mais transcritos quando comparados aos animais GG. A expressão gênica do MR e GR foi significativamente relacionada às concentrações de cortisol in vivo e post mortem, porém não influenciou as concentrações de ACTH (in vivo e post mortem), glicogênio e lactato. A expressão gênica do MR e GR não foi relacionada às características indicadoras da qualidade da carne. / The stress causes significant changes in the metabolism of the animals causing the release of glucocorticoid hormones. These metabolic changes have anabolic effect on muscle protein metabolism, affecting the biochemical processes of transformation of muscle on meat. This study aimed to (i) examine relationships between endocrine and metabolic variables associated with stress and meat quality characteristics in castrated and non-castrated animals, (ii) evaluate mineralocorticoid receptor (MR) and glucocorticoid receptor (GR) gene expression in endocrine and metabolic characteristics and related this to meat quality of Nellore castrated and non-castrated animals. To this end, 130 animals were slaughtered between the years 2009 and 2011. Blood samples were collected before and after slaughter to measure concentrations of ACTH and cortisol. Longissimus dorsi muscle samples were collected during slaughter for measurement of glycogen and lactate, as well for gene expression analyzes (RT-qPCR). For the shear force analyzes, samples were aged for one, seven and 14 days. For gene expression analysis, genotypes of three markers related to MR (MR1_1, MR1_2 and MR1_3), and the two related to GR (GR2_1 and GR2_2) were determined via real-time PCR. It was observed that castrated have lower pH value at 24 hours than non-castrated animals, and tender meat on the seventh and 14th day of aging, such as cortisol (in vivo and post mortem) and lactate concentrations significantly superior to non-castrated animals. Gene expression of MR1_3 was significantly different. Animals with GA genotype had 57.27% more transcripts than GG genotype. The gene expression of MR and GR was significantly related to cortisol concentrations in vivo and post mortem, but did not influence the concentrations of ACTH (in vivo and post mortem), glycogen and lactate. The MR and GR gene expression was not related to the meat quality characteristics.

Introdução: A doença de Cushing apresenta elevada morbimortalidade. Seu tratamento de escolha é a cirurgia transesfenoidal que possui resultados satisfatórios em cerca de 70% dos casos. Na doença persistente ou recorrente, reabordagem cirúrgica, radioterapia e adrenalectomia bilateral podem ser realizadas, porém, essas opções apresentam como desvantagens o desenvolvimento de hipopituitarismo e a dependência de terapia de reposição. Até o momento, nenhuma droga tem se mostrado eficaz no tratamento do corticotrofinoma. Os esquemas terapêuticos mais eficazes são os inibidores da esteroidogênese que não atuam no tumor hipofisário. Objetivos: avaliar o efeito do octreotide e da cabergolina administrados isoladamente e em associação nas concentrações urinárias de cortisol e plasmáticas de ACTH em pacientes com corticotrofinomas; correlacionar esse efeito com a expressão tumoral dos receptores SSTR2, SSTR5 e DRD2; correlacionar a expressão tumoral desses receptores através de RT-PCR quantitativa e imunohistoquímica; avaliar se o uso prévio dessas drogas altera a expressão desses receptores. Casuística e Métodos: grupo controle composto por 11 pacientes (10 mulheres e 1 homem) entre 21 e 43 anos sem tratamento prévio à neurocirurgia e um grupo tratado formado por 11 pacientes (2 homens e 9 mulheres) entre 22 e 53 anos que receberam o seguinte tratamento antes da cirurgia: coleta de três amostras de cortisol urinário e ACTH plasmático, seguida da introdução de octreotide 100 g, subcutâneo, 8/8h durante 30 dias e nova coleta de três amostras de cortisol urinário e ACTH plasmático. Em seguida, iniciou-se a cabergolina 0,5 mg via oral 3 vezes na semana durante 30 dias com nova coleta de três amostras de cortisol urinário e ACTH plasmático. A seguir, o octreotide era associado por mais 30 dias com nova coleta de três amostras de cortisol urinário e ACTH plasmático. Resultados: Os valores de cortisol urinário apresentaram queda significante após o uso de cabergolina isolada (P = 0,016) e em associação ao octreotide (P = 0,012). A eficácia do tratamento combinado não foi maior que a da cabergolina isolada. Os valores de ACTH plasmático não revelaram diferença significante durante o tratamento e não se correlacionaram com os valores de cortisol. A média de expressão do mRNA do gene DRD2 foi maior no grupo tratado (1,170 ± 0,417) quando comparada ao grupo controle (0,776 ± 0,252) (P = 0,036). Houve dissociação entre os conteúdos de mRNA e da proteína desse receptor. Não foi possível analisar a expressão do mRNA do gene SSTR5, pois o tratamento das amostras com DNAse causou degradação do RNA. A imunorreatividade para SSTR5 esteve presente em todos os pacientes e não foi alterada pelo tratamento prévio. Não houve diferença estatística na expressão do gene SSTR2 entre os grupos controle (1,253 ± 0,511) e tratado (1,267 ± 0,386) bem como diferença significante da imunoexpressão do SSTR2 entre os grupos. Houve correlação entre os conteúdos de mRNA e da proteína desse receptor (P = 0,021). Não houve correlação entre a expressão dos receptores analisados e a resposta ao octreotide e à cabergolina isoladamente ou em associação. Conclusões: a cabergolina isolada representa opção terapêutica na doença de Cushing persistente ou recorrente. A associação de octreotide na dose estudada por 30 dias não foi mais eficiente em reduzir o cortisol urinário. A resposta a essas drogas não está relacionada à expressão dos receptores SSTR2, SSTR5 e DRD2 / Introduction: The Cushings disease presents high morbimortality. Its treatment of choice is transsphenoidal surgery which has satisfactory results in about 70% of cases. In persistent or recurrent disease, a second transsphenoidal surgery, radiotherapy and bilateral adrenalectomy can be carried through, however, these options present disadvantages as development of hypopituitarism and lifelong dependence on hormone replacement therapy. Presently, no drug has shown efficacy in corticotrophinomas treatment. The most efficient agents are the inhibitors of steroidogenesis which have no effect at pituitary tumor. Objectives: To evaluate isolated octreotide and cabergoline effects and their association on plasma ACTH and urinary cortisol in Cushings disease patients, to correlate this effect with tumoral expression of SSTR2, SSTR5 and DRD2 receptors; to correlate tumoral expression of these receptors by quantitative RT-PCR and immunohistochemistry; to evaluate whether these drugs modifies these receptors expression. Patients and methods: control group with 11 patients (10 women and 1 man) between 21 and 43 years who underwent pituitary surgery with no prior treatment and a treated group with 11 patients (2 men and 9 women) between 22 and 53 years that received the following treatment before surgery: : after three baseline urinary cortisol samples and one plasma ACTH sample, patients received octreotide 100 g, subcutaneous 8/8h for 30 days collecting three urinary cortisol samples and one plasma ACTH. After that, cabergoline was introduced 0,5 mg 3x/week for 30 days collecting three urinary cortisol samples and one plasma ACTH sample. Then, octreotide was associated to cabergoline for another 30 days followed by three urinary cortisol and one plasma ACTH sample. Results: Urinary cortisol concentrations significantly decreased after isolated and combined cabergoline use (P = 0,016 and P = 0,012, respectively). Combined treatment efficacy was not greater than isolated cabergoline administration. Plasma ACTH did not change statistically during treatment and did not correlate with urinary cortisol. The average of DRD2 gene expression was higher in control group (0,776 ± 0,252) in relation to treated group (1,170 ± 0,417) (P = 0,036). It had dissociation between mRNA and protein contents of this receptor. SSTR5 gene mRNA expression was not analyzed due to RNA degradation after DNAse tissue treatment. SSTR5 immunoreactivity was present in all patients and it was not modified by previous treatment. No statistic difference was observed between SSTR2 gene expression in control group (1,253 ± 0.511) and in treated group (1,267 ± 0,386). There was no significant difference in SSTR2 immunoexpression between groups. It had correlation between the mRNA and protein contents of this receptor (P = 0.021). No significant relationship was found between hormonal response to isolated and combined therapy and receptors mRNA expression levels. Conclusions: cabergoline represents therapeutical option in persistent or recurrent Cushings disease. Octreotide-cabergoline association in the studied dosage and for the period of 30 days was not more efficient in eliciting urinary cortisol reduction. The responsiveness to these drugs did not correlate to SSTR2 and DRD2 mRNA expression

As relações sociais são construídas e mantidas a partir da interação entre os indivíduos. A ocitocina (OT), vasopressina (AVP), estrogênios (EST) e dopamina (DOPA), bem como seus respectivos receptores estão envolvidos na modulação do comportamento sexual de fêmeas. Estruturas do sistema nervoso central (SNC), tais como o bulbo olfatório (BO), o hipotálamo (HPT), o córtex pré-frontal (CPF) e o hipocampo (HPC) exercem importantes funções relacionadas à motivação sexual, reconhecimento de odores, memória e respostas emocionais. Em camundongos fêmeas, a OT é essencial para o comportamento de lordose e para estabelecer a preferência pelo parceiro. Este estudo teve como objetivo analisar o impacto do nocauteamento no gene da OT (OTKO) no comportamento sexual de camundongos fêmeas, na síntese hipotalâmica de AVP e na expressão gênica dos receptores de OT (OTR), AVP (AVPR1a), EST alfa (ERα), EST beta (ERβ) e DOPARD2 no BO, HPT, CPF e HPC. Foram utilizados 11 camundongos fêmeas (C57BL/6J) para o grupo controle (WT) e o mesmo número para o grupo OTKO. A detecção do transgene no genoma foi realizada pela técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) e os animais foram classificados como: WT (OT+/+), heterozigoto (OT+/-) e OTKO (OT-/-). O teste do comportamento sexual da fêmea foi realizado na noite do proestro e os parâmetros comportamentais avaliados foram: frequência, duração e latência de lordose, além da frequência de montas, bem como as posturas não receptivas e a locomoção. A coleta das estruturas encefálicas (BO, HPT, CPF e HPC) aconteceu na manhã seguinte do teste comportamental. Os cDNAs foram sintetizados por transcrição reversa seguida de reação em cadeia da polimerase (RT-PCR). A expressão gênica de cada receptor foi calculada a partir da fórmula 2-ΔΔCt. Os dados do registro comportamental e da expressão gênica foram expressos pela média, erro padrão da média (±EPM), analisados pelo teste de Mann-Whitney e o nível de significância aceito foi de p<0,05. Nossos resultados mostraram aumento significativo da latência e diminuição significativa da frequência e da duração do comportamento de lordose em fêmeas OTKO. Em relação às posturas não receptivas, fêmeas OTKO apresentaram diminuição significativa da latência e aumento significativo da frequência e da duração destas posturas. No que concerne à expressão gênica dos diferentes receptores, fêmeas OTKO apresentaram diminuição significativa da expressão gênica do OTR apenas no HPC em relação ao grupo WT. Verificamos que o grupo OTKO apresentou diminuição significativa da expressão gênica do AVPR1a apenas no HPT, mas aumento da expressão no HPC quando comparadas ao grupo WT. Também, fêmeas OTKO apresentaram diminuição significativa da expressão gênica do ERα e ERβ apenas no CPF quando comparadas ao grupo WT. Não foram encontradas diferenças significativas na expressão gênica do DOPARD2 em nenhuma das estruturas estudadas quando comparados os dois grupos estudados. No que diz respeito ao nocauteamento no gene da OT, nossos resultados mostraram que este não promove diferença significativa na síntese de RNAm de AVP no HPT do grupo OTKO quando ao grupo WT. Nossos principais achados nos permitem inferir que a ausência da OT dentro do SNC, bem como a importante alteração da expressão dos genes estudados (OTR, AVPR1a, ERα e ERβ) principalmente no CPF estão relacionados com a diminuição do comportamento sexual observada nas fêmeas OTKO. / Social relations are built and maintained from the interaction between individuals. Oxytocin (OT), vasopressin (AVP), estrogens (EST), dopamine (DOPA) and their receptors are involved in the modulation of sexual behavior in females. Structures of the central nervous system (CNS), such as the olfactory bulb (OB), hypothalamus (HPT), medial amygdale, prefrontal cortex (PFC) and hippocampus (HPC) have important functions related to sexual motivation, odor recognition, memory, and emotional responses. In mice, OT is essential for lordosis behavior and to establish the female preference for her partner. The experimental model using knockout animals for OT allows evaluating the physiological and behavioral changes generated from this genetic manipulation. This study aimed to analyze the impact of OT gene knockout (OTKO) in sexual behavior of female mice, in the synthesis hypothalamic of AVP and gene expression of OT receptors (OTR), AVP (AVPR1a), EST alpha (ERα), EST beta (ERβ) and DOPARD2 in OB, HPT, PFC and HPC. We used 11 female mice (C57BL/6J) for the control group (WT) and the same number for the OTKO group. Detection of the transgene in the genome was performed by polymerase chain reaction (PCR) and the animals were classified as: WT (OT+/+), heterozygous (+/-OT) and OTKO (OT-/-). The female sexual behavior test was performed on the evening of proestrus and these behavioral parameters were evaluated: frequency, duration and latency lordosis, frequency of mounts, as well as non-receptive positions and locomotion. The collection of brain structures (OB, HPT, PFC and HPC) happened the next morning the behavioral test. The CDNAs were synthesized by reverse transcription followed by polymerase chain reaction (RT-PCR). The gene expression of each receptor was calculated from the 2-ΔΔCt formula. Data from the behavioral record and gene expression were expressed as mean, standard error of the mean (±SEM) and analyzed by the Mann-Whitney test. In all cases, P<0.05 was considered statistically significant. Our results showed significant increase in latency and decrease in the frequency and duration of lordosis behavior in OTKO females. For non-receptive postures, OTKO females were significantly reduced latency and increased frequency and duration of these postures. Regarding the gene expression of different receptors, OTKO females showed significant decrease in OTR gene expression only in the HPC compared to WT group. We found that the OTKO group showed a significant decrease in gene expression of AVPR1a only in HPT, but increased expression in HPC as compared to WT group. Also, OTKO females showed significant decrease in gene expression of ERα and ERβ only the PFC when compared to the WT group. There were no significant differences in gene expression DOPARD2 in any of the studied structures when comparing the two groups. Regarding knockout in OT gene, our results showed that this does not promote significant difference in AVP mRNA synthesis in HPT of OTKO group when the WT group. Our main findings allow us to infer that the absence of OT within the CNS, as well as a significant changes in expression of the genes studied (OTR, AVPR1a, ERα and ERβ) mainly in the PFC are related to decreased sexual behavior observed in OTKO females.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:48Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-08-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) / Fédération pour la Recherche sur le Cerveau (FRC) / Ligue Française Contre l'Épilepsie (LFCE) / Foi mostrado anteriormente que os transportadores de glutamato controlam eficientemente atividade de rede no cérebro imaturo de roedores prevenindo a geração de crises. Em particular, inibição de transportadores de glutamato pelo DL-TBOA produz um padrão patológico no eletroencefalograma de ratos recém nascidos registrados em livre movimento. Esse padrão é composto de crises parciais e de breves surtos paroxísticos recorrentes alternados com períodos silenciosos caracterizados como atividade de “surto-atenuação”. A associação de surto-atenuação e crises parciais é observada em recém nascidos cometidos de encefalopatias epilépticas precoces, levantando a possibilidade que transportadores de glutamato podem estar implicados nesta síndrome epiléptica. Curiosamente, TBOA produz despolarizações recorrentes de longa duração e surtos de potencial de ação em interneurônios e células piramidais em fatias corticais. Esse padrão referido como “Slow Network Oscillations” (SNOs) e as crises observadas em vivo, são bloqueadas por antagonistas de receptores NMDA (APV), sugerindo que ambos compartilham mecanismos similares. Assim SNOs providenciam um modelo in vitro para investigação dos mecanismos envolvidos na gênese de atividades paroxísticas. Utilizando registros eletrofisiológicos, nós mostramos que SNOs refletem dois processos que ocorrem durante a inibição de transportadores de glutamato: (1) Um aumento local da concentração de glutamato que ativa ambos receptores NMDA e metabotrópicos (mGluRs) de glutamato de maneira tônica. A ativação de mGluRs reduz a corrente de potássio (IM) aumentando a excitabilidade neuronal. (2) Uma liberação fásica de glutamato que escapa da fenda sináptica (“spillover”) e ativa receptores NMDA extra-sinápticos localizados em ambos interneurônios e células piramidais. Utilizando microscópio de dois fótons multi-feixe, nós analisamos a dinâmica de cálcio das SNOs e mostramos que elas são associadas com ondas recorrentes de cálcio. As ondas de cálcio SNOs não se originam em locais específicos e se propagam lentamente de maneira unidirecional ativando toda a rede neuronal. Assim, propomos que a redução tônica de IM torna a rede neuronal propensa à geração de crises. As atividades paroxísticas são geradas uma vez que os neurônios são suficientemente despolarizados atingindo um potencial de membrana onde IM é normalmente ativada. Nossos resultados indicam que essa despolarização ocorre devido à ativação de receptores extra-sinápticos NMDA. De maneira geral, nossos experimentos revelam que receptores mGluRs e NMDA trabalham em sinergia desempenhando um papel importante na geração de crises. Nós especulamos que esta sinergia acontece em patologias neuronais associadas com a perda de homeostase de glutamato como, por exemplo, em insultos anóxo-isquêmicos / It has been previously shown that cell-surface glutamate transporters efficiently control network activity in the maturing rodent brain, preventing the generation of seizures. In particular, inhibition of glutamate transporters by DL-TBOA leads to a pathological EEG pattern in freely moving rat pups. This is composed of partial seizures and recurrent short paroxysmal bursts, alternating with silent periods, and is characteristic of “suppression burst” activity (SB). The association of SB and partial seizures is observed in neonates suffering from early epileptic encephalopathy, raising the possibility that glutamate transporters could be implicated in this syndrome. Interestingly, TBOA produces recurrent long lasting depolarizations and bursts of action potentials in interneurons and pyramidal cells in cortical slices. This pattern referred to as slow network oscillations (SNOs) and the seizures observed in vivo, were blocked by the NMDA receptor antagonist (APV), suggesting that they share similar mechanisms. Therefore, SNOs provide a suitable in vitro model for investigating the mechanisms involved in the genesis of paroxysmal activity. Using electrophysiological recordings we show that SNOs reflect two processes that occur during inhibition of glutamate transporters: (1) An ambient increase in glutamate concentrations, that tonically activates both NMDA receptors and glutamate metabotropic receptors (mGluRs). The activation of mGluRs reduces the potassium current (IM), increasing neuronal excitability. (2) A phasic release of glutamate that spills out of synapses and activates extrasynaptic NMDA receptors located in both interneurons and pyramidal cells. Using multibeam two-photon microscopy, we analyzed SNOs calcium dynamics and show that they are associated with recurrent calcium waves. The SNOs calcium waves do not have specific sites of origin however they slowly propagate in a unidirectional manner, activating the entire network. Together, we propose that the tonic reduction of IM makes the neuronal network prone to the generation of seizures and the paroxysmal activity is generated when neurons are sufficiently depolarized, and reach the membrane potential where IM is normally activated. Our data indicate that this depolarization occurs due to activation of extrasynaptic NMDA receptors. In total our experiments reveal that mGluRs and NMDA receptors work in synergy playing an important role in the generation of seizures. We speculate that this synergy happens in neuronal pathologies associated with an imbalance in glutamate homeostasis such as anoxo-ischemic insults. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-11-19T18:59:36Z No. of bitstreams: 1 Atila dos Santos Batista. Papel dos receptores....pdf: 4517971 bytes, checksum: 2d9cb0d434dcb66027ca90861bbd1a75 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-19T18:59:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Atila dos Santos Batista. Papel dos receptores....pdf: 4517971 bytes, checksum: 2d9cb0d434dcb66027ca90861bbd1a75 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / Diferentes áreas do sistema nervoso central que participam da regulação cardiovascular recebem projeções de núcleos da rafe produtores de 5-HT. Diversos estudos têm também demonstrado a participação dos receptores serotoninérgicos nas respostas neuroendócrinas e emocionais ao estresse e no equilíbrio hidrossalino, assim os objetivos do referido trabalho foram: a) estudar o papel dos receptores do tipo 5-HT3 presentes na ASM (área septal medial) sobre as respostas cardiovasculares ao estresse de contenção em ratos; b) verificar a possível interação entre os receptores colinérgicos muscarínicos e 5-HT3 presentes na ASM no controle cardiovascular; c) verificar o papel dos receptores do tipo 5-HT3 na ASM sobre o controle hidrossalino. Foram utilizados ratos Wistar (280-300g) submetidos ao implante de uma cânula guia na ASM. Os animais destinados aos estudos cardiovasculares receberam implante de catéter carotídeo para análise da PA. No momento do experimento referente ao estresse os animais receberam injeção de m-CPBG e ondansetrona na ASM e 15 min após a microinjeção foram submetidos ao estresse de contenção com registro da PA. Para análise da interação entre os receptores muscarínicos e os receptores serotoninérgicos do tipo 5-HT3 os animais receberam previamente atropina, antagonista colinérgico muscarínico, e após 10 min receberam ondansetrona com registro constante da PA por mais 110min. No protocolo experimental para depleção de sódio os animais receberam microinjeções de furosemida 24h antes do experimento tendo disponíveis bebedouros de água destilada. No momento do experimento os animais receberam microinjeções de m-CPBG e ondansetrona e após 15 min os volumes de água e salina 1,5% foram registrados por 2h. Para análise do efeito do bloqueio dos receptores 5-HT3 sobre o comportamento de ingestão de água os animais foram submetidos a privação hídrica por 24h. No momento do experimento microinjeções de salina, m-CPBG ondansetrona foram feitas na ASM com medida dos volumes ingeridos ao longo de 2h. Verificamos que os receptores serotoninérgicos do tipo 5-HT3 presentes na ASM inibem o aumento da PA em animais submetidos ao estresse, além disso, verificamos também que a resposta hipertensiva decorrente do bloqueio dos receptores serotoninérgicos do tipo 5- HT3 depende da integridade funcional dos receptores colinérgicos muscarínicos. Por outro lado, tanto a ativação, quanto o bloqueio dos receptores serotoninérgicos do tipo 5-HT3 presentes na ASM parecem não mediar a ingestão de sódio em animais sódio-depletados nem a ingestão de água em animais sob privação hídrica. / Different areas of the central nervous system that participate in cardiovascular regulation receive the projections of rafe nuclei that product 5-HT. Several studies have also demonstrated the participation of serotoninergic receptors in neuroendocrine and emotional responses for stress and in fluid and electrolyte balance. Thus, the objectives of this work were: a) to study the role of type 5-HT3 receptors present in MSA (medial septal area) on the cardiovascular responses to stress of restraint in rats; b) to verify the possible interaction between muscarinic cholinergic receptors and 5-HT3 present in MSA in cardiovascular control; c) to verify the role of type 5-HT3 receptors in MSA on fluid and electrolyte control. There were used Wistar rats (280-300g) submitted to a guide cannula implant in MSA. The animals for cardiovascular studies received carotid catheter implant to AP analyses. At the time of stress experiment the animals received m-CPBG and ondansetron injection in MSA and, 15 minutes after microinjection were submitted to stress of restraint with the AP register. To analyses the interaction between the muscarinic receptors and 5-HT3 serotoninergic receptors, the animals previously received atropine, cholinergic muscarinic antagonist, and 10 minutes after received ondansetron with the constant register of AP for 110 minutes more. In the experimental protocol for sodium depletion animals received furosemide microinjections 24 hours before the experiment with distilled water drinking fountains available. At the time of the experiment the animals received m-CPBG and ondansetron injection and after 15 minutes the volumes of water and 1,5% saline were registered for two hours. To analyses the effect of 5-HT3 receptors blockade on the water ingestion behavior the animals had been submitted to water privation by 24 hours. At the time of the experiment microinjections of saline, m-CPBG and ondansetron were made in MSA with measurement of ingested volumes during two hours. We verified that the type 5-HT3 serotoninergic receptors present in MSA inhibit the increase of AP in animals on stress. In addition, we also verified that the hypertensive response due to the type 5-HT3 serotoninergic receptors blockade depends on the functional integrity of the muscarinic cholinergic receptors. On the other hand, both the activation as the blocking of type 5-HT3 serotoninergic receptors presents in MSA seem not to mediate sodium ingest in sodium-depleted animals nor the water ingestion in animals on water deprivation.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-01-25T16:12:26Z No. of bitstreams: 1 Bernardo Simões Franklin.pdf: 11748497 bytes, checksum: e1831598c734af4113b0028438c1b84f (MD5) / Made available in DSpace on 2013-01-25T16:12:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bernardo Simões Franklin.pdf: 11748497 bytes, checksum: e1831598c734af4113b0028438c1b84f (MD5) Previous issue date: 2009 / Desde sua descoberta, os receptores do tipo Toll (TLRs) têm sido envolvidos em quase todas as doenças que afetam a saúde humana. Seu papel na proteção contra vários patógenos, incluindo protozoários está bem estabelecido. Entretanto, pouco se sabe sobre o papel dos TLRs na malária. No presente estudo, investigamos o papel dos TLRs durante a malária murina e humana. Nossos resultados mostraram que camundongos com deficiência para MyD88, um adaptador essencial para a sinalização dos TLRs, produzem níveis de citocinas pró-inflamatórias significativamente menores e apresentam sintomas mais amenos durante a infecção por Plasmodium chabaudi. Entretanto, estes animais retêm a capacidade de controlar a parasitemia sugerindo que os TLRs possuam um papel na patogênese e não na proteção contra a malária. Posteriormente, mostramos que ambas, a infecção natural humana por P. falciparum e a experimental murina por P. chabaudi, aumentam a expressão e a responsividade dos TLRs nas células do sistema imune inato. O estado hiper-responsivo das células durante a malária é derivado da ativação de TLR9 e a produção de IFN por células T, levando a uma alta susceptibilidade ao choque séptico durante a malária aguda. Finalmente, em colaboração com a EISAI Research Institute, desenvolvemos um antagonista de TLR9 e testamos seu efeito na Malária Cerebral (CM), uma das manifestações clínicas mais graves da malária. O tratamento oral com este composto inibiu os sintomas, tais como extravasamento vascular cerebral, protegendo camundongos da morte por CM. Em conjunto, nossos resultados mostram um importante papel dos TLRs, especialmente TLR9, na patogênese da malária e que a intervenção na função destes receptores é uma potencial quimioterapia anti-inflamatória contra essa doença. / Toll-like receptors (TLRs) have been involved in almost every know disease that afflict human health so far and their role in resistance to several pathogens, including protozoan parasites, has been well established. The role of TLRs in malaria, however, still remains to be elucidated. Here we studied the role of TLRs in experimental and naturally acquired malaria infection. We showed that mice with deficiency to MyD88, an essential adaptor to TLRs signaling, produce significant lower levels of proinflammatory cytokines and commensurate better clinical outcome upon infection with Plasmodium chabaudi. Nevertheless, these mice can still control parasite loads suggesting that TLRs are involved in pathogenesis rather than protection during malaria. We further studied cellular responsiveness of innate immune responses during human and murine malaria. We showed that both natural acquired P. falciparum infection in humans and experimental infection of mice with P. chabaudi increase TLR expression in innate immune cells causing pro-inflammatory priming of TLR responses. The cellular hyper-responsiveness during Malaria is caused by TLR9 activation and IFN production by T cells conferring high susceptibility to septic shock during the acute disease. Finally, in collaboration effort with EISAI Research Institute, we develop and tested an antagonist of TLR9, on Cerebral Malaria (CM), one of the most severe manifestations of malaria. Oral treatment of mice with this compound inhibited CM symptoms, such as vascular leakage, and prevented death from CM. All together our results show an important role of TLRs, especially TLR9, in malaria pathogenesis and that the therapeutic targeting of TLRs is a potential anti-inflammatory chemotherapy against malaria.

As relações sociais são construídas e mantidas a partir da interação entre os indivíduos. A ocitocina (OT), vasopressina (AVP), estrogênios (EST) e dopamina (DOPA), bem como seus respectivos receptores estão envolvidos na modulação do comportamento sexual de fêmeas. Estruturas do sistema nervoso central (SNC), tais como o bulbo olfatório (BO), o hipotálamo (HPT), o córtex pré-frontal (CPF) e o hipocampo (HPC) exercem importantes funções relacionadas à motivação sexual, reconhecimento de odores, memória e respostas emocionais. Em camundongos fêmeas, a OT é essencial para o comportamento de lordose e para estabelecer a preferência pelo parceiro. Este estudo teve como objetivo analisar o impacto do nocauteamento no gene da OT (OTKO) no comportamento sexual de camundongos fêmeas, na síntese hipotalâmica de AVP e na expressão gênica dos receptores de OT (OTR), AVP (AVPR1a), EST alfa (ERα), EST beta (ERβ) e DOPARD2 no BO, HPT, CPF e HPC. Foram utilizados 11 camundongos fêmeas (C57BL/6J) para o grupo controle (WT) e o mesmo número para o grupo OTKO. A detecção do transgene no genoma foi realizada pela técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) e os animais foram classificados como: WT (OT+/+), heterozigoto (OT+/-) e OTKO (OT-/-). O teste do comportamento sexual da fêmea foi realizado na noite do proestro e os parâmetros comportamentais avaliados foram: frequência, duração e latência de lordose, além da frequência de montas, bem como as posturas não receptivas e a locomoção. A coleta das estruturas encefálicas (BO, HPT, CPF e HPC) aconteceu na manhã seguinte do teste comportamental. Os cDNAs foram sintetizados por transcrição reversa seguida de reação em cadeia da polimerase (RT-PCR). A expressão gênica de cada receptor foi calculada a partir da fórmula 2-ΔΔCt. Os dados do registro comportamental e da expressão gênica foram expressos pela média, erro padrão da média (±EPM), analisados pelo teste de Mann-Whitney e o nível de significância aceito foi de p<0,05. Nossos resultados mostraram aumento significativo da latência e diminuição significativa da frequência e da duração do comportamento de lordose em fêmeas OTKO. Em relação às posturas não receptivas, fêmeas OTKO apresentaram diminuição significativa da latência e aumento significativo da frequência e da duração destas posturas. No que concerne à expressão gênica dos diferentes receptores, fêmeas OTKO apresentaram diminuição significativa da expressão gênica do OTR apenas no HPC em relação ao grupo WT. Verificamos que o grupo OTKO apresentou diminuição significativa da expressão gênica do AVPR1a apenas no HPT, mas aumento da expressão no HPC quando comparadas ao grupo WT. Também, fêmeas OTKO apresentaram diminuição significativa da expressão gênica do ERα e ERβ apenas no CPF quando comparadas ao grupo WT. Não foram encontradas diferenças significativas na expressão gênica do DOPARD2 em nenhuma das estruturas estudadas quando comparados os dois grupos estudados. No que diz respeito ao nocauteamento no gene da OT, nossos resultados mostraram que este não promove diferença significativa na síntese de RNAm de AVP no HPT do grupo OTKO quando ao grupo WT. Nossos principais achados nos permitem inferir que a ausência da OT dentro do SNC, bem como a importante alteração da expressão dos genes estudados (OTR, AVPR1a, ERα e ERβ) principalmente no CPF estão relacionados com a diminuição do comportamento sexual observada nas fêmeas OTKO. / Social relations are built and maintained from the interaction between individuals. Oxytocin (OT), vasopressin (AVP), estrogens (EST), dopamine (DOPA) and their receptors are involved in the modulation of sexual behavior in females. Structures of the central nervous system (CNS), such as the olfactory bulb (OB), hypothalamus (HPT), medial amygdale, prefrontal cortex (PFC) and hippocampus (HPC) have important functions related to sexual motivation, odor recognition, memory, and emotional responses. In mice, OT is essential for lordosis behavior and to establish the female preference for her partner. The experimental model using knockout animals for OT allows evaluating the physiological and behavioral changes generated from this genetic manipulation. This study aimed to analyze the impact of OT gene knockout (OTKO) in sexual behavior of female mice, in the synthesis hypothalamic of AVP and gene expression of OT receptors (OTR), AVP (AVPR1a), EST alpha (ERα), EST beta (ERβ) and DOPARD2 in OB, HPT, PFC and HPC. We used 11 female mice (C57BL/6J) for the control group (WT) and the same number for the OTKO group. Detection of the transgene in the genome was performed by polymerase chain reaction (PCR) and the animals were classified as: WT (OT+/+), heterozygous (+/-OT) and OTKO (OT-/-). The female sexual behavior test was performed on the evening of proestrus and these behavioral parameters were evaluated: frequency, duration and latency lordosis, frequency of mounts, as well as non-receptive positions and locomotion. The collection of brain structures (OB, HPT, PFC and HPC) happened the next morning the behavioral test. The CDNAs were synthesized by reverse transcription followed by polymerase chain reaction (RT-PCR). The gene expression of each receptor was calculated from the 2-ΔΔCt formula. Data from the behavioral record and gene expression were expressed as mean, standard error of the mean (±SEM) and analyzed by the Mann-Whitney test. In all cases, P<0.05 was considered statistically significant. Our results showed significant increase in latency and decrease in the frequency and duration of lordosis behavior in OTKO females. For non-receptive postures, OTKO females were significantly reduced latency and increased frequency and duration of these postures. Regarding the gene expression of different receptors, OTKO females showed significant decrease in OTR gene expression only in the HPC compared to WT group. We found that the OTKO group showed a significant decrease in gene expression of AVPR1a only in HPT, but increased expression in HPC as compared to WT group. Also, OTKO females showed significant decrease in gene expression of ERα and ERβ only the PFC when compared to the WT group. There were no significant differences in gene expression DOPARD2 in any of the studied structures when comparing the two groups. Regarding knockout in OT gene, our results showed that this does not promote significant difference in AVP mRNA synthesis in HPT of OTKO group when the WT group. Our main findings allow us to infer that the absence of OT within the CNS, as well as a significant changes in expression of the genes studied (OTR, AVPR1a, ERα and ERβ) mainly in the PFC are related to decreased sexual behavior observed in OTKO females.