Os primeiros dias de vida de um animal caracterizam uma fase crucial para seu desenvolvimento neuroanatômico e neurofisiológico, e intervenções nesse período podem gerar modificações neurais persistentes nos animais adultos. O procedimento de manipulação neonatal, que envolve uma breve separação dos filhotes da companhia de sua mãe nos primeiros dias de vida, gera alterações comportamentais características, como uma resposta de medo atenuada a ambientes novos, alterações no comportamento sexual e menor resposta a estresse. Adicionalmente, alguns estudos observaram maior consumo de alimento palatável nos animais manipulados, sem encontrar alteração no consumo da ração padrão. Este comportamento poderia ser resultado de alterações nos mecanismos hedônicos destes animais. Poucos estudos sobre manipulação neonatal e respostas hedônicas utilizam ratos fêmeas. Portanto, o objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito da manipulação neonatal sobre a reação facial afetiva à administração de soluções de sacarose em ratos fêmeas pré-púberes e adultas, manipuladas no período neonatal, comparadas com ratas não manipuladas, avaliando-se também o imunoconteúdo de tirosina hidroxilase e do receptor D2 da dopamina no núcleo accumbens. O protocolo de manipulação neonatal foi realizado dos dias 1 a 10 de vida, sendo o dia do nascimento considerado dia 0. Os animais foram colocados em um recipiente dentro de uma incubadora a 32°C por 10 min/dia, sem contato físico com a genitora. Somente fêmeas foram utilizadas para este trabalho. Foi realizado um teste de reatividade ao sabor, que consiste de filmagens das expressões faciais do animal em resposta à administração oral de solução, tendo sido utilizadas quatro concentrações de sacarose (0,03M; 0,1M; 0,3M; 1M) para os animais jovens e duas concentrações de sacarose (0,1M e 0,3M) para os animais adultos. Nos animais adultos o ciclo estral foi avaliado para correlacionar com os resultados dos testes comportamentais. Os resultados do presente estudo demonstraram uma maior reatividade ao sabor doce nos animais manipulados quando testados na fase pré-púbere. Esta resposta pode estar relacionada a modificações nos mecanismos hedônicos como resultado da manipulação neonatal. Porém, não foi encontrada diferença estatística para a reatividade ao sabor doce entre animais adultos dos grupos controle e manipulado. Adicionalmente, a avaliação do imunoconteúdo de receptor D2 e da enzima tirosina hidroxilase não revelou diferença estatística significativa entre os grupos controle e manipulado, tanto para os animais jovens quanto para os adultos. Estes resultados podem ser indicativos de que o sistema dopaminérgico não está relacionado com as modificações nas respostas hedônicas observadas nas fêmeas jovens. Concluindo, a manipulação neonatal gerou animais mais responsivos à sacarose na idade jovem, porém, estas alterações foram revertidas nos animais adultos. / The neonatal period is a crucial phase for the neuroanatomical and neurophysiological development, and interventions within this period can generate long-lasting neural modifications. Neonatal handling, consisting of a brief maternal separation, can result in behavioral alterations such as diminished neophobia, sexual behavior alterations and reduced stress response. Furthermore, these animals also ingest more palatable food than control animals, without alterations in the regular lab chow consumption. Such behavior could be a result of modifications within brain reward mechanisms. There have been only a few studies about neonatal handling and response to reward using female rats. Therefore, the purpose of the present study was to determine the effects of neonatal handling on affective facial reactions to sucrose solutions in peripubertal and adult female rats. We also examined nucleus accumbens enzyme tyrosine hydroxylase and dopamine D2 receptor immunocontent. Handling procedures were carried out from the 1st day to the 10th day after birth. The pups were placed in a small plastic box inside an incubator at 32°C for 10 min daily. Only female rats were used. Behavioral tests were performed during the peripuberty period and on adults. Orofacial reactions after sucrose solution delivery were recorded on a digital camera for the taste reactivity analysis. The peripubertal animals (~28 days) received four different sucrose concentrations (0,03M; 0,1M; 0,3M; 1M), while the adult animals (>60 days) received two sucrose concentrations (0,1M; 0,3M). Estrous cycle was accessed before tests in adult females for further analysis. The present results show that responsivity to sweet solutions in peripuberty was higher in animals handled during the neonatal period. This higher response could be due to modifications in reward mechanisms as a result of neonatal handling. No statistical difference was found for the adult animals when compared to non-handled. In addition, no statistical difference was found for tyrosine hydroxylase and dopamine D2 receptor immunocontent in both peripubertal and adult animals. Thus, it appears that the dopaminergic system is not related to the handling alterations in peripubertal hedonic responses. In conclusion, neonatal handled female rats show higher reward responses to sucrose solutions during peripuberty. However, this effect seems to be reverted in adult handled animals.

Introdução: O câncer de próstata atinge cerca de três quartos da população masculina acima de 65 anos, sendo esta neoplasia o sexto tipo de câncer mais comum no mundo, e o mais prevalente em homens. O receptor de androgênios (AR) desempenha um papel crítico no desenvolvimento normal da próstata, bem como no câncer prostático. Sua atividade transcricional é regulada através da interação com diversas proteínas. O NCoR1 (correpressor de receptores nucleares) está envolvido na diminuição da atividade do AR sobre a transcrição de genes alvo. Objetivos: Desenvolver um modelo de cultura celular de câncer prostático a partir de fragmentos tumorais; identificar o melhor gene normalizador para estudos de expressão gênica em amostras das células em cultivo; avaliar os efeitos do silenciamento do AR e seu corregulador, NCoR1, sobre a proliferação celular e expressão gênica de PSA, um gene alvo do AR, em células de cultura primária e em células de uma linhagem de câncer prostático (LNCaP – Lymph Node Carcinoma of the Prostate). Métodos: Fragmentos de tumores prostáticos coletados após prostatectomia radical ou prostatovesiculectomia foram plaqueados e mantidos em cultivo. As células que proliferaram a partir dos explants foram testadas para marcadores de epitélio (citoqueratinas) e de malignidade (racemase). Após 10 dias, as células foram silenciadas para o AR e, posteriormente, lisadas para a extração de RNA total ou de proteínas. Células LNCaP foram mantidas em cultura e silenciadas para o AR e o NCoR1, sendo avaliada também a proliferação celular nesta última condição. O cDNA obtido a partir das culturas primárias de CaP foi usado para a amplificação do mRNA de oito genes candidatos a normalizadores, além dos mRNAs do AR e PSA. O cDNA das células LNCaP foi usado para amplificação do mRNA do PSA, e o sobrenadante das células coletado para a dosagem do PSA secretado. Resultados: Apenas 47,7% do total de culturas primárias apresentaram adesão dos fragmentos e proliferação de células. Não foi observada associação entre a adesão dos fragmentos e o escore de Gleason dos tumores. As células cultivadas apresentaram positividade para os marcadores de células epiteliais e de malignidade de células prostáticas, indicando que as células em cultivo se tratavam de células tumorais prostáticas. Para análise da expressão gênica nestas células, o gene que mostrou os melhores parâmetros de estabilidade de expressão foi o gene SDHA, e a melhor combinação de dois genes sugerida neste estudo foi SDHA e ALAS1. O silenciamento do receptor de androgênios foi observado 48 horas após a transfecção com siRNAs, sendo observada uma diminuição nos níveis do mRNA já em 24 horas após a transfecção. Observou-se uma diminuição da expressão gênica do PSA em 24 horas, em resposta à diminuição dos níveis do AR, tanto em cultura primária de CaP quanto na linhagem LNCaP. Em células LNCaP, a transfecção com siRNAs específicos para o NCoR1 não depletou completamente os níveis proteicos, porém estes diminuíram em 24, 48 e 72 horas após a transfecção. Foi verificado um aumento da expressão gênica de PSA 48 horas após o silenciamento do NCoR1, em células tradadas com diidrotestosterona. Não foi observado aumento da secreção de PSA no sobrenadante das células em cultivo 48 horas após o silenciamento. A proliferação das células LNCaP foi diminuída nos grupos transfectados com siRNAs específicos para o NCoR1 e siRNAs inespecíficos, em relação com grupo controle. Conclusões: O modelo de cultura celular a partir de fragmentos tumorais prostáticos é viável, e proporciona uma boa amostragem de células para análises moleculares de câncer de próstata sob diferentes condições experimentais. No entanto, a taxa de sucesso dos cultivos é moderada. Neste modelo, em que foram testados diversos genes em relação à sua estabilidade de expressão, o gene SDHA apresentou uma boa estabilidade, ao contrário de outros genes frequentemente utilizados como genes de referência sem nenhuma análise prévia de sua expressão, como beta-actina, GAPDH e beta-2-microglobulina. Assim, o SDHA, ou ainda a combinação SDHA e ALAS1, é indicado para as estratégias de normalização neste tipo de amostra. O silenciamento do AR em células tumorais prostáticas diminuiu a expressão gênica de PSA, como esperado. O silenciamento de seu correpressor, NCoR1, aumentou os níveis de mRNA do PSA, indicando que sua ausência resulta em um aumento da atividade transcricional do AR. A menor taxa de proliferação nos grupos transfectados pode estar mais relacionada ao estresse da transfecção do que à ausência de NCoR1 nas células. Mais análises poderão confirmar os efeitos da ausência deste correpressor sobre a resposta das células tumorais prostáticas, o que abrirá caminho para um melhor entendimento da fisiopatologia dos tumores prostáticos. / Introduction: Prostate cancer (PCa) occurs in seventy-five percent of men over 65 years old, and it is the sixth most common type of cancer in the world and the most prevalent in men. Androgen receptor (AR) plays a critical role in normal prostate gland development and also in prostate cancer. Its transcriptional activity is regulated by protein interaction and NCoR1 (nuclear receptor co-repressor) decreases the AR activity on target genes transcription. Objectives: To develop a prostate cancer cell culture model from tumor fragments; to identify the best housekeeping gene for gene expression studies in that cultured cells; to evaluate the effects of AR and NCoR1 silencing on cell proliferation and PSA gene expression, a AR target gene, in cells of primary culture of PCa and in a prostate cancer cell line, LNCaP. Methods: PCa fragments obtained from radical prostatectomy or prostatovesiculectomy were plated and maintained in culture. Proliferating cells were tested for markers of epithelium (cytokeratin) and malignancy (racemase). After ten days, cells were transfected with AR siRNAs and then lysed for total RNA or protein extraction. LNCaP cells were silenced for AR and NCoR1, and proliferation rate was also measured in the last condition. cDNA obtained from primary culture was used to amplify eight candidate to housekeeping genes mRNA, and also AR and PSA mRNA. cDNA from LNCaP cells was used to amplify PSA mRNA, and the cells supernatant was collected to dose secreted PSA. Results: Only 47.7% of the total number of primary cultures had fragment adhesion and cell proliferation. There was no association between explants adhesion and tumor Gleason’s score. Cells were positive for epithelium and malignancy markers, confirming the growth of prostate cancer cells. For gene expression analysis in these cells, the gene showing the best parameters of stability of expression was SDHA, and the best combination of two genes was SDHA and ALAS1. AR silencing was observed in 48 hours after siRNA transfection, with a decrease of mRNA levels in 24 hours after transfection. There was a decrease of PSA gene expression in 24 hours, either in primary culture or in LNCaP cells. In LNCaP cells, transfection with NCoR1 siRNA did not depleted entirely the protein levels. However, the levels of NCoR1 decreased in 24, 48, and 72 hours after transfection in relation to control group. There was an increase of PSA gene expression in 48 hours after NCoR1 siRNA transfection in cells treated with dihydrotestosterone. There was no increase in PSA secretion in cells supernatant in response to NCoR1 silencing. LNCaP cell proliferation was decreased in both transfected groups, the specific siRNA to NCoR1 and the unspecific control, in relation to control group. Conclusions: the culture cell model from explants of prostate cancer is practicable, and provides a good cell sampling to molecular analysis of prostate cancer under different experimental conditions. Nevertheless, the successful rate of cultures is moderate. In this model, several genes were tested for expression stability, and SDHA had presented the best values, unlike others classical housekeeping genes, as beta-actin, GAPDH and beta-2-microglobulin. Thus, SDHA, or the combination of SDHA and ALAS1, is indicated to normalization strategies in these samples. The silencing of AR in prostate cancer cells had decreased PSA gene expression, as expected. The silencing of its co-repressor, NCoR1, had increased the PSA mRNA levels, indicating that the absence of this coregulator results in an increase of AR transcriptional activity. The smaller proliferation of transfected groups in relation to control group could be related to the transfection stress, more than to the absence of NCoR1. More analysis can confirm the effects of NCoR1 silencing on tumor cells proliferation rate, and contribute to a better understanding of prostate tumors pathophysiology.

Resumo não disponível

A cafeína é a substância psicoativa mais consumida no mundo. Ela aumenta o estado de alerta, estabiliza o humor e também pode proporcionar melhora no desempenho cognitivo. Diversos estudos epidemiológicos e com roedores indicam uma relação inversa entre consumo de cafeína (um antagonista dos receptores de adenosina) e o comprometimento da memória associado ao envelhecimento e à Doença de Alzheimer. Considerando que o comprometimento da sinalização encefálica da insulina é um componente importante da fisiopatologia da Doença de Alzheimer, a estreptozotocina vem sendo utilizada, via intracerebroventricular, para produzir um modelo de Doença de Alzheimer com características neuroquímicas, fisiopatológicas e comportamentais semelhantes à Doença de Alzheimer em humanos. Dessa forma, está tese teve como objetivo avaliar as alterações dos receptores de adenosina e a imunoreatividade neuronal no hipocampo de ratos submetidos à administração intracerebroventricular de estreptozotocina, bem como um possível efeito protetor da cafeína sobre esses parâmetros e sobre a memória de reconhecimento. Como resultado, encontramos comprometimento da memória, modificação do imunoconteúdo e da expressão do receptor de adenosina A2A e perda neuronal no hipocampo no modelo animal de Doença de Alzheimer. O tratamento crônico com cafeína foi eficaz na prevenção do comprometimento da memória e das alterações neuronais observadas no hipocampo do modelo de Doença de Alzheimer. Essas observações fornecem suporte adicional para a possibilidade de que o consumo de cafeína poderia ser uma estratégia para prevenir o déficit mnemónico. No entanto, o efeito positivo da cafeína foi observado somente no modelo de Doença de Alzheimer. Nos animais controles, a cafeína não produziu nenhum efeito sobre a memória. / Caffeine is the most consumed psychoactive substance in the world, utilized to increase alertness, stabilize humor and enhance cognitive performance. Several epidemiological and animal studies indicate an inverse correlation between caffeine intake (an adenosine receptors antagonist) and memory impairment associated with ageing and Alzheimer’s disease. Considering that impaired brain insulin signaling is a main feature of Alzheimer’s disease, intracerebroventricular streptozotocin has been used as a model of Alzheimer’s disease with features resembling those of Alzheimer's disease patients. Therefore, the aim of this thesis was to evaluate the adenosine receptors immunocontent and neuronal immunoreactivity in the hippocampus of rats submitted to intracerebroventricular streptozotocin, as well as a possible protective effect of caffeine on these parameters and on recognition memory. The results showed memory impairment, modification of A2A adenosine receptor immunocontent and neuronal loss in the hippocampus of the animal model of Alzheimer’s disease induced by streptozotocin. Chronic caffeine treatment was effective in preventing the memory impairment and neuronal changes observed in Alzheimer’s disease rats. These assessments provide additional support for the hypothesis that caffeine consumption might be a valid strategy in preventing mnemonic deficit. Nonetheless, the positive effects of caffeine consumption were observed only among Alzheimer’s disease rats. Caffeine consumption had no effect over control animal’s performance.

Glioblastoma multiforme (GBM) é o mais comum e mais maligno tumor cerebral. O péssimo prognóstico é parcialmente devido à baixa biodisponibilidade dos quimioterápicos no tecido tumoral, recorrência originada por células precursoras resistentes ao tratamento e um sistema imune comprometido. De fato, linfócitos regulatórios modulam o sistema imune para uma resposta pró-tumoral, tornando ainda mais difícil o tratamento. Nesse contexto, nanocápsulas lipídicas (LNCs) têm sido amplamente estudadas a fim de aumentar especificidade dos fármacos ao tecido tumoral. Metotrexato (MTX) e trans-resveratrol (RSV) possuem ação antitumoral já descrita, mas necessitam doses relativamente altas para ação anti-glioblastoma in vivo. O MTX também possui ação imunossupressora através do aumento de adenosina no meio extracelular. A Adenosina, por sua vez, pode modular tanto células efetoras quanto células regulatórias no microambiente tumoral. Dessa forma, a hipótese apresentada nessa tese é que o RSV e o MTX possam ser mais eficazes quando carreados por nanocápsulas em modelos de GBM. Além disso, buscamos avaliar se o MTX poderia interferir com enzimas do sistema purinérgico. Por fim, pesquisamos como a adenosina poderia modular linfócitos B e T através das enzimas CD39 e ecto-5’-NT/CD73. O RSV em nanocápsulas e o MTX em nanocápsulas (RSV-LNCs e MTX-LNCs) aumentaram a atividade anti-tumoral em relação aos compostos em solução, induzindo parada no ciclo celular e apoptose em células de GBM. O MTX diminuiu a expressão da proteína antiapoptótica BCL-2 e aumentou a caspase-3 ativa, levando as células de GBM à apoptose. Além disso, o MTX aumentou a expressão da enzima ecto-5’-NT/CD73 tanto em células de glioma quanto em linfócitos T presentes no microambiente dos gliomas. Esse aumento da expressão foi acompanhado da diminuição em linfócitos T efetores e T regulatórios. Também, demonstramos que linfócitos B que possuem alta expressão da enzima CD39, tem capacidade supressiva sobre linfócitos efetores. Em conjunto, os resultados apresentados nessa Tese apresentaram possíveis novas alternativas de tratamento e contribuíram para melhor compreender esse maligno câncer cerebral. / Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common and most malignant brain tumor. The awful prognosis is in part due to the low bioavailability of chemotherapy agents in the tumoral tissue, recurrence originated from treatment-resistant progenitor cells and an impaired immune system. Indeed, regulatory lymphocytes modulate the immune system toward a pro-tumoral response, turning the treatment even more difficult. In this sense, lipid-core nanocapsules (LNCs) have been widely studied to raise the drug specificity to the tumor. Methotrexate (MTX) and trans-resveratrol (RSV) have antitumoral activity, but need relatively high doses to the anti-glioblastoma outcome in vivo. MTX has immunosuppressive capability mediated by the increase of adenosine in the extracellular milieu. Adenosine in turn may modulate both effector and regulatory immune cells in the tumoral microenvironment. Thereby, the hypothesis presented is that RSV and MTX may have an antitumor improvement when loaded into LNCs in GBM models. Moreover, we sought to evaluate whether MTX could interfere with purinergic enzymes. Lastly, we evaluated how adenosine could modulate B- and T-lymphocytes through CD39 and ecto-5’NT enzymes. RSV- and MTX-loaded lipid-core nanocapsules (RSV-LNCs or MTX-LNCs) increased their antitumoral outcome in relation to the solution compounds, inducing both cell cycle arrest and apoptosis in GBM cells. MTX decreased the expression of the antiapoptotic protein BCL-2 and increased the active caspase-3, triggering glioblastoma cells to apoptosis. Furthermore, MTX increased the expression of ecto-5’-NT/CD73 in glioma cells and T lymphocytes of the glioma microenvironment. This up-regulation was followed by decreasing in T effector and T regulatory lymphocytes. Also, we further demonstrated that B lymphocytes with high expression of CD39 enzyme can suppress T efector lymphocytes. Also, we further demonstrated that B lymphocytes with high expression of CD39 enzyme can suppress T efector lymphocytes. Taken together, the results presented herein indicate newfound treatment approaches and new knowledge regarding to this deadliest brain tumor.

Introdução: leiomiomas uterinos são os tumores benignos mais prevalentes nas mulheres em idade fértil, ocorrem em cerca de 50% da população feminina e são a indicação mais frequente de histerectomia. A importância dos esteroides ovarianos na etiologia dos leiomiomas está bem estabelecida; contudo, as contribuições relativas dos estrógenos e da progesterona no crescimento dos leiomiomas ainda são controversas. Muitos estudos têm apresentado evidências de que a progesterona seria mais importante do que os estrógenos para o desenvolvimento destes tumores, e antiprogestágenos como a mifepristona podem tornar-se uma nova possibilidade de tratamento conservador. Ensaios clínicos têm sugerido que a mifepristona é efetiva no tratamento de leiomiomas, causando redução no tamanho dos tumores. Todavia, a recorrência da proliferação dos tumores após o fim do tratamento e os mecanismos de ação da mifepristona na regulação dos receptores de progesterona ainda não estão esclarecidos. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da mifepristona sobre a proliferação celular e a expressão gênica de receptores de progesterona A e B, em um modelo de cultura de células de miométrio e leiomioma, sob diferentes condições hormonais. Métodos: fragmentos de leiomioma e de miométrio adjacente foram obtidos de cinco pacientes submetidas à histerectomia. Foram padronizadas as culturas primárias de leiomioma e miométrio, e as células de cada tipo de tecido em cultura foram divididas em cinco grupos de tratamento: estradiol, estradiol e mifepristona, estradiol e progesterona, estradiol, progesterona e mifepristona e controle (etanol utilizado como veículo dos hormônios). Foi realizada análise imunocitoquímica para α-actina. A proliferação celular foi avaliada através de contagem em hemocitômetro e ensaio de MTT no tempo 7 (após o tratamento com mifepristona) e no tempo 9 (após a recuperação do tratamento). No dia 7, foi feita extração de RNA para avaliar a expressão de receptores de progesterona (PRs) A e B através de PCR em tempo real. Resultados: o estabelecimento do modelo de cultura de células foi confirmado através da coloração positiva para α-actina e pela observação de características morfológicas típicas de células musculares lisas. As técnicas de avaliação da proliferação celular, contagem e MTT, mostraram correlação positiva. O tratamento com estradiol aumentou a proliferação celular de ambos os tipos de tecido, em relação ao grupo controle. O tratamento com progesterona associada ao estradiol aumentou a proliferação das células de ambos tecidos, em relação ao tratamento com estradiol isoladamente e ao controle. Para os dois tratamentos, as células de leiomioma proliferaram mais do que as células de miométrio. No tempo 7, o tratamento com mifepristona associada ao estradiol inibiu a proliferação celular em leiomioma (42%) e no miométrio (23%), em comparação ao mesmo tecido tratado somente com estradiol. O tratamento com mifepristona em associação com estradiol e progesterona inibiu a proliferação celular em leiomioma (105%) e miométrio (56%), em comparação ao mesmo tecido tratado com estradiol e progesterona. No tempo 9, após a recuperação do tratamento com mifepristona, células de miométrio mostraram maior resposta proliferativa do que células de leiomioma. Todavia, o tratamento com mifepristona não foi capaz de inibir completamente a proliferação celular, visto que todos os grupos tratados mostraram aumento de proliferação do tempo 7 até o tempo 9. Foi demonstrada a expressão das duas isoformas de PRs, A e B, em miométrio e leiomioma in vitro; contudo, as comparações entre os grupos de tratamento não foram possíveis devido ao reduzido tamanho amostral. Conclusões: culturas primárias de células de miométrio e leiomioma são um modelo viável para avaliação da proliferação celular em diferentes condições hormonais, e o ensaio de MTT pode ser um bom método de avaliação. A mifepristona inibiu a proliferação celular em ambos os tipos de tecido, com o maior efeito quando associada ao estradiol e à progesterona e em células de leiomioma. Células de miométrio e leiomioma expressam as duas isoformas de PRs in vitro. Mais estudos são necessários para esclarecer o papel da mifepristona na regulação da expressão gênica e proteica dos PRs. / Introduction: uterine leiomyomata are the most common benign tumors in women of reproductive age, with an estimated incidence greater than 50% and being the most common indication for hysterectomy. Importance of ovarian steroids in the etiology of leiomyomas is well established; however, relative contributions of estrogens and progesterone in leiomyomas growth are still controversial. Many studies have presented evidences that progesterone is more important than estrogens for the development of these tumors, and antiprogestins like mifepristone have become a new possibility for conservative treatment. Clinical trials suggest that mifepristone is effective in treating leiomyomata, producing reduction of their size. However, recurrence of tumor proliferation after treatment and molecular mechanisms of mifepristone action in regulating progesterone receptors remains unknown. Therefore, the aim of this study was to evaluate the effect of mifepristone on cell proliferation and progesterone receptors A and B gene expression, in a model of leiomyoma and matched myometrium cell cultures under different hormonal conditions. Methods: human leiomyoma and matched myometrial tissues were obtained from five patients undergoing hysterectomy. Cells maintened in culture from each tissue were divided into 5 treatment groups: estradiol, estradiol and mifepristone, estradiol and progesterone, estradiol, progesterone and mifepristone, and control group (ethanol as a vehicle from hormones). Immunocytochemistry analysis for α-actin was performed. Cell proliferation was evaluated by hemocytometer counting and MTT assay at day 7 (after mifepristone treatment) and day 9 (after recovery from treatment). RNA extraction was performed at day 7 to evaluate progesterone receptors (PRs) A and B expression by real time PCR. Results: culture cell establishment was confirmed by positive staining for α-actin and by observed morphological characteristics from smooth muscle cells. Cell proliferation evaluating techniques, hemocytometer counting and MTT, showed positive correlations. Estradiol treatment increased cell proliferation for leiomyoma and myometrium cells compared to control group. Progesterone combined to estradiol increased cell proliferation in both cell types, compared to estradiol alone and control group. For both hormonal treatments, leiomyoma showed significantly higher proliferation than myometrial cells. At day 7, mifepristone treatment in association with estradiol inhibited cell proliferation in leiomyoma (42%) and myometrial cells (23%), compared to the same tissue treated with estradiol alone. Mifepristone treatment in association with estradiol and progesterone also inhibited cell proliferation in leiomyoma (105%) and myometrial cells (56%), compared to the same tissue treated with estradiol and progesterone. At day 9, after recovery from mifepristone treatment, myometrial cells showed greater proliferative response than leiomyoma cells. However, mifepristone treatment was not able to completely inhibit cell proliferation, whereas treated groups showed increased proliferation from day 7 to 9. We have found that two isoforms of PRs, A and B, were expressed in both myometrial and leiomyoma in vitro; however, comparisons between groups were not possible due to the small sample size. Conclusions: primary myometrial and leiomyomata cell cultures are a viable model for cell proliferation analysis under different hormonal conditions, and MTT assay could also be a good evaluation method. Mifepristone inhibited cell proliferation of both types of tissue, with maximum effect in association with estradiol and progesterone in leiomyoma cells. PRs A and B were expressed in myometrial and leiomyoma cells in vitro. Further investigation is needed to clarify whether mifepristone regulates gene and protein expression of PRs.

Sabe-se que o sistema canabinóide endógeno está envolvido com os processos de formação e evocação da memória. Agonistas dos receptores CB1 exibem diferentes efeitos conforme a via de infusão, seja ela sistêmica, seja local, atingindo estruturas específicas do encéfalo. Neste estudo pretendemos estabelecer o perfil farmacológico-comportamental e eletrofisiológico do agonista CP55,940 quando administrado no hipocampo dorsal de ratos, estrutura em que há poucos estudos prévios com este fármaco: diferente de outros agonistas como a WIN55,212 e mesmo a pouco seletiva anandamida, o CP55,940 restringe-se a receptores canabinóides e chega a ser mais potente que o Δ9-THC, embora não discrimine entre os receptores CB1 (central) e CB2 (periférico). Os fármacos foram infundidos bilateralmente, em diferentes concentrações, na área CA1 do hipocampo, imediatamente após o treino ou antes do teste na tarefa de Condicionamento Aversivo ao Contexto (CAC), visando estudar seus efeitos, respectivamente, na consolidação e na evocação da memória. A CP55,940 pós-treino foi amnéstica apenas na concentração de 5 μg/μl, e esse efeito foi revertido pelo antagonista AM251, seletivo para CB1, em concentração sem efeito próprio, comprovando tal efeito dever-se à ação sobre os receptores CB1. O mesmo efeito foi observado 24h após o treino, na infusão pré-teste, se bem que agora a CP55,940 foi efetiva também em concentrações mais baixas, sugerindo que os receptores desse sistema endógeno tenham ficado mais sensíveis a seus ligantes em função do aprendizado; a seletividade por CB1 neste caso, porém, não ficou claramente atestada pois o efeito de 5 μg/μl de CP55,940 só foi revertido com uma concentração maior de AM251. Na eletrofisiologia, uma concentração de CP55,940 comparável à efetiva sobre a CAC (10μM), não foi capaz de inibir a indução da LTP, já que a potenciação só se sustentou por cerca de 30min – não passou de uma LTP. Esses resultados reforçam e diversificam estudos anteriores, inclusive de nosso grupo, que comprovam a participação dos receptores CB1 na formação e/ou evocação de novas memórias aversivas, bem como possíveis alterações plásticas na densidade desses receptores em função da experiência cognitiva, embora não necessariamente mediadas por eventos sinápticos plásticos como a LTP. / The endogenous cannabiboid system is known to be involved memory formation and retrieval processes. CB1 agonists may cause different effects according to the administration pathway, be it systemic or local/intrastructure. Here we try to establish the behavioral-pharmacologic and electrophysiologic profile of the agonist CP55,940 infused into the rat dorsal hippocampus, a structure less studied with this drug: different from other agonists such as WIN55,212 or even the poorly selective anandamida, CP55,940 sticks only to cannabinoid receptors and is more potent than Δ9-THC, but does not distinguish between central CB1 and peripherical CB2 receptors. The drug was infused bilaterally in different concentrations into the CA1 area of the hippocampus, right after training or pre-test in the Context Fear Conditioning (CFC) task, in order to study its effects upon memory consolidation and retrieval, respectively. Post-training CP55,940 was amnestic only at 5 μg/μl, and the CB1-selective antagonist AM251 reverted this effect in a concentration without action per se, which proves that the original effect is mediated by CB1 receptors. The same amnestic effect was observed 24h after training, in the pretest infusion, only that now CP55,940 was affective also with lower concentrations, suggesting that these receptors are now more sensitive to its endogenous ligands due to learning; CB1-selectivity, however, is not clearly proven here since 5 μg/μl of CP55,940 was reverted only by a higher concentration of AM251. In electrophysiology, a concentration of CP55,940 compatible with that found effective upon CFC (10μM), was not able to block LTP induction, since the potentiation was not sustained for more than 30min – it was only a STP. These results teinforce and diversify previous findings, including some from our own lab, that prove the involvement of CB1 receptors in memory consolidation and/or recall, as well as possible plastic changes in receptor density due to the cognitive experience, despite not necessarily mediated by plastic synaptic events such as LTP.

Introdução: A Doença de Gaucher (DG) é causada pela atividade reduzida da enzima lisossomal glucocerebrosidase, o que leva ao acúmulo de glicocerebrosídeo nas células e a uma estimulação crônica do sistema imune. Células natural killer (NK) possuem um papel importante na resposta imune e sua atividade é alterada na DG. Os receptores KIR (Killer Immunoglobulin-like Receptors) regulam a atividade das células NK através da interação com moléculas de HLA (Human Leukocyte Antigen) de classe I das célulasalvo. Objetivo: Analisar a variabilidade dos genes KIR em uma coorte de pacientes com DG do Sul do Brasil, compará-las a um grupo controle e buscar associações com manifestações clínicas. Metodologia: Trinta e um pacientes com DG tipo I (24 com forma leve, 4 com forma moderada e 3 com forma grave) foram analisados e comparados a 250 controles saudáveis quanto a frequência dos genes HLA e KIR. Resultados/Discussão: Não houve diferença significativa nas frequências de variantes dos genes KIR entre os grupos. O alelo HLA B37 é mais frequente nos pacientes com DG do que no grupo controle (p=0,011). A idade de início dos sintomas mostrou associação com a combinação das variantes KIR2DL2 e KIR2DS2 com seu ligante HLA-C1 (p=0,038). Pacientes que apresentam a variante HLA-C2 parecem apresentar maior susceptibilidade a desenvolver bandas mono ou policlonais na eletroforese de proteínas (p=0,007, OR=21,3). Foi encontrada associação entre os alelos DR11 (p=0.008) e DR13 (p=0.011) e gravidade da doença. O alelo DR11 parece estar associado a comprometimento neurológico, enquanto o alelo DR13 ao desenvolvimento de osteonecrose. Conclusão: Nossos dados sugerem uma possível associação entre variantes dos genes KIR e HLA e a DG. Devem ser estudadas em outras coortes de pacientes já que parecem ser um fator modificador de fenótipo. / Background: Gaucher disease (GD) is caused by the reduced activity of a lysosomal enzyme glucocerebrosidase, which leads to the accumulation of glucocerebroside in the cells and a chronic stimulation of the immune system. Natural Killer (NK) cells play an important role in the immune response, and their activity is impaired in GD. Killer immunoglobulin-like receptors (KIR) regulate the activity of NK cells through an interaction with specific human leukocyte antigen (HLA) class I molecules on target cells. Objectives: To analyze the variability of KIR genes in a Southern Brazilian sample of GD patients, to compare it with controls, and to look for associations with clinical manifestations. Methodology: Thirty one GD type I patients (24 mild, 4 moderate, and 3 severe) were analyzed and compared to 250 healthy controls regarding the frequency of HLA and KIR genes. Results/Discussion: There was no significative difference in the frequencies of KIR gene variants between the groups. The HLA B37 allele is more frequent in patients with GD than in control group (p=0.011). The age of onset of symptoms was associated with KIR2DL2 and KIR2DS2 combination with the ligand HLA-C1 (p=0.038). Patients who have the HLA-C2 variant appear to have more mono/polyclonal bands in protein electrophoresis (p=0.007, OR=21.3). An association between the DR11 (p=0.008) and DR13 (p=0.011) alleles and disease severity was found. The DR11 allele appears to be associated with neurological impairment, while the DR13 allele to the development of osteonecrosis. Conclusion: Our data suggest a possible association between KIR genes and HLA genes and GD. They should be studied in other cohorts of GD patients as they seem to be a phenotype modifying factor.

A cafeína é a substância psicoestimulante mais consumida no mundo todo. Muitos estudos já foram realizados avaliando os seus benefícios sobre as funções cognitivas. Algumas evidências sugerem a participação do sistema colinérgico nos efeitos da cafeína, mas os estudos ainda são incipientes. O objetivo desse estudo foi verificar os efeitos da administração aguda de cafeína frente ao bloqueio dos receptores colinérgicos muscarínicos pela administração do antagonista não-seletivo escopolamina. Camundongos adultos machos receberam cafeína (10 mg/kg, i.p.) uma vez ao dia durante 4 dias. No quinto dia, a escopolamina (2 mg/kg, i.p.) foi administrada imediatamente após a sessão de treino na tarefa de reconhecimento de objetos. Na tarefa de esquiva inibitória a escopolamina foi administrada 15 minutos antes ou imediatamente após a sessão de treino para avaliar aquisição e consolidação da memória. Na tarefa de reconhecimento de objetos, a cafeína preveniu o comprometimento da memória de reconhecimento pela administração pós-treino de escopolamina. A cafeína também foi efetiva em prevenir o comprometimento da consolidação da memória de curta e longa duração pela administração póstreino de escopolamina. Entretanto, a cafeína só foi efetiva em prevenir o comprometimento da memória pela administração pré-treino da escopolamina quando o teste foi realizado 90 minutos após o treino (memória de curta duração). Esses resultados sugerem que os efeitos preventivos da cafeína observados em modelos de déficit mnemônico podem envolver a participação do sistema colinérgico. / Caffeine is the psychostimulant most consumed worldwide. Many studies have been performed evaluating its benefits on the cognitive functions. There is evidence to suggest the participation of cholinergic system on the effects of caffeine, but studies are still incipient. The aim of this study was to investigate the effects of acute administration of caffeine on memory impairment by the blockade of muscarinic cholinergic receptors. Adult male mice received caffeine (10 mg/kg, i.p.) once daily during 4 consecutive days. On the fifth day, the non selective antagonist for muscarinic receptors, scopolamine (2 mg/kg, i.p.) was administered immediately after training session on the novel object recognition task. In the inhibitory avoidance task, scopolamine was administered 15 minute s prior to or immediately after training session to evaluate acquisition and consolidation of memory. In the novel object recognition task caffeine was effective in preventing the impairment of short- and long-term memory consolidation by post training administration of scopolamine. In the inhibitory avoidance task, caffeine was effective in preventing short-term memory impairment by administration of scopolamine prior to training. When scopolamine was administered after training, caffeine was able to prevent both short- e long-term memory impairments. These results suggest that the preventive effects of caffeine against mnemonic deficits may involve participation of the cholinergic system.

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