Os micro-organismos são profícuas fontes de produtos naturais bioativos. Diversos fármacos de importância clínica são de origem microbiana, sendo que a maioria dos antibióticos usados clinicamente é produzida por actinobactérias, principalmente do gênero Streptomyces. A resistência a múltiplas drogas por microorganismos patogênicos e também pelas células tumorais leva à necessidade por novos fármacos antibacterianos e antitumorais. Actinobactérias endofíticas têm demonstrado grande potencial para a busca de produtos naturais bioativos. O presente trabalho relata o estudo químico de duas linhagens de actinobactérias endofíticas, Streptomyces sp. RTd 22 e Streptomyces sp RTd 31, isoladas das raízes de Tithonia diversifolia. As frações ativas nos ensaios biológicos foram fracionadas para a identificação dos compostos bioativos, sendo eles os antibióticos macrolídeos concanamicinas A (S31-1) e B (S31-2), anidro-agliconas das concanamicinas A (S31-3) e B (S31-4), todos produzidos por Streptomyces sp RTd31, e o ionóforo poliéter grisorixina (S22-2), produzido por Streptomyces sp. RTd22. Foi realizado o monitoramento da produção desses compostos bioativos por UPLC-MS através do modo SIM. As concanamicinas A e B tiveram um máximo de produção com 96h, já a grisorixina obteve um máximo com 192h. Outros compostos identificados por desreplicação dos extratos butanólicos de ambas as actinobactérias foram os sideróforos norcardamina (S31-7) e desoxi-nocardamina (S31-8), já o sideróforo desferrioxamina B (S31-9) foi identificado apenas nos extratos butanólicos de Streptomyces sp RTd31. Experimentos de variação do meio de cultivo e co-cultura com bactérias patogênicas foram empregados a fim de estimular a biossíntese de novos compostos, porém nenhum novo metabólito foi identificado. O sequenciamento genético da actinobactéria Streptomyces sp. RTd22 permitiu verificar a presença de vários clusters biossintéticos nesse micro-organismo através da análise feita pelo antiSMASH. Foi possível identificar o cluster da himastatina (S22-4) e da coeliquelina (S22-5), sendo que ambos os compostos não foram biossintetizados nas condições de cultivo utilizadas. O cluster biossintético da grisorixina foi determinado e o experimento de recombinação homóloga para a deleção do gene análogo a flavina mono-oxigenase da nigericina nigC foi realizado. Dois mutantes foram obtidos e um deles foi cultivado para a análise do perfil metabólico por espectrometria de massas. Não houve a produção da grisorixina nem do seu possível precursor pelo mutante, mas outros metabólitos foram produzidos / Microorganisms are prolific sources of bioactive natural products. Several clinically important drugs have microbial origin, and most of the therapeutically used antibiotics are produced by actinobacteria, mainly from the genus Streptomyces. The multidrug resistance observed in pathogenic microorganisms and tumor cells lead to the need for new antibacterial and antitumor drugs . Endophytic actinobacteria have shown great potential in the search for bioactive natural products. This work describes the chemical study of two endophytic actinobacteria strains: Streptomyces sp. RTd 22 and Streptomyces sp RTD 31, isolated from Tithonia diversifolia roots. Active fractions in biological assays were further fractionated for identifying the bioactive compounds, which are: the macrolide antibiotics concanamycins (S31-1) and B (S31-2), anhydrous aglycones of concanamycins A (S31-3) and B (S31-4), all four produced by Streptomyces sp. RTd31, and the ionophore polyether grisorixin (S22-2), produced by Streptomyces sp. RTd22. The production of these bioactive compounds was monitored by UPLC-MS via the SIM mode. Concanamycins A and B had maximum production at 96 h, and grisorixin at 192 h. Other compounds identified by the dereplication of buthanolic extracts of both actinobacteria were the siderophore norcardamine (S31-7) and deoxy-nocardamine (S31-8), the siderophores desferrioxamine B (S31-9) was identified only in buthanolic extracts of Streptomyces sp RTd31. Experiments varying media and co-culture were tested to stimulate the biosynthesis of novel compounds, but nothing new was identified. By genome sequencing of Streptomyces sp RTd22 and antiSMASH analysis it was possible to verify the presence of several biosynthetic clusters in the genome of this strain. It was possible to identify the biosynthetic clusters of himastatin (S22-4) and its analogous compound coelichelin (S22-5); however, these compounds were not biosynthesized in the culture conditions used. The grisorixin biosynthetic cluster was determined, and homologous recombination was performed for deleting the analogue gene of nigericin flavin monooxygenase nigCI. Two mutants were obtained, and one of them was cultured for analyzing its metabolic profile by mass spectrometry. There was no production of grisorixin or its possible precursor by the mutant, but others compounds were produced.

Os micoplasmas são os menores microrganismos capazes de autoreplicação conhecidos na natureza, responsáveis por uma série de doenças no homem e nos animais, infectando ainda plantas e insetos. Constituem um grande grupo de bactérias, ordenadas em diferentes gêneros na classe Mollicutes, cuja principal característica em comum, além do genoma reduzido, é a ausência de parede celular. Mycoplasma mycoïdes subsp. mycoïdes SC, responsável pela Pleuropneumonia Contagiosa Bovina, foi o primeiro microrganismo desta classe de bactérias a ser identificado. Esta é uma doença bastante grave, com altas taxas de morbidade e mortalidade. A variedade Mycoplasma mycoïdes subsp. mycoïdes LC é responsável principalmente por casos de Pleuropneumonia Contagiosa Caprina, mastite no gado bovino, e ainda artrite em ovinos e caprinos em menor extensão. M. capricolum é um patógeno caprino, responsável principalmente por casos de artrite com grande importância econômica na medicina veterinária. M. pulmonis é um patógeno de roedores, considerado como o melhor modelo experimental para o estudo das micoplasmoses respiratórias. M. genitalium, o menor microrganismo conhecido capaz de se autoreplicar, é um patógeno humano responsável por casos de uretrite não gonocócica, cujo seqüenciamento completo do cromossomo tornou-se um marco na era da genômica. O estudo funcional do genoma destes micoplasmas, para a compreensão de sua biologia e patogenicidade, requer o desenvolvimento de ferramentas genéticas eficientes. No presente trabalho, análises in silico das seqüências na região das prováveis origens de replicação cromossômica (oriC) destes micoplasmas demonstraram a existência de possíveis DnaA boxes localizados em torno do gene dnaA. Estas regiões oriC foram caracterizadas funcionalmente após sua clonagem em vetores artificiais e a transformação dos micoplasmas com os plasmídeos recombinantes resultantes. O plasmídeo pMPO1, contendo a região oriC de M. pulmonis, sofreu integração no cromossomo do micoplasma por recombinação homóloga após poucas passagens in vitro. A redução desta oriC para o fragmento contendo somente os DnaA boxes localizados nas estremidades 5´ou 3´do gene dnaA não foi capaz de produzir plasmídeos replicativos em M. pulmonis, exceto quando estes dois fragmentos foram clonados no mesmo vetor, espaçados pelo determinante de resistência à tetraciclina tetM. Um fragmento interno do gene da hemolisina A (hlyA) de M. pulmonis foi clonado nestes plasmídeos oriC, e os vetores resultantes foram utilizados para transformar o micoplasma. A integração destes vetores por um crossing-over com o gene hlyA, causando a sua dirupção, foi documentada. Deste modo, estes plasmídeos oriC podem vir a se tornar ferramentas genéticas valiosas para o estudo do papel de genes específicos, notadamente aqueles potencialmente envolvidos na patogênese. / Mycoplasmas are the smallest microorganisms capable of self replication known to date, responsible for many diseases in man and animals, infecting also plants and insects. They constitute a large group of bacteria, classified in different genera in the class Mollicutes, which main common characteristic, besides the small genome, is the absence of a cell wall. Mycoplasma mycoïdes subsp. mycoïdes SC, responsible for the Bovine Contagious Pleuropneumonia, was the first microorganism of this class of bacteria to be identified. That is a quite severe disease, with high morbidity and mortality rates. Mycoplasma mycoïdes subsp. mycoïdes LC is responsible mainly for cases of Caprine Contagious Pleuropneumonia, mastitis in cattle, and also arthritis in goats and sheep in less extension. M. capricolum is a pathogen of goats, responsible mainly by cases of arthritis with large economic impact in veterinary medicine. M. pulmonis is a rodent pathogen, considered to be the best experimental model for studying respiratory mycoplasmoses. M. genitalium, the smallest microorganism capable of self replication, is an human pathogen responsible for cases of non gonococcal urethritis, which complete chromosome sequencing has become a benchmark in the era of genomics. Functional studies of these mycoplasma genomes, for comprehension of their biology and pathogenicity, requires the development of efficient genetic tools. In the present work, in silico analysis of sequences of the putative origin of chromosome replication (oriC) region of these mycoplasmas demonstrates the existence of putative DnaA boxes located around the dnaA gene. These oriC regions were functionally characterized after cloning into artificial vectors and transformation of mycoplasmas with the resulting recombinant plasmids. The plasmid pMPO1, which contains the M. pulmonis oriC region, has integrated into the mycoplasma chromosome by homologous recombination after a few in vitro passages. Reduction of this oriC to the fragment containing only the DnaA boxes located upstream or downstream the dnaA gene could not produce plasmids able to replicate in M. pulmonis, except when these two fragments were cloned in the same vector, spaced by tetracycline resistance gene tetM. An internal fragment of the M. pulmonis hemolysine A gene (hlyA) was cloned into these oriC plasmids, and the resulting vectors were used to transform the mycoplasma. Integration of these disruption vectors by one crossing-over with the hlyA gene could be documented. Therefore, these oriC plasmids may become valuable genetic tools for studying the role of specific genes of mycoplasmas, specially those potentially involved in pathogenesis.

O Glioblastoma Multiforme (GBM) é o tipo de tumor cerebral maligno com maior incidência na população. A perda do gene PTEN (fosfatase e tensina homóloga) é uma alteração comum associada ao GBM (até 60%) e esse gene codifica uma enzima que antagoniza a ação de PI3K, inibindo a fosforilação de AKT e, desse modo, regulando vias de sinalização relativas à sobrevivência celular e proliferação. Mutações em PTEN têm sido associadas à instabilidade genômica e ao aumento no número de quebras de fita dupla, além de serem relacionadas também à redução da expressão de RAD51, a qual é uma proteína-chave da via de reparo por recombinação homóloga (HR). Diante disso, o objetivo deste estudo foi avaliar se o status de PTEN interfere na expressão de RAD51 e proteínas parálogas (RAD51C e RAD51B) e, consequentemente, se PTEN é capaz de influenciar a eficiência de HR. Com o objetivo de induzir a formação de quebras de fita duplas (DSBs) no DNA, as células foram tratadas com a droga antitumoral etoposídeo, que produz quebras no DNA, principalmente duplas (DSBs). Duas linhagens de GBM com status diferentes de PTEN foram utilizadas: T98G (PTEN mutado) e LN18 (PTEN tipo selvagem). As células de GBM foram tratadas com etoposídeo em diferentes experimentos ou ensaios: proliferação celular, quantificação da necrose e apoptose, cinética do ciclo celular, imunofluorescência da proteína ?- H2AX, quantificação dos níveis de expressão de RAD51 e parálogas e o silenciamento de PTEN na linhagem LN18. Os resultados mostraram que a linhagem LN18 foi mais sensível à droga nos tempos iniciais (24 e 72 h) (até 61,2% de redução), em comparação com a T98G (até 12,3% de redução); no tempo mais tardio de análise (120 h), ambas as linhagens sofreram redução acentuadana proliferação. Adicionalmente, a LN18 exibiu maior porcentagem de células apoptóticas e necróticas, em comparação com a linhagem T98G, nos tempos de24, 72 e 120 horas após o tratamento. O ensaio de imunofluorescência revelou maior indução de células positivas para ?-H2AX na linhagem LN18 em relação à T98G (p =<0,001), após tratamento com etoposídeo (50 e 75 ?M). Nessas concentrações, a análise da cinética do ciclo celular mostrou um bloqueio na fase G2 em ambas as linhagens (p<0,01) nos tempos analisados (24, 48 e 72h), mas apenas a linhagem LN18 revelou bloqueio na fase S. A expressão de RAD51, RAD51B e C foi mais elevada em LN18 em comparação com a T98G e U87MG, nas células tratados (75?M) e controles. PTEN foi silenciado (siRNA-PTEN) na linhagem LN18 para verificar se a redução da expressão desse gene reduziria também a expressão de RAD51 e parálogas. Após 72 horas de silenciamento, com 69,9% de inibição de PTEN, a expressão de RAD51 e RAD51C também se mostrou reduzida em relação ao grupo controle. Em conjunto, os resultados obtidos no presente estudo indicam que o status de PTEN é crucial para as vias de sobrevivência, controle do ciclo celular e indução de apoptose nas células de GBM, indicando a relação entre PTEN e RAD51 e parálogas nas células de GBM tratadas com um indutor de quebras no DNA. Adicionalmente, outras ferramentas de estudo são requeridas para investigar as vias moleculares e possíveis interações e complexos proteicos envolvendo a participação de PTEN e RAD51 e suas proteínas parálogas / Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common malignant brain tumor. Loss of PTEN (Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10) gene is the most frequent alteration associated with GBM and encodes a phosphatase enzyme that antagonizes the PI3K, by inhibiting AKT phosphorylation thereby regulating signaling pathways related to cell survival and proliferation. PTEN deficiency has been associated with genomic instability and increased endogenous DSBs, as well as reduced expression of RAD51, which is a key gene with crucial role in HR. In this study, we aimed to evaluate whether the PTEN status in GBM cell lines can affect RAD51 expression and HR efficiency under conditions of treatment with the antineoplastic drug etoposide, which targets the DNA topoisomerase II enzyme, thus leading to the production of DNA breaks. T98G (PTEN mutated) and LN18 (PTEN wild-type) cells were treated with etoposide, and several assays were carried out: cell proliferation, detection and quantification of necrosis and apoptosis, cell cycle kinetics, immunofluorescence staining, RAD51 (and paralogs) protein expression, and PTEN silencing in LN18 cell line, by using the siRNA method. LN18 cells showed a greater reduction in cell proliferation, compared to T98G after treatments (25, 50, 75 e 100 µM) at 24, 72 and 120h. Both cell lines showed a significant increase (p=<0.001) in cell death induction, but LN18 presented a greater percentage of apoptotic and necrotic cells than T98G (24, 72 and 120h). The induction of DSB was analyzed by immunostaining (with ?-H2AX antibody), and for the concentrations (50 and 75 µM) tested, LN18 showed higher levels of ?-H2AX positive cells than that observed for T98G (p=<0.001). The analysis of cell cycle kinetics performed for cells treated with etoposide (50 and 75 µM) and collected at 24, 48 and 72h, LN18 presented a greater G2-blockage, as compared to T98G; only LN18 showed a blockage at the S-phase. The expression of RAD51, RAD51B and C was higher in LN18 compared to T98G and U87MG cells treated with etoposide (75 µM) and controls. When we silenced PTEN in LN18 linage, to check if PTEN silencing may reduce the expression of RAD51 and its paralogs, we found a 69.9% reduction in PTEN protein expressions, and the expression of RAD51 and RAD51C was also found reduced, compared to the control group. Taken together, the results obtained in this study indicate that the status of PTEN is critical for survival pathways, cell cycle control and induction of apoptosis in GBM cells, confirming the relationship between PTEN and RAD51 and its paralogs in GBM cells treated with an inducer of DNA breaks. These results contribute with relevant information for further studies on molecular pathways underlying the interaction between PTEN and RAD51 and its paralogs

O projeto de obtenção de huAcMos (Anticorpos Monoclonais Humanizados) tinha como escopo a humanização de anticorpos murinos com potencial terapêutico, inserção das sequências em vetores de expressão e transfecção em células CHO (do inglês, Chinese Hamster Ovary). A expressão do huAcMo Anti-CD18 resultou em baixos níveis da proteína recombinante e inciamos o processo de expressão de isoformas do huAcMo Anti-CD3. As células foram transfectadas com seqüências codificadoras do fragmento FvFc Anti-CD3 e clonadas pelo equipamento ClonePix FL. O fragmento foi caracterizado e demonstrou uma menor afinidade quando comparada com a molécula murina original. Ulizamos o sistema de recombinação homóloga (CHO Flp-In, Invitrogen) para expressão da molécula inteira do huAcMo Anti-CD3. Os clones foram caracterizados e demonstrou, assim como o fragmento FvFc, uma menor afinidade pelo alvo. As diferenças nas propriedades de ligação são freqüentemente encontradas após processos de humanização; dependendo da função efetora esta diminuição de afinidade não é negativa para a molécula. / The humanized antibodies (huMab) project intent to use murine antibodies with therapeutic potencial to obtain more human sequences with maintened specificity. The sequences were inserted in expression vectors and transfected in CHO (Chinese Hamster Ovary) cells. Anti-CD18 huMab expression results in low levels of recombinant protein and lead us to try the expression of Anti-CD3 isoforms. The cells were transfected for the expression of a FvFc antibody fragment and cloned using ClonePix FL equipment. The fragment characterization demonstrate a lower affinity when compared with the murine molecule. We use the homologous recombination system (CHO Flp-In) for the expression of the whole molecule of huMab Anti-CD3; like the FvFc fragment, the whole molecule demonstrate a lower affinity for the target. The differences in the affinity properties are frequently found after humanization process and depending on the expected efector functions is not negatively characterized.

O vírus da cinomose canina (CDV) é um importante patógeno de cães domésticos e carnívoros selvagens. A infecção pelo CDV é relevante a nível mundial e está associada com alta morbidade e mortalidade. Em diversos países a cinomose é considerada controlada pelo uso de vacinas, no entanto, no Brasil ainda é endêmica, principalmente devido ao grande número de animais não domiciliados. Além disso, surtos em cães e várias espécies de animais silvestres ocorrem com frequência, dizimando populações ameaçadas. As vacinas vivas atenuadas são seguras para cães, mas seu uso não é aconselhado em espécies altamente suscetíveis à infecção pelo CDV. Também os relatos de surtos de cinomose em cães supostamente vacinados levantam a hipótese de que as vacinas disponíveis no mercado podem não ser eficientes frente a algumas cepas de campo. Com o objetivo de gerar dados acerca dos mecanismos de evolução do CDV e desenvolver e testar a eficácia de uma vacina bivalente inativada contra o vírus da raiva (RABV) e CDV a presente tese será apresentada na forma de dois artigos científicos. Ainda, um artigo de revisão sobre os modelos animais utilizados para obtenção de informações sobre o vírus do sarampo utilizando a infecção de CDV em furões e cães foi publicada e será apresentada na presente tese. No primeiro artigo, foi analisada a ocorrência de recombinação homóloga em genomas de CDV e detectou-se oito possíveis vírus recombinantes, incluindo um evento de recombinação entre uma cepa de campo e uma cepa vacinal atenuada, sugerindo que o uso de vacinação com vírus vivo atenuado pode influenciar a evolução do CDV. No segundo trabalho, uma vacina recombinante bivalente inativada baseada em RABV expressando as glicoproteínas do envelope do CDV, hemaglutinina e proteína de fusão, mostrou-se eficiente na proteção contra infecção por CDV em furões quando utilizado um protocolo prime/boost. Finalmente, foi publicada uma revisão de literatura sobre os modelos animais utilizados para obtenção de informações sobre a patogênese do vírus do sarampo utilizando a infecção com o vírus da cinomose. / Canine distemper virus (CDV) is an important pathogen of domestic dogs and wild carnivores. CDV infection is globally relevant and it is associated with high morbidity and mortality. In several countries, distemper is considered controlled by vaccination, however, in Brazil it is still endemic, mainly due to the large number of non-domiciliated animals. In addition, outbreaks in dogs and various species of wild animals occur frequently, decimating threatened populations. Live attenuated vaccines are safe for dogs, but their use is not advised in species that are highly susceptible to CDV infection. Also, reports of canine distemper in supposedly vaccinated dogs raise the hypothesis that commercially available vaccines may not be effective against some wild type strains. In order to investigate the mechanisms of CDV evolution and to develop and assess the efficacy of an inactivated bivalent vaccine against rabies virus and CDV, this thesis will be presented in the form of two scientific papers. Furthermore, a review article on the animal models used to gain information on measles virus using CDV infection in ferrets and dogs has been published and will be presented in this thesis. In the first paper, the occurrence of homologous recombination in CDV genomes was analyzed and eight possible recombinant viruses were detected, including a recombination event between a wild type strain and an attenuated vaccine strain, suggesting that the use vaccines based on attenuated live virus may influence CDV evolution. In the second study, an inactivated bivalent recombinant vaccine based on RABV expressing CDV envelope glycoproteins, hemagglutinin and fusion protein, proved to be effective in protecting against CDV infection in ferrets when using a prime/boost protocol. Finally, a literature review was published on the animal models used to obtain information on the pathogenesis of measles virus using infection with canine distemper virus.

O gênero Pestivirus da família Flaviviridae, compreende vírus de genoma RNA fita simples e polaridade positiva que comumente estão associados a infecções em ruminantes e suídeos. Possui quatro espécies reconhecidas: o vírus da diarreia viral bovina tipo 1 (BVDV-1), o BVDV-2, o vírus da doença da fronteira (BDV) e o vírus da peste suína clássica (CSFV). Além disso, possui possíveis espécies atípicas, sendo o vírus ‘HoBi’-like a mais reconhecida na literatura. Com o objetivo de gerar mais informações acerca da epidemiologia molecular de pestivírus no País e dos mecanismos na evolução de vírus do gênero, o presente trabalho será apresentado sob a forma de seis artigos científicos. Os trabalhos visam a caracterização de pestivírus detectados em bovinos e javalis no Rio Grande do Sul, a identificação de cepas resultantes de provável recombinação homóloga, a análise das variantes virais intrahospedeiro (quasispécies) de animais infectados pelo vírus ‘HoBi’-like, e a comparação da multiplicação in vitro de diferentes cepas de pestivírus em cultivos celulares oriundos de diferentes raças bovinas. No primeiro trabalho, amostras de soro bovino de animais do Rio Grande do Sul foram obtidas junto ao serviço veterinário oficial e submetidas a RT-PCR para detecção de pestivírus seguida de sequenciamento e análise filogenética das amostras positivas, onde 57,6% foram classificadas como BVDV-1 e 42,4% como BVDV-2, sendo constada frequência elevada de BVDV-2 quando comparada a outras regiões no mundo. No segundo trabalho, 40 amostras de javalis cativos obtidas de abatedouro foram testadas utilizando metodologia semelhante a anteriormente mencionada, e foi possível a detecção de uma amostra positiva, que foi classificada como BVDV-2, sendo a primeira evidência molecular do BVDV em javalis na literatura. No terceiro artigo científico, foi pesquisado a ocorrência de recombinação homóloga, utilizando metodologia in silico, em sequências de pestivírus presentes em banco de dados públicos, onde foram descritos novos possíveis eventos de recombinação entre BVDV-1a e BVDV-1b, BVDV-2a e BVDV-2b e CSFV-2.2 com outro genogrupo indefinido. No quarto e quinto trabalhos, animais persistentemente infectados com o vírus ‘HoBi’-like foram gerados experimentalmente e, utilizando RT-PCR seguida de clonagem, sequenciamento e análises in silico, a composição e variações intrahospedeiro das quasispécies virais em circulação foram avaliadas, onde foi possível observar que características individuais do hospedeiro são importantes na seleção de variantes virais e que a nuvem de mutantes aumenta com o passar do tempo, não havando quasispécie dominante. Por fim, no sexto artigo científico, a multiplicação de cepas de BVDV-1a e 1b, BVDV-2a e vírus ‘HoBi’-like foram avaliadas in vitro em células de cultivo primário obtidas de gado europeu, zebuíno e raça mista e comparadas utilizando modelos estatísticos, onde foi possível a observação de ausência de diferenças entre as raças (P=0,88), mas presença de diferença entre indivíduos da mesma raça (P˂0,05). Os resultados aqui apresentados somam informações acerca da epidemiologia molecular, biologia e evolução dos pestivírus, sendo importantes para embasar futuras campanhas de controle e erradicação das doenças causadas por pestivírus. / The genus Pestivirus of the family Flaviviridae, comprises single stranded RNA-viruses that are commonly associated with infections in ruminants and swine. It has four recognized species: bovine viral diarrhea virus 1 (BVDV-1), BVDV-2, border disease virus (BDV) and classical swine fever virus (CSFV). It also has putative atypical species where the ‘HoBi’-like virus is the most highlighted in the literature. In order to generate more information about molecular epidemiology of pestiviruses and important mechanisms in the evolution of the virus genus, this work will be presented in six scientific articles form. The works aimed in the characterization of pestivirus detected in cattle and wild boar in Rio Grande do Sul state, identification of strains resulting from putative homologous recombination, analysis of intrahost viral variants (quasispecies) of animals infected with ‘HoBi’-like viruses, and the comparison of in vitro growth of different pestivirus strains in cell cultures derived from different cattle breeds. In the first study, bovine serum samples of cattle from Rio Grande do Sul state were collected by the official veterinary service and submitted to RT-PCR for detection of pestivirus followed by DNA sequencing and phylogenetic analysis of the positive samples, where 57.6% were classified as BVDV-1 and 42.4% as BVDV-2, which revealed high frequency of BVDV- 2 when compared to other regions worldwide. In the second work, 40 captive wild boar lung samples obtained from slaughterhouse were tested using similar methodology described above, and one sample resulted positive and was classified as BVDV-2, which represented the first molecular evidence of BVDV in wild boars. In the third scientific article, the occurrence of homologous recombination was investigated using in silico methods applied to sequences available in public databases, which are described putative new events between BVDV-1a and BVDV-1b, BVDV-2a and 2b and CSFV-2.2 and undetermined genogroup. In the fourth and fifth studies, animals persistently infected with the ‘HoBi’-like viruses were experimentally generated and using RT-PCR followed by cloning, sequencing and in silico analysis, the composition and intrahost variations of viral quasispecies in circulation were evaluated, where it was observed that individual characteristics of the host are important in the selection of viral variants and the mutant clouds increased overtime. Finally, in the sixth scientific article, the growth of BVDV-1a and 1b, and BVDV-2b, ‘HoBi’-like virus strains were evaluated in vitro using primary cell cultures obtained by taurine, indicine and mixed breed cattle using statistical models, it was possible to observe the absence of differences between cattle breeds (P=0.88), but presence of difference between individuals within the breed (P˂0.05). The results presented herein add information about the molecular epidemiology, biology and evolution of pestiviruses, being important to support future control and eradication programs of diseases caused by pestiviruses.

O gênero Pestivirus da família Flaviviridae, compreende vírus de genoma RNA fita simples e polaridade positiva que comumente estão associados a infecções em ruminantes e suídeos. Possui quatro espécies reconhecidas: o vírus da diarreia viral bovina tipo 1 (BVDV-1), o BVDV-2, o vírus da doença da fronteira (BDV) e o vírus da peste suína clássica (CSFV). Além disso, possui possíveis espécies atípicas, sendo o vírus ‘HoBi’-like a mais reconhecida na literatura. Com o objetivo de gerar mais informações acerca da epidemiologia molecular de pestivírus no País e dos mecanismos na evolução de vírus do gênero, o presente trabalho será apresentado sob a forma de seis artigos científicos. Os trabalhos visam a caracterização de pestivírus detectados em bovinos e javalis no Rio Grande do Sul, a identificação de cepas resultantes de provável recombinação homóloga, a análise das variantes virais intrahospedeiro (quasispécies) de animais infectados pelo vírus ‘HoBi’-like, e a comparação da multiplicação in vitro de diferentes cepas de pestivírus em cultivos celulares oriundos de diferentes raças bovinas. No primeiro trabalho, amostras de soro bovino de animais do Rio Grande do Sul foram obtidas junto ao serviço veterinário oficial e submetidas a RT-PCR para detecção de pestivírus seguida de sequenciamento e análise filogenética das amostras positivas, onde 57,6% foram classificadas como BVDV-1 e 42,4% como BVDV-2, sendo constada frequência elevada de BVDV-2 quando comparada a outras regiões no mundo. No segundo trabalho, 40 amostras de javalis cativos obtidas de abatedouro foram testadas utilizando metodologia semelhante a anteriormente mencionada, e foi possível a detecção de uma amostra positiva, que foi classificada como BVDV-2, sendo a primeira evidência molecular do BVDV em javalis na literatura. No terceiro artigo científico, foi pesquisado a ocorrência de recombinação homóloga, utilizando metodologia in silico, em sequências de pestivírus presentes em banco de dados públicos, onde foram descritos novos possíveis eventos de recombinação entre BVDV-1a e BVDV-1b, BVDV-2a e BVDV-2b e CSFV-2.2 com outro genogrupo indefinido. No quarto e quinto trabalhos, animais persistentemente infectados com o vírus ‘HoBi’-like foram gerados experimentalmente e, utilizando RT-PCR seguida de clonagem, sequenciamento e análises in silico, a composição e variações intrahospedeiro das quasispécies virais em circulação foram avaliadas, onde foi possível observar que características individuais do hospedeiro são importantes na seleção de variantes virais e que a nuvem de mutantes aumenta com o passar do tempo, não havando quasispécie dominante. Por fim, no sexto artigo científico, a multiplicação de cepas de BVDV-1a e 1b, BVDV-2a e vírus ‘HoBi’-like foram avaliadas in vitro em células de cultivo primário obtidas de gado europeu, zebuíno e raça mista e comparadas utilizando modelos estatísticos, onde foi possível a observação de ausência de diferenças entre as raças (P=0,88), mas presença de diferença entre indivíduos da mesma raça (P˂0,05). Os resultados aqui apresentados somam informações acerca da epidemiologia molecular, biologia e evolução dos pestivírus, sendo importantes para embasar futuras campanhas de controle e erradicação das doenças causadas por pestivírus. / The genus Pestivirus of the family Flaviviridae, comprises single stranded RNA-viruses that are commonly associated with infections in ruminants and swine. It has four recognized species: bovine viral diarrhea virus 1 (BVDV-1), BVDV-2, border disease virus (BDV) and classical swine fever virus (CSFV). It also has putative atypical species where the ‘HoBi’-like virus is the most highlighted in the literature. In order to generate more information about molecular epidemiology of pestiviruses and important mechanisms in the evolution of the virus genus, this work will be presented in six scientific articles form. The works aimed in the characterization of pestivirus detected in cattle and wild boar in Rio Grande do Sul state, identification of strains resulting from putative homologous recombination, analysis of intrahost viral variants (quasispecies) of animals infected with ‘HoBi’-like viruses, and the comparison of in vitro growth of different pestivirus strains in cell cultures derived from different cattle breeds. In the first study, bovine serum samples of cattle from Rio Grande do Sul state were collected by the official veterinary service and submitted to RT-PCR for detection of pestivirus followed by DNA sequencing and phylogenetic analysis of the positive samples, where 57.6% were classified as BVDV-1 and 42.4% as BVDV-2, which revealed high frequency of BVDV- 2 when compared to other regions worldwide. In the second work, 40 captive wild boar lung samples obtained from slaughterhouse were tested using similar methodology described above, and one sample resulted positive and was classified as BVDV-2, which represented the first molecular evidence of BVDV in wild boars. In the third scientific article, the occurrence of homologous recombination was investigated using in silico methods applied to sequences available in public databases, which are described putative new events between BVDV-1a and BVDV-1b, BVDV-2a and 2b and CSFV-2.2 and undetermined genogroup. In the fourth and fifth studies, animals persistently infected with the ‘HoBi’-like viruses were experimentally generated and using RT-PCR followed by cloning, sequencing and in silico analysis, the composition and intrahost variations of viral quasispecies in circulation were evaluated, where it was observed that individual characteristics of the host are important in the selection of viral variants and the mutant clouds increased overtime. Finally, in the sixth scientific article, the growth of BVDV-1a and 1b, and BVDV-2b, ‘HoBi’-like virus strains were evaluated in vitro using primary cell cultures obtained by taurine, indicine and mixed breed cattle using statistical models, it was possible to observe the absence of differences between cattle breeds (P=0.88), but presence of difference between individuals within the breed (P˂0.05). The results presented herein add information about the molecular epidemiology, biology and evolution of pestiviruses, being important to support future control and eradication programs of diseases caused by pestiviruses.

O vírus da cinomose canina (CDV) é um importante patógeno de cães domésticos e carnívoros selvagens. A infecção pelo CDV é relevante a nível mundial e está associada com alta morbidade e mortalidade. Em diversos países a cinomose é considerada controlada pelo uso de vacinas, no entanto, no Brasil ainda é endêmica, principalmente devido ao grande número de animais não domiciliados. Além disso, surtos em cães e várias espécies de animais silvestres ocorrem com frequência, dizimando populações ameaçadas. As vacinas vivas atenuadas são seguras para cães, mas seu uso não é aconselhado em espécies altamente suscetíveis à infecção pelo CDV. Também os relatos de surtos de cinomose em cães supostamente vacinados levantam a hipótese de que as vacinas disponíveis no mercado podem não ser eficientes frente a algumas cepas de campo. Com o objetivo de gerar dados acerca dos mecanismos de evolução do CDV e desenvolver e testar a eficácia de uma vacina bivalente inativada contra o vírus da raiva (RABV) e CDV a presente tese será apresentada na forma de dois artigos científicos. Ainda, um artigo de revisão sobre os modelos animais utilizados para obtenção de informações sobre o vírus do sarampo utilizando a infecção de CDV em furões e cães foi publicada e será apresentada na presente tese. No primeiro artigo, foi analisada a ocorrência de recombinação homóloga em genomas de CDV e detectou-se oito possíveis vírus recombinantes, incluindo um evento de recombinação entre uma cepa de campo e uma cepa vacinal atenuada, sugerindo que o uso de vacinação com vírus vivo atenuado pode influenciar a evolução do CDV. No segundo trabalho, uma vacina recombinante bivalente inativada baseada em RABV expressando as glicoproteínas do envelope do CDV, hemaglutinina e proteína de fusão, mostrou-se eficiente na proteção contra infecção por CDV em furões quando utilizado um protocolo prime/boost. Finalmente, foi publicada uma revisão de literatura sobre os modelos animais utilizados para obtenção de informações sobre a patogênese do vírus do sarampo utilizando a infecção com o vírus da cinomose. / Canine distemper virus (CDV) is an important pathogen of domestic dogs and wild carnivores. CDV infection is globally relevant and it is associated with high morbidity and mortality. In several countries, distemper is considered controlled by vaccination, however, in Brazil it is still endemic, mainly due to the large number of non-domiciliated animals. In addition, outbreaks in dogs and various species of wild animals occur frequently, decimating threatened populations. Live attenuated vaccines are safe for dogs, but their use is not advised in species that are highly susceptible to CDV infection. Also, reports of canine distemper in supposedly vaccinated dogs raise the hypothesis that commercially available vaccines may not be effective against some wild type strains. In order to investigate the mechanisms of CDV evolution and to develop and assess the efficacy of an inactivated bivalent vaccine against rabies virus and CDV, this thesis will be presented in the form of two scientific papers. Furthermore, a review article on the animal models used to gain information on measles virus using CDV infection in ferrets and dogs has been published and will be presented in this thesis. In the first paper, the occurrence of homologous recombination in CDV genomes was analyzed and eight possible recombinant viruses were detected, including a recombination event between a wild type strain and an attenuated vaccine strain, suggesting that the use vaccines based on attenuated live virus may influence CDV evolution. In the second study, an inactivated bivalent recombinant vaccine based on RABV expressing CDV envelope glycoproteins, hemagglutinin and fusion protein, proved to be effective in protecting against CDV infection in ferrets when using a prime/boost protocol. Finally, a literature review was published on the animal models used to obtain information on the pathogenesis of measles virus using infection with canine distemper virus.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Bovine viral diarrhea virus (BVDV) is a worldwide pathogen associated with important losses to livestock production. Most of these losses come from reproductive disorders and from the ability of the virus to produce persistent infections following in utero infection of the fetus. A number of reverse genetics methodologies have been used for BVDV in order to better understand the biology of the virus, which allowed the elucidation of a number of biological features including virus replication, host-virus interaction, immune response, and the pathogenesis of fetal infection. The present study describes the construction, characterization and manipulation of an infectious clone out of a non-cytophatic Brazilian BVDV strain IBSP4-ncp. The cDNA recombinant clone was constructed by yeast homologous recombination with a low-copy vector, from three genomic fragments comprising the open reading frame (ORF). The two untranslated regions (5' and 3' UTR) were replaced by the respective UTRs of the reference strain NADL. The constructed vector was transcribed in vitro and the resulting RNA was transfected on MDBK cells to rescue infectious virus. The rescued viruses (IC-pBSC_IBSP4-ncp#2 and #3) were maintained for ten passages in tissue culture and characterized in vitro, showing replication dynamics, focus size and morphology similar to those of the parental IBSP-4. Genomic analysis revealed five point mutations in the gene coding for Npro protein, resulting in amino acid changes. These mutations probably reflect an adaptation of the virus to the heterologous UTRs. The infectious clone IC-pBSC_IBSP4-ncp#2 was further used for the construction of a recombinant virus expressing the Gaussia luciferase (Gluc) reporter gene. The reporter gene was inserted between the Npro and Core genes, being flanked by an upstream linker and a downstream sequence of the Foot and Mouth Disease virus protease (FMDV2Apro) for accurate protein processing. The recombinant vector was in vitro transcribed and the RNA was transfected on MDBK cells. Recombinant infectious viruses were rescued (IC-pBSC_IBSP4-ncpGluc#3 and #4) and characterized in vitro, showing replication dynamics, focus size and morphology similar to those of the parental IBSP-4 clone. The Gluc reporter gene was accurately expressed and processed by the recombinant virus during 15 passages in tissue culture. These studies revealed that the infectious clone constructed herein can be easily manipulated and is able to carry in its genome heterologous genes up to 555 base pairs in length in a stable fashion and without interference with its replication efficiency. Thus, the constructed clone may be very useful for genetic manipulation towards studying different aspects of the BVDV biology and its interactions with the host, and for the development of vaccine strains with attenuated phenotype and/or with antigenic markers. / O vírus da diarreia viral bovina (BVDV) é um patógeno de bovinos distribuído mundialmente, associado com importantes perdas econômicas. As maiores perdas devem-se aos problemas reprodutivos causados pela infecção, e pela capacidade do vírus de causar persistência após infecção fetal no terço inicial da gestação. Para entender melhor a biologia desse vírus, sistemas de genética reversa foram desenvolvidos e tem permitido a elucidação de vários aspectos da replicação viral, interação vírus hospedeiro, resposta imune e patogenia da infecção fetal. O presente estudo relata a construção, caracterização e manipulação de um clone infeccioso, a partir da cepa brasileira não-citopática IBSP4-ncp. O clone de DNA recombinante foi construído pela técnica de recombinação homóloga em levedura, utilizando um vetor de baixo número de cópias, construído a partir de três fragmentos genômicos, que compreendiam a fase aberta de leitura (open reading frame, ORF) do vírus. As duas regiões não traduzidas (5 e 3 UTR) foram substituídas pelas respectivas UTRs da cepa de referência NADL. O vetor construído foi transcrito in vitro e o RNA obtido foi transfectado em células MDBK para recuperação de vírus infecciosos. Os vírus recuperados (CI-pBSC_IBSP4-ncp#2 e #3) foram mantidos por 10 passagens em cultivo celular e caracterizados in vitro, apresentando dinâmica de replicação, tamanho e morfologia de focos similares ao vírus parental IBSP-4. A análise do genoma por sequenciamento revelou cinco mutações pontuais no gene Npro, com trocas de aminoácidos, provavelmente refletindo uma adaptação do vírus às UTRs heterólogas. O clone infeccioso construído CIpBSC_ IBSP4-ncp#2, foi então utilizado para a construção de um vírus recombinante expressando o gene repórter Gaussia luciferase (Gluc). O gene repórter foi inserido entre os genes Npro e Core do vírus. Para o processamento da proteína repórter, uma sequência ligante foi adicionada anteriormente ao gene, e a sequência da protease do vírus da Febre Aftosa (FMDV2Apro) foi inserida após o gene. O vetor recombinante construído foi transcrito in vitro e o RNA obtido foi transfectado em células MDBK. Vírus recombinantes infecciosos foram recuperados (CI-pBSC_IBSP4-ncpGluc#3 e #4) e caracterizados in vitro, apresentando dinâmica de replicação, tamanho e morfologia de focos similares ao vírus obtido do clone infecioso. O gene repórter Gluc foi corretamente expresso e processado pelo vírus recombinante durante 15 passagens em cultivo celular. Com os resultados obtidos nestes estudos, conclui-se que o clone infeccioso construído pode ser facilmente manipulado e é capaz de carrear em seu genoma, e expressar de forma estável, genes heterólogos com até 555 pares de base, que parecem não interferir com sua capacidade replicativa. Dessa forma, o clone obtido pode ser muito útil para manipulação genética visando estudar diferentes aspectos da biologia do BVDV e de suas interações com o hospedeiro, assim como para a produção de cepas vacinais com fenótipo atenuado e/ou com marcadores antigênicos.

O gênero Pestivirus da família Flaviviridae, compreende vírus de genoma RNA fita simples e polaridade positiva que comumente estão associados a infecções em ruminantes e suídeos. Possui quatro espécies reconhecidas: o vírus da diarreia viral bovina tipo 1 (BVDV-1), o BVDV-2, o vírus da doença da fronteira (BDV) e o vírus da peste suína clássica (CSFV). Além disso, possui possíveis espécies atípicas, sendo o vírus ‘HoBi’-like a mais reconhecida na literatura. Com o objetivo de gerar mais informações acerca da epidemiologia molecular de pestivírus no País e dos mecanismos na evolução de vírus do gênero, o presente trabalho será apresentado sob a forma de seis artigos científicos. Os trabalhos visam a caracterização de pestivírus detectados em bovinos e javalis no Rio Grande do Sul, a identificação de cepas resultantes de provável recombinação homóloga, a análise das variantes virais intrahospedeiro (quasispécies) de animais infectados pelo vírus ‘HoBi’-like, e a comparação da multiplicação in vitro de diferentes cepas de pestivírus em cultivos celulares oriundos de diferentes raças bovinas. No primeiro trabalho, amostras de soro bovino de animais do Rio Grande do Sul foram obtidas junto ao serviço veterinário oficial e submetidas a RT-PCR para detecção de pestivírus seguida de sequenciamento e análise filogenética das amostras positivas, onde 57,6% foram classificadas como BVDV-1 e 42,4% como BVDV-2, sendo constada frequência elevada de BVDV-2 quando comparada a outras regiões no mundo. No segundo trabalho, 40 amostras de javalis cativos obtidas de abatedouro foram testadas utilizando metodologia semelhante a anteriormente mencionada, e foi possível a detecção de uma amostra positiva, que foi classificada como BVDV-2, sendo a primeira evidência molecular do BVDV em javalis na literatura. No terceiro artigo científico, foi pesquisado a ocorrência de recombinação homóloga, utilizando metodologia in silico, em sequências de pestivírus presentes em banco de dados públicos, onde foram descritos novos possíveis eventos de recombinação entre BVDV-1a e BVDV-1b, BVDV-2a e BVDV-2b e CSFV-2.2 com outro genogrupo indefinido. No quarto e quinto trabalhos, animais persistentemente infectados com o vírus ‘HoBi’-like foram gerados experimentalmente e, utilizando RT-PCR seguida de clonagem, sequenciamento e análises in silico, a composição e variações intrahospedeiro das quasispécies virais em circulação foram avaliadas, onde foi possível observar que características individuais do hospedeiro são importantes na seleção de variantes virais e que a nuvem de mutantes aumenta com o passar do tempo, não havando quasispécie dominante. Por fim, no sexto artigo científico, a multiplicação de cepas de BVDV-1a e 1b, BVDV-2a e vírus ‘HoBi’-like foram avaliadas in vitro em células de cultivo primário obtidas de gado europeu, zebuíno e raça mista e comparadas utilizando modelos estatísticos, onde foi possível a observação de ausência de diferenças entre as raças (P=0,88), mas presença de diferença entre indivíduos da mesma raça (P˂0,05). Os resultados aqui apresentados somam informações acerca da epidemiologia molecular, biologia e evolução dos pestivírus, sendo importantes para embasar futuras campanhas de controle e erradicação das doenças causadas por pestivírus. / The genus Pestivirus of the family Flaviviridae, comprises single stranded RNA-viruses that are commonly associated with infections in ruminants and swine. It has four recognized species: bovine viral diarrhea virus 1 (BVDV-1), BVDV-2, border disease virus (BDV) and classical swine fever virus (CSFV). It also has putative atypical species where the ‘HoBi’-like virus is the most highlighted in the literature. In order to generate more information about molecular epidemiology of pestiviruses and important mechanisms in the evolution of the virus genus, this work will be presented in six scientific articles form. The works aimed in the characterization of pestivirus detected in cattle and wild boar in Rio Grande do Sul state, identification of strains resulting from putative homologous recombination, analysis of intrahost viral variants (quasispecies) of animals infected with ‘HoBi’-like viruses, and the comparison of in vitro growth of different pestivirus strains in cell cultures derived from different cattle breeds. In the first study, bovine serum samples of cattle from Rio Grande do Sul state were collected by the official veterinary service and submitted to RT-PCR for detection of pestivirus followed by DNA sequencing and phylogenetic analysis of the positive samples, where 57.6% were classified as BVDV-1 and 42.4% as BVDV-2, which revealed high frequency of BVDV- 2 when compared to other regions worldwide. In the second work, 40 captive wild boar lung samples obtained from slaughterhouse were tested using similar methodology described above, and one sample resulted positive and was classified as BVDV-2, which represented the first molecular evidence of BVDV in wild boars. In the third scientific article, the occurrence of homologous recombination was investigated using in silico methods applied to sequences available in public databases, which are described putative new events between BVDV-1a and BVDV-1b, BVDV-2a and 2b and CSFV-2.2 and undetermined genogroup. In the fourth and fifth studies, animals persistently infected with the ‘HoBi’-like viruses were experimentally generated and using RT-PCR followed by cloning, sequencing and in silico analysis, the composition and intrahost variations of viral quasispecies in circulation were evaluated, where it was observed that individual characteristics of the host are important in the selection of viral variants and the mutant clouds increased overtime. Finally, in the sixth scientific article, the growth of BVDV-1a and 1b, and BVDV-2b, ‘HoBi’-like virus strains were evaluated in vitro using primary cell cultures obtained by taurine, indicine and mixed breed cattle using statistical models, it was possible to observe the absence of differences between cattle breeds (P=0.88), but presence of difference between individuals within the breed (P˂0.05). The results presented herein add information about the molecular epidemiology, biology and evolution of pestiviruses, being important to support future control and eradication programs of diseases caused by pestiviruses.