Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2014-02-17T18:40:37Z No. of bitstreams: 1 Isaac Queiroz de Oliveira.... Triagem dos antígenos ... 2013. pdf.pdf: 1026269 bytes, checksum: bfd51de16e1f840140bd71f78f00b22d (MD5) / Made available in DSpace on 2014-02-17T18:40:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Isaac Queiroz de Oliveira.... Triagem dos antígenos ... 2013. pdf.pdf: 1026269 bytes, checksum: bfd51de16e1f840140bd71f78f00b22d (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / As leishmanioses são antropozoonoses causadas por diferentes protozoários do gênero Leishmania. Estima-se que cerca de 350 milhões de pessoas estejam em áreas de risco, com uma incidência anual de aproximadamente dois milhões de novos casos no mundo. O cão é o principal reservatório dos centros urbanos e o flebótomo é o vetor responsável por sua transmissão. No Brasil, de acordo com as recomendações do Ministério da Saúde, cães soropositivos para leishmaniose devem ser sacrificado. O diagnóstico recomendado pelo Ministério da Saúde é feito com o teste rápido DPP-LVC® para triagem e o ELISA para confirmação. Trabalhos demonstram que o DPP-LVC® não é capaz de detectar uma parcela da população de cães, o que pode contribuir para a perpetuação da doença nestas áreas. Doze proteínas recombinantes (Lci1A, Lci2B, Lci3, Lci4, Lci5, Lci6, Lci7, Lci8, Lci10, Lci11, Lci12, Lci13) foram clonadas e sequenciadas em um estudo anterior, porém não foram completamente caracterizadas quanto à antigenicidade. Nossa hipótese é que um conjunto de antígenos selecionados a partir dessas proteínas recombinantes de L. infantum poderá ampliar a identificação de animais infectados em áreas endêmicas. O objetivo deste estudo foi identificar um conjunto de antígenos recombinantes de L. infantum, a partir de 12 antígenos previamente selecionados, quanto ao reconhecimento por soros de cães infectados para futuramente compor um teste imunodiagnóstico para leishmaniose visceral canina. No presente estudo, os 12 antígenos recombinantes previamente selecionados foram produzidos em nosso laboratório e purificados em Bio-Manguinhos. O ensaio de MAPIA (Multi- Antigen Print ImmunoAssay), que consiste em uma plataforma de triagem de antígenos em papel de nitrocelulose, mais próxima do teste rápido DPP-LVC®, foi utilizado para avaliação do reconhecimento dos 12 antígenos recombinantes por soros de cães infectados. Na triagem foram utilizados soros caninos positivos para leishmaniose visceral (n = 39), obtidos em estudo epidemiológico de corte transversal em área endêmica. Para avaliação da reatividade cruzada foram utilizados soros de cães com outras patologias: leishmaniose tegumentar (n = 10), tripanossomíase canina (n = 10), babesiose (n = 10) e erliquiose (n = 11), além de soros de animais negativos (n = 40). Inicialmente, foi definido o melhor protocolo para ser utilizado nos ensaios de MAPIA. Posteriormente, a triagem dos antígenos foi realizada com os soros e, para avaliar, a confiabilidade dos resultados obtidos, os testes foram lidos por dois observadores de maneira independente. A concordância entre as leituras visuais dos dois observadores foi avaliada utilizando o índice Kappa. O teste exato de Fisher foi empregado para avaliar diferenças estatísticas entre o índice de positividade das proteínas avaliadas. As proteínas Lci1A e Lci2B foram reconhecidas por 74% e 69%, respectivamente. As Lci4, Lci5 e Lci12 obtiveram reconhecimento de 33%, 31% e 33%, respectivamente pelos anticorpos presentes nos soros. Baixa reatividade dos soros de cães com babesiose, erliquiose, tripanossomíase canina foi observada com as 12 proteínas recombinantes avaliadas. Soros de cães com leishmaniose tegumentar foram os que apresentaram mais reatividade com as proteínas recombinantes. Analises combinatórias foram realizadas para identificar a partir dos 12 antígenos previamente selecionados, o conjunto destes capaz de identificar o maior número de soros de cães com leishmaniose visceral canina testados. Foram identificadas duas combinações compostas por cinco antígenos, Lci1A, Lci2B, Lci8, Lci12, Lci4 e Lci1A, Lci2B, Lci8, Lci12, Lci5. Quando comparado o reconhecimento desses conjuntos com a combinação de Lci1A e Lci2B foi observado um aumento de 77% para 87%, no entanto não foi observada diferença estatística (p= 0,098) apesar desse incremento. Esse achado aponta para possibilidade de avaliar os dois conjuntos em um teste imunocromatográfico no formato do teste final (DPP). Em resumo, utilizando o teste de triagem MAPIA foi possível selecionar dois conjuntos de cinco proteínas recombinantes de L. infantum que mostraram potencial para compor um teste imunodiagnóstico no formato DPP multi-antígenos. / Leishmaniasis is an antropozoonosis caused by different protozoa of the genus Leishmania. It is estimated that approximately 350 million of people are at risk areas, with annual incidence of approximately two million new cases worldwide. The dog is the main reservoir in urban centers and the sandfly is the vector responsible for transmission. In Brazil, according to the recommendations of the Ministry of Health, seropositive dogs for leishmaniasis should be euthanized. The diagnosis is made by the DPP-LVC® as screening and ELISA as confirmatory. Studies have shown that DPP-LVC® is not able to detect a portion of the dog population, which may contribute to the perpetuation of the disease in these areas. Twelve recombinant proteins (Lci1A, Lci2B, Lci3, Lci4, Lci5, Lci6, Lci7, Lci8, Lci10, Lci11, Lci12, Lci13) were cloned and sequenced in a previous study, but were not fully characterized for antigenicity. Our hypothesis is that a set of selected recombinant antigens of L. infantum may increase the identification of infected animals in endemic areas. The aim of this study was identify a set of recombinant antigens of L. infantum from 12 previously selected for recognition by sera from infected dogs to compose an immunodiagnostic test for canine visceral leishmaniasis. The 12 recombinant antigens were produced in our laboratory and purified in Bio-Manguinhos. MAPIA (Multi-Antigen Print ImmunoAssay), which consists in a screening platform for antigen in nitrocellulose paper, was used to assess the recognition of recombinant antigens for 12 sera of dogs infected. MAPIA is closer to rapid test DPP-CVL® than other screening tests. We used this screening method with sera positive for canine visceral leishmaniasis (n = 39) obtained in a cross-sectional epidemiological study in endemic area. For evaluation of cross-reactivity, sera from dogs with other diseases: cutaneous leishmaniasis (n = 10), canine trypanosomiasis (n = 10) babesiosis (n = 10) and ehrlichiosis (n = 11), and animal sera negative (n = 40) were used. Initially, was decided that the best protocol to be used in the assays. Subsequently, screening of antigens was performed with sera and to evaluate the reliability of the results, the tests were read by two observers independently. The agreement between visual readings of the two observers was assessed using the kappa index. The Fisher exact test was used to evaluate statistical differences between the positivity rate of the proteins studied. The proteins Lci1A and Lci2B were recognized by 74% and 69%, respectively. Lci4 (33%), Lci5 (31%) and Lci12 (33%) achieved a good degree of recognition by antibodies present in serum. We observed low reactivity of sera from dogs with babesiosis, ehrlichiosis, and canine trypanosomiasis with the 12 recombinant proteins. Sera from dogs with cutaneous leishmaniasis were most likely reacted with the recombinant proteins. Combinatorial analyzes were performed to identify a set of antigens from the 12 previously selected, that can identify the larger number of sera from dogs with canine visceral leishmaniasis. We identified two combinations composed of five antigens, Lci1A, Lci2B, Lci8, Lci12, Lci4 and Lci1A, Lci2B, Lci8, Lci12, Lci5 that were most recognized by serums. When compared recognition of combination of Lci1A + Lci2B and two sets of 5 proteins, sensitivity increased from 77% to 87%, however this increase was not statistically different (p = 0.098). Despite this finding did not reach statistical significance, points us to evaluate the possibility of two sets in an immunoassay format of the final test (DPP). In summary, using MAPIA, two sets of five recombinant proteins of L. infantum showed potential to be used in immunodiagnostic test in multi-antigens DPP.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-graduação em Biotecnologia / Made available in DSpace on 2013-07-16T03:37:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 247981.pdf: 1781469 bytes, checksum: a099ea9e628cb5c63de8bfd3d28635a1 (MD5) / O uso de caudas de afinidade tem facilitado a purificação de proteínas recombinantes para aplicações bioquímicas, terapêuticas e estudos estruturais. A cauda mais comum é a cauda contendo seis-histidinas (His-tag) porque permite a purificação das proteínas recombinantes por cromatografia de afinidade. Em alguns casos, as caudas de tamanhos maiores podem aumentar a solubilidade da proteína de interesse. Em outros, a presença da cauda pode alterar a conformação estrutural da proteína, a atividade, interações proteína-proteína e a formação de cristais com um bom padrão de difração, necessário para elucidar a estrutura tridimensional. Todos esses efeitos negativos reforçam a importância de realizar uma caracterização funcional das proteínas expressas com caudas e que a clivagem das mesmas é de grande utilidade antes de realizar estudos funcionais e estruturais. A protease TEV é uma das mais utilizadas para clivar a cauda de proteínas recombinantes porque ela reconhece uma seqüência de aminoácidos muito específica (EXXYXQ*S/G) (onde X pode ser qualquer resíduo) e é ativa a baixas temperaturas e na presença de inibidores de protease adicionados durante o processo de purificação. A protease TEV é disponível comercialmente na forma solúvel, porém é muito cara. Quando a TEV é utilizada na forma solúvel, ela deve ser separada da proteína de interesse. Esta separação é normalmente realizada por uma etapa de cromatografia de exclusão molecular, que permite a separação da cauda, da proteína clivada e não clivada. Nos casos em que a proteína de interesse possua uma massa molecular semelhante a protease TEV, são necessárias etapas adicionais de purificação diferentes da gel filtração. Quando um grande número de proteínas é estudada, como nos projetos de genômica estrutural para a cristalização de proteínas, a produção da TEV deve ser contínua nos laboratórios, aumentando o custo do processo de purificação. Neste trabalho, a protease TEV foi produzida e imobilizada em diferentes suportes visando obter um biocatalisador ativo, estável e que possa ser reutilizado em vários processos de clivagem de caudas de histidina de proteínas recombinantes. Para isso, foram utilizadas três estratégias: a primeira pela imobilização no suporte glutaraldeído-agarose (G-agarose) que permite a ligação da TEV pelos grupos e-amino das lisinas. A segunda pela imobilização em tiolsulfinato-agarose (TSI-agarose) pela união da proteína pelos grupos tiol das cisteínas e a última pela imobilização pelos grupos tiol e por outros nucleófilos da superfíce da TEV. O rendimento da purificação das proteínas a partir de 1 litro de cultivo foi de 20 mg para a TEV e 5 mg para o substrato da TEV. A protease TEV imobilizada em TSI-agarose clivou 100% do substrato em 24 h a temperatura ambiente e a imobilizada em G-agarose clivou 50% do substrato nas mesmas condições. A TEV imobilizada em TSI-agarose foi mais estável que a enzima solúvel durante um período de armazenamento de 16 dias a 4°C e pode ser reutilizada em pelo menos cinco ciclos de clivagem.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2018-04-10T17:38:54Z No. of bitstreams: 1 2017_CamylaMaradaSilvaRibeiro.pdf: 2147624 bytes, checksum: bc4db3ff95897ee865d19ffe7b63a8b4 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-04-11T16:47:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_CamylaMaradaSilvaRibeiro.pdf: 2147624 bytes, checksum: bc4db3ff95897ee865d19ffe7b63a8b4 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-11T16:47:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_CamylaMaradaSilvaRibeiro.pdf: 2147624 bytes, checksum: bc4db3ff95897ee865d19ffe7b63a8b4 (MD5) Previous issue date: 2018-04-11 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). / O DNA de organismos eucarióticos é organizado sob a forma de cromatina, sendo responsável pela regulação da transcrição, replicação e reparo do DNA. O nucleossomo, unidade fundamental da cromatina, compreende estrutura formada por uma sequência de DNA enrolada no octâmero de histonas, chegando a altos níveis de compactação que dão origem ao cromossomo. Para o estudo da estrutura do nucleossomo, é imprescindível a sua reconstituição in vitro, na qual faz-se necessário um método eficiente para a obtenção de histonas recombinantes. Existem diversos protocolos para expressão e purificação de histonas recombinantes publicados na literatura. Portanto, o objetivo deste trabalho é estabelecer um protocolo para obtenção de histonas canônicas recombinantes. Para estabelecimento do protocolo de expressão, duas cepas competentes de E. coli (Rosetta gami e Rosetta pLysS) foram testadas quanto a capacidade de produzir grande quantidade de histona recombinante por duas diferentes metodologias: expressão clássica com uso de IPTG e expressão espontânea. As histonas foram purificadas por extração de corpos de inclusão seguido por cromatografia de troca iônica. Surpreendentemente, os melhores resultados de expressão, para todas as histonas, foram obtidos pela metodologia de auto-expressão com uso de Rosetta pLysS. No entanto, com exceção da H3, bons resultados também foram adquiridos por expressão clássica com IPTG. Ajustes no protocolo de purificação foram realizados de forma a reduzir a degradação por proteases, grande desafio encontrado nesta etapa. A utilização de associação de inibidores favoreceu a modulação desta degradação. Assim, foi possível estabelecer um método para expressão e purificação de histonas de forma a obter grande quantidade de histona recombinante livres de degradação. / Eukaryotic DNA is organized into chromatin that regulates gene transcription, DNA replication and repair. Nucleosomes, the basic unit of chromatin, are formed by a sequence of DNA wrapped around a histone octamer, achieving high levels of compaction that goes to chromosome. In order to reconstitute nucleosomes in vitro to perform structural studies on chromatin, it is necessary to have an efficient method for recombinant histone production. Although there is several established protocols for expression and purification of recombinant histones, our challenge is to adapt a protocol that will be compatible with laboratory. For establishment of histone expression protocol, two competent E. coli strains (Rosetta gami and Rosetta pLysS) were tested about the ability to produce large amounts of recombinant histone by two different methodologies: classical expression using IPTG and spontaneous expression. The human histones H2A, H2B, H3 e H4 were purified from inclusion body followed by ion exchange chromatography. Surprisingly, the best expression results for all histones were obtained by spontaneous expression methodology using Rosetta pLysS. However, with the exception of H3, good results were also acquired by classical expression with IPTG. Adjustments in purification protocol were performed in order to reduce degradation by proteases, a challenge encountered in this step. The use of association of inhibitors helped the modulation of degradation. Thus, it was possible to establish a method for expression and purification of histones in order to obtain large amounts of recombinant histone free of degradation

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2014-11-06T13:36:54Z No. of bitstreams: 1 2014_AnaClaudiadeSouza.pdf: 3213999 bytes, checksum: c330e78f60850f7c3b109e305fe3b27c (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-11-13T13:01:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_AnaClaudiadeSouza.pdf: 3213999 bytes, checksum: c330e78f60850f7c3b109e305fe3b27c (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-13T13:01:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_AnaClaudiadeSouza.pdf: 3213999 bytes, checksum: c330e78f60850f7c3b109e305fe3b27c (MD5) / A utilização de plantas como sistema de produção de proteínas é uma alternativa que está crescendo, e se tornando um importante recurso para a expressão de proteínas de uso terapêutico e de enzimas. Progressos significativos têm sido feitos no desenvolvimento de proteínas recombinantes produzidas em cultura celular e em tecidos de plantas, além de avanços no desenho e implementação de biorreatores. Portanto, o objetivo deste estudo é utilizar sistema de planta para expressão transiente de proteínas recombinantes. Um dos objetivos específicos é expressar a proteína docapsídeo de norovirus (NV CP) para montagem de virus like particles (VLP)utilizando vetor binário e os genes de supressor viral de silenciamento gênico(SG). Outro objetivo específico é produzir o antígeno multiepitopo do vírus dadengue utilizando vetor viral baseado no Cucumber mosaic virus (CMV). Comoobjetivo específico final o vetor baseado no CMV foi testado como vetor deindução de silenciamento gênico (VIGS). Para a expressão de NV CP, asproteínas VP1 e VP2 deste vírus foram clonadas em vetor binário ecoexpressas com a proteína viral supressora de SG, 126 K de Pepper mildmottle virus, em Nicotiana benthamiana. Para visualização, as VLPs forampurificadas de folhas agroinfiltradas e observadas no microscópio eletrônico de transmissão. O uso de vetor binário e gene de supressor viral de SG foi viável para expressão e montagem de NV VLP. Para a expressão da proteínamultiepitopo do vírus da dengue, foi realizada a modificação do vetor viralbaseado no CMV. O RNA 2 do vírus foi modificado para conter os sítios declonagem, e o genoma do vírus foi clonado em vetor binário para que o mesmo pudesse ser utilizado no sistema de agroinfiltração. Os resultados demonstraram que o vetor de expressão baseado no CMV produziu a proteína de interesse com baixo rendimento e que, portanto, deve ser aprimorado. Como objetivo de testar, portanto, a viabilidade deste vetor como VIGS, o mesmo foi modificado novamente para que pudesse realizar a clonagem utilizando sistema de recombinação. Para isso, o gene da fitoeno desaturase (PDS) foi clonado neste vetor, e os resultados demonstraram que o mesmo é infeccioso,porém novos testes serão realizados para aprimorar seu uso como VIGS. ______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The use of plant system as protein expression is an alternative strategy for themass production of therapeutic proteins and enzymes. Significant progresshave been made in producing recombinant proteins in plant cell culture and inplant tissues for the implementation as bioreactors. Therefore, the aim of thisstudy is to use plant system for transient expression of human virus antigen.One of viral proteins expressed was the capsid protein of norovirus (NV-CP) forassembly of virus like particles (VLP) using binary vector and viral suppressorsilencing gene (SG). Another protein was the dengue multi-epitope antigenusing Cucumber mosaic virus (CMV)-based viral vector. CMV-based vector wastested also as the vector induced gene silencing (VIGS) vector. For expressionof NV-CP, the gene of VP1 and VP2 protein were cloned into binary vector andco-expressed with viral protein suppressor (SG), 126K protein of Pepper mildmottle virus in Nicotiana benthamiana. To confirm the VLPs assembly, thepurified VP1 fraction was observed by transmission electron microscopy. Theresults demonstrated that the system using binary vector and SG is viable forthe expression and assembly of NV VLPs. For dengue multiepitopo proteinexpression, the CMV-based vector was modified. CMV RNA 2 segment wasmodified to contain new cloning site and virus genome was cloned into thebinary vector to be used in agroinfiltration system. The results showed thatCMV-based protein expression vector produced the target protein with lowlevels and, therefore, should be improved the system. To evaluate the viabilityof the CMV as a VIGS vector, CMV vector was modified introducing Gatewayrecombination site (Invitrogen). The phytoene desaturase (PDS) gene wascloned into this vector and infiltrated expecting photo-breeching effect resultedas gene knock-down by VIGS. The results demonstrate that it was infectious,but clear knock-down phenotype as photo-breaching was not observed. Thefurther tests are needed to enhance the effect as VIGS.

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Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2009-2010 / Chez les eucaryotes, les protéines de la recombinaison homologue comme RAD51 et RAD52 jouent des rôles dans la maintenance de l'intégrité et la stabilité génomique. La protéine humaine RAD52 est un des membres de la large famille des "single-strand annealing proteins (SSAPs)" et stimule la recombinaison dépendante de RAD51. Chez les procaryotes et les bactériophages, il a été difficile d'établir la présence d'homologue de RAD52 avec des séquences conservées. Récemment, plusieurs protéines soupçonnées d'être des SSAPs ont été trouvées chez de nombreux phages infectant des souches de Lactococcus lactis. Une de ces SSAPs a été nommée Sak et se retrouve dans le bactériophage virulent u136 qui appartient à la famille des Siphoviridae. Dans cette étude, nous démontrons que Sak est homologue à la portion N-terminale de la protéine RAD52 humaine. Sak lie préférentiellement l'ADN simple-brin plutôt que le double-brin et favorise la renaturation de longs ADN complémentaires. Sak interagit avec RecA et stimule les réactions in vitro de recombinaison homologue. Des mutations modulant la liaison à l'ADN de RAD52 affectent Sak de façon similaire. Remarquablement, la reconstruction par microscopie électronique de Sak révèle une structure en anneau de onze sous-unités, similaire à la structure formée par les cristaux du fragment N-terminal de RAD52. Pour la première fois, nous proposons un homologue viral de RAD52 tant au point de vue phylogénétique que de sa séquence en acide aminé, sa structure et sa fonction.

La moléculture végétale a connu un essor considérable ces dernières années, permis parnombre d’avantages pratiques associés aux plantes incluant une mise à l’échelle aisée pour la production de vaccins ou d’anticorps thérapeutiques en grandes quantités. De nombreuses études ont été réalisées, ces dernières années, pour optimiser les rendements en protéines d’intérêt médical chez Nicotiana benthamiana, une cousine sauvage du tabac.Ces études ont été menées, toutefois, sans tenir compte de la teneur foliaire en protéines endogènes, souvent considérées comme des contaminants majeurs au moment de la purification des protéines d’intérêt. Dans ce contexte, notre principal objectif de recherche pour cette étude a été d’évaluer l’influence de traitements culturaux variés aussi bien sur le rendement total en protéine recombinante dans des plants agroinfiltrés de N. benthamianaque sur la teneur relative en ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygénase (RuBisCO),principal contaminant endogène du tissu foliaire. Nos résultats confirment un impact souvent significatif des conditions culturales sur le rendement total en protéine recombinante dans la plante, mais peu d’effets sur la part relative en RuBisCO dans le tissu foliaire. / Plant molecular farming has grown considerably in recent years, thanks to a number of benefits associated with plants including a convenient scaling-up of production settings that allow for the production of large quantities of vaccines or therapeutic antibodies. Numerous studies have been conducted in recent years to optimize the yields of medically valuable recombinant proteins in the wild tobacco relative Nicotiana benthamiana. Most of these studies, however, have not considered the host plant endogenous proteins, which oftenrepresent major contaminants during the downstream purification of recombinant proteins.In this context, our main research objective for this project has been to evaluate the relative impacts of cultural conditions on recombinant protein yield and relative content of ribulose1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (RuBisCO), the major endogenous protein contaminant in leaf tissue. Our results confirm the influence of most cultural conditions on total recombinant protein yield, but a negligible effect of these conditions on the relative amount of RuBisCO in leaf tissue.

Ingeniera Civil en Biotecnología / Ingeniera Civil en Química / Magíster en Ciencias de la Ingeniería, Mención Química / El Presente Trabajo de Título se enmarca dentro del proyecto de investigación Fondecyt Nº1080143 denominado "Effects of hydrophobic polypeptide tag fusion on protein purification by Hydrophobic Interaction Chromatography", cuyo objetivo es determinar, cuantitativa y cualitativamente, el efecto de la fusión de polipéptidos hidrofóbicos en diferentes etapas del proceso de producción de proteínas recombinantes. Una de las etapas del proyecto, consiste en la optimización de las condiciones y el modo de operación del cultivo de Escherichia coli, que maximicen la productividad de cutinasas recombinantes. El microorganismo hospedero corresponde a Escherichia coli BL21 (DE3), cepa en la que se ha introducido el vector de expresión pET11a, el cual, bajo inducción, permite la producción de la proteína recombinante cutinasa a la que se han adicionado los aminoácidos triptófano(W), prolina(P) y tirosina(Y). Los polipéptidos hidrofóbicos adicionados son WPWP(Cutinasa-(WP)2) e YYY(Cutinasa-(Y)3). Las condiciones de cultivo en estudio, variables de entrada, corresponden a: temperatura de crecimiento y temperatura de inducción (25/18°C y 37/25°C), densidad celular en el punto de inducción (0,8 y 1,5 U Abs600nm ), concentración de inductor (0,1 y 0,5 mM IPTG); concentración de extracto de levadura (5 y 20 g/L), concentración de triptona (10 y 15 g/L) y concentración de glicerol (0 y 0,3 % v/v), en el medio de cultivo. Para realizar el estudio, se desarrolló un diseño experimental factorial fraccionario (26-2IV) que permite obtener información contundente respecto de los efectos principales de los factores (condiciones de cultivo) y sus interacciones (interacciones entre 2 factores) en cultivos batch en matraces. Se llevó a cabo la totalidad de experimentos establecidos en la malla de tratamientos, para las variantes Cutinasa-(WP)2 y Cutinasa-(Y)3. Mediante un análisis estadístico de los resultados obtenidos se determinó la significancia de los factores y sus interacciones sobre la productividad y rendimiento (test ANOVA 95% nivel de significancia), se elaboró un modelo matemático lineal para estas variables en función de los factores e interacciones significativas y se determinaron las condiciones óptimas que maximizan la productividad y rendimiento para cada variante en particular, utilizando el modelo anteriormente nombrado. Los resultados obtenidos permitieron optimizar la producción de Cutinasa-(WP)2, sin inconvenientes, alcanzando una producción total de 28.870 [U Cutinasa-(WP)2/L] lo que equivale a 5,3 veces lo producido bajo las condiciones del caso base. El rendimiento optimizado fue 6,5 veces el rendimiento del caso base. Las condiciones óptimas de cultivo son: temperatura de crecimiento y temperatura de inducción, 37oC/25oC (Alto); densidad celular en el punto de inducción, 1,5 U Abs600nm(Alto); concentración de inductor, 0,1 mM IPTG (Bajo); concentración de extracto de levadura, 20 g/L (Alto); Concentración de triptona, 10 g/L (Bajo) y concentración de glicerol nula. El comportamiento errático de la variante Cutinasa-(Y)3 generó dificultades para modelar, predecir y optimizar la productividad y rendimiento de los cultivos. Se propone que las problemáticas de esta variante provienen de la cepa electrocompetente transfomada productora de Cutinasa-(Y)3. La comparación de los modos de operación en el fermentador Biostat B entregaron como resultado que el modo batch, para la variante Cutinasa-(WP)2, presentó mayor productividad específica total y rendimientoequivalentes a 2,5 y 1,4 veces la producción de fermentador operando en modo fed-batch con alimentación constante de nutrientes. En el caso de la variante Cutinasa-(Y)3, el modo de fermentación batch también fue el más favorable. Se concluye que todos los factores analizados tienen efectos significativos sobre la productividad y/o rendimiento de cutinasa recombinante en cultivos de E. coli BL21(DE3). Los factores e interacciones que poseen un efecto positivo y significativo sobre la productividad y/o rendimiento de ambas variantes corresponden a: densidad celular y sus interacciones con los factores temperatura de crecimiento e inducción y concentración de extracto de levadura. Los factores e interacciones que presentan efectos negativos y significativos sobre la productividad y/o rendimiento de ambas variantes son la concentración de inductor, concentración de triptona y la interacción concentración de glicerol-concentración extracto de levadura.

L'acclimatation au froid est un phénomène qui permet aux plantes exposées à de basses températures positives de pouvoir tolérer ensuite le gel. ElIe est, ici, étudiée chez le pois (Pisum sativum L.) en conditions contrôlées grâce à deux lignées, Champagne tolérante au gel après cette phase d'acclimatation et Térèse sensible même après la phase d'acclimatation. L'analyse du protéome des feuilles, des tiges et des racines de ces lignées a permis l'identification de protéines ayant un rôle potentiel dans l'acclimatation au froid. Pour les feuilles et la base des tiges, la majorité des protéines différentielIement exprimées et identifiées, soit 35% des protéines, participent à la photosynthèse et à la glycolyse (métabolisme primaire). Dans les tiges, 25% des protéines sont des chaperonnes et dans les racines, les protéines de défense représentent 47% des protéines identifiées. Les teneurs en raffinose, saccharose, glucose ainsi qu'en citrate augmentent chez Champagne dans les 3 parties étudiées de la plante lors de l'acclimatation au froid. Ces concentrations restent faibles et à peu près stables chez Champagne non acclimaté et Térèse qu'il ait ou non subi la phase d'acclimatation. Le dosage de ces métabolites a aussi été réalisé chez des lignées recombinantes issues du croisement entre Champagne et Térèse. Ceci a permis la détection de QTL pouvant être explicatifs de l'acclimatation au froid avec, notamment, des QTL de teneur en raffinose qui co-localisent avec des QTL de tolérance au gel présents sur les groupes de liaison 5 et 6. Des PQL ont aussi été recherchés avec l'analyse du protéome des feuilles des lignées recombinantes. Certains co-localisent avec les QTL précédemment détectés. L'ensemble des données fournies par les différentes approches nous permet d'émettre des hypothèses pour expliquer les mécanismes mis en place chez Champagne pour tolérer le gel. / CoId acclimation is the process whereby plants, previously exposed to low positive temperatures, are sUbsequently able to tolerate frost. This phenomenon was studied under controlled conditions in pea (Pisum sativum L.) in two Iines: Champagne, frost tolerant after cold acclimation and Terese, frost sensitive even if previously submitted to a cold acclimation period. Leaf, stem and root proteomes were analysed. Thirty five per cent of the identified differentially expressed proteins in leaves and stems during the cold acclimation period were involved in photosynthesis and glycolysis. ln stems, 25% were identified as folding proteins and ir roots, 47% were involved in the defense response. The raffinose, sucrose, glucose and citrate contents increased in Champagne leaves, stems and roots during the cold acclimation. ln contrast, the levels of these compounds were low in non-acclimated Champagne as weil as in Terese submitted to the cold acclimation period or not. Metabolite levels were also determined on the recombinant inbred lines (RIL) resulting from the cross between Champagne and Terese. Subsequent analyses permitted the detection of potential cold acclimation explicative OTL. ln particular, raffinose content QTL were colocalized with frost da mage QTL on the linkage groups 5 and 6. POL were also detected with the study of RtL leaf proteome. A number of these PQL colocalized with the previously detected QTL. The data obtained using these different approaches allowed us to propose hypothezises potentially explaining the mechanisms used by Champagne to tolerate frost.

Made available in DSpace on 2015-12-06T22:54:33Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / A imunização genética com um DNA plasmidial, contendo o gene que codifica a proteína 2 da superfície de amastigotas (ASP-2), é capaz de proteger parte dos camundongos altamente suscetíveis A/Sn contra uma infecção letal pelo Trypanosoma cruzi. Com base neste resultado, a hipótese central desta tese foi a de que se poderia melhorar racionalmente a eficácia da vacinação contra a infecção experimental pelo T. cruzi, utilizando diferentes formulações vacinais e/ou esquemas de vacinações. Para tal, empregaram-se protocolos de imunização e reforço homólogo ou heterólogo, usando DNA plasmidial, proteínas recombinantes, e vírus recombinantes da ASP-2 de T. cruzi. Inicialmente, testou-se se o reforço heterólogo com a proteína ASP-2 recombinante aumentava a eficácia da vacinação com o DNA plasmidial (pIgSPCl.9). Este protocolo não se mostrou mais eficaz, mas abriu a possibilidade de que a imunização com a proteína ASP-2 recombinante pudesse ser utilizada como um protocolo vacinal alternativo. Com esta abordagem, descreveu-se que a administração de 3 doses de uma proteína recombinante (GST-P4P7), representando os aminoácidos 261-500 da ASP-2 em fusão com a glutationa S-transferase, na presença dos adjuvantes alum e CpG ODN 1826, era capaz de induzir altos níveis de proteção. Neste modelo experimental, observou-se que a imunidade protetora foi de longa duração e dependente dos linfócitos CD8 específicos para o epítopo imunodominante TEWETGQI. Determinou-se também que o adjuvante CpG ODN 1826 melhorou a eficácia da imunidade protetora, e que linfócitos T CD4 específicos são importantes para a indução dos linfócitos CD8 protetores. Como o protocolo de vacinação com a proteína recombinante GST-P4P7 exigia o uso de três doses, testou-se então a possibilidade de que um adenovírus recombinante, expressando a ASP-2 (AdASP-2), pudesse ser utilizado num protocolo de imunização e reforço homólogo ou heterólogo (somente duas doses). Na comparação dos protocolos de vacinação homólogos ou heterólogos com pIgSPCl.9 e AdASP-2, observou-se que, nos animais A/Sn, tanto a imunização homóloga quanto a heteróloga, usando o AdASP-2, proporcionaram um alto grau de imunidade protetora contra a infecção pelo T. cruzi. Os estudos utilizando o protocolo heterólogo (pIgSPCl.9 seguido por AdASP-2), que protege 80-100% dos camundongos, mostraram que a imunidade era de longa duração e dependente dos linfócitos T CD4 e CD8. Esta imunidade protetora se correlacionou com a atividade citotóxica específica in vivo, antes do desafio com o T. cruzi. Com base nestes resultados, analisou-se a imunidade protetora após a vacinação heteróloga em camundongos com deficiência de um importante mediador da citotoxicidade, a perforina. Os animais deficientes (KO) da expressão de perforina vacinados se mostraram suscetíveis à infecção experimental. Uma análise da resposta imune celular destes camundongos mostrou que eles apresentavam uma menor produção de IFN-γ por esplenócitos re-estimulados in vitro, na presença do antígeno recombinante. Na análise dos linfócitos T CD8 específicos observou-se que havia: i) uma expansão numérica normal; ii) uma redução numérica significativa dos linfócitos multifuncionais, capazes de expressar simultaneamente IFN-γ/CD107a e IFN-γ/TNF-α.; iii) baixa citotoxicidade in vivo; iv) baixa expressão de CD44 e de KLRG-1. Por fim, para definir a importância relativa do IFN-γ e da citotoxicidade na proteção contra a infecção pelo T. cruzi após a vacinação heteróloga, camundongos IFN-γ KO foram imunizados com pIgSPCl.9 seguido por AdASP- 2. Estes animais apresentaram um alto grau de citotoxicidade in vivo, mas nenhuma imunidade protetora detectável. Em resumo, ao longo deste trabalho obtiveram-se evidências que confirmam a hipótese inicial de que, utilizando diferentes formulações vacinais e/ou esquemas de vacinações, se poderia melhorar racionalmente a eficácia da vacinação contra a infecção experimental pelo T. cruzi. Pela utilização de depleções in vivo e de animais geneticamente deficientes, definiu-se a importância dos linfócitos T CD4 e CD8, da perforina e do IFN-γ na imunidade gerada pela vacinação com a ASP-2 de T. cruzi. Acredita-se que os dados obtidos no decorrer desta tese serviram para: i) uma melhor compreensão dos mecanismos imunológicos de resistência à infecção pelo T. cruzi e dos seus antígenos alvos; ii) o desenvolvimento de vacinas recombinantes contra infecções por protozoários intracelulares em geral e, especificamente, contra a doença de Chagas; iii) o desenvolvimento de vacinas recombinantes capazes de induzir uma potente resposta imune mediada por linfócitos T. / Genetic immunization with plasmidial DNA containing the gene encoding the amastigote surface protein 2 (ASP-2) protects part of the highly susceptible A/Sn mice against a lethal challenge with Trypanosoma cruzi. Based on these results, in this thesis, we tested the hypothesis that the efficacy of the vaccination against T. cruzi experimental infection could be rationally improved by the use of different vaccine formulations and/or vaccinations strategies. For that purpose, we employed homologous or heterologous priming and boosting strategies, with plasmidial DNA, recombinant proteins, and adenovirus expressing T. cruzi ASP-2. Initially, we tested whether boosting with a recombinant protein of ASP-2 could improve the efficacy of the priming vaccination with plasmidial DNA (pIgSPCl.9). This protocol was not more efficient, but opened the possibility that the immunization with the recombinant protein could be used as an alternative vaccine strategy. Using this approach, we described that the administration of 3 doses of a recombinant protein representing the amino acids 261-500 of ASP-2 in fusion o the gluthatione Stransferase (GST-P4P7), in the presence of the adjuvants alum and CpG ODN 1826, was capable of eliciting high levels of protective immunity. In this experimental model, protective immunity was: i) long-lasting; and ii) dependent on the effector CD8 T lymphocytes specific for the immunodominant epitope TEWETGQI. We also established that the adjuvant CpG ODN 1826 improved the efficacy of protective immunity, and that CD4 T lymphocytes were important for the induction of protective CD8 T cells. Because the vaccination strategy employing the recombinant protein GST-P4P7 required 3 doses, we tested the possibility that a recombinant adenovirus expressing ASP-2 (AdASP-2) could be used in a homologous or heterologous priming and boosting protocol with two doses only. By comparing homologous or heterologous priming and boosting with pIgSPCl.9 and AdASP- 2, we found that homologous or heterologous immunizations with AdASP-2 led to a high degree of protective immunity against T. cruzi infection, in highly susceptible A/Sn mice. Follow up studies using the heterologous priming and boosting strategy (pIgSPCl.9 followed by AdASP-2), which protects 80-100% of the mice, showed that protective immunity was long-lived and dependent on the activation of CD4 or CD8 T cells. Protective immunity correlated with antigenspecific in vivo cytotoxic activity prior to the challenge with T. cruzi. Based on this observation, we evaluated the protective immunity following the heterologous vaccination in mice genetically deficient for an important mediator of cytotoxicity, perforin. Vaccinated perforin knock-out (KO) mice were extremely susceptible to the experimental infection. The analyses of the immune response of these mice showed that their splenocytes produced less IFN-γ when re-stimulated in vitro with recombinant antigen. Analysis of specific CD8 T lymphocytes showed: i) a normal numeric expansion; ii) a significantly lower frequency of polyfunctional cells expressing simultaneously IFN-γ/CD107a or IFN-γ/TNF-α.; iii) lower in vivo cytotoxicity; iv) lower expression of CD44 and KLRG-1. Finally, to define the relative importance of IFN-γ and cytotoxic T lymphocytes in the protection against T. cruzi infection following heterologous vaccination, IFN-γ KO mice were immunized with pIgSPCl.9 followed by AdASP-2. These mice developed a high level of in vivo cytotoxicity, but no detectable protective immunity. In summary, during this work we gathered evidences that confirmed our initial hypothesis that we could rationally improve the efficacy of vaccination against T. cruzi experimental infection using different vaccine formulations and/or vaccination strategies. Using in vivo depletions and KO mice, we defined the importance of CD4 cells, CD8 cells, perforin and IFN-γ during immunity generated by vaccination with ASP-2 of T. cruzi. We believe that our findings will provide: i) a better understanding of the immunologic mechanisms and the target antigens during the resistance to T. cruzi infection; ii) to aid the development of recombinant vaccines against intra-cellular parasitic protozoan infections in general and Chagas’ disease, specifically; iii) to aid the development of recombinant vaccines capable of eliciting potent immune response mediated by T lymphocytes. / BV UNIFESP: Teses e dissertações