Regulatorische T-Zellen (Tregs) spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulation atopischer Erkrankungen. Die Voraussetzungen für eine allergische Reaktionslage werden schon während der intrauterinen Entwicklung geschaffen. Über den Einfluss der intrauterinen Umgebung auf die Tregs zur Geburt ist bisher wenig bekannt. In der vorliegenden Arbeit sollte in der prospektiven Geburtskohorten-Studie LINA (Einfluss von Lebensstil und Umweltfaktoren auf das Allergierisiko Neugeborener) geklärt werden, inwiefern der Immunstatus der werdenden Mutter, eine atopische Familienanamnese sowie Umweltexpositionen während der Schwangerschaft den Immunstatus der Neugeborenen beeinflussen. Ein besonderer Schwerpunkt wurde dabei auf Tregs gelegt. Weiterhin sollte die Relevanz der Tregs zur Geburt für das Allergierisiko im ersten Lebensjahr des Kindes analysiert werden. Die Messung der Anzahl und Funktionalität der Tregs im Blut der werdenden Mutter in der 34. Schwangerschaftswoche und im Nabelschnurblut erfolgte sowohl durchflusszytometrisch in einer Subkohorte (n=24 Mutter-Kind Paare), als auch durch eine methylspezifische qPCR in der gesamten Kohorte der LINA-Studie (n=346 Mutter-Kind Paare). Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten erstmals darauf hin, dass mütterliche Tregs möglicherweise einen regulatorischen Einfluss hinsichtlich der Programmierung des fötalen Immunsystems haben (Hinz et al., Clin Exp Allergy 2010). Die durchflusszytometrische Charakterisierung der Tregs der Mutter-Kind Paare zeigte beim Vergleich der Expression von CD4, CD25, CD127 und FOXP3, dass der Anteil der CD4+CD25high Tregs im Nabelschnurblut deutlich höher war, der Anteil FOXP3 positiver Zellen innerhalb der CD4+CD25high Tregs Population war zur Geburt jedoch signifikant geringer, verglichen mit den werdenden Müttern. Weiterhin war eine geringe Anzahl mütterlicher Tregs während der Schwangerschaft und eine erhöhte Produktion der TH2-Zytokine IL-4, IL-5 und IL-13 mit erhöhten Gesamt-IgE-Spiegeln im Nabelschnurblut verbunden (Hinz et al., 2010). Durch die Quantifizierung der Tregs auf Basis des TSDR-Methylierungsstatus` im FOXP3 Gen, einer spezifischen und zuverlässigen Methode zum Nachweis stabiler Tregs, konnte der Zusammenhang zwischen einer Vielzahl pränataler Faktoren, Tregs zur Geburt und dem Allergierisiko in der gesamten Geburtskohorte geklärt werden (Hinz et al., Allergy 2011). Das männliche Geschlecht des Kindes, die Atopie der Eltern, Rauchen und Desinfektionsmittel-Exposition während der Schwangerschaft sowie eine erhöhte mütterliche Produktion von IFN-γ, IL-13 und IL-17E war mit einer geringeren Treg-Anzahl im Nabelschnurblut assoziiert. Für Kinder mit einer geringeren Treg-Anzahl im Nabelschnurblut war das Risiko für eine atopische Dermatitis und einer Sensibilisierung gegen Nahrungsmittelallergene im ersten Lebensjahr signifikant höher (Hinz et al., 2011).:Bibliografische Beschreibung II Abkürzungsverzeichnis IV 1. Einleitung 1 1.1. Hintergrund der Untersuchungen 1 1.2. Historischer Hintergrund/Definition „Allergie“ 1 1.3. T-Zellpopulationen mit Relevanz für die Entwicklung allergischer Erkrankungen 2 1.4. Regulatorische T-Zellen 5 1.5. Bedeutung des Immunstatus zur Geburt - prädiktive Marker für die Allergieentstehung 8 1.6. Ursachen der frühkindlichen Allergieentstehung – genetische Prädisposition und pränatale Umgebung 10 1.7. Die LINA-Studie 13 2. Zielstellung 15 3. Originaldateien 16 4. Diskussion 34 4.1. Unterschiede im Phänotyp und der Funktion der Tregs in der Schwangerschaft und zur Geburt 36 4.2. Zusammenhang zwischen dem Immunstatus der werdenden Mutter und dem des Kindes zur Geburt 37 4.3. Geschlechtsspezifische Unterschiede in der Anzahl der Tregs zur Geburt 41 4.4. Zusammenhänge zwischen der familiären Prädisposition und der Anzahl der Tregs im Nabelschnurblut 42 4.5. Zusammenhänge zwischen Umweltfaktoren während der Schwangerschaft und der Anzahl der Tregs im Nabelschnurblut 44 4.6. Zusammenhang zwischen der Anzahl der Tregs zur Geburt, Sensibilisierung und allergischen Erkrankungen im ersten Lebensjahr des Kindes 46 4.7. Stärken und Schwächen der Untersuchungen 47 5. Zusammenfassung 49 6. Literaturverzeichnis 52 Anlage – Supplemental Materials 66 Hinz et al., Clin Exp Allergy 2010 66 Hinz et al., Allergy 2011

Ein wichtiges Merkmal der normalen Schwangerschaft ist die Toleranz des mütterlichen Immunsystems gegenüber den fremden fetalen Antigenen. Regulatorische T-Zellen (Treg-Zellen) steigen während der frühen Schwangerschaft an und leisten einen entscheidenden Beitrag zur fetalen Toleranz. Allerdings sind die genauen Mechanismen ihres Anstieges und ihrer Wirkungsweise noch weitgehend ungeklärt. Erste Untersuchungen zeigten, dass die Anzahl an Treg-Zellen in der empfänglichen Phase des Estruszyklus in der Maus am höchsten war. Es kann vermutet werden, dass die erhöhte Anzahl an Treg-Zellen zum Zeitpunkt der Insemination eine frühe Erkennung von väterlichen Antigenen begünstigt und somit zur Vorbereitung des mütterlichen Immunsystems auf die Implantation des Embryos beiträgt. Weiterhin konnte nachgewiesen werden, dass Alloantigene im Ejakulat den frühen Anstieg der Treg-Zellen in der Schwangerschaft bedingen und dass das in der Samenblasenflüssigkeit enthaltene Zytokin TGF-beta die Expansion der Treg-Zellen unterstützt. Diese Ergebnisse befürworten eine Alloantigen-vermittelte Expansion der Treg-Zellen während der frühen Schwangerschaft, die darüber hinaus durch TGF-beta begünstigt wird. Im Rahmen dieser Arbeit konnte ebenfalls belegt werden, dass das Schwangerschaftshormon hCG einen entscheidenden Einfluss auf die Treg-Zellen im Verlauf der Schwangerschaft ausübt. Untersuchungen unter Verwendung von menschlichem Probenmaterial konnten deutlich zeigen, dass hCG die Migration von Treg-Zellen zu Trophoblasten vermittelt und zur Konvertierung von konventionellen T-Zellen in Treg-Zellen beiträgt. Darüber hinaus konnten Versuche im Mausabortmodell zeigen, dass die Applikation von hCG die Expansion und Funktion der Treg-Zellen entscheidend beeinflusst, wodurch das Auftreten von Aborten in Abortweibchen verhindert werden konnte. HCG vermittelt demnach die Generierung, Migration und Funktion der Treg-Zellen und trägt entscheidend zum erfolgreichen Verlauf der Schwangerschaft bei. / Normal pregnancy is characterized by the generation of maternal immune tolerance towards the foreign fetal antigens. Regulatory T cells (Treg cells) have been shown to increase in number during early pregnancy stages and to be essential for the establishment of fetal tolerance. However, the mechanisms and factors supporting their increase and function are not well defined. First investigations showed that Treg cells accumulated in the sexually receptive phase of the murine estrous cycle. Thus, it can be assumed that the accumulation of Treg cells around the time of insemination favours early recognition of paternal antigens and thereby prepares the maternal immune system for the implantation of the blastocyst into the maternal endometrium. Experiments investigating the increase of Treg cells during early pregnancy suggest that alloantigens present in the ejaculate mediated early Treg cell augmentation. Moreover TGF-beta, which represents a major component in the seminal fluid, provoked the proliferation of Treg cells. These results suggest that the early expansion of Treg cells is alloantigen-mediated and that seminal fluid-derived TGF-beta is involved in this expansion. Additionally it has been shown that the pregnancy hormone human Chorionic Gonadotropin (hCG) has an important impact on Treg cells during pregnancy. By using human samples it has been proven that hCG mediates the migration of Treg cells to trophoblast cells and supports the conversion of naïve T cells into Treg cells directly at the fetal-maternal interface. In mice, the application of hCG resulted in an increase in the number and function of Treg cells and thereby prevented abortion in a mouse abortion-prone model. Thus, hCG mediates the generation, migration and function of Treg cells and contributes to a successful pregnancy outcome.

Während der letzten 10 Jahre, wurden viele neue immunsuppremierende Medikamente für die Verbesserung des Kurzzeit-Transplantationsergebnisses entwickelt (Halbwertzeit bzw. Abstoßung einer Niere nach ca. 10-12 Jahren). Das heutige therapeutische Ziel besteht auf der einen Seite aus der Minimierung der Kosten bzw. der Minimierung der Nebenwirkungen verursacht durch die Immunsuppressiva und auf der anderen Seite der Verbesserung des Langzeit-Überleben eines Transplantates. Um eine dosis-abhängige Zerstörung des Transplantates durch die Immunsuppressiva zu vermeiden, bedarf es der spezifischen Entwicklung von zusätzlichen Toleranzprotokollen. Ein Top-Kandidat für die Toleranzinduktion in Transplantationen stellen die CD4+CD25high regulatorischen T Zellen dar. Da humane regulatorische T Zellen jedoch nur 1-2 % der peripheren CD4+ T Zellen repräsentieren, ist es nicht möglich ausreichende Zellmengen auf zu reinigen. Dazu ist die Etablierung adäquater Protokolle für die Isolation und ex vivo Expansion von CD4+CD25high Treg’s notwendig. In unserem System ist es uns möglich die CD4+CD25high zellen mit einer sehr hohen Reinheit zu isolieren ( ca. 80% CD4+CD25highFoxp3+). Danach werden die isolierten Treg’s mit verschiedenen Protokollen, wie der Expansion mit CD2-,CD3- und CD28 Expansionbeads oder allogenen Feederzellen, expandiert. Das suppressive Potential der expandierten CD4+CD25+ Treg’s wurde in drei funktionellen Assays, einem CFSE-basierenden Proliferationsassay, einem Cytokin-Bead-Array und einem Elispot bestimmt. Basierend auf den genannten Methoden wurde das Proliferationspotential allogen stimulierter Responder T Zellen, die IFNg Produktion und das Th1/TH2 Cytokinprofil in einer gemischten Lymphozytenreaktion mit unterschiedlichen Mengen der expandierten Treg’s untersucht Ein weiterer Aspekt dieses Projektes ist die Expansion isolierter regulatorischer T Zellen mit zusätzlichem Rapamycin. Das immunsuppremierende Medikament Rapamycin blockiert die Il2-abhängige T Zellproliferation durch die Inhibition von mTOR und induziert die Expansion regulatorischer T Zellen. / During the last decade, a broad set of immunosuppressive drugs has been developed which improve short-term transplant results (1yr survival, acute graft rejection), but not long-term results (graft half life, e.g. kidney rejection after approx. 10-12 years). In this regard, the therapeutic aim is to minimise costs and long-term side effects caused by immunosuppressive drugs on the one hand, and on the other to considerably improve the long term survival of transplanted patients. To avoid dose-dependent damage of the transplant by immunosuppressive drugs, a specific development of additional tolerance protocols is mandatory. One top candidate for the tolerance induction in transplantation is the population of CD4+CD25high regulatory T cells (Treg’s). Because Tregs constitute 1-2% of peripheral CD4+ T cells in human, it may not be possible to purify sufficient cells ex vivo. Therefore it is necessary to establish appropriate protocols for isolation and expansion of CD4+CD25high Treg’s. In our system we are able to isolate CD4+CD25high cells with a very high purity (approx. 80% CD4+CD25highFoxp3+). Afterwards we expand the isolated Treg’s by different expansion protocolls such as expansion with CD3-, CD2- and CD28-expansionsbeads as well as allogeneic feedercells. The suppressive potential of the expanded CD4+CD25+ Treg’s was determined by three different functional assays, a CFSE-based proliferationassay, a Cytokine-Bead-Array, and an IFNGamma-Elispot. Based on mentioned methods, the proliferative potential of allogenic stimulated responder T cells, IFNGamma production and Th1/Th2 cytokine profile, as well as the IFNGamma producing T-cells in a mixed lymphocyte reaction with different amounts of the expanded regulatory T cells were tested. Another aspect of our project is the expansion of the isolated regulatory T cells with additional rapamycin. The immunosuppressive drug rapamycin is a powerful pharmacological agent which blocks IL2-dependent T cell proliferation by accumulation with mTOR and induces expansion of regulatory T cells.

Eine mangelhafte Produktion des Zytokins Interleukin-2 (IL-2), sowie Veränderungen in der Population der CD4+Foxp3+ regulatorischen T Zellen (Treg) wurden im Zusammenhang mit der Autoimmunkrankheit Systemischer Lupus erythematodes (SLE) beschrieben. Jedoch wurde ein möglicher kausaler Zusammenhang zwischen diesen beiden Auffälligkeiten und der Pathogenese des SLE bis jetzt nicht aufschlussreich untersucht. Durchflusszytometrische Analysen zeigten hier, dass der Anteil an Treg mit hoher Expression der IL-2 Rezeptoruntereinheit CD25, die mit funktioneller und metabolischer Treg Aktivität assoziiert wurde, in SLE Patienten erniedrigt ist. Außerdem ist das homöostatische Gleichgewicht zwischen Treg und konventionellen T Zellen gestört. In vitro Experimente zeigten, dass eine defekte IL-2 Produktion der CD4+ T Zellen für die niedrige CD25 Expression der Treg von SLE Patienten verantwortlich ist, wohingegen Stimulation mit IL-2 in vitro die CD25 Expression der Treg wiederherstellt und auch das Überleben der Treg erhöht. Vor allem niedrige IL-2 Konzentrationen hatten einen selektiven Effekt auf die Treg Population, während andere Lymphozyten nur wenig beeinflusst wurden. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde eine klinische Studie mit niedrig dosiertem IL-2 zur Behandlung von Patienten mit refraktärem SLE implementiert. Niedrig dosiertes IL-2 führte zu einer peripheren Expansion suppressiver Treg mit stark erhöhter CD25 Expression und verbesserte das homöostatische Gleichgewicht zwischen Treg und konventionellen T Zellen. Diese Effekte wurden von einer klinischen Remission in drei der fünf mit IL-2 behandelten SLE Patienten begleitet. Zusammenfassend machen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit die Bedeutung des IL-2 Defizits für die Veränderungen in der Treg Population und die Pathogenese des SLE deutlich, und zeigen, dass niedrig dosiertes IL-2 einen sicheren und effizienten neuen Therapieansatz darstellt, der direkt in die Pathogenese des SLE eingreift. / A defective production of the cytokine Interleukin-2 (IL-2), as well as abnormalities in the population of CD4+Foxp3+ regulatory T cells (Treg), have been described in association with the autoimmune disease systemic lupus erythematosus (SLE). However, a possible causal relationship between these two features and SLE pathogenesis has not been adequately investigated so far. Here, flow-cytometric analyses showed that the proportion of Treg expressing high levels of the IL-2 receptor subunit CD25, which was associated with functional and metabolic Treg activity, is reduced in SLE patients. In addition, the homeostatic balance between Treg and conventional T cells is disturbed in SLE. In vitro experiments showed that a defective IL-2 production by CD4+ T cells accounts for the low CD25 expression in Treg from SLE patients. In contrast, in vitro stimulation with IL-2 restores CD25 expression in Treg and enhances their survival. Especially low IL-2 concentrations had a selective effect on the Treg population, while other lymphocytes were only marginally affected. Based on these results, a clinical trial with low-dose IL-2 was implemented for the treatment of patients with refractory SLE. Low-dose IL-2 treatment of SLE patients caused a selective peripheral expansion of suppressive Treg with strongly increased CD25 expression levels, and improved the homeostatic balance between Treg and conventional T cells. These effects were accompanied by clinical remission in three of the five SLE patients that were treated with low-dose IL-2 during the course of this study. In summary, this work demonstrates the impact of IL-2 deficiency for the Treg abnormalities and disease pathogenesis in SLE, and it proposes low-dose IL-2 as a safe and efficient novel therapeutic approach, which directly targets SLE pathogenesis.

Bei der Aufrechterhaltung des homeostatischen Gleichgewichts und der peripheren Selbst-Toleranz spielen CD4+CD25+ regulatorische T-Zellen (Tregs) eine wichtige Rolle. In Vorarbeiten wurden Subpopulationen von murinen CD4+ Tregs identifiziert, die sich durch die Expression des Integrins alphaE auszeichnen. Diese alphaE+ Treg Subpopulationen weisen einen Effektor/Memory-ähnlichen Phänotyp auf. In der vorliegenden Dissertation wurde untersucht, welche Bedingungen zur Entwicklung von alphaE+ Effektor/Memory Tregs in vivo führen und aus welchen Vorläuferzellen sie entstehen. Dabei zeigte sich, dass es sich bei den alphaE+ Tregs um Effektor/Memory T-Zellen handelt, die unter physiologischen Bedingungen in vivo ein hohes Maß an Zellteilung aufweisen, welche zum Teil abhängig von der bakteriellen Besiedelung des Darms ist. Darüber hinaus wurde beobachtet, dass alphaE+ Tregs nach oraler, antigen-spezifischer Aktivierung in den darm-assozierten lymphoiden Geweben sowohl aus konventionellen naiven CD4+ T-Zellen, als auch aus thymus-generierten naiven CD4+CD25+ Tregs entstehen können. Zusammenfassend deuten die erzielten Ergebnisse darauf hin, dass das spezifische mukosale Mikroenvironment sowohl die Expansion als auch Konvertierung von Tregs fördert und so eine wichtige Rolle für die Aufrechterhaltung der Homeostase von alphaE+Foxp3+ Tregs spielt. Zudem wurde in dieser Arbeit die Ausbildung von gewebespezifischen Homingrezeptor-Phänotypen von naiven CD4+CD25+ Tregs untersucht. In in vitro Kultur-Systemen zeigte sich, dass selektive Modulation von Tregs, ähnlich wie bei konventionellen T-Zellen, die Induktion von organspezifischen Migrationseigenschaften ermöglicht. So konnte eine effiziente Wanderung von Tregs in den Darm ausgelöst werden. Diese Daten legen den Schluss nahe, dass die Herstellung von Tregs mit spezifischen Wanderungseigenschaften eine Option für therapeutische Anwendungen in der adoptiven T-Zell Therapie sein könnte. / Regulatory CD4+CD25+ T cells (Tregs) play an important role in immune homeostasis and in the maintenance of self-tolerance. Previously, subsets of murine CD4+ Tregs characterised by expression of the integrin alphaE had been identified. These alphaE+ Treg subsets display an effector/memory-like phenotype. In the present study the circumstances favouring in vivo generation of effector/memory-like alphaE+ Tregs were analysed. The results presented here show that alphaE+ effector/memory-like Treg subsets contain a large fraction of cycling cells under physiologic conditions in healthy mice. This in vivo proliferation depended, at least in part, on intestinal commensal microflora. Furthermore, it was observed that alphaE+ Tregs not only developed by differentiation of naive-like CD4+CD25+ Tregs, but were also generated de novo from naive CD4+ T cells in the gut-associated lymphoid tissue upon oral antigen delivery. Taken together, these results indicate that the mucosal microenvironment favours both expansion and conversion of Tregs and thereby represents an important mechanism for the homeostatic maintenance of alphaE+Foxp3+ Tregs. In addition, susceptibility of naive CD4+CD25+ Tregs to acquire tissue-specific homing receptor phenotypes was investigated. In vitro culture systems demonstrated that Tregs, similarly to conventional T cells, could be configured with organ-selective homing properties allowing efficient targeting into the gut. These results suggest that generation of Tregs with specific homing properties for therapeutic purposes in adoptive T cell therapy might be a feasible option.

In dieser Arbeit werden zwei intrazelluläre Signalwege, betreffend den Tumorsuppressor p53 und das Signalmolekül Ca2+ , diskutiert und modelliert. Einzelzellmessungen des Tumorsuppressors p53 zeigen pulsatile Antwor- ten nach Zufügung von DNA Doppelstrangbrüchen (DSBs). Außer für sehr hohe Schadensdosen, ist das zeitliche auftreten dieser Pulse unregelmäßig. Mithilfe eines Wavelet basierten Pulsdetektors werden die einzelzell Trajek- torien untersucht und die inter-Puls Intervall (IPI) Verteilungen extrahiert. Diese weisen auf nicht-oszillatorische Regime in den Daten hin. Die Theorie der anregbaren Systeme angewendet auf regulatorische Netzwerke ermöglicht dieses komplexe Verhalten mathematisch zu beschreiben. Die Kopplung von Schadens-Sensor-Kinase Dynamik mit dem kanonischen p53 negativen feedback loop, ergibt ein anregbares p53 Modell. Detaillier- te Bifurkationsanalysen zeigen ein robustes anregbares Regime, welches durch ein starkes Schadenssignal auch in Oszillationen überführt werden kann. Treibt man das p53 Modell mit einem stochastischen DNA-Schadens-Prozess, kann sowohl das oszillatorische Verhalten nach hohem Schaden, als auch das unregelmäßige pulsatile Verhalten ohne äußere Stimulation reproduziert werden. Intrazelluläre Ca 2+ Spikes entstehen durch eine hierarchische Kaskade stochastischer prozesse. Die Anwendung einer semi-markovschen Beschreibung führt zu praktischen analytischen Lösungen des erstpassagezeiten Problems. Eine hierbei entdeckte Zeitskalenseparation ermöglicht ein neues allgemeines Ca2+ -Modell. Dieses erklärt auf äußerst prägnante Weise viele wesentliche experimentelle Ergebnisse, insbesondere die Momentenbeziehungen der inter-Spike Intervall Verteilungen. Schließlich erlaubt die hier vorgestellte Theorie Berechnungen der Stimulus-Enkodierung, also die Adaption des Ca 2+ Signals auf veränderliche extrazelluläre Stimuli. Die Vorhersage einer fold change Enkodierung kann durch Experimente gestützt werden. / In this work two signaling pathways, involving the tumor suppressor p53 and the second messenger Ca2+ , are to be discussed and modelled. The tumor suppressor p53 shows a pulsatile response in single cells after induction of DNA double strand breaks (DSBs). Except for very high amounts of damage, these pulses appear at irregular times. The concept of excitable systems is employed as a convenient way to model such observed dynamics. An application to biomolecular reaction networks shows the need for a positive feedback within the p53 regulatory network. Exploiting the reported ultrasensitive dynamics of the upstream damage sensor kinases, leads to a simplified excitable kinase-phosphatase model. Coupling that to the canonical negative feedback p53 regulatory loop, is the core idea behind the construction of the excitable p53 model. A detailed bifurcation analysis of the model establishes a robust excitable regime, which can be switched to oscillatory dynamics via a strong DNA damage signal. Driving the p53 model with a stochastic DSB process yields pulsatile dynamics which reflect different experimental scenarios. Intracellular Ca 2+ concentration spikes arise from a hierarchic cascade of stochastic events. An analytical solution strategy, employing a semi-Markovian description and involving Laplace transformations, is devised and successfully applied to a specific Ca2+ model. The new gained insights are then used, to construct a new generic Ca2+ model, which elegantly captures many known features of Ca2+ signaling. In particular the experimentally observed relations between the average and the standard deviation of the inter spike intervals (ISIs) can be explained in a concise way. Finally, the theoretical considerations allow to calculate the stimulus encoding relation, which governs the adaption of the Ca 2+ signals to varying extracellular stimuli. This is predicted to be a fold change response and new experimental results display a strong support of this idea.

In den letzten zwei Jahrzehnten wurden T-Lymphozyten verstärkt als Zielzellen für genetische Modifikationen eingesetzt, mit der Absicht vererbbare oder erworbene Krankheiten zu behandeln. Vor kurzem konnte unsere Arbeitsgruppe zeigen, dass alloantigen-spezifische, genmodifizierte T-Lymphozyten ein enormes Potential besitzen, als Transport- Systeme für therapeutische Gene in allogene Transplantate zu dienen. Diese T-Lymphozyten migrieren und akkumulieren spezifisch in das allogene Transplantat, in welchem es zu einer lokalen und starken T-Zell aktivierungsabhängigen Expression des Transgens kommt. In der vorliegenden Arbeit wurde das Potential von viralem IL-10 als therapeutisches Transgen untersucht. Dazu wurde zunächst in der gemischten Lymphozyten-Kultur (MLR) eine Lewis T-Zelllinie spezifisch für Ratten-DA Alloantigene generiert. Während der MLR wurden die Lymphozyten retroviral transduziert, so dass sie vIL-10 stabil exprimieren. Der Zytokin-Level der TvIL-10-Lymphozyten liegt 48h nach der T-Zellaktivierung zwischen 1-2ng/m. Die vIL-10 transgenen T-Lymphozyten zeigen einen CD4+CD25+ Phänotyp und sezernieren neben vIL-10 auch Ratten IL-10 und IFN-g aber kein IL-4, ähnlich wie T-regulatorische Zellen Typ 1 (Treg1). Zunächst wurden die vIL-10 transgenen T-Lymphozyten hinsichtlich ihres Potentials untersucht, die alloantigen-spezifische Immunantwort in vitro zu modulieren. Dazu wurden 5% vIL-10 transgener T-Lymphozyten zu einer MLR hinzugegeben. Zuvor wurden die naiven Lewis T-Lymphozyten mit einem Membranfarbstoff markiert, um die Proliferation und die Zytokin-Expression dieser Zellen zu untersuchen. Im Vergleich zu Kontroll-MLRs ohne transgene oder mit EGFP-transgenen Lymphozyten konnte eine signifikante Inhibierung der Proliferation als auch der INF-g Expression von naiven T-Lymphozyten detektiert werden. Trotz dieses großen Potentials in vitro, führte der adoptive Transfer der vIL-10 transgenen Zellen allein oder in Kombination mit Cyclosporin (0,5mg/kg/Tag) nicht zu einer Verlängerung der Transplantatüberlebenszeit im allogenen Herztransplantationsmodell. Diese Daten zeigen, dass die Überexpression von vIL-10 im Transplantat eines starken Abstoßungsmodells nicht zur Verlängerung der Transplantatüberlebenszeit führt. Außerdem kann das in vitro gezeigte regulatorische Potential dieser T-Zellen nicht zwangsläufig auf ihr in vivo Potential übertragen werden. / During last two decades T lymphocytes have become key targets for genetic modification in order to treat inherited or acquired human diseases. Recently, we demonstrated the capacity of allospecific gene-engineered T lymphocytes as a transport shuttle for therapeutic transgenes into allografts. These lymphocytes migrate and accumulate specifically in allografts where alloantigen-driven T cell activation strongly enhances local expression of the gene of interest. In this study, the influence of viral IL-10 as a therapeutic transgene was addressed. Lewis T cell lines specific for DA rat alloantigens were generated in a modified mixed lymphocyte reaction protocol (MLR). During MLR, lymphocytes were genetically modified to express vIL-10 using a retroviral gene expression system. The cytokine level in the supernatant of TvIL-10-lymphocytes varied between 1-2 ng/ml 48h after T-cell activation. Like T regulatory 1 (Treg1) cells, vIL-10 transgenic T lymphocytes express the phenotype CD4+25+ and secrete, in addition to vIL-10, rat IL-10 and IFN-g but no IL-4. First we evaluated the potential of vIL-10 transgenic T cell lines to modulate alloantigen-specific immune responses in vitro. Small numbers of TvIL-10-lymphocytes were added to MLR (less than 5%). Naive cells were stained with membrane dyes to trace proliferation and to analyze cytokine expression. In comparison to control MLR with no transgenic cells or equal numbers of TEGFP-lymphocytes, the proliferation as well as the production of IFN-g of naive responder cells were significantly diminished. Despite this regulatory capacity in vitro, the vIL-10 transgenic T lymphocytes were not able, either alone or in combination with suboptimal cyclosporine (0,5mg/kg/day), to prolong the survival of DA rat cardiac allografts in LEW recipients. These data demonstrate that intragraft IL-10 overexpression is not sufficient to prolong allograft survival in a high-responder strain combination and that the regulatory capacity of T cells in vitro does not predict their in vivo efficiency.

Cis-regulatorische Elemente wie Promotoren und Enhancer, die die Regulation der Transkription von Genen steuern, befinden sich in Regionen des dekondensierten Chromatins. DNase-seq und ATAC-seq sind weit verbreitete Verfahren, um solche offenen Chromatinregionen genomweit zu untersuchen. Die einzel-Nukleotid-Auflösung von DNase-seq wurde des Weiteren genutzt, um Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen (TFBS) in regulatorischen Regionen durch TF-Footprinting zu bestimmen. Kürzlich durchgeführte Studien haben jedoch gezeigt, dass DNase I einen Sequenzbias aufweist, welcher nachteilige Auswirkungen auf die Footprinting-Effizienz hat. Auch wurden das Footprinting und die Auswirkungen des Sequenzbias auf ATAC-seq noch nicht umfassend untersucht. In dieser Arbeit nehme ich einen systematischen Vergleich der beiden Methoden vor und zeige, dass die beiden Methoden unterschiedliche Sequenzbiases haben und korrigiere diese protokollspezifischen Biases beim Footprinting. Der Einfluss von Bias-Korrekturen der Footprinting Ergebnisse ist für DNase-seq größer als für ATAC-seq, und Footprinting mit DNase-seq führt zu besseren Ergebnissen in unserer Datensätze. Trotz dieser Unterschiede zeige ich, dass die Integration replizierter Experimente die Ableitung von qualitativ hochwertigen Footprints ermöglicht, wobei die beiden Techniken weitgehend übereinstimmen. Diese Techniken werden ferner eingesetzt, um die cis-regulatorischen Elemente zu charakterisieren, die die Embryogenese der Fruchtfliege Drosophila melanogaster bestimmen. Durch die Verwendung von Embryonen die sich im richtigen Entwicklungsstadium befinden, sowie gewebespezifischer Kernsortierung mit offenem Chromatin-Profiling können zeitlich und gewebespezifisch aufgelöste vermeintliche cis-regulatorische Elemente definiert werden. Zusammengenommen demonstrieren diese Analysen die Fähigkeit der offenen Chromatin-Profilierung und der Computeranalyse zur Aufklärung der Mechanismen der Genregulation. / Cis-regulatory elements such as promoters and enhancers, that govern transcriptional gene regulation, reside in regions of open chromatin. DNase-seq and ATAC-seq are broadly used methods to assay open chromatin regions genome-wide. The single nucleotide resolution of DNase-seq has been further exploited to infer transcription factor binding sites (TFBS) in regulatory regions through TF footprinting. However, recent studies have demonstrated the sequence bias of DNase I and its adverse effects on footprinting efficiency. Furthermore, footprinting and the impact of sequence bias have not been extensively studied for ATAC-seq. In this thesis, I undertake a systematic comparison of the two methods and demonstrate that the two methods have distinct sequence biases and correct for these protocol-specific biases when performing footprinting. The impact of bias correction on footprinting performance is greater for DNase-seq than for ATAC-seq, and footprinting with DNase-seq leads to better performance in our datasets. Despite these differences, I show that integrating replicate experiments allows the inference of high-quality footprints, with substantial agreement between the two techniques. These techniques are further employed to characterize the cis-regulatory elements governing the embryogenesis of a complex organism, the fruit fly Drosophila melanogaster. Combining tight staging of embryos and tissue-specific nuclear sorting with open chromatin profiling, enables the definition of temporally and tissue-specifically resolved putative cis-regulatory elements. Taken together, these analyses demonstrate the power of open chromatin profiling and computational analysis in elucidating the mechanisms of transcriptional gene regulation.

Knochengewebe besitzt die einzigartige Fähigkeit sich nach einem Bruch komplett zu regenerieren. Dennoch zeigen 10-15% der Patienten einen gestörten Heilungsverlauf. Das Immunsystem spielt eine entscheidende Rolle in der Frakturheilung. Im Rahmen der hier präsentierten Doktorarbeit wurde der Einfluss der CD4+ regulatorischen T-Zellen (Treg) auf die Knochenheilung untersucht. In einem Maus-Osteotomie-Modell wurde die zeitliche und räumliche Verteilung ausgewählter Immun- und Knochenzellen im osteotomierten Knochen untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass Immunzellen im gesamten Heilungsverlauf in der Frakturzone zu finden waren und oft eine direkte Kolokalisation mit den Knochenzellen aufwiesen. Diese Ergebnisse zeigen deutlich die starke Interaktion beider Systeme. Ein adaptiver Transfer muriner Treg vor Setzen der Osteotomie diente als immunmodulatorischer Ansatz zur Verbesserung des Frakturheilungsprozesses. Tiere mit einem unerfahrenen Immunsystem (SPF-Haltung) zeigten eine verbesserte Heilung nach Treg-Transfer. Mäuse mit einem erfahrenen Immunsystem (semi-sterile Haltung) zeigten einen kontroversen Heilungserfolg: eine Hälfte der Mäuse heilte signifikant besser und die andere Hälfte signifikant schlechter. Die Schlechtheiler zeigten eine höhere Ratio von CD8+ Effektoren zu Treg im Vergleich zu den Gutheilern. In einer darauffolgenden Proof-of-concept-Studie konnte gezeigt werden, dass eine prä-OP definierte Ratio von CD8+ Effektoren zu Treg mit dem Heilungserfolg nach Osteotomie korrelierte. Im Rahmen dieser Doktorarbeit konnte ein potentiell positiver Einfluss von CD4+ Treg auf den Frakturheilungsprozess bestätigt werden. Dennoch wurde auch der enorme Einfluss des prä-OP Immunstatus auf den Heilungserfolg deutlich. Für die Klinik ist es also im Rahmen einer Immuntherapie umso wichtiger Patienten-basierte Therapieformen zu entwickeln, bei denen der individuelle Immunstatus eines jeden Patienten vor Anwendung der Therapie berücksichtigt wird. / Bone tissue possesses the remarkable capacity to fully regenerate after injury. However, in 10-15% of patients, unsuccessful bone repair is still a present problem. Components of the adaptive immune system play an indispensable role in bone regeneration. The here presented PhD thesis focused on the interaction of CD4+ regulatory T cells (Treg) during fracture healing. In a murine osteotomy model, the spatiotemporal distribution of immune and bone cells was analyzed within the healing bone. Cells of the immune system were detectable throughout the whole healing cascade in the injured area und showed often a direct co-localization with bone cells. These results highlight the interconnectivity of immune and bone cells during regeneration. By adoptive transfer of murine CD4+ Treg prior to osteotomy, an immunomodulatory approach to improve bone healing was conducted. Mice possessing an unexperienced immune system (SPF housing) showed a consistent improved healing outcome after adoptive Treg transfer. However, mice with a more experienced immune system (semi-sterile housing) receiving an adoptive Treg transfer demonstrated a controversial healing outcome: half of the mice showed a significantly improved and the other half a significantly poorer healing outcome. In the mice with a poorer healing outcome, a higher ratio of CD8+ effector T cells and Treg was observed. In a following proof of concept study, a pre-osteotomy defined ratio of CD8+ effector T cells and Treg could predict the healing outcome after adoptive Treg transfer and osteotomy. A potential positive impact of Treg in bone repair was confirmed in this study. However, the tremendous impact of the environment and thereby of the immune status prior to immunomo-dulation was also clearly demonstrated. Hence, for the clinic, it is even more important to develop and to apply patient based immunomodulatory treatment approaches considering the individual immune status of each patient prior to treatment.

Die Mehrzahl der im Thymus generierten CD4+CD25high regulatorischen T-Zellen (Treg) besitzt hohe Affinität gegenüber körpereigenen Antigenen. Es ist bekannt, dass T-Zell Rezeptoren (TCR) auf Treg Zellen in der Peripherie zusätzlich auch fremde Antigene verschiedener Pathogene wie Parasiten, Bakterien und Viren erkennen. Wenig ist bekannt über das klonale T-Zell Rezeptor Repertoire dieser Treg Populationen und ihre Beziehung zu CD4+CD25low effektor T-Zellen (Teff) im Menschen. In dieser Studie analysieren wir humane TCR auf expandierten Treg and Teff Zellen mit definierter Antigen Spezifität für Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Klasse II restringierte „fremde“ Epitope des Cytomegalovirus (CMV). Bemerkenswerterweise fanden wir, dass der gleiche TCR Vb-CDR3 Klon in beiden funktionell unterschiedlichen Subpopulationen in vitro dominant expandiert ist. Im Unterschied zu ihren klonal-identischen Teff Gegenspielern, exprimieren die suppressiven Treg Zellen kaum CD127 und IL-2, aber hohe Mengen an IFNg und IL-10. Zusammen mit der signifikant erhöhten FOXP3 Expression, trotz unvollständiger foxp3-DNA Demethylierung, lassen sich die CMV-spezifischen CD4+CD25high Treg Zellen einem induzierten Treg (iTreg) Phänotyp zuordnen mit Ähnlichkeit zum beschriebenen Tr-1 Phänotyp. Darüber hinaus konnten wir die klonale TCR Identität auch in frisch isolierten CD4+CD25low und CD4+CD25high Subpopulationen bestätigen, was die Entstehung von CMV-spezifischen Treg Zellen bereits in vivo nahe legt. Periphere CD25high Treg Zellen supprimieren die anti-virale Immunantwort in Patienten mit häufigen CMV-Reaktivierungen, was auf ihre Bildung als Reaktion chronischer Antigenexposition interpretiert werden kann. Unsere Ergebnisse beweisen erstmals direkt, dass aus dem gleichen humanen T-Zell Klon Teff und Treg Zellen mit identischer Spezifität entstehen können und lassen vermuten, dass die Treg Induktion in der Peripherie durch häufige Antigenexposition vorangetrieben wird. / The majority of thymically arised regulatory CD4+CD25high T cells (Treg) show high affinity to self-antigens. It has been proposed that T-cell receptors (TCR) on Treg cells in the periphery also recognize foreign-antigens from pathogens, such as bacteria and viruses. Studies in mice have shown that peripheral Treg cells can be generated not only from naïve T cells but also from effector T cells (Teff). However, in humans the clonal TCR-repertoire of these Treg populations and their relation to effector CD4+CD25low Teff is not sufficiently known up to date. Here, we analyzed human TCRs derived from expanded Treg and Teff cells with defined specificity to MHC class-II restricted “foreign” epitopes of Cytomegalovirus (CMV). Remarkably, we found that both functionally distinct subsets share the same dominant TCR-CDR3 clones in vitro. In contrast to their Teff counterparts, the Treg cells express low CD127 and IL-2, but high IL-10 upon antigen stimulation. Therefore, together with increased FOXP3 expression, but incomplete foxp3 DNA-demethylation, human CMV-antigen specific Treg cells exhibit an induced phenotype (iTreg) in vitro with similarity to recently described Tr-1 phenotype. Moreover, the clonal identity was confirmed in freshly isolated CD4+CD25low and CD4+CD25high subsets, suggesting their generation occurred already in vivo. Peripheral CD25high Treg cells suppress the anti-viral immune response in patients with frequent CMV-reactivations, implying their development as reaction on chronic antigen-exposure. Our results demonstrate directly for the first time, that the same human T-cell clone can possess the phenotype of Teff and Treg cells with specificity to identical foreign epitopes and suggest that Treg-induction in the periphery is supported by frequent antigen-exposure.