In einem komplexen tierexperimentellen Ansatz wurde das Potenzial der anti huCD4-Antikörper MAX16H5 und MAX12F6 zur Modulierung zellvermittelter Immun-reaktionen in vivo untersucht. Dafür kam ein mehrfach transgenes Mausmodell zur Anwendung, in dem das humane Zielmolekül und dessen physiologischer Ligand als Transgene exprimiert waren. Als T-Zell vermittelte Immunreaktion wurde eine Kon-taktreaktion (delayed type hypersensitivity, DTH) gegen DNFB etabliert und validiert. An der DTH wurde untersucht, ob und wie die verschiedenen Antikörper die Sen-sibilisierungs- und die Auslösungsphase beeinflussen. Die experimentellen Ergeb-nisse zeigen, dass die Antikörper epitop- und isotypabhängig die beiden Phasen der DTH unterschiedlich beeinflussen. Die Applikation der Antikörper während der Sensi-bilisierung führte zu einer unterschiedlich ausgeprägten Suppression der DTH. Dage-gen hatten sie gegensätzliche Effekte auf die Auslösung. Während nach MAX12F6-Behandlung eine stärkere und prolongierte DTH gemessen wurde, verlief die DTH-Reaktion nach MAX16H5-Applikation deutlich abgeschwächt. Mittels flowzytometri-scher Analysen konnte gezeigt werden, dass die Antikörper unterschiedliche Subpo-pulationen der T-Helferzellen depletieren. Darüber hinaus führte MAX16H5 offen-sichtlich zur Induktion regulatorischer T-Zellen. Die Daten erklären unterschiedliche Erfolge aus ersten klinischen Studien mit verschiedenen anti huCD4 Antikörpern. Auch eignet sich CD4 auch als diagnostisches Target zur in vivo Diagnostik T-Zell vermittelter Entzündungsreaktionen. Mit Antikörperfragmenten von MAX16H5 wurde ein immunszintigraphisches Verfahren entwickelt, das die spezifische Darstellung der mit der DTH einhergehenden Entzündungsreaktion ermöglicht.

In einem komplexen tierexperimentellen Ansatz wurde das Potenzial der anti huCD4-Antikörper MAX16H5 und MAX12F6 zur Modulierung zellvermittelter Immun-reaktionen in vivo untersucht. Dafür kam ein mehrfach transgenes Mausmodell zur Anwendung, in dem das humane Zielmolekül und dessen physiologischer Ligand als Transgene exprimiert waren. Als T-Zell vermittelte Immunreaktion wurde eine Kon-taktreaktion (delayed type hypersensitivity, DTH) gegen DNFB etabliert und validiert. An der DTH wurde untersucht, ob und wie die verschiedenen Antikörper die Sen-sibilisierungs- und die Auslösungsphase beeinflussen. Die experimentellen Ergeb-nisse zeigen, dass die Antikörper epitop- und isotypabhängig die beiden Phasen der DTH unterschiedlich beeinflussen. Die Applikation der Antikörper während der Sensi-bilisierung führte zu einer unterschiedlich ausgeprägten Suppression der DTH. Dage-gen hatten sie gegensätzliche Effekte auf die Auslösung. Während nach MAX12F6-Behandlung eine stärkere und prolongierte DTH gemessen wurde, verlief die DTH-Reaktion nach MAX16H5-Applikation deutlich abgeschwächt. Mittels flowzytometri-scher Analysen konnte gezeigt werden, dass die Antikörper unterschiedliche Subpo-pulationen der T-Helferzellen depletieren. Darüber hinaus führte MAX16H5 offen-sichtlich zur Induktion regulatorischer T-Zellen. Die Daten erklären unterschiedliche Erfolge aus ersten klinischen Studien mit verschiedenen anti huCD4 Antikörpern. Auch eignet sich CD4 auch als diagnostisches Target zur in vivo Diagnostik T-Zell vermittelter Entzündungsreaktionen. Mit Antikörperfragmenten von MAX16H5 wurde ein immunszintigraphisches Verfahren entwickelt, das die spezifische Darstellung der mit der DTH einhergehenden Entzündungsreaktion ermöglicht.

Background Regulatory T cells (Treg) are a subpopulation of CD4+ T cells that play an important role in the peripheral tolerance mechanisms of the immune system. Their suppressive function on autoreactive T cells can prevent autoimmunity. In type 1 diabetes (T1D), Treg have been inconsistently reported to be impaired in their capability to suppress autoreactive T cells (Tan, et al., 2014; Zhang, et al., 2012). Treg can be thymus derived (tTreg) or generated from naïve CD4+ CD25- T cells in the periphery (pTreg), which exhibit similar suppressive qualities as tTreg. They have also been reported to be actively induced (iTreg) under tolerogenic conditions (Kleijwegt, et al., 2010; Yuan and Malek, 2012). Although several Treg subpopulations have been described, the archetypical Treg express the major markers CD4, CD25 and FOXP3, while CD127 is heavily downregulated. However, activated conventional T cells (Tconv) show a similar phenotype, at least transiently (Miyara, et al., 2009). Since Treg and Tconv have opposing functions and therapeutic indications, it is important to obtain markers that confidently identify bona fide Treg. Scientific aim The aim of my thesis is to define the heterogeneity of human T cells with a specific emphasis to identify bona fide Treg. I examined heterogeneity of this population in healthy controls and T1D patients, as my model disease, and examined how T cells that are exposed to antigen can be defined as Treg or Tconv. Material and Methods For marker phenotyping I used samples from new onset T1D patients (age 7-11 years), autoantibody positive (Aab+) patients and age-matched healthy controls, which were tested by flow cytometry with an array of Treg-associated markers. Separately, freshly isolated CD4+CD25+CD127lo Treg and CD+CD25- Tconv were used for transcriptomic analysis, which was done by RNAseq on isolated whole RNA. For functional analysis of antigen specific gene expression patterns I developed a multi-dye proliferation assay. Treg (CD4+CD25+CD127lo) and Tconv (CD4+CD25-CD127+/lo) were sorted from isolated peripheral blood mononuclear cells (PBMC). I recombined the sorted and proliferation dye stained subsets with CD4- cells to simulate whole PBMC assays and stimulated them with tetanus-, influenza- or auto-antigens (GAD65, proinsulin). Cells were incubated for 5 days and responding proliferating cells as well as non-responding cells were single cell sorted and analyzed by multiplex qPCR. In investigating therapeutic approaches to expand or generate Treg, I examined in vitro approaches for de novo induction of Tregs with tolerogenic dendritic cells (tDCs). The tDCs were differentiated from monocytes either in the presence of 1α,25-OH(2)Vitamin D3 and/or Dexamethasone and matured with lipopolysaccharide. In a multistep assay, naïve T cells were incubated with DCs for two rounds and functional suppression assays were performed. The resultant T cells were analyzed at the DNA, protein, and functional level. Results Substantial phenotypic heterogeneity of peripheral blood CD4+ T cells was observed and documented for three major populations: resting Tconv (CD25-CD127+/lo), activated Tconv (CD25+CD127+) and Treg (CD25+CD127lo) in healthy controls. Despite this, I observed no differences between the Treg subpopulations from new onset T1D patients, Aab+ patients and healthy controls. In addition, there were no differences in the Treg transcriptome of T1D patients and healthy controls by RNAseq. I was, however, able to identify a small set of differentially expressed genes was discovered in Tconv suggesting a role of neutrophils in the onset of T1D. Heterogeneity of antigen-responsive Tconv and Treg was identified by gene expression profiling. I was able to define Treg specific as well as activation specific profiles, and found different expression profiles if T cells are foreign antigen or autoantigen activated and if the responding cells are Treg or Tconv. Genes that define the specific profiles include FOXP3, CD127, several cytokines, transcription factors and activation markers. The manipulation of naïve CD4+CD25- T cells by tDCs led to an unstable CD25+CD127loFOXP3+ phenotype of the generated cells. However, none of the subsequently performed functional assays could confirm that the resultant cells were iTreg or exhausted activated Tconv. In particular, methylation status of the Treg-specific demethylated region (TSDR) was inconsistent with stable Treg, suggesting that so-called tolerogenic protocols may not lead to a long-lived Treg phenotype. Conclusion CD4+CD25+ T cells are heterogeneous. I defined marker combinations that will help distinguish Treg from ex vivo and in vitro activated Tconv cells. With these tools, I was able to show that healthy controls and patients with type 1 diabetes cannot be distinguished by Treg phenotype. Comprehensive single cell analysis of antigen activated T cells provided the most promising avenue for identifying antigen-specific Treg and opens new possibilities to analyze immune therapeutic approaches, particularly when Treg expansion is the therapeutic objective. The findings will be used for monitoring children participating in antigen-based prevention studies in children at risk for T1D. / Hintergrund Regulatorische T Zellen (Treg) sind eine Subpopulation der CD4+ T Zellen, welche eine wichtige Rolle in den peripheren Toleranzmechanismen des Immunsystems spielen. Ihre suppressive Funktion auf autoreaktive T Zellen kann Autoimmunität verhindern. Verschiedene Studien berichteten widersprüchlich, dass Treg in Typ 1 Diabetes (T1D) in ihrer Fähigkeit beeinträchtigt sind autoreaktive T Zellen zu supprimieren (Tan et al., 2014; Zhang et al., 2012). Treg können im Thymus differenzieren (tTreg) oder aus peripheren naïven CD4+CD25- T Zellen generiert werden (pTreg), welche ähnliche suppressive Eigenschaften wie tTreg besitzen. Es wurde außerdem berichtet, dass Treg aktiv unter tolerisierenden Konditionen induziert werden können (iTreg) (Kleijwegt et al., 2010; Yuan and Malek, 2012). Obwohl verschiedene Treg Subpopulationen beschrieben wurden, exprimieren die archetypischen humanen Treg die Hauptmarker CD4, CD25 und FOXP3 exprimieren, während CD127 herunterreguliert ist. Jedoch zeigen auch aktivierte konventionelle T Zellen (Tconv) diesen Phänotyp (Miyara et al., 2009). Da Treg und Tconv gegensätzliche Funktionen und therapeutische Indikationen aufweisen, ist es wichtig Marker zu erhalten, die sicher bona fide Treg identifizieren. Fragestellung Das Ziel meiner Arbeit ist es, die Heterogenität von humanen T Zellen zu definieren mit einen spezifischen Fokus bona fide Treg zu identifizieren. Dafür untersuchte ich die Heterogenität dieser Zellpopulation in gesunden Individuen und T1D Patienten, als Krankheitsmodell, und wie T Zellen als Treg oder Tconv definiert werden können wenn sie einem Antigen ausgesetzt sind. Material und Methoden Für das Phänotypisieren habe ich Proben von Patienten mit beginnendem T1D (Alter 7-11 Jahre), Autoantikörper positiven Patienten (Aab+) und gesunden Individuen mittels Durchflusszytometrie auf eine Reihe von Treg-assoziierten Markern getestet. Des Weiteren wurden frisch isolierte CD4+CD25+CD127lo Treg und CD+CD25- Tconv für die Transkriptomanalyse (RNAseq) genutzt, welche mit der Gesamt-RNA durchgeführt wurden. Für die funktionelle Analyse von Antigen-spezifischen Genexpressionsmustern habe ich ein Multifarbenproliferationstest entwickelt. Treg (CD4+CD25+CD127lo) und Tconv (CD4+CD25-CD127+/lo) wurden aus isolierten mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC) sortiert. Ich habe die sortierten und gefärbten Zellen mit CD4- Zellen zusammengefügt, um einen Gesamt-PBMC-Test zu simulieren und habe die Zellen mit Tetanus-, Influenza- oder Auto-antigen (GAD65, Proinsulin) stimuliert. Die Zellen wurden für 5 Tage inkubiert und die Antigen-reagierenden und -proliferierenden Zellen sowie die nicht-reagierenden Zellen Einzelzell sortiert und mittels Multiplex qPCR analysiert. Um therapeutische Ansätze zum Expandieren oder Generieren von Treg zu untersuchen, habe ich in vitro Ansätze für die de novo Induktion von Treg durch die Nutzung von tolerisierenden dendritischen Zellen (tDCs) untersucht. Die tDCs wurden von Monozyten in Anwesenheit von 1α,25-OH(2)Vitamin D3 und/oder Dexamethason differenziert und mit Lipoploysaccharid maturiert. Naïve T Zellen wurden in einem Mehrschrittverfahren mit DCs inkubiert. Die resultierenden T Zellen wurden auf DNA, Protein und funktioneller Ebene analysiert. Ergebnisse Substantielle phänotypische Heterogenität von peripheren Blut CD4+ T Zellen wurde in drei Hauptpopulationen in gesunden Individuen beobachtet und dokumentiert: ruhende Tconv (CD25-CD127+/lo), aktivierte Tconv (CD25+CD127+) und Treg (CD25+CD127lo). Weiterführend ergab der phänotypische Vergleich von Patienten mit beginnender T1D, Aab+ Patienten und gesunden Individuen keine Unterschiede in den Treg Subpopulationen. Außerdem zeigten sich keine Unterschiede in den durch RNAseq gemessenen Treg Transkriptomen von T1D Patienten und gesunden Individuen. Jedoch wurde ein kleine Gruppe von differentiell exprimierten Genen in Tconv entdeckt, welche eine mögliche Rolle von Neutrophilen in T1D andeuten. Heterogenität von Antigen-spezifischen Tconv und Treg Antworten wurde durch Genexpressionsanalysen identifiziert. Ich konnte Treg- sowie Aktivierungs-spezifische Muster definieren und verschiedene Expressionsprofile finden, wenn T Zellen durch Fremd- oder Autoantigen aktiviert wurden und ob sie die reagierenden Zellen Treg oder Tconv sind. Folgende Gene waren hauptsächlich in die Profilbildung involviert: FOXP3, CD127, mehrere Zytokine, Transkriptionsfaktoren und Aktivierungsmarker. Die Manipulation von naïven CD4+CD25- T Zellen durch tDCs führte zu einem instabilen CD25+CD127loFOXP3+ Phänotyp der generierten Zellen. Jedoch konnte keiner der weiterführenden funktionellen Analysen unterscheiden, ob die resultierenden Zellen iTreg oder aktivierte erschöpfte T Zellen waren. Insbesondere war der Methylierungsstatus der Treg-spezifisch demethylierten Region (TSDR) nicht konsistent mit einen stabilen Treg Phänotyp, was darauf hinweist, dass sogenannte tolerisiernde Protokolle nicht zu einem langlebigen Treg Phänotyp führen. Schlussfolgerungen CD4+CD25+ T Zellen sind heterogen. Ich habe Markerkombinationen definiert die helfen werden Treg von ex vivo und in vitro aktivierten Tconv Zellen zu unterscheiden. Mit diesen Mitteln war ich in der Lage zu zeigen, dass gesunde Individuen und Patienten mit Typ 1 Diabetes nicht anhand ihres Treg Phänotyps unterschieden werden können. Umfassende Einzelzell-Analysen von Antigen aktivierten T Zellen lieferten den vielversprechendsten Ansatz für die Identifizierung von Antigen-spezifischen Treg und eröffnen neue Möglichkeiten um immuntherapeutische Ansätze zu analysieren, insbesondere wenn Treg Expansion das therapeutische Ziel ist. Diese Erkenntnisse werden zukünftig für das Monitoring von Kindern, mit einem hohen T1D Risiko, genutzt die an Antigen-basierten Präventionsstudien teilnehmen.

Regulatorische Foxp3+CD4+ T-Zellen sind essentiell für das Gleichgewicht des intestinalen Immunsystems. Eine Einschränkung ihrer Suppressionsfunktion wird bei Patienten mit Immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked (IPEX)-Syndrom beobachtet und führt im Tiermodell zu lymphoproliferativen Erkrankungen und intestinalen Entzündungen. Von entscheidender Bedeutung für Homöostase und Suppressionsfunktion regulatorischer T-Zellen ist das Signalmolekül Interleukin-2 (IL-2). Im Gegensatz zu Effektor-T-Zellen exprimieren Foxp3+CD4+ T-Zellen den hochaffinen IL-2-Rezeptor αβγ konstitutiv. IL-2 wird von regulatorischen T-Zellen nicht in relevanten Mengen exprimiert. Sie sind somit auf von anderen Zellen sezerniertes IL-2 angewiesen. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass im Tiermodell regulatorische Foxp3+CD4+ T-Zellen durch Applikation eines IL-2/anti-IL-2-Antikörperkomplex nicht nur in mesenterialen Lymphknoten und Milz, sondern auch lokal in der Lamina propria mucosae des Kolons der Versuchstiere expandiert werden. Als relevante Quelle von IL-2 in situ könnten aktivierte proliferierende T-Zellen dienen. Um dies näher zu untersuchen, wurde die Proteinexpression proliferierender Einzelzellen mittels Matrix assisted laser desorption/ionisation-Time of flight-Massenspektrometrie-Imaging (MALDI-Imaging) analysiert. Es gelang die Identifikation präferentiell in lymphoiden Geweben exprimierter Peptidmassen. Obwohl die Einzelzellanalyse mittels MALDI-Imaging prinzipiell möglich erscheint, ist ein Nachweis von Zytokinen wie IL-2 derzeit aufgrund fehlender Sensitivität im Proteinmassebereich zwischen 10kDa und 20kDa nicht möglich. Die therapeutischen Möglichkeiten der Expansion regulatorischer Foxp3+ T-Zellen durch stabile IL-2-Rezeptor-Agonisten und die Rolle von IL-2 für die intestinale Immunregulation sollten weiter untersucht werden.:Bibliographische Beschreibung 3 Inhaltsverzeichnis 4 Abkürzungsverzeichnis 7 1. Einleitung 9 1.1. Störung der Barrierefunktion des intestinalen Immunsystems als Ursache chronisch entzündlicher Darmerkrankungen 9 1.2. Foxp3+ regulatorische T-Zellen 10 1.3. Die Rolle von Interleukin-2 für regulatorische T-Zellen 11 1.4. Signaltransduktion in regulatorischen T-Zellen als Grundlage ihrer selektiven Expansion und Induktion 12 1.5. Möglichkeiten der präferentiellen Expansion regulatorischer T-Zellen 15 1.5.1. Expansion regulatorischer T-Zellen durch Agonisten des hochaffinen IL-2-Rezeptors 15 1.5.2. Induktion regulatorischer T-Zellen durch TGF-β 16 1.5.3. Expansion regulatorischer T-Zellen durch Rapamycin (Sirolimus) 17 1.5.4. Expansion regulatorischer T-Zellen durch UVB-Bestrahlung bzw. Vitamin D-Rezeptor-Agonisten 18 1.5.5. Expansion regulatorischer T-Zellen durch Histon-Deacetylaseinhibitoren 19 1.6. Suppression von Effektor-T-Zellen durch regulatorische T-Zellen 20 1.6.1. Zellkontaktabhängige Mechanismen 20 1.6.2. Zellkontaktunabhängige Mechanismen 22 1.7. Matrix assisted laser desorption ionisation-Time of flight-Massenspektromie (MALDI-TOF-MS): Bedeutung und Funktion 23 1.8. Zielstellung 25 2. Materialien und Methoden 26 2.1. Versuchstiere 26 2.2. IL-2/IgG2b-Fusionsprotein-Vorexperiment 26 2.2.1. Induktion von 2,4,6-Trinitrobenzensulfonsäure (TNBS)-Kolitis 26 2.2.2. Durchführung des IL-2/IgG2b-Fusionsprotein-Vorexperimentes 26 2.3. Durchführung des IL-2/anti-IL-2-Antikörperkomplex-Experiments 27 2.4. Durchflusszytometrie 27 2.5. Histologische Färbungen 28 2.5.1. Probenvorbereitung 28 2.5.2. Hämatoxylin/Eosin (HE) Färbung 29 2.5.3. Immunfluoreszenz-Färbungen 29 2.5.4. Ki67-Schnellfärbung 30 2.5.5. Mikroskopie und Photographie 30 2.6. Histologische Auswertungen 31 2.6.1. Kolitis-Score 31 2.6.2. Bildanalyse 31 2.6.3. Validierung der automatischen Bildanalyse mittels CellProfiler 33 2.7. MALDI-Imaging 35 2.7.1. Probenvorbereitung für MALDI-Imaging 35 2.7.2. Analyse der Peptidexpression in Gewebeschnitten mittels MALDI-Imaging 36 2.8. Statistische Auswertungen 36 2.8.1. Statistische Tests 36 2.8.2. Berechnung der zu erwartenden Zahl von Kontakten zwischen Ki67+ und Foxp3+ Zellen 36 3. Ergebnisse 38 3.1. Design des IL-2/anti-IL-2-Antikörperkomplex Experimentes 38 3.2. Mit IL-2/anti-IL-2-Antikörperkomplex behandelte Tiere zeigen Splenomegalie und Lymphadenomegalie 40 3.3. Behandlung mit einem IL-2/anti-IL-2-Antikörperkomplex führt zur präferentiellen Expansion regulatorischer T-Zellen in mesenterialen Lymphknoten und Milz 41 3.4. Behandlung mit IL-2/anti-IL-2-Antikörperkomplex führt nicht zu Kolitis 43 3.5. Behandlung mit IL-2/anti-IL-2-Antikörperkomplex führt zur präferentiellen Expansion regulatorischer T-Zellen in der Lamina propria mucosae 45 3.6. IL-2/anti-IL-2-Antikörperkomplex steigert die Proliferation regulatorischer T-Zellen in der Lamina propria mucosae und lymphoiden Follikeln des Kolons 47 3.7. Regulatorische T-Zellen sind nach Behandlung mit IL-2/anti-IL-2-Antikörperkomplex weiter mit proliferierenden Zellen assoziiert. 50 3.8. MALDI-Imaging als Möglichkeit der Proteinexpressionsanalyse in situ 52 3.8.1. Vergleich der Proteinexpression in verschiedenen Geweben von Ileum und Zäkum mit der Expression in Thymus und mesenterialem Lymphknoten 55 3.8.2. MALDI-Imaging nach Schnellfärbung Ki67+ Zellen mit Streptavidin 63 3.8.3. Analyse der Massenspektren von Einzelzellen mittels MALDI-Imaging 66 4. Diskussion 68 4.1. Applikation von IL-2/anti-IL-2-Antikörperkomplex hat keine fatalen Nebenwirkungen 68 4.2. IL-2/anti-IL-2-Antikörperkomplex führt zur präferentiellen Expansion regulatorischer T-Zellen in mesenterialen Lymphknoten, Milz und Kolon 70 4.3. IL-10 als wichtiger Vermittler der Suppressionsaktivität durch IL-2/anti-IL-2-Antikörperkomplex expandierter regulatorischer T-Zellen 71 4.4. Expansion regulatorischer T-Zellen beim Menschen: Voraussetzungen und Chancen 72 4.5. Regulatorische T-Zellen akkumulieren an proliferierenden Zellen 73 4.6. Nachweis spezifischer Massen in Gewebe und Einzelzellen mittels MALDI-Imaging 74 5. Zusammenfassung 80 Literaturverzeichnis 83 Publikationen 90 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 97 Lebenslauf 98 Danksagungen 99

Regulatorische T-Zellen (Treg) eröffnen neue immuntherapeutische Wege zur Kontrolle unerwünschter Immunreaktionen, jedoch wirft die Heterogenität dieser Zellen die Frage auf, welche Treg-Population für die klinische Anwendung. Darauf basierend werden in dieser Arbeit drei Fragestellungen bearbeitet: i) Bestimmung der Häufigkeit von Tregs und deren Subpopulationen in verschiedenen Altersgruppen bei Empfängern einer Organtransplantation (Tx) und einer gesunden Kontrollgruppe; ii) Vergleich der Suppressorkapazität verschiedener Treg-Populationen und in vitro-Expansion der Zellen unter Erhaltung ihrer Funktionalität; iii) Klärung der Differenzierungsmerkmale von Tregs und deren Verknüpfung mit konventionellen T-Zellen (Tconv) mittels Analyse des T-Zell-Rezeptor- (TCR) Repertoires. Sowohl bei gesunden Probanden als auch bei Tx-Empfänger konnte eine altersabhängige Verschiebung von naiven (TregN) hin zu dominant zentralen Gedächtnis-Zellen (TregCM) beobachtet werden, Treg von Tx-Empfängern hatten mehr Effektor-Memory-Zellen (EM) und sie waren mehr aktiviert. In Bezug auf die Kontrolle der frühen Tconv zeigen TregCM eine erhöhte Suppressorkapazität im Vergleich zu TregN. Außerdem sind im Gegensatz zu TregN nur TregCM dazu in der Lage, Apoptose bei Responderzellen zu induzieren. Der Grund hierfür könnte in der stärkeren Expression von CTLA-4 auf TregM liegen. Die Expansionskultur führte zur phänotypischen Veränderung der TregN, deren Umwandlung in TregCM mit einer verbesserten Suppressoraktivität verbunden ist. Die Daten legen nahe, dass das Expandieren mit gesamt Treg für die Adoptive-Treg-Therapie optimal sind, da sie der größte Anteil von ihnen die hochpotenten TregCM sind. TCR-Studien mittels Next Generation Sequencing zeigen weiter, dass TregM aus TregN entstehen, anstatt aus Tconv, in einem Antigen-gesteuerten Prozess. Diese Daten belegen erstmalig neue Erkenntnisse hinsichtlich der Unterschiede der TCR-Repertoires von TregM und Tconv beim Menschen. / Regulatory T cells (Treg) offer new immunotherapeutic options to control undesired immune reactions, but the heterogeinetiy of Treg raises the question which Treg population should be used for clinical translation Thus, this project involves three main parts: i) investigating Treg frequency and subsets distribution with age in healthy donors and transplant (Tx) patients; ii) comparing the suppressive capacity of Treg subsets and expanding them in vitro without losing functionality; iii) clarifyjing the differiation relationship of Treg subsets and their relation to conventional T cells (Tconv) by T cell receptor (TCR) repertoire analysis. From both healthy donors and Tx patients, an age-dependent shift from naïve Treg (TregN) to the dominant central-memory Treg (TregCM) was observed,; However,Treg in Tx patients contained more effector-memory EM cells, , and they were pre-activated due to the exposure to allo antigens,. Regarding control of early Tconv activation, TregCM showed enhanced suppressive capacity compared to TregN; furthermore, only TregCM could induce apoptosis of responder cells while TregN could not, which may result from thehigherexpression of cytotoxic T-lymphocyte antigen 4 (CTLA-4) on TregM. Following in vitro expansion of the Treg subsets, however, TregN converted mainly into TregCM phenotype with enhanced suppression activity. The poor proliferation capacity of TregEM might indicate EM as the terminal differential stage. These data suggest that expansion with total Treg is optimal for adoptive Treg therapy as the majority of them are the highly potent TregCM. Lastly, TCR repertoire study by next generation sequencing (NGS) indicate that TregM derived from TregN rather than Tconv in an antigen-driven process. The highest similarity of the TCR repertoires was observed between TregCM and TregEM. These data reveal new insights for the first time into the distinct TCR repertoires of Treg subsets and Tconv in human by NGS technology.

An der Interpretation extrazellulärer Signale beteiligte Regulationsnetzwerke sind von zentraler Bedeutung für alle Organismen. Extrazelluläre Signale werden gewöhnlich durch enzymatische Kaskaden innerhalb weniger Minuten in den Zellkern weitergeleitet, wo sie langsame Änderungen der Genexpression bewirken und so das Schicksal der Zelle beeinflussen. Im ersten Teil der Arbeit wird durch mathematische Modellierung untersucht, wie die MAPK Kaskade Signale von der Zellmembran in den Kern weiterleitet. Es wurden Netzwerkeigenschaften herausgearbeitet, die verhindern, dass die MAPK Kaskade fälschlicherweise durch genetische Mutationen aktiviert wird. Desweiteren wurde eine versteckte positive Rückkopplungsschleife identifiziert, welche die Aktivierung der MAPK Kaskade oberhalb eines gewissen Schwellwert-Stimulus verstärkt. Der zweite Teil der Arbeit konzentriert sich darauf, wie Änderungen der Genexpression auf langsamer Zeitskala in das Signalnetzwerk rückkoppeln. Eine systematische Genexpressionsdaten-Analyse ergab, dass transkriptionelle Rückkopplung in Eukaryoten generell über Induktion kurzlebiger Signalinhibitoren geschieht. Dynamische Modellierung und experimentelle Validierung von Modellvorhersagen ergab, dass das Inhibitorprotein SnoN als zentraler negativer Feedback Regulator im TGFbeta Signalweg fungiert. Der dritte Teil der Arbeit untersucht, wie die Genexpressionsmaschinerie intrazelluläre Signale interpretiert (“dekodiert“). Eine experimentelle und theoretische Analyse der cyanobakteriellen Eisenstress-Antwort ergab, dass IsrR, eine kleine regulatorische RNA, die Genexpression auf ausreichend starke und lange Stimulation beschränkt. Des Weiteren wurde ein “Reverse Engineering“-Algorithmus auf Hochdurchsatz-RNAi-Daten angewendet, um die Topologie eines krebsrelevanten Transkriptionsfaktornetzwerks abzuleiten. Zusammenfassend wurde in dieser Dissertation gezeigt, wie mathematische Modellierung die experimentelle Analyse biologischer Systeme unterstützen kann. / Intracellular regulatory networks involved in sensing extracellular cues are crucial to all living organisms. Extracellular signals are rapidly transmitted from the cell membrane to the nucleus by activation of enzymatic cascades which ultimately elicit slow changes in gene expression, and thereby affect the cell fate. In the first part of this thesis, the Ras-MAPK cascade transducing signals from the cell membrane to the nucleus is analyzed using mathematical modeling. Model analysis reveals network properties which prevent the MAPK cascade from being inappropriately activated by mutations. Moreover, the simulations unveil a hidden positive feedback loop which ensures strong amplification of MAPK signalling once extracellular stimulation exceeds a certain threshold. The second part of the thesis focuses on how slow gene expression responses feed back into the upstream signalling network. A systematic analysis of gene expression data gathered in mammalian cells demonstrates that such transcriptional feedback generally involves induction of highly unstable signalling inhibitors, thereby establishing negative feedback regulation. Dynamic data-based modelling identifies the SnoN oncoprotein as the central negative feedback regulator in the TGFbeta signalling pathway, and corresponding model predictions are verified experimentally in SnoN-depleted cells. The third part of the thesis focuses on how intracellular signals are decoded by the downstream gene expression machinery. A combined experimental and theoretical analysis of the cyanobacterial iron stress response reveals that small non-coding RNAs allow cells to selectively respond to sufficiently strong and sustained stimuli. Finally, a reverse engineering approach is applied to derive the topology of a complex mammalian transcription factor network from high-throughput knock-down data. In conclusion, this thesis demonstrates how mathematical modelling can support experimental analysis of biological systems.

Das phylogenetisch weit verbreitete RNA-bindende Protein Hfq ist an einer Vielzahl von Prozessen innerhalb des bakteriellen RNA-Metabolismus, insbesondere im Rahmen der post-transkriptionellen Genregulation durch kleine RNAs (sRNAs) beteiligt. Hfq-Proteine zählen zu der Familie der Sm- und Lsm-Proteine und zeichnen sich strukturell durch die funktionelle Ausbildung ringförmiger Homohexamere aus. Cyanobakterielle Orthologe zeigen gegenüber den gut untersuchten Hfq-Proteinen aus E. coli und anderen Proteobakterien eine schwache Sequenzkonservierung und bieten auch daher einen interessanten Ansatzpunkt für die Untersuchung riboregulatorischer Prozesse in diesen Organismen. In der vorliegenden Arbeit werden einleitende Untersuchungen zu Funktion und Struktur des orthologen Hfq-Proteins aus dem einzelligen Modell-Cyanobakterium Synechocystis sp. PCC 6803 vorgestellt. Die Inaktivierung des hfq-Gens (ssr3341) führte in diesem Organismus zum Verlust der phototaktischen Motilität. Mithilfe elektronenmikroskopischer Analysen konnte dieser Phänotyp auf das Fehlen von Typ IV Pili zurückgeführt werden. Microarray-Analysen wiesen in der deltahfq-Mutante für 31 Gene eine veränderte, in den meisten Fällen reduzierte Transkriptakkumulation nach. Am stärksten betroffenen waren Gene bzw. Operone, welche dem Regulon des cAMP-Rezeptorproteins Sycrp1 zugeordnet werden und zum Teil nachweislich an der Motilität von Synechocystis-Zellen beteiligt sind. Weitere vergleichende Expressionsanalysen identifizierten mithilfe eines speziellen Tiling-arrays ferner zwei „intergenisch“ kodierte potenzielle sRNAs, Hpr1 und Hpr3, deren Transkriptmengen signifikant von der hfq-Inaktivierung beeinflusst werden. Kristallstrukturdaten deuten zusammen mit den Ergebnissen aus in vitro-Bindungsstudien und genetischen Komplementierungsexperimenten - trotz starker Konservierung zentraler struktureller Charakteristika - neuartige biochemische und funktionelle Eigenschaften des Hfq-Proteins aus Synechocystis sp. PCC 6803 an. Funktionelle Implikationen werden im strukturellen und phylogenetischen Kontext diskutiert. / The phylogenetically conserved RNA binding protein Hfq is a key player in bacterial RNA metabolism, particularly with regard to sRNA-mediated post-transcriptional gene regulation. Hfq proteins belong to the well-conserved family of Sm- and Lsm proteins and are characterized by the formation of homo-hexameric ring-shaped structures. In comparison with well-studied Hfq proteins from E.coli and other proteobacteria the cyanobacterial orthologues show rather poor sequence conservation. Therefore, they provide a quite interesting background for analyzing riboregulatory processes in these organisms. In this work, the orthologous Hfq protein from the unicellular model cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 has been initially characterized on the functional and structural level. Insertional inactivation of the hfq gene (ssr3341) led to a non-phototactic phenotype that was due to the loss of type IV pili on the cell surface, as demonstrated by electron microscopy. Microarray analyses revealed a set of 31 genes with altered transcript levels in the knock-out mutant. Among the most strongly affected genes, there were members of two operons that had previously been shown to be involved in motility, controlled by the cAMP receptor protein Sycrp1. Further comparative transcriptional analyses using custom tiling arrays revealed two putative sRNAs (Hpr1 and Hpr3) from intergenic regions, whose transcript levels appeared to be significantly affected by hfq-inactivation. Structural analyses, genetic complementation as well as RNA-binding studies in vitro indicate that the Hfq orthologue from Synechocystis sp. PCC 6803 exhibits novel biochemical and functional properties, though retaining general structural features of its proteobacterial counterparts. Functional implications are discussed with regard to structural und phylogenetic considerations.

Ziel der Arbeit war, zu untersuchen, ob der gezielte Einsatz gentherapeutischer Methoden zu einer Verhinderung der Abstoßung allogener Transplantate bzw. zu einer Verhinderung der Induktion des Ischämie-/Reperfusionsschadens in verschiedenen Transplantationsmodellen der Ratte beitragen kann. Dabei wurden zwei Schwerpunkte gesetzt: Zum einen wurde auf den ex-vivo Gentransfer von therapeutischen Molekülen direkt in das Transplantat mit Hilfe von rekombinanten Adenoviren fokussiert. Zum anderen wurde das Potenzial von retroviral modifizierten, allospezifischen T-Zellen als Träger therapeutischer Gene zur Verhinderung der Transplantatrejektion untersucht. Diese Habilitationsschrift umfasst dreizehn Originalartikel in internationalen Zeitschriften, sechs Übersichtsartikel (Reviews) und vier Manuskripte, die bereits zur Veröffentlichung eingereicht sind. / The aim of the research was to investigate, whether the specific use of gene therapeutic methods can play a role in the prevention of allogeneic graft rejection or in the prevention of the induction of ischemia/reperfusion damage in various rat transplantation models. Doing this there were to main focusses: First we concentrated on the ex-vivo gene transfer of therapeutic molecules directly into the graft, which was done using recombinant adenoviruses. Then we investigated the potential of retrovirally modified, allospecific T-cells as carriers for therapeutic genes for the prevention of graft rejection. This publication consists of thirteen original papers in international journals, six reviews and four manuscripts that have been submitted for publication.

Die Etablierung von Hochdurchsatz-Technologien zur Durchführung von Genexpressionsmessungen führte in den letzten 20 Jahren zu einer stetig wachsende Menge an verfügbaren Daten. Sie ermöglichen durch Kombination einzelner Experimente neue Vergleichsstudien zu kombinieren oder Experimente aus verschiedenen Studien zu großen Datensätzen zu vereinen. Dieses Vorgehen wird als Meta-Analyse bezeichnet und in dieser Arbeit verwendet, um einen großen Genexpressionsdatensatz aus öffentlich zugänglichen T-Zell Experimenten zu erstellen. T-Zellen sind Immunzellen, die eine Vielzahl von unterschiedlichen Funktionen des Immunsystems inititiieren und steuern. Sie können in verschiedene Subtypen mit unterschiedlichen Funktionen differenzieren. Der mittels Meta-Analyse erstellte Datensatz beinhaltet nur Experimente zu einem T-Zell-Subtyp, den regulatorischen T-Zellen (Treg) bzw. der beiden Untergruppen, natürliche Treg (nTreg) und induzierte Treg (iTreg) Zellen. Eine bisher unbeantwortete Frage lautet, welche subtyp-spezifischen gen-regulatorische Mechanismen die T-Zell Differenzierung steuern. Dazu werden in dieser Arbeit zwei spezifische Herausforderungen der Treg Forschung behandelt: (i) die Identifikation von Zelloberflächenmarkern zur Unterscheidung und Charakterisierung der Subtypen, sowie (ii) die Rekonstruktion von Treg-Zell-spezifischen gen-regulatorischen Netzwerken (GRN), die die Differenzierungsmechanismen beschreiben. Die implementierte Meta-Analyse kombiniert mehr als 150 Microarray-Experimente aus über 30 Studien in einem Datensatz. Dieser wird benutzt, um mittels Machine Learning Zell-spezifische Oberflächenmarker an Hand ihres Expressionsprofils zu identifizieren. Mit der in dieser Arbeit entwickelten Methode wurden 41 Genen extrahiert, von denen sechs Oberflächenmarker sind. Zusätzliche Validierungsexperimente zeigten, dass diese sechs Gene die Experimenten beider T-Zell Subtypen sicher unterscheiden können. Zur Rekonstruktion von GRNs vergleichen wir unter Verwendung des erstellten Datensatzes 11 verschiedene Algorithmen und evaluieren die Ergebnisse mit Informationen aus Interaktionsdatenbanken. Die Evaluierung zeigt, dass die derzeit verfügbaren Methoden nicht in der Lage sind den Wissensstand Treg-spezifischer, regulatorsicher Mechanismen zu erweitern. Abschließend präsentieren wir eine Datenintegrationstrategie zur Rekonstruktion von GRN am Beispiel von Th2 Zellen. Aus Hochdurchsatzexperimenten wird ein Th2-spezifisches GRN bestehend aus 100 Genen rekonstruiert. Während 89 dieser Gene im Kontext der Th2-Zelldifferenzierung bekannt sind, wurden 11 neue Kandidatengene ohne bisherige Assoziation zur Th2-Differenzierung ermittelt. Die Ergebnisse zeigen, dass Datenintegration prinzipiell die GRN Rekonstruktion ermöglicht. Mit der Verfügbarkeit von mehr Daten mit besserer Qualität ist zu erwarten, dass Methoden zur Rekonstruktion maßgeblich zum besseren Verstehen der zellulären Differenzierung im Immunsystem und darüber hinaus beitragen können und so letztlich die Ursachenforschung von Dysfunktionen und Krankheiten des Immunsystems ermöglichen werden. / Within the last two decades high-throughput gene expression screening technologies have led to a rapid accumulation of experimental data. The amounts of information available have enabled researchers to contrast and combine multiple experiments by synthesis, one of such approaches is called meta-analysis. In this thesis, we build a large gene expression data set based on publicly available studies for further research on T cell subtype discrimination and the reconstruction of T cell specific gene regulatory events. T cells are immune cells which have the ability to differentiate into subtypes with distinct functions, initiating and contributing to a variety of immune processes. To date, an unsolved problem in understanding the immune system is how T cells obtain a specific subtype differentiation program, which relates to subtype-specific gene regulatory mechanisms. We present an assembled expression data set which describes a specific T cell subset, regulatory T (Treg) cells, which can be further categorized into natural Treg (nTreg) and induced Treg (iTreg) cells. In our analysis we have addressed specific challenges in regulatory T cell research: (i) discriminating between different Treg cell subtypes for characterization and functional analysis, and (ii) reconstructing T cell subtype specific gene regulatory mechanisms which determine the differences in subtype-specific roles for the immune system. Our meta-analysis strategy combines more than one hundred microarray experiments. This data set is applied to a machine learning based strategy of extracting surface protein markers to enable Treg cell subtype discrimination. We identified a set of 41 genes which distinguish between nTregs and iTregs based on gene expression profile only. Evaluation of six of these genes confirmed their discriminative power which indicates that our approach is suitable to extract candidates for robust discrimination between experiment classes. Next, we identify gene regulatory interactions using existing reconstruction algorithms aiming to extend the number of known gene-gene interactions for Treg cells. We applied eleven GRN reconstruction tools based on expression data only and compared their performance. Taken together, our results suggest that the available methods are not yet sufficient to extend the current knowledge by inferring so far unreported Treg specific interactions. Finally, we present an approach of integrating multiple data sets based on different high-throughput technologies to reconstruct a subtype-specific GRN. We constructed a Th2 cell specific gene regulatory network of 100 genes. While 89 of these are known to be related to Th2 cell differentiation, we were able to attribute 11 new candidate genes with a function in Th2 cell differentiation. We show that our approach to data integration does, in principle, allow for the reconstruction of a complex network. Future availability of more and more consistent data may enable the use of the concept of GRN reconstruction to improve understanding causes and mechanisms of cellular differentiation in the immune system and beyond and, ultimately, their dysfunctions and diseases.

Zusammenfassung Das beta-Proteobakterium Ralstonia eutropha H16 besitzt zwei [NiFe]-Hydrogenasen, die dem Organismus das Wachstum mit H2 als alleiniger Energiequelle unter aeroben Bedingungen ermöglichen. Reguliert wird die Expression dieser [NiFe]-Hydrogenasen durch ein bakterielles Zweikomponentensystem. Die Signaltransduktionskette besteht aus einer H2-sensierenden, regulatorischen [NiFe]-Hydrogenase (RH), einer Histidin-Proteinkinase und einem Response-Regulator. Um Einblicke in die Struktur-Funktions-Beziehung der H2-sensierenden Komponente zu bekommen, wurden Aminosäure-Austausche in konservierten Bereichen nahe des NiFe-Zentrums der RH durchgeführt. Der Austausch des invarianten Glu13 (E13Q, E13L) resultierte im Verlust der regulatorischen, der H2-oxidierenden und der H/D-Austauschaktivitäten. Spektroskopische Daten wiesen auf ein vollständig assembliertes NiFe-Zentrum hin. Mit Hilfe der ortho-/para-Konversionsaktivität wurde gezeigt, dass dieses Zentrum nach wie vor H2 binden kann. Dies deutet darauf hin, dass eine H2-Bindung am aktiven Zentrum nicht für die regulatorische Funktion der RH ausreicht. Durch den Austausch des Asp15 in His wurde der Konsensus eines konservierten Motivs der Standard-Hydrogenasen hergestellt. Das entstandene RH-Mutantenprotein besaß nur noch eine sehr niedrige H2-oxidierende Aktivität, bei nahezu unveränderter H/D-Austauschrate sowie intakter regulatorischer Aktivität. Dies deutet darauf hin, dass der H2-Umsatz nicht entscheidend für die H2-Sensierung ist. Um Informationen über die Struktur des aktiven Zentrums der RH zu erhalten, war es notwendig, große Mengen RH zu isolieren. Hierfür wurde die Strep-tag-Technologie eingesetzt, die es ermöglichte, die RH als natives Doppeldimer und als homodimeres Protein zu reinigen. Röntgenabsorptionsspektroskopie ergab erstmals, dass sich die Koordination des Nickel-Atoms im aktiven Zentrum sowohl im oxidierten als auch im reduzierten Zustand der RH deutlich von der in Standard-Hydrogenasen unterscheidet. / The beta-proteobacterium Ralstonia eutropha H16 is capable of using H2 as a facultative energy source by means of two distinct, energy-converting [NiFe]-hydrogenases. Transcription of the hydrogenase genes is regulated in response to the availability of H2 via a histidyl-aspartyl phosphorelay comprising a heterodimeric, regulatory [NiFe]-hydrogenase (RH), a histidine protein kinase and a response regulator. In order to gain insights into the mechanism of H2-mediated signal transduction, conserved amino acid residues close to the NiFe active site of the RH were exchanged. Replacement of the strictly conserved Glu13 within the RH large subunit by glutamine and leucine resulted in the loss of the regulatory, H2-oxidizing and hydrogen/deuterium exchange activities. Infrared spectroscopic analysis revealed, that the RH E13Q and E13L derivatives contained a fully assembled NiFe active site and showed para-/ortho-H2 conversion activity. These results indicated that H2-binding at the active site is not sufficient for H2 sensing. Replacement of Asp15, a residue unique in H2 sensors, by histidine restored the consensus of energy-linked [NiFe]-hydrogenases. The resulting RH mutant protein showed only traces of H2-oxidizing activity, whereas the H/D-exchange activity and the regulatory activity were nearly unaffected. H2-dependent signal transduction in the respective mutant strain was less sensitive to O2 than in the wild type. These results suggest that the H2 sensing is independent of H2 turnover. To get insights into the structure of the RH it was necessary to isolate large amounts of RH. By establishing the Strep-tag technology, allowing a fast, mild and efficient purification, it was possible to isolate the native RH-double dimer as well as the modified monodimeric RHstop protein in sufficient amounts for spectroscopic analyses. X-ray absorption spectroscopy showed for the first time that the RH active site undergoes significant structural changes upon exposure to H2.