Il y a 4 isoforme de p38 : α, β, δ, and γ. MK5, à l'origine identifié comme étant un régulateur de PRAK (Regulated/Activated Protein Kinase), est maintenant connu pour être activée par la protéine kinase p38 (qui est un mitogène activé par la protéine kinase, MAPK). Cette dernière est impliquée dans les mécanismes de fibrose et d'apoptose pendant l'hypertrophie cardiaque. De plus, MK5 est également activée par les MAPKs atypiques; ERK3 et ERK4. Bien qu’elles soient fortement exprimées dans le coeur, le rôle physiologique de MK5 et ERK3 demeure inconnu. Par conséquent, nous avons étudié l'effet de la constriction aortique transversale (TAC) – induisant un surcharge chronique de pression chez les souris hétèrozygotes knockout pour MK5 (MK5+/-) ou ERK3 (ERK3+/-) et pour leurs types sauvages (MK5+/+ et ERK3+/+). Deux sem post-TAC; le ratio de poids du coeur/poids corporel a été augmenté chez les 2 souris MK5+/- et MK5+/+. L'échocardiographie de la trans-thoracique démontre que la surcharge de pression a altéré la fonction diastolique du ventricule gauche chez MK5+/+, mais pas chez la souris MK5+/-. De plus, nous avons observé moins de dépôt de collagène, évalué par une coloration au trichrome de Masson, 2 et 3 sem post-TAC chez les souris MK5+/-. Parallèlement, le niveau de l’ARNm de collagène type1 alpha-1 a été significativement diminué dans les coeurs des souris MK5+/-, 2 et 3 sem post-TAC. De même, ERK3, mais pas ERK5 ni p38α, co-IP avec MK5 dans les 2 modèles des coeurs TAC; aigus ou chroniques. En revanche, l’ajout exogénique de GST-MK5 a abaissé ERK4 et p38α, mais pas ERK3 dans les lysâtes de coeur de souris. Par contre, GST-ERK3 et GST-p38α ne démontrent aucune co-IP avec MK5. Ces données suggèrent que dans le coeur seul ERK3, et non ERK4 ou p38α, est capable d’interagir avec, et réguler MK5. A niveau physiologique MK5 interagit entièrement avec ERK3 et par conséquent MK5 n’est pas disponible pour lier les protéines exogéniques. Les souris hétérozygotes pour ERK3 (ERK3+/-) ont également démontré une réduction ou une absence de collagène et une faible expression d’ARNm du collagène type1 alpha1, 3 sem post-TAC. Ces résultats démontrent un important rôle pro-fibrotique de la signalisation MK5-ERK3 pendant une surcharge chronique de pression.Nous avons également démontré 5 variant d'épissage de (MK5.1-5), y compris la forme originale (MK5.1). MK5.2 et MK5.5 subissent une délétion de 6 paires de base dans l’exon 12 : MK5.3 manque l'exon 12 : MK5.4 et MK5.5 manquent les exons 2-6. L'expression des ARNm des différents variant d'épissage a été vérifiée par PCR en temps réel (qPCR). Bien que l’expression est ubiquitaire, l'abondance relative de chaque variant était tissu-spécifique (coeur, rein, pancréas, muscle squelettique, poumon, foie, et cerveau). En plus, l'abondance relative des variant d’épissage varie pendant la surcharge de pression et le développement postnatal du coeur. En outre, l'immunofluorescence a indiqué que MK5.1-5.3 se localise au noyau alors que MK5.4-5.5 est situé au niveau cytoplasmic dans les cellules HEK 293 non stimulées. Suite à une stimulation avec l'anisomycin, un activateur de p38 MAPK, MK5.1-5.3 se translocalise du noyau au cytoplasme alors qu’une petite fraction de MK5.4-5.5 translocalise vers le noyau. Ces variant d'épissage peuvent diversifier la signalisation de MK5-ERK3 dans coeur, mais leur rôle exact oblige des recherches supplémentaires. Excepté l’isoforme δ, toutes les isoformes de p38 sont exprimées dans le coeur et la forme α est considérée comme étant l'isoforme dominante. L’analyse par qPCR et immunobuvardage de type western ont démontré que p38α et p38γ sont les deux isoformes prédominantes alors que p38β et p38δ sont exprimées aux mêmes niveaux dans le coeur de rat adulte. L'immunofluorescence a démontré que p38α et p38γ se trouvent dans le cytoplasme et le noyau. Cependant, suite à la surcharge par TAC, p38γ s'est accumulé dans noyau tandis que la distribution de p38α est demeurée inchangée. Ainsi, l'abondance de p38γ et sa translocalisation nucléaire suite à la surcharge de pression indique un rôle potentiel dans l'expression génique pendant le remodelage cardiaque. En conclusion, nous avons mis en évidence pour la première fois un rôle pro-fibrotique pour la signalisation MK5-ERK3 pendant une surcharge chronique de pression. D'ailleurs, les niveaux comparables d'expression de p38γ avec p38α, et la localisation différentielle de p38γ pendant la surcharge aiguë ou chronique de pression suggèrent différents rôles possibles pour ces isoformes pendant le remodelage hypertrophique cardiaque. / There are 4 isoforms of p38 MAP kinase: α, β, γ, and δ. p38 signaling has been implicated in fibrosis and apoptosis during cardiac hypertrophy. MK5, originally identified as a p38 Regulated/Activated Protein Kinase (PRAK), is known to be downstream of p38 mitogen activated protein kinase (MAPK). Although highly expressed in the heart, the physiological roles of MK5 remain unknown. To determine if MK5 plays a role in mediating detrimental effects downstream of p38, we studied the effect of transverse aortic constriction (TAC)-induced chronic pressure overload in mice heterozygous for a knockout of MK5 (MK5+/-). Moreover, as MK5 is also activated by the atypical MAPKs, ERK3 and ERK4, the effects of TAC were also studied in ERK3+/- mice. Wild-type (MK5+/+; ERK3+/+) littermates were used as controls. Two wks post-TAC, heart weight/body weight ratios were significantly and similarly increased in both MK5+/- and MK5+/+ hearts. Trans-thoracic echocardiography revealed that pressure overload impaired left ventricular diastolic function in MK5+/+, but not in MK5+/- hearts. In addition, less collagen deposition, assessed by Masson trichrome staining, was observed in MK5+/- hearts 2 and 3 wks post-TAC. Furthermore, TAC-induced increases in collagen alpha1 type1 mRNA levels were significantly lower in MK5+/- hearts at both 2 and 3 wks post-TAC. Immunoprecipitation of MK5 resulted in co-immunoprecipitation of ERK3 but not ERK4 or p38α in either acute or chronic sham-operated and TAC hearts. In contrast, exogenous GST-MK5 pulled down endogenous ERK4 and p38α, but not ERK3, from mouse heart lysates. Neither exogenous GST-ERK3 nor GST-p38α pulled down MK5. These results suggest that MK5 associates with, and is regulated by ERK3, but not ERK4 or p38α in heart. At physiological expressional levels, all MK5 was bound to ERK3 and hence not available to bind exogenous protein. Along similar lines, mice heterozygous for an ERK3 knockout (ERK3+/-) also showed reduced or absent collagen deposition and lower collagen alpha1 type1 mRNA levels 3 wks post-TAC. This data suggests an important pro-fibrotic role of MK5-ERK3 signaling during chronic pressure overload.We also demonstrated the existence of 5 splice variants of (MK5.1-5), including the originally published form (MK5.1). MK5.2 and MK5.5 had a 6 base pair deletion in exon 12: MK5.3 lacked exon 12: and MK5.4 and MK5.5 lacked exons 2-6. Subsequently, expression of the splice variants at the mRNA level was quantified by real time qPCR. Although ubiquitously expressed, the relative abundance of each variant was tissue-specific (heart, kidney, pancreas, skeletal muscle, lung, liver, and brain). Additionally, the relative abundance of MK5 splice variants changed in the heart during pressure overload and post-natal development. Furthermore, immunofluorescence revealed MK5.1-5.3 localized to the nucleus and MK5.4-5.5 to the cytoplasm in unstimulated HEK 293 cells. Upon stimulation with anisomycin, which activates p38 MAPK, MK5.1-5.3 translocated from the nucleus to the cytoplasm and small amounts of MK5.4-5.5 relocated to the nucleus. These splice variants may further diversify MK5-ERK3 signaling in the heart, but their exact role awaits further investigation. With the exception of p38δ, all p38 isoforms are expressed in the heart and α is considered to be the prominent isoform in this tissue. qPCR and western blot analysis revealed p38α and p38γ to be the predominant isoforms and p38β and p38δ are expressed at comparable levels in the adult heart. Confocal immunofluorescence studies revealed p38α and p38γ in both the cytoplasm and nucleus. However, in response to TAC, p38γ accumulated in the nucleus whereas the distribution of p38α remained unaffected. The high abundance of p38γ and its nuclear accumulation during chronic pressure overload suggest that this isoform may play a role in gene expression during pathological cardiac remodeling. In conclusion, we have shown for the first time a pro-fibrotic role for MK5-ERK3 signaling during chronic pressure overload. Moreover, comparable expression levels of p38γ with p38α, and differential localization of p38γ during acute or chronic pressure overload, suggest these isoforms play different roles during cardiac remodeling.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Le souffle chez les chevaux et l’asthme chez l’humain sont des maladies respiratoires qui partagent plusieurs caractéristiques, notamment des épisodes de bronchospasme et de détresse respiratoire dus à une inflammation pulmonaire inappropriée en réponse à une inhalation de substances antigéniques. Les manifestations cliniques incluent des efforts respiratoires augmentés, des sifflements et de la toux. Au niveau des voies respiratoires, on observe une augmentation du muscle lisse péribronchique, une fibrose sous épithéliale, une métaplasie/hyperplasie épithéliale et du mucus en quantité augmentée. L’augmentation du muscle lisse est particulièrement importante car elle n’affecte pas seulement le calibre basal des voies respiratoires, mais elle accentue l’obstruction respiratoire lors de bronchoconstriction. Ces changements sont regroupés sous le terme de « remodelage » et sont associés à un déclin accéléré de la fonction respiratoire chez les patients asthmatiques. Alors que les traitements actuels contrôlent efficacement le bronchospasme et relativement bien l’inflammation, leurs effets sur le remodelage sont mal connus. Dans le cadre de thèse, la réversibilité du remodelage musculaire péribronchique a été investiguée chez des chevaux atteints du souffle dans deux études longitudinales. Ces études, faites principalement sur du tissu pulmonaire prélevé par thoracoscopie, sont difficilement réalisables chez l’humain pour des raisons éthiques, ou chez d’autres animaux, car ceux-ci présentent rarement une inflammation de type asthmatique de façon spontanée. Les résultats démontrent que les chevaux atteints du souffle ont approximativement deux fois plus de muscle péribronchique que les chevaux sains d’âge similaire gardés dans les mêmes conditions, et que la prolifération des myocytes contribue à cette augmentation. Ils démontrent aussi qu’une stimulation antigénique relativement brève chez des chevaux atteints du souffle depuis plusieurs années n’accentue pas le remodelage, ce qui suggère que l’augmentation du muscle lisse atteint un plateau. Nous avons également montré que le remodelage du muscle lisse chez des chevaux adultes est partiellement réversible et que cette réversibilité peut être accélérée par l’administration de corticostéroïdes par inhalation. Il semble toutefois qu’une portion du remodelage chronique est irréversible puisque les corticostéroïdes ont accéléré la diminution du muscle mais sans toutefois mener à une amélioration plus marquée au terme de l’étude qu’avec une modification environnementale stricte. La diminution de trente pourcent observée sur un an paraît modeste mais elle démontre clairement, et pour une première fois, que le remodelage du muscle lisse présent chez des chevaux adultes malades depuis plusieurs années est au moins partiellement réversible. / Equine heaves and asthma in people are two respiratory diseases that share many characteristics, including episodes of bronchospasm and respiratory distress due to an inappropriate airway inflammation in response to inhaled antigens. In both diseases, the main clinical manifestations are increased breathing efforts, wheezing and coughing. Changes in the airway wall include increased airway smooth muscle, subepithelial fibrosis, epithelial changes, and increased mucus. The increase in smooth muscle is of particular importance as it not only affects baseline airway caliber, but also accentuates the effect of bronchoconstriction on airflow limitation. These structural changes are grouped under the term “remodeling” and are associated with the accelerated decline of respiratory function in asthmatics. While current treatments offer adequate control of bronchospasm and inflammation, their effects on remodeling are unknown. In this thesis, airway smooth muscle remodeling reversibility was investigated in heaves-affected horses. The longitudinal studies conducted here, mostly made on peripheral pulmonary tissue harvested under thoracoscopic guidance, can not be easily done in people for ethical reasons, or in other animal species, few of them having spontaneous asthma-like disease like horses. Results have shown that heaves-affected horses have twice as much airway smooth muscle than age-matched controls kept in the same environment, and that myocyte proliferation contributes to this increase. It was also shown that a relatively brief antigenic exposure in chronically affected horses does not further increase smooth muscle mass, which suggests that it may reach a plateau over time. It was also shown that airway smooth muscle is partially reversible and that this reversibility can be accelerated with inhaled corticosteroids. On the other hand, corticosteroids only accelerated the decrease in mass compared to strict environmental control, without affecting the total improvement observed at the end of the study, which suggests that some of this chronic remodeling is irreversible. The thirty percent decrease seems relatively modest but it is nevertheless the first demonstration that airway smooth muscle remodeling of adult horses affected by heaves for years is at least in part reversible.

Le cancer du sein est le cancer qui a la plus forte fréquence au Canada. En 2012, on estime que 23 200 nouveaux cas de cancer du sein seront diagnostiqués. Deux tiers des tumeurs mammaires expriment ou surexpriment le récepteur des oestrogènes α (ERα). De même, les oestrogènes sont importants pour la croissance de ces tumeurs. La présence des récepteurs hormonaux est un critère qui détermine le choix de la thérapie; à cet égard, le ciblage des récepteurs des oestrogènes par les antioestrogènes a pour but d’inactiver ces récepteurs et diminuer leur contribution à la croissance tumorale. Les antioestrogènes sont des inhibiteurs compétitifs de ERα. Tamoxifene est le médicament le plus utilisé pour traiter les tumeurs mammaires ER+ de tous les stades, avant ou après la ménopause. Tamoxifene est antioestrogène partiel ou SERM qui a un profile mixte d’activités agonistes et antagonistes. Fulvestrant ou ICI 182, 780 est un antioestrogène de type total ou SERD dépourvu de toute activité agoniste. Ce composé est utilisé en clinique chez les femmes après la ménopause ayant des tumeurs mammaires avancées. Fulvestrant constitue, donc, une deuxième ligne thérapeutique en cas de rechute après à un traitement par Tamoxifene. Afin de comprendre le potentiel thérapeutique de Fulvestrant, il est primordial d’étudier son impact sur ERα. Actuellement, la polyubiquitination et la dégradation de ERα sont les mécanismes les plus connus pour expliquer l’inactivation de ERα par Fulvestrant. Par ailleurs, en utilisant des modèles cellulaires ER+ et ER-; nous avons montré que les antioestrogènes totaux induisent une insolubilité de ERα indépendamment de leur capacité à induire sa dégradation. L’insolubilité corrèle avec l’association de ERα avec la matrice nucléaire et avec l’inhibition de sa transactivation. L’hélice H12 du domaine de liaison du ligand joue un rôle important dans l’insolubilité et l’inactivation de ERα par les antioestrogènes totaux. Par ailleurs, les antioestrogènes totaux se distinguent par leur capacité à induire la SUMOylation de ERα par SUMO1 et SUMO2/3. La SUMOylation est rapide et précède la dégradation de ERα dans cellules ER+. À l’aide de dérivés de l’antioestrogène total ICI 164, 384, nous avons montré que la chaine latérale des antioestrogènes totaux est à la base de l’induction de la SUMOylation et de l’inactivation de ERα. De plus, la SUMOylation semble être une marque d’inhibition, car la déSUMOylation restaure une activité de ERα en présence des antioestrogènes totaux. L’hélice H12 du LBD et le domaine de liaison à l’ADN sont requis pour l’induction de la SUMOylation. La recherche de protéines impliquées dans l’inactivation et dans la SUMOylation a permis d’identifier le facteur de remodelage de la chromatine ACF dans le même complexe que ERα. De manière similaire à la SUMOylation, le recrutement de ACF est précoce et constitue une propriété spécifique des antioestrogènes totaux. D’autre part, Fulvestrant induit le recrutement de ACF au niveau du promoteur du gène cible des oestrogènes pS2, ce qui suggère une contribution du remodelage de la chromatine dans les mécanismes d’action des antioestrogènes totaux. La surexpression de la DéSUMOylase SENP1 abolit le recrutement de ACF ce qui indique un rôle de la SUMOylation dans le recrutement de ACF. De même, l’hélice H12 du LBD de ERα constitue un lien entre l’inactivation de ERα et le recrutement de ACF. L’insolubilité, la SUMOylation et l'interaction du complexe ACF sont le reflet des mécanismes d’action des antioestrogènes totaux. Ces observations peuvent être utilisées comme des critères fonctionnels pour identifier d’autres composés avec de meilleures propriétés pharmacologiques que Fulvestrant. / Approximately 70% of breast tumors express or overexpress estrogen receptor alpha (ERα) and are treated with antiestrogens (AEs), which act as competitive inhibitors of this receptor. Tamoxifen has been widely used for the treatment of ERα-positive tumors, but intrinsic or acquired resistance can lead to tumor recurrence. Full AEs such as Fulvestrant (ICI182, 780) are currently used to treat postmenopausal women with ERα-positive breast cancers with disease progression following Tamoxifen therapy. Unlike Tamoxifen and other Selective estrogen receptor modulators (SERMs), full AEs (SERDs) are devoid of any agonistic activity. It is currently thought that the capacity of full AEs to induce rapid polyubiquitination and degradation of ERα underlies their complete suppression of ERα signalling. On the one hand, we show a correlation between ICI 182, 780 induced ERα inhibition and its association with the insoluble fraction. This insolubility corresponds to an immobilization within the nuclear matrix and takes place in the absence of an accelerated turn over. The helix 12 in the ligand binding domain is important in the induction of insolubility and inactivation. On the other hand, we identify ERα as a target for Small Ubiquitin-like Modifier (SUMO) posttranslational modification by SUMO1 and SUMO2/3 specifically when liganded with full AEs. Induction of SUMOylation is rapid and precedes receptor degradation in ERα-positive breast cancer cells. On the other hand, the SERMs do not induce SUMOylation. The helix 12 in the ligand binding domain and the DNA binding domain play a role in the induction of SUMOylation in the presence of full AEs. Structure activity relationship experiments with full AE derivatives showed that the induction of SUMOylation is correlated with the degree of inhibition of ERα-mediated transcription. In addition, preventing SUMOylation by overexpression of a SENP1 deSUMOylase abolished the inverse agonist properties of full AEs without increasing activity in the presence of agonists or of Tamoxifen. In our attempt to screen for factors with a possible role in SUMOylation and inactivation, we show that the treatment with SERDs but not SERMs, induces a rapid interaction between ERα and the human ATP-utilizing chromatin assembly and remodeling factor (ACF) in ERα-negative and ERα-positive cell lines. The helix 12 is important since introducing single point mutations in this helix lead to an increased solubility and abrogate ACF recruitment. Using ChIP, we find an increase of ACF1 subunit association with proximal promoter of estrogen target gene pS2 suggesting a possible role of ACF in remodeling in this promoter. ACF recruitment is SUMOylation dependant since the overexpression of DeSUMOylase SENP1 abolishes the interaction between ERα and ACF. Together, induction of insolubility, SUMOylation and ACF recruitment are characteristic properties of full antiestrogens that contribute to their specific activity profile. They can be used to screen for new compounds with an improved therapeutic potential.

La vasculopathie du greffon est une pathologie caractérisée par un rétrécissement progressif et oblitérant des vaisseaux sanguins menant à une ischémie et une perte de fonction du greffon. Le rétrécissement vasculaire est dû à une accumulation de matrice extracellulaire (MEC) et de cellules mononuclées positives pour l’actine musculaire lisse alpha (alphaSMA) dont les cellules souches mésenchymateuses, le tout formant une néointima oblitérante. Cette pathologie est la cause principale de la perte des greffons rénaux et cardiaques à long terme. Le rejet vasculaire aigu est un prédicteur de la vasculopathie du greffon. L’équipe du Dr Hébert a démontré que l’apoptose endothéliale, qui joue un rôle important dans le développement du rejet vasculaire, initie la libération de LG3, un fragment du protéoglycan perlécan. Les taux sanguins et urinaires de LG3 sont augmentés chez les receveurs d’allogreffe rénale avec rejet vasculaire et vasculopathie du greffon. Les résultats obtenus en laboratoire durant ma maîtrise ont permis de mieux caractériser l’impact du LG3 sur un type cellulaire important participant à la formation de néointima : les cellules souches mésenchymateuses. Mes travaux ont démontré que le LG3 induit à la fois la migration horizontale des MSC et la transmigration des MSC. Cette migration est dépendante de la voie de signalisation d’ERK1/2, précédemment identifiée comme voie centrale dans la formation de néointima. De plus, nos résultats démontrent que la kinase Src est activée en amont de l’activation de la voie MAPK. La migration horizontale et la transmigration induites par le LG3 sont aussi dépendantes des intégrines alpha2beta1, ainsi que l’activation de la voie MAPK. Dans un modèle de transplantation murin, nous avons également démontré que l’injection sérique de LG3 recombinant favorise l’accumulation de cellules positives pour alphaSMA dans la néointima. En outre, lorsque le receveur est déficient pour l’intégrine alpha2, mais que le greffon est sauvage, la formation de néointima induite par l’injection de LG3 est diminuée dans le greffon suggérant que les cellules du receveur jouent un rôle important dans la formation de la néointima. Enfin, nous avons démontré que l’injection de LG3 augmente aussi le nombre de cellules positives pour la forme phosphorylée d’ERK1/2 (p-ERK1/2) dans la néointima du greffon et que cette accumulation est dépendante de la présence des intégrines 2 1 chez les cellules du receveur.Lorsque le receveur est sauvage, il y a une augmentation du nombre de cellules positives pour p-ERK1/2. L’investigation de ces mécanismes dans le remodelage vasculaire expose de nouvelles opportunités pour inhiber la réponse cellulaire qui mène au remodelage inadapté lors d’un dommage vasculaire chronique et ainsi prolonger la survie du greffon. / Graft vasculopathy is diseases characterized by a progressive and obliterate narrowing of the blood vessels leading to ischemia and loss of graft function. This vascular narrowing is due to an accumulation of extracellular matrix and mononuclear cells positive for alpha smooth muscle actin (alphaSMA) including mesenchymal stem cells, thus forming an occlusive neointima. This condition is the leading cause of long term loss of kidney and heart transplants. Acute vascular rejection is a predictor of graft vasculopathy. Dr. Hébert’s team has demonstrated that endothelial apoptosis, which plays an important role in the development of vascular rejection, initiates the release of LG3, a fragment of the proteoglycan perlecan. Blood and urine levels of LG3 are increased in renal allograft recipients with vascular rejection and graft vasculopathy. The results obtained in the laboratory during my Master have helped to better characterize the impact of LG3 on an important cell type involved in neointima formation: the mesenchymal stem cells. My work has shown that the LG3 induces both the horizontal migration and the transmigration of MSC. This migration is ERK1/2-dependent, previously identified as a key molecule involved in neointima formation. In addition, our results demonstrate that Src kinase is activated by upstream activation of the MAPK pathway. Horizontal migration and transmigration induced by LG3 are also dependent on alpha2beta1 integrins, and the activation of the MAPK pathway. In a murine transplantation model, we also demonstrated that intravenous injection of recombinant LG3 promotes the accumulation of alphaSMA positive cells in the neointima. In addition, when the recipient is deficient for the alpha2 integrin but the graft is wild type, LG3 fails to induce neointima formation in the graft suggesting that recipient cells play an important role in the neointima formation. Finally, we demonstrated that intravenous injection of LG3 also increases the number of positive cells for the phosphorylated form of ERK1/2 (p-ERK1/2) in the neointima. This accumulation is dependent on the presence of alpha2beta1 integrins on recipient cells: when the recipient is wild type, there is an increase in the number of cells positive for p-ERK1/2.The investigation of these mechanisms in vascular remodeling presents new opportunities to inhibit the cellular response that leads to inadequate remodeling during chronic vascular damage and prolong graft survival.

Il a été démontré que les chevaux atteints du souffle présentent une augmentation de la masse de muscle lisse entourant les voies respiratoires comparativement à des chevaux sains (Herszberg, Ramos-Barbon et al. 2006, Leclere, Lavoie-Lamoureux et al. 2011). L’augmentation de la masse de muscle lisse ainsi observée résulte d’une hyperplasie, et possiblement, d’une hypertrophie des myocytes. Les traitements usuels du souffle ne sont que partiellement efficaces à diminuer cette augmentation. L’objectif de cette étude était d’explorer les mécanismes moléculaires impliqués dans ces changements affectant la cellule musculaire lisse dans la pathologie du souffle chez le cheval. Pour ce faire, nous avons examiné les effets d’une exposition antigénique sur l’expression du «Serum Response Factor» (SRF) dans le muscle lisse bronchique. Le SRF est un facteur de transcription localisé dans le noyau de la cellule musculaire lisse et régulant l’expression génique de celle-ci en favorisant un phénotype prolifératif ou contractile. Les résultats démontrent qu’avant exposition antigénique, les pourcentages de cellules exprimant le SRF sont faibles. Une augmentation significative du pourcentage de myocytes exprimant le SRF survient suite à une stimulation antigénique chez les chevaux atteints de souffle alors qu’aucune augmentation n’est observée chez les chevaux contrôles. Ces résultats suggèrent que le SRF pourrait contribuer au remodelage du muscle lisse péribronchique dans la pathologie du souffle. / Previous studies have shown that heaves-affected horses, when compared to age-matched control horses, have an increased smooth muscle mass surrounding their airways (Herszberg, Ramos-Barbon et al. 2006, Leclere, Lavoie-Lamoureux et al. 2011). Also, it is shown that hyperplasia, and possibly hypertrophy, contribute to this finding. Current therapies are only partially effective at reversing this finding. The goal of this study was to explore the molecular pathways involved in airway smooth muscle remodelling during heaves. We studied the Serum Response Factor (SRF), a nuclear transcriptional factor that controls gene expression in the smooth muscle cell and favour either a proliferative or a contractile phenotype. The results show that before antigenic exposition, the percentage of cells expressing SRF is low. A significant increase in the percentage of SRF-expressing myocytes occurs after antigenic stimulation in heaves-affected horses whereas no increase is observed in control subjects. These results suggest that the transcription factor SRF may contribute to airway smooth muscle remodeling in heaves-affected horses.

La rapamycine est un immunosuppresseur utilisé pour traiter plusieurs types de maladies dont le cancer du rein. Son fonctionnement par l’inhibition de la voie de Tor mène à des changements dans des processus physiologiques, incluant le cycle cellulaire. Chez Saccharomyces cerevisiae, la rapamycine conduit à une altération rapide et globale de l’expression génique, déclenchant un remodelage de la chromatine. Nous proposons que les modifications des histones peuvent jouer un rôle crucial dans le remodelage de la chromatine en réponse à la rapamycine. Notre objectif principal est d’identifier d’une banque de mutants d’histone les variantes qui vont échouer à répondre à la rapamycine dans une tentative de réaliser une caractérisation des modifications d’histone critiques pour la réponse à cette drogue. Ainsi, nous avons réalisé un criblage d’une banque de mutants d’histone et identifié plusieurs mutants d‘histone dont la résistance à la rapamycine a été altérée. Nous avons caractérisé une de ces variantes d’histone, à savoir H2B, qui porte une substitution de l’alanine en arginine en position 95 (H2B-R95A) et démontré que ce mutant est extrêmement résistant à la rapamycine, et non à d’autres drogues. Des immunoprécipitations ont démontré que H2B-R95A est défectueux pour former un complexe avec Spt16, un facteur essentiel pour la dissociation de H2A et H2B de la chromatine, permetant la réplication et la transcription par les ADN et ARN polymérases, respectivement. Des expériences de ChIP-Chip et de micropuce ont démontré que l’arginine 95 de H2B est requise pour recruter Spt16 afin de permettre l’expression d’une multitude de gènes, dont certains font partie de la voie des phéromones. Des évidences seront présentées pour la première fois démontrant que la rapamycine peut activer la voie des phéromones et qu’une défectuosité dans cette voie cause la résistante à cette drogue. / Rapamycin is an immunosuppressant used for treating many types of diseases such as kidney carcinomas. It works by inhibiting the Tor signaling pathway leading to changes in physiological processes, including cell cycle arrest. In Saccharomyces cerevisiae, rapamycin leads to a rapid and global alteration in gene expression, prompting chromatin remodeling. We propose that histone modification(s) might play a crucial role in remodeling of the chromatin in response to rapamycin. Our main objective is to identify from a histone mutant collection variants that fail to respond to rapamycin in an attempt to characterize histone modifications critical for this drug response. As such, we conducted a screen of the histone mutant collection and identified several hits that showed resistance to rapamycin. We characterized one of the histone variants, namely H2B, carrying alanine substitution at arginine 95 (H2B-R95A) and show that it is extremely resistant to rapamycin, but not to other drugs. Pull downs demonstrated that H2B-R95A was defective in forming a complex with Spt16, an essential factor that is required to disassociate H2A and H2B from the chromatin in order to allow replication and transcription by DNA and RNA polymerases, respectively. ChIP-Chip and microarray experiments showed that arginine 95 of H2B is required to recruit Spt16 to allow expression of several genes, a subset of which are involved in the pheromone signaling pathway. Evidence will be presented to show for the first time that rapamycin can activate the pheromone pathway and that defects in this pathway cause resistance to the drug.

Introduction. Les mécanismes physiopathologiques du remodelage vasculaire pulmonaire chez le patient BPCO sont encore mal élucidés. L'inflammation pourrait jouer un rôle déterminant.Objectifs. Déterminer le rôle de l'interleukine 6 (IL6) dans la physiopathologie de l'hypertension pulmonaire (HTP) associée à la BPCO.Méthodes. Nous avons étudié le lien entre l'IL6 et l'HTP sur une population de patients atteints de BPCO, l'effet de l'hypoxie sur le développement d'une HTP chez des souris IL6-/- et l'effet in vitro de l'IL6 sur les cellules endothéliales et les cellules musculaires lisses d'artère pulmonaire humaine.Résultats. Les patients BPCO avec HTP présentaient un taux plasmatique d'IL6 circulante plus élevé. Le génotype GG de l'IL6 était corrélé à un risque plus élevé de développer une HTP. L'IL6 est produite par tous les acteurs cellulaires impliqués dans la physiopathologie du remodelage vasculaire pulmonaire et en particulier la cellule musculaire lisse. Sa synthèse, ainsi que celle de ses récepteurs, est très nettement stimulée par l'hypoxie aigue et chronique. L'IL6 participe probablement à l'entretien de la dysfonction endothéliale, à la migration des cellules musculaires lisses et au recrutement des cellules inflammatoires. Les souris IL6-/- sont partiellement protégées de l'hypertension pulmonaire hypoxique et présentent un moindre recrutement pulmonaire de cellules inflammatoires induit par l'hypoxie. Le taux d'IL6 est corrélé à une longueur télomérique plus courte chez les patients BPCO, témoignant d'un processus de vieillissement biologique accéléré. L'HTP associée à la BPCO ou à l'hypoxie chronique pourrait résulter d'une accentuation du processus de sénescence des cellules vasculaires pulmonaires, favorisé par l'inflammation.Conclusion. L'inflammation et plus particulièrement l'IL6 semblent fortement impliquées dans la physiopathologie du remodelage vasculaire pulmonaire chez le patient BPCO. / Introduction. The pathophysiological mechanisms responsible for pulmonary vascular remodeling in COPD remain poorly understood. Inflammation may play a major role.Objectives. To study the role of interleukin-6 (IL6) in the pathophysiology of pulmonary hypertension associated with COPD.Methods. We studied the relationship between IL6 and PH in a population of patients with COPD, the effect of hypoxia on the development of PH in mice IL6-/- and the effect of IL-6 on endothelial cells and smooth muscle cells of human pulmonary artery in vitro.Results. COPD patients with PH were characaterised by a more pronounced hypoxia and higher plasma levels of circulating IL-6. The GG genotype of IL-6 also correlated with a higher risk of developing PH in these patients. Each of the different cellular elements that promote pulmonary vascular remodeling are known to produce IL-6, with smooth muscle cells known to be a particularly important source of this cytokine In addition, synthesis of IL-6 and its associated receptors is increased in response to acute and chronic hypoxia. It is likely that IL-6 contributes to endothelial dysfunction, the migration and, indirectly, proliferation of smooth muscle cells, and recruitment of inflammatory cells. Indeed, IL6-/- mice are partially protected from hypoxia-associated pulmonary hypertension and demonstrate attenuated hypoxia-induced lung recruitment of inflammatory cells. Levels of IL-6 also correlate with shorter telomere length in patients with COPD, indicating a process of accelerated biological aging. This suggests that pulmonary hypertension secondary to COPD or chronic hypoxia may be due to inflammation-associated acceleration of normal pulmonary vascular cell sénescence.Conclusion. Inflammation in general, and IL-6 in particular, appear to be strongly involved in the pathophysiology of pulmonary vascular remodeling in patients with COPD

Les Cellules Folliculaires Dendritiques (FDC) régulent l'homéostasie des lymphocytes B et sont indispensables à la mise en place des réponses immunes humorales. Les FDC s'organisent, au sein des organes lymphoïdes secondaires, en réseaux tridimensionnels denses, nécessaires à leur fonctionnement. Les études s'intéressant aux FDCs, empruntent classiquement des approches in vitro ou ex vivo, peu adaptées à la nature de ce type cellulaire. Au cours de mon travail de thèse, nous avons utilisé plusieurs systèmes de 'multicolor fate mapping' dans le but de déchiffrer in situ les mécanismes à l'origine du développement initial, et du remodelage des réseaux de FDCs en contexte inflammatoire. Nous avons démontré que les FDCs provenaient de la prolifération clonale et de la différentiation des Cellules Marginales Réticulaires (MRC), un autre sous-type cellulaire stromal résidant près des sinus sous-capsulaires ganglionnaires, et dont les fonctions étaient à ce jour, inconnues. Lors des réponses immunes, nous avons prouvé que les FDCs nouvellement formées, ne dérivaient ni du recrutement de progéniteurs circulants ni de la prolifération de FDCs matures, mais plutôt de la prolifération clonale des MRCs, suivie de leur différentiation en FDCs. Au-delà de l'étude de la biologie des FDCs, notre travail a révélé une fonction importante des MRCs dans le soutien de la plasticité des réseaux de FDCs. / Follicular Dendritic Cells (FDCs) regulate B cell function and development of high affinity antibody responses but little is known about their biology. FDCs associate in intricate cellular networks within secondary lymphoid organs. In vitro and ex vivo methods may thus be of little interest to understand the genuine immunobiology of FDCs in their native habitat. Herein, we utilised various multicolor fate mapping systems to investigate the ontogeny and dynamics of lymph node (LN) FDCs in situ. We show that LN FDC networks arise from the clonal expansion and differentiation of Marginal Reticular Cells (MRCs), a population of lymphoid stromal cells lining the LN subcapsular sinus. We further demonstrate that during an immune response, FDCs accumulate in germinal centers and that neither the recruitment of circulating progenitors nor the division of local mature FDCs significantly contributes to this accumulation. In contrast, we provide evidence that newly generated FDCs also arise from the proliferation and differentiation of MRCs, thus unraveling a critical function of this poorly defined stromal cell population.

Introdução: Diabetes mellitus (DM) é uma desordem metabólica associada a diversas alterações sistêmicas e uma das características é afetar o metabolismo ósseo. As modificações teciduais induzidas pela força ortodôntica estão relacionadas à sua remodelação por ativação da reabsorção óssea alveolar no lado de pressão e conseqüente aposição óssea no lado de tração. Objetivo: avaliar o processo de remodelação do periodonto de sustentação através da análise imunohistoquímica e histológica após a aplicação da expansão rápida da maxila (ERM) em ratos sob estado diabético. Material e Métodos: Noventa ratos Wistar, machos, foram distribuídos aleatoriamente em seis grupos de estudo, contendo cada um, 15 animais: grupo C: animais não-diabéticos e sem expansão rápida da maxila (ERM); grupo DM: animais com diabetes mellitus (DM) induzidos por Streptozotocina (STZ); grupo ERM: animais com ERM; grupo DM+ERM: animais com DM + ERM; grupo DM+INS: animais com diabetes mellitus e tratados com insulina (INS); grupo DM+INS+ERM: animais com diabetes mellitus, tratados com insulina e realizada a ERM. Os animais foram submetidos à eutanásia 3, 7 ou 10 dias após a ERM. Foram realizadas análises histológicas qualitativas e imunoistoquímicas para avaliar a expressão da tríade protêica (TRAP, RANKL e OPG). Para as reações imunoistoquímicas foram realizadas análise qualitativa e semi quantitativa através da atribuição de scores para a intensidade da expressão das proteínas analisadas. Nos dados não paramétricos, foi utilizado o teste de Kruskal-Wallis e pós-teste de Dunn nas comparações (p0,05). Resultado: Em relação aos aspectos histológicos houve alteração na disposição das fibras colágenas, morfologia dos fibroblastos, quantidade de vasos sanguíneos e quantidade de tecido ósseo neo-formado caracterizado pelas linhas incrementais nos grupos ERM, DM+ERM e DM+INS+ERM comparado com seus respectivos grupos controle. Qualitativamente, a neoformação do osso alveolar dos ratos diabéticos foi menor quando comparado com os normais e, a alteração sistêmica diabetes melittus promoveu redução significativa na taxa de formação e maturação óssea. O grupo ERM mostrou os maiores valores para indicadores de osteoclastogênese (TRAP) nos períodos iniciais sendo que nos grupos diabéticos (DM+ERM e DM+INS+ERM), essa expressão foi maior nos períodos finais do experimento. O mesmo comportamento foi verificado com as proteínas de remodelação e neo-formação óssea (RANKL e OPG) óssea. Conclusão: A diabetes mellitus atrasou o processo de reparo do periodonto de sustentação e alterou o turnover ósseo. A insulina utilizada para o controle do diabetes melhoraram as respostas, mas não restabeleceram completamente os valores iniciais do grupo controle. Porém, apesar das diferenças qualitativas nas respostas teciduais do periodonto, a condição diabética em estado inicial mostrou pouco impacto clínico sobre o procedimento de movimentação dentária induzida / Introduction: Diabetes mellitus (DM) is a metabolic disorder associated with several systemic changes and one of the characteristics is to affect bone metabolism. Tissue modifications induced by orthodontic force are related to its remodeling by activation of alveolar bone resorption on the pressure side and consequent bone apposition on the traction side. Objective: To evaluate the remodeling process of the support periodontium through immunohistochemical and histological analysis after the application of rapid maxillary expansion (RME) in rats on diabetic state. Material and Methods: Ninety male Wistar rats were randomly assigned to six study groups, each containing 15 animals: GC: non-diabetic animals without rapid maxillary expansion (RME); GDM: animals with diabetes mellitus (DM) induced by Streptozotocin (STZ); GRME: animals with RME; GDM+RME: animals with DM + RME; GDM+INS: animals with DM, treated whit insulin; GDM+INS+RME: animals with DM, treated with insulin and RME. The animals were submitted to euthanasia 3, 7 or 10 days after RME. Qualitative and immunohistochemical histological analyzes were performed to evaluate the expression of the protein triad (TRAP, RANKL and OPG). For the immunohistochemical reactions, qualitative and semi quantitative analysis were performed through the assignment of scores for the expression intensity of the analyzed proteins. The non-parametric data were used the Kruskal-Wallis test and Dunn post-test in the comparisons (p<0.05). Results: In relation to the histological aspects, there was alteration in the collagen fibers, fibroblast morphology, number of blood vessels and quantity of neoformed bone tissue characterized by the incremental lines in the RME, DM+RME and DM+INS+RME groups, compared to their respective control groups. Qualitatively, the neoformation of the alveolar bone of the diabetic rats was smaller when compared to the normal ones, and the systemic alteration diabetes melittus promoted a significant reduction in the formation rate and bone maturation. The RME group showed the highest values for indicators of osteoclastogenesis (TRAP) in the initial periods, and this expression was higher in the diabetic groups (DM+RME and DM+INS+RME) in the final periods of the experiment. The same behavior was verified with bone remodeling and neoformation (RANKL and OPG) proteins. Conclusion: Diabetes mellitus delayed the periodontal repair process and altered bone turnover. Insulin used to control diabetes improved responses but did not completely restore control group initial values. However, in spite of the qualitative differences in the tissue responses of the periodontium, the diabetic condition in initial state showed little clinical impact on the induced tooth movement procedure