O carcinoma de célula renal (RCC) subtipo célula clara é o câncer mais letal e prevalente do sistema urinário. O diagnóstico deste tipo de câncer frequentemente é tardio em conseqüência da falta de sintomas perceptíveis aos pacientes. Um dos objetivos deste trabalho é a identificação de novos marcadores moleculares para diagnóstico precoce, o que ajudaria a diminuir a mortalidade em função de complicações resultantes do avanço da doença. Outro objetivo é a identificação de um conjunto de marcadores moleculares de prognóstico, de modo à prever com acurácia a evolução clínica da doença e, por conseqüência, o tempo de sobrevida do paciente. As modificações transcricionais associadas à carcinogênese e à progressão do câncer de rim ainda não foram completamente elucidadas. Além dos oncogenes e genes supressores de tumor, RNAs não-codificadores (ncRNAs) recentemente foram apontados como importantes reguladores da expressão gênica em humanos, e podem ter um papel importante na transformação maligna do câncer de rim. Para analisar a expressão gênica de ncRNAs e de genes codificadores para proteína foram utilizados dois microarranjos desenvolvidos por nosso grupo, enriquecidos em sondas para ncRNAs. Uma das plataformas possui 4 mil sondas de cDNA, das quais 822 sondas são para ncRNAs mapeando em regiões intrônicas. Outra possui 44 mil elementos e combina sondas de oligonucleotídeos (60-mer) intrônicas e exônicas de um mesmo locus genômico. Análises estatísticas foram feitas com a ferramenta Significance Analysis of Microarrays (q &#8804; 0,05) combinadas ou com a técnica de \"patient leave-one-out\" (genes com presença em 8 100% dos subconjuntos), ou alternativamente com o teste discriminante de Golub (p &#8804; 0,01 ou p < 0,05). Com a plataforma de 4 mil sondas foram estudadas 30 amostras de tecido renal de 18 pacientes com RCC subtipo célula clara. Um conjunto de 36 ncRNAs foi identificado como diferencialmente expresso entre amostras tumorais e não-tumorais. Uma assinatura adicional de 265 genes codificadores de proteínas foi identificada, indicando possíveis novos marcadores moleculares. Uma análise estatística supervisionada com dados de 16 pacientes identificou uma assinatura de ncRNAs correlacionada com sobrevida de 5 anos, formada por 27 ncRNAs com significativa expressão alterada em pacientes livres da doença em comparação com pacientes que morreram em função da doença. Uma assinatura adicional de 64 genes codificadores de proteínas também foi identificada como significativamente correlacionada com o acompanhamento clínico dos pacientes. Com a plataforma de 44 mil sondas foram analisados 17 pacientes, com amostras pareadas de tecido renal tumoral e não-tumoral agrupadas em 8 pools, sendo 4 de amostras tumorais e 4 de não-tumorais. Um conjunto de 66 ncRNAs parcialmente intrônicos antisenso e outro de 52 ncRNAs totalmente intrônicos antisenso foram identificados como diferencialmente expressos. Identificamos um subconjunto de 28 ncRNAs totalmente intrônicos antisenso e senso cuja expressão do gene codificador de proteína do mesmo locus estava simultaneamente alterada. Estes dados apontam para possíveis redes de regulação da expressão gênica dos ncRNAs em câncer. A extensa lista de ncRNAs e de genes codificadores para proteína identificados neste estudo podem ser promissores marcadores moleculares de carcinoma renal subtipo célula clara. / Renal cell carcinoma (RCC) is the most common malignancy of the adult kidney, and the clear cell subtype is the most prevalent and lethal cancer of the urinary system. Late diagnosis for this type of cancer is frequent, usually as a consequence of the lack of symptoms. One of the objectives of the present work is the identification of new molecular markers for the early diagnosis, which would help decrease mortality that develops as a function of disease progression. Another objective is the identification of a set of prognosis molecular markers, so as to accurately predict the clinical outcome of the disease, and consequently, patient survival. Transcriptional changes associated to carcinogenesis and to kidney cancer progression have not been entirely elucidated. Besides oncogenes and tumor suppressor genes, non-coding RNAs (ncRNAs) have been recently indicated as important regulators of gene expression in humans, and could have an important role in the malignant transformation in renal cancer. In order to measure ncRNA and protein-coding gene expression we have used two microarray platforms developed by our group, which are enriched in ncRNA probes. One of the platforms has 4 thousand cDNA probes, of which 822 are for ncRNAs that map to intronic regions. Another has 44 thousand elements and combines 60-mer oligonucleotide probes for intronic and exonic regions from the same genomic locus. Statistical analyses have been performed with the Significance Analysis of Microarrays tool (q &#8804; 0.05) combined with a patient leave-one-out approach (genes present in 100% of the sub-sets), or alternatively with Golubs discriminant test (p &#8804; 0.01 or p < 0.05). 11 With the 4-thousand probes platform we studied 30 samples from renal tissue of 18 RCC patients with clear cell subtype. A set of 36 ncRNAs has been identified as differentially expressed between tumor and non-tumor tissue. An additional signature of 265 protein-coding genes has been identified, indicating possible new molecular markers. A supervised statistical analysis with data from 16 patients has identified a ncRNA signature correlated to 5-year survival outcome, comprised of 27 ncRNAs with significantly altered expression in diseasefree patients compared to patients who died from cancer within the 5-year follow-up. An additional 64-gene signature of protein-coding genes has been identified as significantly correlated to clinical outcome. With the 44-thousand probes platform we have analyzed 17 patients, with paired tumor and non-tumor samples grouped into 8 pools, of which 4 were from tumor and 4 from nontumor samples. A set of 66 partially intronic antisense ncRNAs and another of 52 totally intronic antisense ncRNAs have been identified as differentially expressed between tumor and non-tumor tissue. A sub-set of 28 totally intronic antisense or sense ncRNAs were identified as having a simultaneous change in expression of the protein-coding gene from the same locus. Overall, the data point to a possible ncRNA regulatory network in cancer. The extensive lists of ncRNAs and of protein-coding genes identified in the present study can be seen as promising molecular markers of RCC from the clear-cell subtype.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-09-29 / Introdução: O carcinoma renal (CR) é relativamente raro comparado a outros cânceres. Um dos mais potentes mitógenos tumorais, o fator de crescimento endotelial vascular, VEGF, é regulado por inúmeras vias, particularmente Ras e Akt, que são alvo de inúmeros agentes terapêuticos, dentre eles o sorafenibe. Estas vias de sinalização têm importante papel no desenvolvimento e manutenção da resistência a múltiplas drogas (MDR). A Echinácea purpúrea é utilizada como tratamento alternativo para alguns tipos de câncer, sendo promissora para a terapêutica de CR. Objetivo: Analisar o efeito da Echinácea purpúrea (Ech) na viabilidade celular, apoptose, nas vias de sinalização Ras e Akt, bem como na angiogênese tumoral através do VEGF e potenciais alterações na resistência a múltiplas drogas. Métodos: O fitoterápico Ech, foi adicionado à cultura de células Caki-1 para posterior análise da viabilidade celular (Cristal Violeta), apoptose (Citometria de fluxo), liberação da enzima Lactato Desidrogenase – DHL (Bio 200) e expressão protéica do VEGF, Ras e Akt (Western blot) e expressão gênica MDR, MRP, LRP (PCR-RT). Os experimentos foram realizados após 24, 48 e 72 horas de tratamento. Os resultados foram analisados pelo teste Anova One Way, com p<0,001 vs CT (X ± EP vs CT). Resultados: Os grupos tratados com Ech demonstraram diminuição significante da viabilidade celular, dose e tempo dependentes comparado aos seus controles. Nós observamos um aumento significante na porcentagem de células apoptóticas no grupo de 72 horas comparado com o grupo controle: 4,7±0,4 vs. 7,6±0,7 (p<0,001), respectivamente. Também, observamos diminuição na expressão protéica (p<0,001) da Akt (0,301±0,02 vs. 0,193±0,009) e VEGF (0,729±0,01 vs. 0,439±0,01) em 48 horas, bem como com 24 horas na proteína Ras (0,484±0,05 vs. 0,289±0,02). Analisando a expressão gênica das proteínas de resistência a múltiplas drogas, Ech causou diminuição substancial de 100% para as proteínas MDR e MRP e decréscimo de 25% na proteína LRP, sugerindo importante efeito nestas proteínas. Conclusão: Baseado em nossos resultados, observamos que a Ech apresenta propriedades anti-oncogênica, uma vez que demonstrou atividade sobre a viabilidade e apoptose celular. Da mesma forma, Ech apresentou importante papel sobre as vias de sinalização Akt e Ras, sendo estas importantes mediadoras da progressão do ciclo celular e do processo apoptótico. Essas vias inibidas demonstraram importante papel na inibição do VEGF, assim como, na regulação da resistência a múltiplas drogas. / Introduction: The renal cell carcinoma (CR) is relatively rare compared to other cancers. One of the most potent tumor mitogen, vascular endothelial growth factor, VEGF is regulated by numerous pathways, especially Ras and Akt, which are targets of many therapeutic agents, among them sorafenib. These signaling pathways play an important role in the development and maintenance of the multidrug resistance (MDR). Echinacea purpurea is used as an alternative treatment for some cancers, and promising for the treatment of CR. Aim: Analyze the effect of Ech purpurea (Ech) on the cellular viability, apoptosis, Ras and Akt signaling pathway as well as tumor angiogenesis throughout VGEF and potential proteins alteration in the cellular resistance to drugs. Methods: Herbal echinacea were added to cell culture Caki-1 for subsequent analysis of cell viability (Crystal Violet), apoptosis (flow cytometry), release of the enzyme lactate dehydrogenase - LDH (Bio 200), protein expression of VEGF, Ras and Akt (Western blot ) and gene expression MDR, MRP, LRP (RT-PCR). The experiments were performed after 24, 48 and 72 hours of treatment. The results were analyzed by One Way ANOVA, p <0.001 vs CT (X ± SE vs CT). Results: Group treated with Ech demonstrated decrease in cell viability dose and time dependent compared to the control (IC50, 150mg/mL) from 0 to 300ug/mL (p<0.001). We observed a statistically significant increase of apoptotic cells for group 72 hours comparing with control group: 4.7±0.4 vs. 7.6±0.7 (p<0.001), respectively. Also, a decrease in protein expression (p<0.05) of the Akt (0.301±0.02 vs. 0.193±0.009) and VEGF (0.729±0.01 vs. 0.439±0.01) in 48 hours, as well as Ras in 24 hours (0.484±0.05 vs. 0.289±0.02) were obtained. By analyzing the genic expression of the proteins resistance to multiple drugs, Ech caused a substantial decrease of 100% for MDR and MRP with 25% decreases in LRP, suggesting an important effect in blunt the resistance protein to drugs. Conclusion: To our knowledge, the Ech has anti-oncogenic properties since it showed activity on the viability and apoptosis. Likewise, Ech has its role on the signaling pathways Akt and Ras, which are important mediators of cell cycle progression and apoptosis. These blunted pathways demonstrated an important role on VEGF inhibition, as well as in the regulation of multidrug resistance. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

O carcinoma de célula renal (RCC) subtipo célula clara é o câncer mais letal e prevalente do sistema urinário. O diagnóstico deste tipo de câncer frequentemente é tardio em conseqüência da falta de sintomas perceptíveis aos pacientes. Um dos objetivos deste trabalho é a identificação de novos marcadores moleculares para diagnóstico precoce, o que ajudaria a diminuir a mortalidade em função de complicações resultantes do avanço da doença. Outro objetivo é a identificação de um conjunto de marcadores moleculares de prognóstico, de modo à prever com acurácia a evolução clínica da doença e, por conseqüência, o tempo de sobrevida do paciente. As modificações transcricionais associadas à carcinogênese e à progressão do câncer de rim ainda não foram completamente elucidadas. Além dos oncogenes e genes supressores de tumor, RNAs não-codificadores (ncRNAs) recentemente foram apontados como importantes reguladores da expressão gênica em humanos, e podem ter um papel importante na transformação maligna do câncer de rim. Para analisar a expressão gênica de ncRNAs e de genes codificadores para proteína foram utilizados dois microarranjos desenvolvidos por nosso grupo, enriquecidos em sondas para ncRNAs. Uma das plataformas possui 4 mil sondas de cDNA, das quais 822 sondas são para ncRNAs mapeando em regiões intrônicas. Outra possui 44 mil elementos e combina sondas de oligonucleotídeos (60-mer) intrônicas e exônicas de um mesmo locus genômico. Análises estatísticas foram feitas com a ferramenta Significance Analysis of Microarrays (q &#8804; 0,05) combinadas ou com a técnica de \"patient leave-one-out\" (genes com presença em 8 100% dos subconjuntos), ou alternativamente com o teste discriminante de Golub (p &#8804; 0,01 ou p < 0,05). Com a plataforma de 4 mil sondas foram estudadas 30 amostras de tecido renal de 18 pacientes com RCC subtipo célula clara. Um conjunto de 36 ncRNAs foi identificado como diferencialmente expresso entre amostras tumorais e não-tumorais. Uma assinatura adicional de 265 genes codificadores de proteínas foi identificada, indicando possíveis novos marcadores moleculares. Uma análise estatística supervisionada com dados de 16 pacientes identificou uma assinatura de ncRNAs correlacionada com sobrevida de 5 anos, formada por 27 ncRNAs com significativa expressão alterada em pacientes livres da doença em comparação com pacientes que morreram em função da doença. Uma assinatura adicional de 64 genes codificadores de proteínas também foi identificada como significativamente correlacionada com o acompanhamento clínico dos pacientes. Com a plataforma de 44 mil sondas foram analisados 17 pacientes, com amostras pareadas de tecido renal tumoral e não-tumoral agrupadas em 8 pools, sendo 4 de amostras tumorais e 4 de não-tumorais. Um conjunto de 66 ncRNAs parcialmente intrônicos antisenso e outro de 52 ncRNAs totalmente intrônicos antisenso foram identificados como diferencialmente expressos. Identificamos um subconjunto de 28 ncRNAs totalmente intrônicos antisenso e senso cuja expressão do gene codificador de proteína do mesmo locus estava simultaneamente alterada. Estes dados apontam para possíveis redes de regulação da expressão gênica dos ncRNAs em câncer. A extensa lista de ncRNAs e de genes codificadores para proteína identificados neste estudo podem ser promissores marcadores moleculares de carcinoma renal subtipo célula clara. / Renal cell carcinoma (RCC) is the most common malignancy of the adult kidney, and the clear cell subtype is the most prevalent and lethal cancer of the urinary system. Late diagnosis for this type of cancer is frequent, usually as a consequence of the lack of symptoms. One of the objectives of the present work is the identification of new molecular markers for the early diagnosis, which would help decrease mortality that develops as a function of disease progression. Another objective is the identification of a set of prognosis molecular markers, so as to accurately predict the clinical outcome of the disease, and consequently, patient survival. Transcriptional changes associated to carcinogenesis and to kidney cancer progression have not been entirely elucidated. Besides oncogenes and tumor suppressor genes, non-coding RNAs (ncRNAs) have been recently indicated as important regulators of gene expression in humans, and could have an important role in the malignant transformation in renal cancer. In order to measure ncRNA and protein-coding gene expression we have used two microarray platforms developed by our group, which are enriched in ncRNA probes. One of the platforms has 4 thousand cDNA probes, of which 822 are for ncRNAs that map to intronic regions. Another has 44 thousand elements and combines 60-mer oligonucleotide probes for intronic and exonic regions from the same genomic locus. Statistical analyses have been performed with the Significance Analysis of Microarrays tool (q &#8804; 0.05) combined with a patient leave-one-out approach (genes present in 100% of the sub-sets), or alternatively with Golubs discriminant test (p &#8804; 0.01 or p < 0.05). 11 With the 4-thousand probes platform we studied 30 samples from renal tissue of 18 RCC patients with clear cell subtype. A set of 36 ncRNAs has been identified as differentially expressed between tumor and non-tumor tissue. An additional signature of 265 protein-coding genes has been identified, indicating possible new molecular markers. A supervised statistical analysis with data from 16 patients has identified a ncRNA signature correlated to 5-year survival outcome, comprised of 27 ncRNAs with significantly altered expression in diseasefree patients compared to patients who died from cancer within the 5-year follow-up. An additional 64-gene signature of protein-coding genes has been identified as significantly correlated to clinical outcome. With the 44-thousand probes platform we have analyzed 17 patients, with paired tumor and non-tumor samples grouped into 8 pools, of which 4 were from tumor and 4 from nontumor samples. A set of 66 partially intronic antisense ncRNAs and another of 52 totally intronic antisense ncRNAs have been identified as differentially expressed between tumor and non-tumor tissue. A sub-set of 28 totally intronic antisense or sense ncRNAs were identified as having a simultaneous change in expression of the protein-coding gene from the same locus. Overall, the data point to a possible ncRNA regulatory network in cancer. The extensive lists of ncRNAs and of protein-coding genes identified in the present study can be seen as promising molecular markers of RCC from the clear-cell subtype.