O processo de reparo do tecido ósseo tem sido alvo de estudos com o intuito de promover uma melhora na qualidade e tempo de reparo. Um elemento que tem sido estudado por alguns grupos é o fluoreto, pois tem sido proposto como terapêutico para osteoporose (Europa). Deste modo, o objetivo deste trabalho foi avaliar comparativamente o efeito do fluoreto administrado na água de beber sobre o reparo ósseo alveolar de ratos. Neste estudo foram utilizados 4 grupos com ratos Wistar de 80 dias de vida (n=200), os quais receberam água de beber contendo 5, 15 e 50 ppm de fluoreto e água deionizada (controle) durante todo experimento. Esses animais tiveram o incisivo superior direito extraído. Os animais foram eutanasiados 0 hora, 7, 14, 21 e 30 e 60 dias após a extração. Amostras de plasma sanguíneo foram obtidas para análise de concentração de flúor, e a região do alvéolo dental foi coletada para as análises de microscopia (Hematoxilina Eosina e imunoistoquímica) e zimografia (metaloproteinases de matriz 2 e 9 MMP-2 e 9). A análise de concentração de flúor no plasma sangüíneo mostrou maior presença desse elemento no grupo tratado com 50 ppm de F nos períodos de 21 e 30 dias. Na análise histológica foi detectado osso neoformado em todos os animais até 60 dias, porém o grupo de 50 ppm de F apresentou menor formação óssea nos períodos de 14, 21 e 30dias. A análise morfométrica confirmou um aumento na densidade de volume de osso neoformado, entre 7 e 60 dias, nos grupos controle, 5 ppm, 15 ppm e 50 ppm de F, com concomitante diminuição na densidade de volume de coágulo sangüíneo. A expressão de RANK-L e OPG não foi alterada pela exposição crônica ao fluoreto na água de beber durante os períodos estudados (p<0,05). A atividade da MMP-2 foi mais acentuada no período inicial, enquanto a MMP-9 teve maior atividade no período final. Concluiu-se que o F, em altas concentrações pode alterar a dinâmica do reparo ósseo alveolar diminuindo a formação de novo tecido ósseo, associado a um atraso na remissão do coágulo sangüíneo. Proteínas como RANK-L, OPG, MMP-2 e MMP-9 também podem ter sua expressão alterada no tecido ósseo em reparo. / The repair of bone has been investigated with the aim of promoting an improvement in the quality and time of the repair process. One element that has been studied by some groups is fluoride, it has been proposed as a treatment for osteoporosis (Europe). Thus, the objective was to comparatively evaluate the effect of fluoride administered in drinking water on alveolar bone repair in rats. This study used 4 groups of rats of 80 days (n=200), which received drinking water containing 5, 15, and 50 ppm of fluoride, and deionized water (control) throughout the experiment. These animals had their upper right incisor extracted. The animals were euthanized 0 hours, 7, 14, 21 and 30 and 60 days after extraction. Samples of blood plasma were obtained for analysis of fluoride concentration, and the region of the alveolus was collected for microscopic analysis (Hematoxylin eosin and Immunohistochemistry) and zymography (metalloproteinases 2 and 9 MMP-2 and 9). Analysis of fluoride concentration in blood plasma showed a greater presence of this element in the group treated with 50 ppm of F in periods of 21 and 30 days. Histological analysis detected a new bone formed in all animals up to 60 days, but the group of 50 ppm F showed lower bone formation at 14, 21 and 30 days. Morphometric analysis confirmed an increase in the volume density of newly formed bone, between 7 and 60 days in control groups, 5 ppm, 15 ppm and 50 ppm F, with a concomitant decrease in the volume density of blood clot. The expression of RANK-L and OPG was not altered by chronic exposure to fluoride in drinking water during the study period (p<0.05). The activity of MMP-2 was more pronounced in the early period, while MMP-9 had higher activity in the final period. It was conclude that the F, in high concentrations change the dynamics of the alveolar bone repair by decreasing the formation of new bone, associated with a delay in treating the blood clot. Proteins as RNK-L, OPG, MMP-2 and MMP-9 may also have changed in their expression in bone tissue repair.

The alveolar bone repair process may be influenced by several local and systemic factors that include mediators and immune system cells. Among these cells, macrophages are essential to trigger the repair process, and may acquire an inflammatory (M1) or anti-inflammatory and pro-reparative profile (M2). In this context, we evaluated the effects of FTY720 on macrophage polarization towards the M2 profile and its effects on the alveolar bone repair process. In this study, we used 8 weeks old male C57BL / 6 mice (N = 5 / time / group). The animals were divided in FTY720 group receiving the drug orally at a dose of 3mg / kg / 24h during the whole experimental period, and the control group receiving only the equivalent vehicle. All animals were submitted to extraction of the right upper incisor and were evaluated at 0, 1, 3, 7 and 14 days after extraction, followed by computed tomography (CT), histomorphometry, birefringence, immunohistochemical and molecular analyzes (PCRArray). Our results demonstrated that in the 14-day period, the FTY720 group presented higher bone tissue density, higher bone tissue volume (BV), greater tissue volume fraction (BV / TV), greater number and thickness of trabeculae (Tb.1 and Tb.Th, respectively) (p<0.05). In the 14-day period, the FTY720 group had a higher number of osteoblasts and osteoclasts than the control group (p<0.05). Accordingly, the expression of various bone markers such as BMP2, BMP7, ALPL, SOST and RANK had their mRNA expressions increased in the FTY720 group. This increase may be related to the potentiation in the formation of the bone tissue compared to the control group. The levels of FIZZ, ARG2 and IL-10 mRNA increased in the FTY720 group together with the presence of CD206 + cells in the 14 days period, suggesting a participation of M2 macrophages in the potentiation of the alveolar bone repair process. The FTY720 group also showed increased expression levels of CCR2, CCR5, CXCR1, CXCL1, CXCL3, CCL20 and CCL25 mRNA, chemokines and chemokine receptors involved in the recruitment of inflammatory cells and undifferentiated mesenchymal cells (MSCs) most notably was the up CXCL12 up regulation (p<0.05). CXCL12 is responsible in the recruitment of MSCs to the repair site. The increase in CXCL12 expression was accompanied by an increase in CD34 expression over a period of 14 days (p<0.05), indicating a higher presence of MSCs in the repair site. Thus, our results demonstrate that FTY720 favored the process of alveolar bone repair in C57BL / 6 mice, possibly because it increased the expression of markers related to bone tissue development (ALPL, SOST, RANK), tissue repair (CXCL12, CD34) and inflammatory cells (CCR2, CCR5) and apparently in the induction of macrophages to an M2 profile (ARG2, FIZZ). / O processo de reparo ósseo alveolar pode ser influenciado por vários fatores locais e sistêmicos que incluem mediadores e células do sistema imunológico. Dentre essas células, os macrófagos são essenciais para desencadear o processo de reparo, podendo adquirir um perfil inflamatório (M1) ou anti-inflamatório e pró-reparativo (M2). Nesse contexto, avaliamos os efeitos do FTY720 na polarização de macrófagos para o perfil M2 e seus efeitos no processo de reparo ósseo alveolar. Nesse estudo foram utilizados camundongos C57BL/6 (N=5/tempo/grupo), machos, com 8 semanas de idade. Os animais foram divididos em grupo que recebeu o fármaco FTY720 via oral, na dosagem de 3mg/Kg/24h, durante todo o período experimental, e grupo controle que recebeu apenas o veículo em regime equivalente. Todos animais foram submetidos à extração do incisivo superior direito e avaliados nos períodos de 0, 1, 3, 7 e 14 dias pós extração, seguido por análises de tomografia computadorizada (CT), histomorfométrica, birrefringência, imuno-histoquímica e molecular (PCRArray). Nossos resultados demonstraram que no período de 14 dias, o grupo FTY720 apresentou maior densidade de tecido ósseo, maior volume de tecido ósseo (B.V), maior volume de fração de tecido ósseo pelo tecido total (BV/TV), maior número e espessura de trabéculas (Tb.1 e Tb.Th, respectivamente) (p<0.05). Ainda no período de 14 dias, o grupo FTY720 apresentou maior número de osteoblastos e osteoclastos em relação ao grupo controle (p<0.05). Em concordância, a expressão de vários marcadores de tecido ósseo como, BMP2, BMP7, ALPL, SOST e RANK, tiveram suas expressões de mRNA aumentadas no grupo FTY720. Esse aumento pode estar relacionado com a potencialização na formação do tecido ósseo comparado ao grupo controle. Os níveis de mRNA de FIZZ, ARG2 e IL-10, sofreram aumento no grupo FTY720 em conjunto com a presença de células CD206+ no período de 14 dias, podendo sugerir uma participação dos macrófagos M2 na potencialização do processo de reparo ósseo alveolar. O grupo FTY720 também mostrou aumento nos níveis de expressão de mRNA de CCR2, CCR5, CXCR1, CXCL3, CCL20 e CCL25, quimicionas e receptores de quimiocinas envolvidos no recrutamento de células inflamatórias e células mesenquimais indiferenciadas (MSCs) com destaque para o aumento da expressão de CXCL12 (p<0.05), quimiocina responsável no recrutamento de MSCs para o local de reparo. O aumento na expressão de CXCL12 foi acompanhado pelo aumento na expressão de CD34 no período de 14 dias (p<0.05) podendo indicar maior presença de MSCs no sitio de reparo. Assim, os nossos resultados demonstram que o FTY720 favoreceu o processo de reparo ósseo alveolar em camundongos C57BL/6, possivelmente por ter aumentado a expressão de marcadores relacionados com o desenvolvimento do tecido ósseo(ALPL, SOST, RANK), no reparo tecidual (TGF-1, IL-10), no recrutamento de células indiferenciadas (CXCL12, CD34) e células inflamatórias (CCR2, CCR5) e aparentemente na indução de macrófagos para um perfil M2 (ARG2, FIZZ).

O reparo tecidual é um estado dinâmico que compreende diferentes processos, entre eles, inflamação, proliferação e remodelação, sendo que cada fase apresenta células e funções específicas. O LED é uma fonte de luz que tem sido utilizada na modalidade fototerapêutica no processo de cicatrização de feridas. A própolis também apresenta características em sua composição que favorece o reparo cicatricial. O presente estudo utilizou como terapias o LED, a própolis e seus usos associados, com o objetivo de compreender a ação desses diferentes tratamentos na resposta inflamatória induzida considerando a cinética do infiltrado inflamatório. O modelo experimental consistia na indução de ferida cirúrgica no dorso de 40 camundongos. Os animais foram divididos em 4 grupos: Controle, LED, Própolis e LED e Própolis, todos apresentaram subgrupos com animais sacrificados aos sete dias e quatorze dias após indução da lesão. A avaliação da histomorfometria foi realizada através de imagens capturadas e avaliadas por sistema de captura de imagens. Os achados da análise nos permitiram concluir que o LED isoladamente tem atividade biomoduladora positiva sobre o número de fibrócitos/fibroblastos e na neovascularização, no entanto, age como antiinflamatório sobre o infiltrado de células do sistema imune. O tratamento isolado com própolis age como proinflamatorio e não apresenta efeito estimulador na proliferação de fibrócitos/fibroblastos, determinando, porém aumento de colágeno e neovascularização enquanto inibe o aumento de SFA. O uso concomitante da própolis e LED atuou como agente antiinflamatório, além de exacerbar a ação do LED na produção de colágeno e na neovascularização.

Entre as várias terapêuticas propostas para o tratamento da osteoporose, a administração de altas doses de fluoreto é uma alternativa que ainda apresenta controvérsia na literatura. O fluoreto se destaca por influenciar na atividade dos osteoblastos, os quais são responsáveis por mediar a síntese de moléculas que compõem o osso. No entanto, o mecanismo de ação do fluoreto em células do tecido ósseo (osteoblastos, osteócitos e osteoclastos) ainda não está bem esclarecido. Neste trabalho foram utilizados camundongos com diferentes densidades ósseas, sendo 32 da linhagem C57BL/6J (menor densidade óssea) e 32 da linhagem C3H/HeJ (maior densidade óssea) com 60 dias de vida, os quais receberam água deionizada ou água com 50 ppm de fluoreto (na forma de NaF). Realizou-se os procedimentos cirúrgicos extraindo o incisivo superior esquerdo e posteriormente os animais foram eutanasiados 7, 14, 21 e 28 dias após a extração. Imediatamente após a eutanásia, foi removida a peça com alvéolo dental esquerdo. Foram feitas análises descritiva e morfométrica das lâminas obtidas (coloração em Hematoxilina Eosina). Foi utilizada análise ANOVA a quatro critérios seguida da análise de Tukey (p<0,05). Em geral, para todos os grupos, a análise histológica mostrou neoformação óssea à partir das paredes do alvéolo e formação de ilhotas ósseas invadindo o centro dos alvéolos, substituindo o tecido conjuntivo existente. O tecido ósseo neoformado substituiu aos poucos o tecido conjuntivo ao longo dos períodos experimentais, sendo esse fenômeno ligeiramente mais evidente nos camundongos da linhagem C57BL/6J. A análise morfométrica confirmou os achados histológicos em relação à quantidade de tecido ósseo neoformado e mostrou diminuição do tecido ósseo neoformado no último período (28 dias) nos animais C3H/HeJ (grupos controle e experimental). Concluimos que o processo de reparo ósseo alveolar é semelhante nas duas linhagens estudadas, porém apresentam padrão de formação óssea diferentes entre elas. O fluoreto parece influenciar as etapas do processo de reparo alveolar nas duas linhagens, aumentando a quantidade de osso neoformado, no entanto, a linhagem de camundongos C57BL/6J é mais propensa aos efeitos do flúor. / Among the various therapeutic proposals for the osteoporosis treatment, the administration of high doses of fluoride is an alternative that still has controversies in literature. Fluoride is highlighted by influencing the activity of osteoblasts, which are responsible for mediating the synthesis of bone. But, the mechanism of action of fluoride on bone cells (osteoblasts, osteocytes and osteoclasts) is not well understood. This way, this study aims to evaluate the alveolar bone repair in rats under the effect of fluoride (NaF) administered in the water. This work were used four groups of strains C57BL/6J mice (total of 32) and C3H/HeJ (total of 32) for 60 days, which received deionized water or water with 50 ppm of fluoride. The surgical procedures were made by extracting the upper left incisor and then the animals were euthanized 7, 14, 21 and 28 days. Histological analysis (Hematoxylin Eosin staining), by light microscopy, were made. The statistical analysis were made using the statistical test one-way ANOVA complemented by Tukey\'s test (p <0.05). Generally, for all groups, the histological analysis showed a new bone formed from the alveolar walls, replacing the connective tissue. The newly formed bone tissue gradually replaces the connective tissue over time; wich was more evident in C57BL/6J mice. Morphometric analisys confirmed the histological findings of the new bone formed and showed a decrease in the new formed bone in the last period (28 days) of the C3H/HeJ animals. We concluded that the process of alveolar repair is similar when it respects to the stages of repair, however they presents different pattern of new bone formation. The fluoride influences the stages of alveolar repair in both lineages, increasing the amount of bone formed, however the mice lineage of C57BL/6J is more prone to the effects of fluoride.

O reparo ósseo é um processo que consiste na restauração dos tecidos. Ele pode ser facilitado através de enxertos, estimulação bioquímica e estimulação física. Por outro lado, pode ser retardado por endotoxina (lipopolissacarídeo; LPS). O exercício físico exerce efeito benéfico para o osso, porém não é reconhecido o efeito sobre a reparação óssea. Assim, investigamos o efeito do exercício físico sobre a ação do LPS no reparo ósseo, por meio, de dosagens de citocinas plasmáticas, densitometria óssea, análise histológica quantitativa do tecido ósseo neoformado e marcadores imuno-histoquímicos, em animais sedentários e treinados. Os ratos foram divididos em quatro grupos: sedentário salina, sedentário LPS, exercício salina e exercício LPS. O exercício consistiu no treinamento físico na esteira durante quatro semanas. Após o treinamento, os ratos foram submetidos à cirurgia para confecção do defeito ósseo na tíbia direita e 24 horas após a cirurgia o LPS foi administrado na dose de 100 ?g/kg ou 1 ml/kg de salina, intraperitoneal. Finalmente, após 10 dias o sangue e as tíbias direitas foram obtidos para as análises, período em que os animais não foram submetidos ao treinamento físico. Os ratos treinados tiveram menor peso corporal do que os ratos sedentários (P<0,001). O exercício físico exerceu efeito positivo na reparação óssea, aumentando a densidade mineral óssea (P<0,005), o conteúdo mineral ósseo (P<0,005), a neoformação óssea (P<0,005), o colágeno tipo I (P<0,05) e a expressão de osteocalcina (P<0,05). As citocinas plasmáticas não foram detectadas na análise. Esses parâmetros não foram afetados pela administração sistêmica de LPS. Assim, os dados são consistentes com o conceito de que o exercício físico exerce um importante efeito osteogênico, que é mantido durante a inflamação sistêmica aguda induzida por uma única dose de LPS. / Bone repair is a process involved in the restoration of injured tissues. It can be facilitated by grafting, biochemical and physical stimulation. On the other hand, may be delayed by endotoxin (lipopolysaccharide; LPS). Physical exercise exerts beneficial effects on the bone, but is not known its effect on bone repair. Thus, we investigated the effect of exercise on the LPS action on bone repair through plasma cytokine measurements, bone densitometry, quantitative histological analysis for new bone tissue and immunohistochemical markers in sedentary and exercised animals. Rats were divided into four groups: sedentary saline, sedentary LPS, exercise saline and exercise LPS. Exercise consisted in physical training on the treadmill for four weeks. After training, rats underwent surgery for making the bone defect in the right tibia and 24 hours after the surgery LPS was administered at a dose of 100 g/kg or 1 ml/kg saline, intraperitonial. Eventually, blood and right tibias were obtained for analysis after 10 days when rats were not submitted to physical training. Exercised rats had lower body weight than the sedentary rats (P<0,001). The physical exercise had a positive effect on bone repair, increased bone mineral density (P<0,005), bone mineral content (P<0,005), bone formation (P<0,005), type I collagen (P<0,05) and osteocalcin expression (P<0,05). Plasma cytokines were not detected in the analysis. These parameters were not affected by systemic administration of LPS. Thus, our data are consistent with the notion that physical exercise has an important osteogenic effect, which is maintained during acute systemic inflammation induced by exposition to a single dose of LPS.

Metarhizium anisopliae é um fungo entomopatogênico usado como agente de controle biológico devido a sua capacidade de infectar mais de 300 espécies de artrópodes. É um organismo muito utilizado como modelo de estudo de interação patógeno-hospedeiro sendo um dos focos de estudo a descrição de genes envolvidos no processo de infecção pela construção de mutantes funcionais. Esse processo pode ser facilitado pelo uso da metodologia do sistema CRISPR/Cas9 para manipulação genômica, que foi derivada do sistema imune adaptativo de procariotos que vem demonstrando potencial tecnológico em edição genética de eucariotos pela incorporação de protoespaçadores (sequencias oriundas de bacteriófagos ou plasmídeos invasores) em seus loci. CRISPR e a proteína associada à CRISPR (Cas) formam uma endonuclease guiada (Cas9) a qual tem como alvo o sítio específico do DNA invasor, provocando a clivagem da dupla fita do DNA alvo em uma sequência específica. Muitos estudos realizados pela edição gênica têm sido desenvolvidos em diferentes organismos por meio da sua adaptação em eucariotos. Com o objetivo de melhorar a eficiência na geração de mutantes em em M. anisopliae, o sistema CRISPR/Cas9 e um sistema de RNAi foram usados a fim de desenvolver novas ferramentas. As metodologias CRISPR/Cas9 e RNAi foram desenvolvidas para ter como alvo o gene reporter gfp da linhagem M. anisopliae E6 GFP+. Para realizar a edição genômica em M. anisopliae, foram gerados, por transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens, fungos transgênicos estáveis que expressam a endonuclease Cas9 códon-otimizada para fungos filamentosos. Oligonucleotídeos foram projetados para ter como alvo quatro regiões diferentes na sequencia do gene gfp com o auxílio da ferramenta CRISPR RGEN tool com o objetivo de evitar o pareamento aleatório. O vetor binário utilizado foi o plasmídeo pPZP com o promotor U6-1 para a expressão do RNA guia. Para a metodologia de RNA interferente foi reproduzido o knockdown do gene repórter gfp por meio de agrotransformação do vetor pPZP::SUR::DP que contém um sistema de dois promotores em direções opostas (dual promoter Pdgp e Ptrpc) e um cassette de expressão com o gene marcador sur (resistência a sulfoniluréia) para a seleção dos transformantes. Foram clonados 420 pares de bases do gene gfp entre os promotores gerando o plasmídeo pPZP::SUR::DP::GFP. O desenvolvimento dessas duas metodologias se mostra viável para análise funcional de genes de M. anisopliae. / Metarhizium anisopliae is an entomopathogenic fungus used as a biological control agent due to its capacity to infect more than three hundred species of arthropods. It is broadly used as a model to the development of host-pathogen interaction studies, including the study of the description of the involved genes in the infection process by the construction of functional mutants. This process may be facilitated by the use of the CRISPR/Cas9 methodology to genomic manipulation, which was derived from the immune adaptive system in prokaryotes and has demonstrated technological potential in genetic of eukaryotes edition through the activity of incorporation of protospacers (sequences arising from bacteriophages or plasmids invaders) in their loci. CRISPR and CRISPR associated protein (Cas) code a guided nuclease (Cas9) that targets a specific site of the invading DNA leading to breakage of double-stranded target DNA in a specific sequence. Multiple gene editing studies have been developed in different organisms including its adaptation to eukaryotes. In order to improve the efficiency of the generation of mutants in M. anisopliae, CRISPR/Cas9 system and a RNAi system were used in order to develop new tools. Both CRISPR/Cas9 and RNAi methodologies were developed having as a target the gfp gene from M. anisopliae E6 GFP+ strain. To perform genome editing in M. anisopliae, stable transgenic fungi that express fungal codon-optimized Cas9 were generated by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Oligonucleotides were designed to target four different regions along the gfp gene by using the CRISPR RGEN tool in order to avoid off-targets. The binary vector was the pPZP plasmid with the U6-1 to RNAi expression. For RNAi analysis, gene knockdown were developed by agrotransformation with a suitable plasmid (pPZP::SUR::DP) containing dual promoters with opposite directions (Pdgp and Ptrpc) and a cassette for the expression of the selective marker (gene sur, conferring sulfonylurea resistance) for the selection of transformants. The 420 bp gfp sequence was cloned between promoters, obtaining thus the plasmid pPZP::SUR::DP::GFP. The development of these two techniques proves itself viable for functional analysis of M. anisopliae genes.

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Submitted by GUSTAVO ANTONIO CORRÊA MOMESSO null (gustavomomesso@gmail.com) on 2017-03-15T15:05:39Z No. of bitstreams: 1 Dissertação - Versão biblioteca.pdf: 2891656 bytes, checksum: 32d00fa843678a5c11f3d22ccb35adc1 (MD5) / Rejected by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: No campo “Versão a ser disponibilizada online imediatamente” foi informado que seria disponibilizado o texto completo porém no campo “Data para a disponibilização do texto completo” foi informado que o texto completo deverá ser disponibilizado apenas 12 meses após a defesa. Caso opte pela disponibilização do texto completo apenas 12 meses após a defesa selecione no campo “Versão a ser disponibilizada online imediatamente” a opção “Texto parcial”. Esta opção é utilizada caso você tenha planos de publicar seu trabalho em periódicos científicos ou em formato de livro, por exemplo e fará com que apenas as páginas pré-textuais, introdução, considerações e referências sejam disponibilizadas. Se optar por disponibilizar o texto completo de seu trabalho imediatamente selecione no campo “Data para a disponibilização do texto completo” a opção “Não se aplica (texto completo)”. Isso fará com que seu trabalho seja disponibilizado na íntegra no Repositório Institucional UNESP. Por favor, corrija esta informação realizando uma nova submissão. Agradecemos a compreensão. on 2017-03-21T14:47:27Z (GMT) / Submitted by GUSTAVO ANTONIO CORRÊA MOMESSO null (gustavomomesso@gmail.com) on 2017-03-21T17:21:40Z No. of bitstreams: 1 Dissertação - Repositório.pdf: 949450 bytes, checksum: 0d220f70d1f6277001ec516a5ce5f739 (MD5) / Rejected by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: A versão do trabalho submetida ao Repositório Institucional UNESP deve conter o texto completo. A equipe do Repositório se encarregará de disponibilizar apenas o conteúdo parcial que segundo a Portaria UNESP 396 de 10 de setembro de 2015 consiste em: Artigo 3º V - conteúdo parcial: as páginas pré-textuais (a folha de rosto, a dedicatória, os agradecimentos, a epígrafe, o resumo na língua vernácula, o resumo em língua estrangeira, as listas de ilustrações, de tabelas, de abreviaturas, de siglas e de símbolos e o sumário), a introdução, a conclusão ou as considerações finais e as referências do trabalho. Lembrando que: é necessário informar no formulário de submissão que a versão do trabalho a ser disponibilizada deve ser a parcial e indicar em quanto tempo a versão integral deverá ser disponibilizada, ao atingir a data limite o sistema automaticamente disponibilizará a versão completa do trabalho. Caso necessite prorrogar o prazo para disponibilização do texto completo, de acordo com o artigo 6º da Portaria UNESP 396: A data para a disponibilização do conteúdo integral poderá ser prorrogada por até mais 2 (dois) anos mediante a apresentação, via ofício, de justificativa pelo Autor ao programa de pós-graduação com no mínimo 90 (noventa) dias de antecedência à data informada para a disponibilização do conteúdo integral. Agradecemos a compreensão. on 2017-03-22T17:03:50Z (GMT) / Submitted by GUSTAVO ANTONIO CORRÊA MOMESSO null (gustavomomesso@gmail.com) on 2017-03-22T22:34:30Z No. of bitstreams: 1 Dissertação - Versão biblioteca.docx: 11818513 bytes, checksum: c0bb0978539470ada8673b5bac6aeeb6 (MD5) / Rejected by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: A versão final da dissertação/tese deve ser submetida no formato PDF (Portable Document Format). O arquivo PDF não deve estar protegido e a dissertação/tese deve estar em um único arquivo, inclusive os apêndices e anexos, se houver. Por favor, corrija o formato do arquivo e realize uma nova submissão. Agradecemos a compreensão. on 2017-03-24T13:21:06Z (GMT) / Submitted by GUSTAVO ANTONIO CORRÊA MOMESSO null (gustavomomesso@gmail.com) on 2017-03-27T01:31:21Z No. of bitstreams: 1 Dissertação - Versão biblioteca.pdf: 2891656 bytes, checksum: 32d00fa843678a5c11f3d22ccb35adc1 (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-03-29T17:17:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 momesso_gac_me_araca_par.pdf: 1050018 bytes, checksum: 78037bbf9643a0ef8536ce47feab0f3d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-29T17:17:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 momesso_gac_me_araca_par.pdf: 1050018 bytes, checksum: 78037bbf9643a0ef8536ce47feab0f3d (MD5) Previous issue date: 2017-02-20 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Este estudo objetivou avaliar o reparo ósseo alveolar em ratas osteopênicas tratadas com ranelato de estrôncio. Trinta e três ratas fêmeas com 3 meses de idade foram selecionadas e divididas em 3 grupos experimentais: OVX (animais submetidos à ovariectomia sem tratamento medicamentoso); SHAM (animais submetidos à cirurgia fictícia sem tratamento medicamentoso) e OVX-RE (animais submetidos à ovariectomia e tratados com ranelato de estrôncio). Inicialmente, os animais foram submetidos à cirurgia de ovariectomia bilateral para indução de condição osteopênica. O tratamento medicamentoso iniciou 30 dias após o procedimento cirúrgico com duração até o momento de eutanásia. Trinta dias após o início do tratamento, foi realizado a extração do incisivo superior direito dos animais para posterior avaliação do reparo alveolar. Os animais do grupo descalcificado foram submetidos à eutanásia aos 14 dias após a extração dentária, sendo as amostradas destinadas às análises histológica e imunoistoquímica. Os animais do grupo calcificado foram submetidos à eutanásia aos 60 dias após a extração dentária, sendo as amostras destinadas às análises por microscopia confocal e microtomográfica. Os resultados histológicos evidenciaram que o grupo OVX-RE demonstrou melhor aspecto de neoformação óssea, com trabéculas mais espessas e baixa presença de tecido conjuntivo, comaprado ao grupo OVX. Os resultados imunoistoquímicos demonstraram intensa marcação de OPG para o grupo OVX-RE e intensa marcação de RANKL para o grupo OVX. Já a análise por microscopia confocal evidenciou que o grupo OVX-RE obteve quantidade significativamente maior de marcação para vermelho de alizarina comaprado aos outros dois grupos (Tukey test – P < 0,05). Em relação aos parâmetros microtomográficos, foi possivel observar maiores valores de BV/TV (Tukey test – P > 0.05) e Tb.Th (Tukey test – P < 0.05) e menores valores de Tb.Sp, Po.Tot e Tb.N (Tukey test –P > 0.05) para o grupo OVX-RE. Sendo assim, é possível concluir que o ranelato de estrôncio melhora os aspectos microscópicos e morfológicos do reparo ósseo alveolar em ratas osteopênicas. / This study aimed evaluate alveolar bone healing in osteopenic rats treated with strontium ranelate. Thirty-three three months’s old female rats were selected and diveded into three groups: OVX (animals underwent to ovariectomy with no drug treatment); SHAM (animals underwent to fake surgery with no drug treatment) and OVXSR (animals underwent to ovariectomy treated with strontium ranelate). Firstly, animals undewent to bilateral ovariectomy to induce osteopenic condition. Drug treatment started at 30 days after, during the all experimental period. Thirty days after, it was performed extraction of the right upper incisor tooth, to further evaluation of alveolar healing. Animals from decalcified group were euthanized at 14 days after tooth extraction, and its samples were destinated to histological and immunohistochemestry analysis. Animals from calcified group were euthanized at 60 days and its samples were destinated to confocal microscopy and micro-tomography analysis. Histological results showed that OVX-SR group had the better aspect of new bone formation, with few number of trabecular bone and poor presence of connective tissue compared to OVX group. Immunohistochemestry results showed an intense labeling of OPG for OVX-SR group and intense labeling of RANKL for OVX group. Regarding confocal microscopy analysis, it was possible observed that OVX-SR group showed a significance greater amount of alizarin precipitation compared to another both groups (Tukey test – P < 0.05). About micro-tomographic parameters, OVX-SR group showed high values for BV/TV (Tukey test – P > 0.05) and Tb.Th (Tukey test – P < 0.05) and lower valus for Tb.Sp, Po.Tot and Tb.N (Tukey test –P > 0.05). It was concluded that strontium ranelate improves microscopy and morphologic aspects on alveolar bone healing of osteopenic rats. / FAPESP: 2015/08456-9

The process of alveolar bone healing can be influenced by several local and systemic factors, which include the immune system and healing related genes. However, the exact role of host inflammatory responsiveness and genetic background in bone healing process remains unclear. In this context, we evaluated the influence inflammation in alveolar bone healing taking advantage of mice strains genetically selected for maximum (AIRmax) or minimum (AIRmin) acute inflammatory response, as well AIR strains homozygous for RR/SS Slc11a1 genotypes. Experimental groups (N=5/time/group) comprised 8-week-old male or female AIRmax and AIRmin; and substrains AIRminRR, AIRminSS and AIRmaxRR and AIRmaxSS; submitted to extraction of upper right incisor and evaluated at 0, 3, 7, 14 and 21 days after upper incision extraction by micro-computed tomography (CT), histomorphometry, birefringence, immunohistochemistry and molecular (PCRArray) analysis. Initially, our results demonstrated that AIRmin mice presented an early increase (p<0.05) in bone volume, hyperdense regions, density of bone matrix and osteoblasts, increased (p<0.05) expressed of BMP4, BMP7 and RUNX2 when compared to AIRmax strain. AIRmin mice also presented lower counts of GR1+ and CD80+ cells, and higher counts of F4/80+ and CD206+ cells, in parallel with higher mRNA expression of CX3CL1, CCL5, CCR5 and ARG when compared to AIRmax animals. In late repair stages, the AIRmin strain presented a decreased (p<0.05) density of osteoclast and blood vessels than AIRmax, along lower RANKL and Catepk and higher PHEX and SOST mRNA expression, but the healing outcome at the endpoint was similar in AIRmin and AIRmax strains. When analyzed the effect of RR/SS Slc11a1 genotypes was evaluated in parallel with the influence AIRmin/AIRmax background, we initially observed that the AIRmax strain, associated with both RR and SS Slc11a1 genotypes, presented a more effective bone healing, characterized by increased (p<0.05) of bone volume and predominance of red fiber in analysis in contrast to AIRmin strains. AIRmaxRR presented increased (p<0.05) F4/80+ and decreased CD80+ e CD206+ cells count, while AIRmaxSS presented increased (p<0.05) GR1+, F4/80+ and CD80+ and decreased CD206+ cells. When the analysis was performed in order to address the influence Slc11a1 variants, AIRmaxSS strain presented a bone healing delay when compared to AIRmaxRR; characterized by decreased (p<0.05) of bone volume, trabecular number and red collagen fibers, increased (p<0.05) GR1+ and CD80+ and decreased F4/80+ and CD206+. Conversely, AIRminSS presented a more effective healing when compared with AIRminRR mice; characterized by increased (p<0.05) of bone volume, trabecular number/separation and red birefringence, increased GR1+ and decreased CD206+ cells count. In conclusion, while AIRmin and AIRmax strains presents a similar healing outcome at the endpoint, the early repair in AIRmin strain was associated with decreased presence of neutrophils and M1 macrophages, and increased M2 macrophages. Additionally, our while results showed that AIRmax inflammatory background was associated to a more effective bone healing process irrespective of the presence of RR/SS Slc11a1 genotypes, RR genotype favors the healing in AIRmax background and SS genotype was found to favor the healing in the AIRmin background. / O processo de reparo ósseo alveolar pode ser influenciado por vários fatores locais e sistêmicos, que incluem o sistema imunológico e os genes relacionados ao reparo. No entanto, o exato papel da resposta inflamatória do hospedeiro e genético background no processo de reparo ósseo ainda não está claro. Neste contexto, avaliamos a influência da inflamação no reparo óssea alveolar, em camundongos selecionadas geneticamente para uma resposta inflamatória aguda máxima (AIRmax) ou mínima (AIRmin), como também em camundongos AIR homozigoto para os alelos RR/SS do gene Slc11a1.Neste estudo foram utilizados camundongos machos e fêmeas (N=5/tempo/grupo), das linhagens selecionados para máxima e mínima (AIRmax e AIRmin) reação inflamatória, e também as sublinhagens AIRminRR, AIRminSS, AIRmaxRR e AIRmaxSS com idade aproximada de 8 semanas. Todos foram submetidos à extração do incisivo superior direito e avaliados nos períodos de 0, 3, 7, 14 e 21 dias pós extração, seguido pela análise tomografia computadorizada (CT), análise histomorfometria, análise de birrefringência, análise imuno-histoquímica e análise molecular (PCRArray). Inicialmente, nossos resultados demonstraram que a linhagem AIRmin, no período inicial, apresentou um aumento (p<0.05) no volume ósseo, nas regiões hiperdensas, na densidade de matriz óssea e osteoblastos, seguido pelo aumento (p<0.05) na expressão de BMP4, BMP7 e RUNX2 quando comparado a linhagem AIRmax. Camundongos AIRmin também apresentou uma menor contagem de células GR1+ e CD80+ e aumento da contagem de células F4/80+ e CD206+, em paralelo com aumento da expressão de mRNA de CX3CL1, CCL5, CCR5 e ARG quando comparado aos camundongos AIRmax. Nos períodos tardios, a linhagem AIRmin apresentou uma diminuição (p<0.05) na densidade de osteoclastos e vasos sanguíneos em comparação AIRmax, seguido por uma diminuição na expressão de mRNA de RANKL e Catepk e aumento de PHEX e SOST, mas o processo de reparo ósseo alveolar, no período final foi semelhante entres as linhagens AIRmin e AIRmax. Quando analisamos o efeito dos alelos RR/SS do gene Slc11a1 em paralelo com a influência do background AIRmin/AIRmax, nós inicialmente observamos que a linhagem AIRmax associada com ambos os alelos RR/SS do gene Slc11a1 apresentaram um processo de reparo mais efetivo, caracterizado pelo aumento (p<0.05) volume ósseo e predominância de fibras vermelhas em comparação com a linhagem AIRmin. Camundongos AIRmaxRR apresentaram aumento (p<0.05) na contagem de células F4/80+ e diminuição na contagem de células CD80+ e CD206+, enquanto, camundongos AIRmaxSS apresentou um aumento (p<0.05) na contagem de células GR1+, F4/80+, CD80+ e diminuição na contagem de células CD206+. Quando analisamos a influência dos alelos do gene Slc11a1, a linhagem AIRmaxSS apresentaram um atraso no reparo óssea quando comparado ao AIRmaxRR; caracterizado pela diminuição (p<0.05) do volume ósseo, número trabecular e fibras colágenas vermelhas, seguido pelo aumento (p<0.05) da contagem de células GR1+ e CD80+ e diminuição de células F4/80+ e CD206+. Por outro lado, camundongos AIRminSS apresentaram um reparo ósseo mais efetivo quando comparada com AIRminRR; caracterizada pelo aumento (p<0.05) do volume ósseo, número / separação trabecular e birrefringência das fibras colágenas no espectro vermelho, seguido pelo aumento da contagem de células GR1+ e diminuição das células CD206+. Diante disso, os nossos resultados demonstraram que as linhagens AIRmin e AIRmax apresentaram um processo de reparo ósseo alveolar semelhantes no período final do reparo, enquanto no reparo inicial a linhagem AIRmin estava associada com a diminuição de neutrófilos e macrófagos M1 e aumento dos macrófagos M2. Além disso, nossos resultados demonstraram que background AIRmax estava associado a um processo de reparo mais efetivo, independentemente da presença de genótipos RR/SS Slc11a1, o genótipo RR favorece o reparo no background AIRmax e o genótipo SS favoreceu a reparo no background AIRmin.

Os Papilomavírus Humanos (HPV) são vírus de DNA, não envelopados que infectam as células epiteliais. A infecção persistente por alguns tipos de HPV é o principal fator de risco para o desenvolvimento do câncer cervical. A maquinaria de reparo de DNA desempenha um papel essencial em várias fases do ciclo de vida do HPV e é crucial para a sobrevivência de células tumorais. Durante a transformação maligna, as oncoproteínas E6 e E7 de HPV são capazes de induzir alterações cromossômicas e numéricas, além de modular a resposta de danos ao DNA. Estas observações sugerem que a maquinaria celular de reparo de dano ao DNA podem desempenhar um papel duplo na biologia do HPV e na sua patogênese. No presente estudo, procurou-se investigar o papel das proteínas de reparo de DNA na biologia das células derivadas de câncer cervical. A fim de alcançar este objetivo, a expressão de 189 genes foi silenciada em células HeLa (HPV 18) e em células SiHa (HPV16), bem como em queratinócitos humanos primários (QHP), utilizando vetores lentivirais que expressam shRNAs específicos. O efeito do silenciamento gênico foi determinado por ensaios de viabilidade celular, análise de proliferação celular, ensaio clonogênico e de formação de colônias em soft ágar. Observamos que o silenciamento dos genes ATM, BRCA1, CHEK2 e HMGB1 reduziu a taxa de crescimento celular, o potencial de crescimento em colônia e a capacidade de crescimento independente de ancoragem das linhagens celulares derivadas de câncer cervical transformadas por HPV, sem afetar QHP. O tratamento das linhagens celulares com fármacos capazes de inibir a atividade das proteínas ATM e CHEK2 revelou uma maior sensibilidade das células tumorais à inibição destas proteínas quando comparadas a QHP. Além disso, mostramos que QHP que expressavam E6E7 ou somente E6 de HPV16 foram mais sensíveis a estes inibidores, quando comparados ao controle QHP ou QHP expressando apenas E7. Além disso, QHP que expressavam mutantes de E6 de HPV16, defectivos para a degradação de p53, foram menos sensíveis do que QHP, que expressavam HPV16 E6 selvagem. Desta forma, estes resultados indicam que estes genes são necessários para a sobrevivência de células transformadas por HPV. Além disso, os nossos resultados sugerem que este efeito está relacionado com a expressão oncoproteína de HPV16 E6 e a sua capacidade para degradar p53. / Human Papillomaviruses (HPV) are non-enveloped DNA viruses that infect epithelial cells. Persistent infection with some HPV types is the main risk factor for the development of cervical cancer. DNA repair machinery plays an essential role in several stages of the HPV life cycle and is crucial for tumor cells survival. During malignant transformation, HPV E6 and E7 oncoproteins induce structural and numerical chromosome alterations and modulate DNA damage response. These observations suggest that cellular DNA repair machinery may play a dual role in both HPV biology and pathogenesis. In the present study, we sought to investigate the role of DNA repair proteins in cervical cancer derived cells biology. In order to achieve this goal, the expression of 189 genes was silenced in HeLa (HPV18) and SiHa (HPV16) cells as well as in primary human keratinocytes (PHK) using lentiviral vectors expressing specific shRNA. The effect of gene silencing was determined by cell viability assay, cell growth analysis, clonogenic and soft agar colony formation test. We observed that ATM, BRCA1, CHEK2 and HMGB1 down-regulation decreased growth rate, clonogenic potential and cellular anchorage-independent growth of HPV-transformed cervical cancer-derived cell lines with no effect in normal keratinocytes. Treatment of cells with drugs that inhibit ATM and CHEK2 activity showed that tumor cells are more sensitive to the inhibition of these proteins than PHK. Besides, we show that PHK expressing HPV16 E6 alone or along with HPV16 E7 were more sensitive to these inhibitors than control PHK or PHK expressing only E7. Moreover, PHK expressing E6 mutants defective for p53 degradation were less sensitive than PHK expressing E6wt. Moreover, to potentiate the effect observed by the ATM and CHEK2 inhibition, we treated cells lines with Doxorubicin and Cisplantin. We observed that tumor cells lines and PHK expressing HPV16 E6 or HPV16 E6/E7 were more sensitive to DNA damage induction. Altogether, these results indicated that these genes are required for HPV-transformed cells survival. Besides, our results suggest that this effect is related to HPV16 E6 oncoprotein expression and its capacity to degrade p53.