INTRODUÇÃO: A esteatose é a doença hepática crônica mais frequente na população. Seus efeitos lesivos hepáticos podem adicionar-se aos efeitos da isquemia e reperfusão (I/R) nos transplantes de fígado e cirurgias hepáticas. Em ambos, o estresse oxidativo e o dano na microcirculação são importantes fatores na gênese da lesão hepática. Vários antioxidantes já foram testados em modelos experimentais de esteatose e I/R e mostraram benefício, entre eles a N-acetilcisteína (NAC). O óxido nítrico (NO) tem efeito controverso sobre a lesão de I/R, entretanto em baixas doses pode ser benéfico à microcirculação hepática. A S-nitroso-Nacetilcisteína (SNAC) fornece a NAC e também NO. Esta droga foi testada mostrando benefício em modelos experimentais de esteatose e I/R de músculo esquelético. Contudo, ainda não foi testada na lesão de I/R em fígados esteatáticos. MÉTODOS: Foram estudados 34 ratos machos Wistar divididos em 4 grupos: grupo I (n=8) - sem esteatose tratados com solução salina; grupo II (n=8) - sem esteatose tratados com SNAC; grupo III (n=9) - com esteatose tratados com solução salina; grupo IV (n=9) - com esteatose tratados com SNAC. A indução da esteatose foi realizada com dieta aproteica. Os animais foram submetidos a isquemia hepática parcial (70%) por um período de 1 hora e um período de reperfusão de 4 horas. A droga foi administrada por via intraperitoneal. Foram avaliados histologia, respiração mitocondrial e estresse oxidativo (MDA) hepáticos, transaminases séricas e mieloperoxidase e extravasamento do corante azul de Evans pulmonares. RESULTADOS: Não houve diferença entre os grupos I e II em todas as variáveis avaliadas (histologia, função mitocondrial (RCR e ADP/O), transaminases (AST e ALT), azul de Evans e mieloperoxidase pulmonares), encontrando-se apenas uma tendência a menor estresse oxidativo (MDA) (p = 0,07) no fígado isquêmico do grupo tratado (grupo II). A comparação entre os grupos III e IV não encontrou diferença nas transaminases (AST e ALT), e no azul de Evans e mieloperoxidase pulmonares. O grupo IV (esteatose e SNAC) apresentou no fígado isquêmico menor hemorragia intraparenquimatosa (p = 0,02), melhor função mitocondrial (RCR) (p = 0,01) (ADP/O) (p = 0,01), e menor estresse oxidativo (MDA) (p = 0,007) quando comparado com o grupo não tratado (grupo III). CONCLUSÕES: Neste modelo, o tratamento com SNAC não melhora a lesão de I/R em ratos sem esteatose. No entanto, a SNAC melhora a lesão hepática pós I/R em ratos com fígado esteatótico. / Steatosis is the most frequent chronic liver disease in general population. Steatosis can make ischemia/reperfusion (I/R) lesions worse in liver transplants and hepatic surgeries. Oxidative stress and hepatic microcirculatory damage are related to generation of steatosis and I/R lesions. Several antioxidant drugs, for example the N-acetylcysteine (NAC), have been already used in steatotic and I/R experimental models, and showed better outcome in treated groups. The nitric oxide (NO) has controversial effects on I/R, however, in low doses it can improve hepatic microcirculation. The S-nitroso-N-acetylcysteine (SNAC) releases NAC and NO. It ameliorated oxidative stress in experimental models of steatosis and skeletal muscle I/R. In contrast, this drug has never been used in steatotic liver I/R. METHODS: thirty four male Wistar rats were studied and divided in four groups: group I (n=8) - without steatosis and treated with saline solution; group II (n=8) - without steatosis and treated with SNAC; group III (n=9) - with steatosis and treated with saline solution; group IV (n=9) - with steatosis treated with SNAC. Aproteic diet was used for steatosis induction. The animals underwent a partial hepatic ischemia (70%) for 1 hour and reperfusion for 4 hours. The drug was administrated intraperitoneally. The parameters evaluated were hepatic histology, mitochondrial respiration and oxidative stress (MDA), seric transaminasis and pulmonary mieloperoxidasis and Evans blue extravasation. RESULTS: There were not any difference between groups I and II in all parameters evaluated (histology, mithocondrial function (RCR and ADP/O), transaminasis (AST and ALT), pulmonary Evans blue extravasation and mieloperoxidasis), and it showed only tendency of less oxidative stress (MDA) (p=0,07) in ischemic liver of treated group (group II). The comparison between groups III and IV didn\'t show any difference in transaminasis (AST and ALT), pulmonary Evans blue and mieloperoxidasis. Group IV (steatosis and SNAC) showed in the ischemic liver lower intraparenchymatous hemorrhage (p=0,02), better mitochondrial function (RCR) (p=0,01) and (ADP/O) (p=0,01), and less oxidative stress (MDA) (p=0,007) when compared with untreated group (group III). CONCLUSIONS: Based on this experimental model, SNAC treatment shows no benefit in non steatotic I/R lesion, however, in steatotic rats, SNAC ameliorates hepatic lesions post I/R.

INTRODUÇÃO: O tamanho ideal do fígado varia entre 0,8% a 4% do peso do receptor (graft to body weight ratio - GBWR). Em crianças com menos de 10 kg submetidas a transplante hepático com doador vivo encontramos frequentemente uma situação denominada large-for-size, que ocorre ao se implantar um enxerto com peso maior que 4% do peso corpóreo do receptor. A lesão de isquemia/reperfusão (LIR) é uma resposta inflamatória mediada pelas células de Kupffer, principais responsáveis pela liberação de espécies reativas de oxigênio no parênquima hepático. Além disso, a célula de Kupffer libera citocinas pró-inflamatórias como TNF-alfa, IL-1 e IL-6 que recrutam polimorfonucleares sistêmicos e linfócitos T-CD4+ perpetuando a lesão mesmo após o fluxo sanguíneo estar restabelecido. O hipofluxo portal pode piorar a LIR na situação large-for-size. Desta forma, um shunt mesentérico-cava tentando direcionar o fluxo para a veia porta poderia ser benéfico nesta situação. MÉTODOS: Dezesseis porcos LandraceLargewhite pesando entre 17 - 38 kg foram submetidos a transplante de fígado. Foram distribuídos em três grupos: controle (CTRL), large-for-size (LFS) e shunt (SHUNT). Foi aferido o fluxo venoso portal, arterial hepático e colhido material para estudo histológico e biomolecular uma hora após a reperfusão. A relação entre o fluxo venoso portal do receptor para o fluxo venoso portal doador (rFVP) foi utilizada para se correlacionar com a gravidade da isquemia/reperfusão. Foram realizadas biópsias uma hora após o transplante para microscopia óptica e TUNEL além de quantificar a expressão dos genes da iNOS, eNOS, IL-6, BAX e BCL, c-fos/c-jun, ICAM e TNF-?. RESULTADOS: O GBWR foi maior nos grupos LFS e SHUNT (3,45 vs. 5,06 e 6,03; p=0,009). Quando comparamos isoladamente receptores e doadores por grupo houve diferença no fluxo portal somente nos grupos LFS (890 ± 203 mL / min vs. 458 ± 119 mL / min, p=0.0034) e SHUNT (1003 ± 5,3 mL/min vs. 495 ± 277 mL/min; p=0,0031). A rFVP foi próxima de 1 no grupo CTRL e significativamente maior que nos grupos LFS e SHUNT (p=0,03). O fluxo arterial hepático foi significativamente menor no grupo SHUNT (62,16 ± 31 mL / min) quando comparado com grupo CTRL (140.4 ± 53.88 mL / min) e LFS (142 ± 55.41 mL / min), p=0,02. A IL-6 e BAX foram menos expressas no grupo CTRL (p=0,05 e p=0,002). Houve uma relação linear entre a expressão dos genes BAX, TNF-alfa e eNOS com a rFVP (p=0,02; p=0,02 e p=0,009 respectivamente). Na avaliação histológica observou-se índice de isquemia e reperfusão semelhante entre os grupos CTRL e SHUNT mas menor em relação ao LFS, 3, 3,5 e 7 respectivamente (p=0,04). CONCLUSÕES: O transplante large-for-size acarreta hipofluxo portal relativo, e isto pode estar relacionado a um maior dano hepatocitário com acentuação da lesão de isquemia-reperfusão. A presença de um shunt entre a veia cava inferior e a veia mesentérica superior não conseguiu aumentar o influxo de sangue para o fígado de maneira persistente e pode estar implicado na diminuição do fluxo arterial hepático. No entanto, o aumento temporário do influxo portal pode estar relacionado a atenuação de algumas características da LIR no transplante large-for-size / INTRODUCTION: The optimum size of the liver graft for transplantation varies between 0.8% and 4% of the weight of the recipient (graft to body weight ratio - GBWR). In children with less than 10 kg who undergo liver transplantation with living donor a disorder called large-for-size (LFS) often occurs, when a graft weighing more than 4% of body weight of the recipient is implanted. Ischemia / reperfusion injury (IRI) is an inflammatory response mediated by Kupffer cells, mainly responsible for the release of reactive oxygen species in the liver parenchyma. In addition, Kupffer cells releases proinflammatory cytokines such as TNF-alfa, IL-1 and IL-6 that recruit systemic polymorphonuclear cells and T-CD4 + perpetuating this injury even after the blood flow is restored. Low portal flow may worsen IRI in LFS situation. So, a mesocaval shunt directing the flow to portal vein should be beneficial in this condition. METHODS: Sixteen Landrace/Largewhite pigs weighing approximately 20 kg (17-38 kg) underwent liver transplantation. They were divided into three groups: control (CTRL), large-for-size (LFS) and shunt (SHUNT). Portal venous flow was measured and liver and blood collected for histological and biomolecular study one hour after reperfusion. The relationship between the portal venous flow from the recipient to the donor portal venous flow (rFVP) was used to establish correlations with the parameters of ischemia and reperfusion. Biopsies were performed one hour after transplant to assess ischemia/reperfusion injury, TUNEL and quantify the following genes expression: iNOS, eNOS, IL-6, BAX and BCL c-fos / c-jun, ICAM, and TNF-alfa. RESULTS: GBWR was higher in groups LFS and SHUNT than CTRL (3.45 vs. 5.06 and 6.03; p=0.009). When compared separately by group recipients and donors difference in portal flow was observed only in LFS groups (890 ± 203 mL / min vs. 458 ± 119 mL / min, p=0.0034) and SHUNT (1003 ± 5.3 mL / min vs. 495 ± 277 mL / min, p=0.0031). rFVP was close to 1 in the CTRL group and significantly higher than the LFS and SHUNT groups (p= 0.03). Hepatic artery blood flow was significantly lower in SHUNT group (62.16 ± 31 mL / min) compared with CTRL group (140.4 ± 53.88 mL / min) and LFS (142 ± 55.41 mL / min), p= 0.02. IL-6 and BAX were expressed less in the CTRL group (p=0.05 and p=0.002). There was a linear relationship between the BAX, TNF-alfa and eNOS with rFVP (p=0.02, p=0.02 and p=0.009 respectively). Histological evaluation showed similar ischemia-reperfusion index between CTRL and SHUNT groups but lower values in compare to LFS group, 3, 3.5 and 7 respectively (p=0.04). CONCLUSIONS: The largefor-size liver transplantation leads to a relative low portal venous flow and this can be related to greater hepatocyte damage with accentuation of ischemia-reperfusion injury. The presence of a shunt between the inferior vena cava and the superior mesenteric vein could not increase the inflow of blood to the liver persistently and may be implicated in decreased hepatic artery blood flow. However, the temporary increase in portal inflow may be related to mitigation of some characteristics of IRI in large-for-size liver transplantation

A obstrução intestinal representa uma das afecções abdominais agudas mais frequentes, com altas taxas de complicações e mortalidade, principalmente na vigência de sepse decorrente da isquemia intestinal. A reanimação volêmica precoce na sepse implica em ganho de sobrevida, entretanto, algumas discussões referentes ao fluido utilizado ou mesmo à terapêutica associada com drogas persistem atuais. Desta forma, o presente estudo propõe avaliar os efeitos da solução salina hipertônica e da pentoxifilina na resposta inflamatória e no estresse oxidativo, em modelo experimental que se assemelha ao problema clínico. Foram utilizados 36 ratos Wistar machos com peso entre 250 e 300 g. Os animais foram submetidos à laparotomia exploradora com ligaduras do íleo terminal a 10 cm e 1,5 cm da válvula íleo-cecal, além de oclusão do pedículo vascular responsável pela irrigação deste segmento intestinal. Após 24 horas, os animais foram reoperados e distribuídos em grupos (N=6), conforme o tratamento: sem reanimação volêmica (OI); Ringer lactato - 32 mL/kg (RL); solução salina hipertônica a 7,5% - 4 mL/kg (SH); pentoxifilina 25 mg/kg (PTX); Ringer lactato com pentoxifilina (RLPT) e solução salina hipertônica com pentoxifilina (SHPT). Ao término do tratamento, realizou-se ressecção do segmento intestinal isquêmico e anastomose para estabelecimento do trânsito intestinal. Os animais foram observados por duas horas, com medidas da pressão arterial média (PAM) registradas em 4 momentos. Após o período de observação, os animais foram submetidos à eutanásia com coleta do intestino e pulmão para análise. A quantificação do malondialdeído (MDA), no pulmão e intestino, foi realizada através do TBARS. No tecido pulmonar, também foram avaliadas as citocinas inflamatórias (IL-1?, IL-6, IL- 10 e CINC-1) pelo método de ELISA e o fator de transcrição nuclear fosforilado (NF-??) por Western blot. Os níveis da PAM, aos cinco minutos após o tratamento, ficaram mais elevados nos grupos RL e SH (p<0,05), com valor maior no SH em relação ao RL (p<0,05); aos 45 minutos, não se observou diferença nos níveis da PAM. A expressão das citocinas IL-1?, IL-6 e CINC-1 foi menor nos grupos SH, PTX e SHPT em relação ao OI e RL (p<0,05). Os grupos SH, PTX e SHPT apresentaram níveis inferiores de IL-1? e IL-6 comparadas ao RLPT (p<0,05) e os grupos SHPT e PTX foram iguais entre si. A expressão de IL-10 foi menor no grupo SHPT quando comparada ao OI (p<0,05). A expressão do NF-?B nos grupos SH, PTX e SHPT foi menor em relação ao OI (p<0,05), sendo que o SHPT ainda foi menor que o RL (p<0,05). Referente ao estresse oxidativo, no pulmão houve menor produção do MDA no grupo SHPT comparado aos demais (p<0,05) e no intestino, o MDA foi inferior nos grupos SH, PTX, RLPT e SHPT comparados aos OI e RL (p<0,05). Estes resultados permitem concluir que a solução salina hipertônica a 7,5% associada ou não à pentoxifilina, e a pentoxifilina isoladamente, atenuam o estresse oxidativo e inibem a ativação do NF-?B, implicando em menor atividade inflamatória com redução na produção de citocinas / Intestinal obstruction is one of the most common acute abdominal diseases, with high rates of complications and mortality, especially in the presence of sepsis due to intestinal ischemia. The early volume resuscitation in sepsis involves survival gain, however, some discussions concerning the fluid used or even combination therapy with drugs persist today. The present study proposes to assess the effects of hypertonic saline and pentoxifylline on inflammatory response and oxidative stress in an experimental model resembling the clinical problem. The study included 36 male Wistar rats weighting between 250 and 300 g. The animals underwent laparotomy with ligation of the terminal ileum 10 cm and 1.5 cm from the ileocecal valve and occlusion of the vascular pedicle responsible for the irrigation of this intestinal segment. After 24 hours, the animals were reoperated and distributed in groups (N=6), according to treatment: without volume resuscitation (OI); Ringer lactate - 32 mL/kg (RL), hypertonic saline 7.5% - 4 mL/kg (HS); pentoxifylline 25 mg/kg (PTX); Ringer lactate with pentoxifylline (RLPT) and hypertonic saline with pentoxifylline (SHPT). After the infusion of the drugs, the ischemic bowel was resected and performed the anastomosis for establishment of intestinal transit. The animals were observed for two hours, with measurements of mean arterial pressure (MAP) recorded in 4 times. After the observation period, the animals were euthanized with bowel and lung collection for analysis. Inflammatory cytokines (IL-1?, IL-6, IL-10 and CINC-1) were assessed by ELISA and phosphorylated nuclear transcription factor (NF-??) was determined by Western blot, both measured in lung tissue. The quantification of the malondialdehyde (MDA) in the lung and intestine was performed using the TBARS assay. Initial levels of MAP were higher in groups RL and HS than others (p<0.05), but at the end levels were similar in all groups. The expression of IL-1?, IL-6 and CINC-1 was lower in the SH, PTX and SHPT groups compared to OI and RL (p <0.05). The SH, SHPT and PTX groups showed lower levels of IL-1? and IL-6 compared to RLPT (p <0.05) and SHPT and PTX groups were equal. The synthesis of IL- 10 was lower in SHPT compared to OI (p <0.05). The expression of NF-?B in SH, PTX and SHPT groups was lower compared to OI (p <0.05), whereas the SHPT was still less than the RL (p <0.05). MDA in the lung was lower in SHPT compared to the other groups (p<0.05) and in the intestine was lower in SH, PTX, RLPT and SHPT groups compared to OI and RL (p<0.05). The results indicate that hypertonic saline 7.5% with or without pentoxifylline, and pentoxifylline alone attenuate oxidative stress and inhibit the activation of NF-?B, resulting in lower inflammatory activity with reduced production of cytokines

INTRODUÇÃO: As técnicas de preservação pulmonar visam a melhorar a qualidade do enxerto e aumentar sua tolerância ao período de isquemia fria. A técnica mais usada atualmente consiste na perfusão da artéria pulmonar com Perfadex. O alto custo associado à importação dessa solução e as dificuldades logísticas dos portos e aeroportos brasileiros com relação a materiais médicohospitalares têm causado problemas para os centros de transplante pulmonar brasileiros. Daí a necessidade de uma solução de preservação pulmonar produzida no Brasil. O objetivo desse estudo é comparar a solução Perfadex com a solução de fabricação nacional LPD-G, quanto ao grau de lesão de isquemia-reperfusão, em um modelo de perfusão pulmonar ex vivo (PPEV). MÉTODOS: Foram usados doadores em morte cerebral, cujos pulmões foram recusados. Cada caso era incluído aleatoriamente em um dos grupos: Grupo 1, a preservação pulmonar era realizada com Perfadex, e Grupo 2, era usado o LPD-G, solução fabricada no Brasil com composição idêntica a do Perfadex. Após a captação, os pulmões eram armazenados a 4 °C por 10 horas. A reperfusão ocorria em um sistema de PPEV, no qual o bloco pulmonar era ventilado e perfundido por uma solução acelular a 37 °C por 60 minutos. A lesão de isquemia-reperfusão era medida através de parâmetros funcionais (gasometria, resistência vascular pulmonar, complacência pulmonar, relação peso úmido/peso seco) e histológicos. Foram feitas biópsias pulmonares em 3 tempos: antes da captação, após o período de isquemia fria e depois da reperfusão. Vários critérios foram usados (edema alveolar, edema intersticial, hemorragia etc.) para criar um Escore de Lesão Pulmonar (ELP). A contagem de células apoptóticas foi feita usando a metodologia TUNEL (TdT-mediated dUTP nick end labeling). RESULTADOS: Após a reperfusão, a capacidade de oxigenação média foi de 405,3 mmHg no Grupo 1 e 406,0 mmHg no Grupo 2 (p = 0,98). A mediana da resistência vascular pulmonar nos pulmões do Grupo 1 foi de 697,6 dina.s.cm-5, enquanto no Grupo 2, esse valor foi de 378,3 dina.s.cm-5 (p = 0,035). A complacência pulmonar média ao final da reperfusão foi de 46,8 cmH2O no Grupo 1 e de 49,3 ml/cmH2O no Grupo 2 (p = 0,816). A razão entre o peso úmido e o peso seco foi em média 2,06 e 2,02 nos Grupos 1 e 2, respectivamente (p = 0,87). Na biópsia realizada após reperfusão, o ELP médio foi de 4,37 e 4,37 nos Grupos 1 e 2, respectivamente (p = 1,0); a contagem de células apoptóticas foi de 118,75/mm2 e 137,50/mm2 nos Grupos 1 e 2, respectivamente (p = 0,71). CONCLUSÕES: A qualidade da preservação pulmonar obtida com a solução LPD-G nacional é semelhante a obtida com o Perfadex. A aplicação clínica da nova solução pode reduzir custos, facilitando a manutenção e a abertura de centros de transplante pulmonar / INTRODUCTION: Pulmonary preservation techniques aim at improving graft quality and increasing tolerance during reperfusion and cold ischemia times. Currently, the most used technique consists of pulmonary artery anterograde perfusion with Perfadex. The high cost associated with the importation of this solution and the logistical difficulties of our ports and airports regarding medical supplies have caused problems for lung transplant centers in Brazil. Therefore there is need for a preservation solution manufactured in Brazil. The aim of this study is to compare the pulmonary preservation solutions Perfadex and LPD-G manufactured in Brazil in an ex vivo lung perfusion (EVLP) model. METHODS: Donors with brain death, whose lungs had been declined by transplantation teams were used. Cases were randomized into two groups: in Group 1, Perfadex was used for pulmonary preservation. In Group 2, LPDnac, a solution manufactured in Brazil and whose compositon is identical to Perfadex, was used. After harvesting, lungs were stored at 4 °C for 10 hours. An EVLP system was used and the pulmonary block was ventilated and perfused by an acellular solution at 37 °C for 60 minutes. Ischemic-reperfusion injury was measured by functional (blood gas, pulmonary vascular resistance, lung compliance, wet/dry weight ratio) and histological parameters. Pulmonary biopsies were performed at three time points: before harvesting, 10 hours after cold ischemia and 60 minutes after reperfusion. Samples were prepared for light microscopy analysis. Several criteria were used (alveolar edema, interstitial edema, hemorrhage etc.) to create a lung injury score (LIS). Apoptotic cell count was carried out using the TUNEL methodology (TdT-mediated dUTP nick end labeling). RESULTS: After reperfusion, mean oxygenation capacity was 406.0 mmHg in Group 2 and 405.3 mmHg in Group 1 (p = 0.98). Mean pulmonary vascular resistance in Group 2 lungs was 378.3 dina.s.cm-5, whereas in Group 1 it was 697.6 dina.s.cm-5 (p = 0.035). Mean pulmonary compliance by the end of reperfusion was 49.3 ml/cmH2O in Group 2 and 46.8 cmH2O in Group 1 (p = 0.816). Mean wet/dry weight ratio was 2.02 and 2.06 in Groups 2 and 1, respectively (p = 0.87). Mean LIS for the biopsy performed after reperfusion was 4.37 and 4.37 in Groups 2 and 1, respectively (p= 1.0); apoptotic cell count was 137.50/mm2 and 118.75/mm2 in Groups 2 and 1, respectively (p = 0.71). CONCLUSION: The preservation solution manufactured in Brazil proved to be as good as Perfadex. The clinical application for the new solution may reduce costs, favoring the maintenance and opening of pulmonary transplantation centers

A Manobra de Pringle é tempo cirúrgico fundamental, e de uso rotineiro em cirurgia hepática, tanto no trauma, como nas ressecções eletivas e nos transplantes. Têm como principal objetivo minimizar o sangramento intraoperatório, não obstante, leve, invariavelmente, à isquemia hepática transitória, à congestão vascular, e à isquemia do território esplâncnico, promovendo distúrbios hemodinâmicos indesejáveis. Algumas drogas têm sido testadas no sentido de minimizar a lesão de isquemia e reperfusão induzida pela Manobra de Pringle. A pentoxifilina tem demonstrado efeitos benéficos contra a lesão de isquemia e reperfusão no fígado. Atua, principalmente, na microcirculação, e também tem ação imunomoduladora. Assim, os objetivos dessa pesquisa foram: comparar os efeitos do uso da pentoxifilina por via portal ou periférica sobre a hemodinâmica regional e sistêmica, bem como a eventual ação hepatoprotetora na lesão de isquemia e reperfusão induzida pela manobra de Pringle. Vinte e quatro cães adultos, machos, e sem raça definida, foram anestesiados com sevoflurano e submetidos à ventilação mecânica. Para adequada descompressão do território esplâncnico, e com o objetivo de conseguir uma isquemia hepática isolada e prolongada, utilizamos derivação venosa extra-corpórea esplenofemural com bomba ativa tipo rolete. A veia pancreatoduodenal foi canulada e posicionado cateter na veia porta para perfusão normotérmica do fígado, utilizando-se bomba de infusão contínua. As variáveis hemodinâmicas foram obtidas através de cateteres posicionados na veia porta, artéria femoral direita, e cateter de Swan-Ganz na artéria pulmonar. As avaliações de perfusão esplâncnica foram realizadas com fluxômetro ultra-sônico na artéria hepática e na veia porta e tonometria a gás. Após 45 minutos de isquemia hepática, obtida pelo clampeamento do pedículo hepático, o fluxo hepático foi restabelecido e os animais observados por mais 120 minutos. Os animais foram divididos em três grupos experimentais: controle (n=8), perfusão do fígado com 500 mL de soro fisiológico a 0,9% durante os 45 minutos de isquemia; grupo pentoxifilina intra-hepático n=8, perfusão hepática com solução de pentoxifilina 50mg/Kg diluída em 500 mL de soro fisiológico a 0,9%; e grupo pentoxifilina sistêmica n=8 perfusão hepática com 500mL de soro fisiológico 0,9% e pentoxifilina 50mg/Kg via sistêmica administrada por veia periférica dissecada no membro superior esquerdo. Foram analisadas variáveis hemodinâmicas sistêmicas e esplâncnicas, gasométricas, tonometria gástrica, metabolismo de oxigênio, enzimas hepáticas e estudo histológico. O grupo pentoxifilina sistêmica apresentou melhora significativa do débito e índice cardíaco aos 60 minutos de reperfusão, em relação ao grupo controle. O fluxo venoso portal e o índice de fluxo de veia porta apresentaram melhora significativa no grupo pentoxifilina sistêmica, em relação ao grupo controle, após 45 minutos de reperfusão, permanecendo assim até o final do experimento. O grupo pentoxifilina intra-hepático também demonstrou melhora do fluxo venoso portal, porém sem alcançar significância estatística. Nos grupos tratados com pentoxifilina, os níveis séricos das enzimas hepáticas (TGO, TGP e LDH) também foram menores do que no grupo controle, ficando próximo à significância estatística. Assim, nas condições da presente pesquisa, pode-se concluir que a administração de pentoxifilina determinou melhora do fluxo venoso portal, quer pela via sistêmica, quer pela via portal. A administração da pentoxifilina pela via sistêmica promoveu melhora estatisticamente significante do fluxo venoso portal, do débito e do índice cardíaco, em relação ao grupo controle. Finalmente, a administração da pentoxifilina na vigência da manobra de Pringle sugere efeito hepatoprotetor / Portal triad occlusion (Pringle maneuver) is currently used during most hepatic resections for trauma or malignancies in order to decrease intraoperative bleeding. However this maneuver is associated with hepatic ischemia and splanchnic congestion. In this setting, many drugs have been tested to decrease the ischemia-reperfusion injury induced by this maneuver. Pentoxifylline, a methylxanthine derivative, has been shown to have beneficial effects on intestinal microvascular blood flow as well as hepatic blood flow during shock and resuscitation. The beneficial effects of pentoxifylline can be associated to the inhibition of inflammatory cytokines, such as TNF- a and IL-6. Our objective was evaluated the potential systemic and regional benefits of intraportal or systemic infusion of pentoxifylline during an experimental model of normothermic hepatic ischemia. Twenty four dogs were evaluated in this study. They were anesthetized with sevofluorane and subjected to mechanical ventilation. During hepatic ischemia period we used an active spleno-femoral. A catheter placed, trough the pancreatoduodenal vein, was used to perform hepatic perfusion. Systemic hemodynamics were evaluated through a Swan-Ganz and arterial catheters. Gastric mucosal pCO2 (gas tonometry), portal vein and hepatic artery blood flow (ultrasonic flowprobes), systemic and regional O2-derived variables, as well as liver enzymes (ALT, AST, DHL) were evaluated throughout the protocol. The animals were subjected to 45 minutes of ischemia. Previously to the Pringle maneuver the animals were randomized in three experimental groups: control (n=8), hepatic perfusion with 500 ml of saline solution; intraportal pentoxifylline (n=8) hepatic perfusion with saline solution + 50 mg/Kg of pentoxifylline; and systemic pentoxifylline (n=8) hepatic perfusion with 500 ml of saline solution and intravenous infusion of 50 mg/Kg of pentoxifylline (brachial vein). After hepatic ischemia period the animals were followed for an additional 120 minutes. Systemic infusion of pentoxifylline improved significantly cardiac output, as well as portal vein blood flow when compared with control group. Intraportal infusion of pentoxifylline presented a partial increase of portal vein blood flow. In both groups treated with pentoxifylline, there was a significant decrease in markers of hepatic cell injury during the reperfusion period when compared with control group. We conclude that systemic or intraportal infusion of pentoxyfilline improves portal vein blood flow, after 45 minutes of hepatic ischemia. Systemic infusion of pentoxifylline promotes a significant improvement in cardiac output when compared with control group. Our findings suggested that regional or systemic infusion of pentoxifylline minimize the deleterious effects of Pringle\'s maneuver

Introdução: O trauma é um fenômeno que cursa com lesão tecidual, sendo que o trauma cirúrgico (TC) apresenta a referida lesão como consequência de um ato cirúrgico. A isquemia seguida de reperfusão (IR) é um evento comum em várias condições patológicas, bem como em diversos procedimentos cirúrgicos, principalmente transplantes. É frequente o desenvolvimento de lesões teciduais locais e remotas após trauma e após a I/R, parte de um fenômeno conhecido como síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SRIS), frequentemente seguida pela falência de múltiplos órgãos (FMO). Estudos provaram o envolvimento do neutrófilo em tais síndromes como resultado da ação de enzimas proteolíticas secretadas a partir de grânulos citoplasmáticos, radicais livres produzidos por explosão respiratória e citocinas liberadas após a infiltração nos tecidos. Nesse contexto, foi provado que o pré-condicionamento isquêmico (PCI), definido como curtos episódios de isquemia precedendo a IR, protege contra essas lesões, com menor ativação de neutrófilos. No entanto, o conhecimento a respeito dos mecanismos operantes nos neutrófilos após o trauma cirúrgico, a isquemia seguida de reperfusão ou o pré-condicionamento isquêmico, ainda são preliminares. Objetivo: Analisar com maior profundidade o impacto dessas condições (TC, IR e PCI) no proteoma e fosfoproteoma do neutrófilo. Métodos: Foi realizada a análise de parâmetros hematológicos juntamente com a análise proteômica e fosfoproteômica de neutrófilos de ratos submetidos a TC, IR e PCI, comparados ao grupo controle. A análise proteômica foi realizada em sistema de nLC-MS/MS orbitrap de alto desempenho, usando marcação com iTRAQ, enriquecimento de fosfopeptídios e pré-fracionamento por HILIC. A análise estatística baseada em clusters utilizando scripts em R mostrou proteínas com abundância relativa diferencial em todas as condições. Resultados: A avaliação dos parâmetros hematológicos antes e depois de TC, IR e IPC demonstrou alterações no número, forma e tamanho de linfócitos, hemácias, plaquetas e, principalmente, neutrófilos (granulócitos). Observou-se um claro aumento na contagem de neutrófilos após TC e IR, sendo que tal aumento foi prevenido pelo PCI. Um total de 393 proteínas foram determinadas como reguladas para abundância relativa entre o grupo controle e o grupo TC. A maioria das proteínas encontradas como reguladas em comum nos grupos TC e IR estão relacionadas à apoptose (caspase-3), motilidade celular (PAK2), transdução de sinal (IL-5, IL-6 e TNF) e degradação pelo sistema proteassoma no neutrófilo. Maior produção de espécies reativas de oxigênio e disfunção da migração direcional de neutrófilos (PKC-delta) com aumento do tempo de vida dos neutrófilos são eventos iniciais importantes que podem resultar em mais dano tecidual e em infecção. A análise proteômica de neutrófilos de ratos após PCI levou à identificação de 2437 grupos de proteínas atribuídos a 5 clusters diferentes, contendo proteínas de abundância relativa significativamente aumentada ou diminuída em IR e PCI. O estudo de vias desses clusters baseado no KEGG revelou aumento nas vias de fagocitose mediada por Fc-gama R, sinalização por quimiocinas, adesão focal e migração transendotelial, citoesqueleto de actina, metabolismo e diminuição nas vias ribossomais, de transporte de RNA, de processamento de proteínas. A regulação da fosforilação de proteínas após IR e PCI mostrou algumas vias como quimiocinas, Fc-gama, GPCR, migração celular e vias pró e antiapoptóticas, sendo que a via de splicing alternativo foi a que apresentou regulação mais evidente (p < 0.0001). A regulação da abundância, bem como da fosforilação, presença de motivos e de domínios levou à identificação de fosfatases, como Fgr, GRK2, PKC delta, ptpn6 e ptprc reguladas por IR, bem como stk38, pkn1, syk e inpp5d reguladas por PCI. A interação mais marcante entre proteínas foi demonstrada como sendo entre os receptores de Fgr e Ptp. Conclusão: Concluímos que as alterações causadas por TC, IR e PCI levaram a intenss alterações na abundância de algumas proteínas e em eventos de fosforilação em neutrófilos, levando ao efeito destrutivo observado após a IR e ao efeito protetor consequente ao PCI / Introduction: Trauma is a phenomenon that involves tissue injury, whereas the surgical trauma (ST) has such injury as a consequence of a surgery. Ischemia reperfusion is common event in many surgical procedures, especially in transplants, as well as in many pathological conditions. Local and remote tissue injuries usually develop after trauma and ischemic reperfusion, part of a phenomenon known as systemic inflammatory response syndrome, frequently followed by multiple organ failure (MOF). Studies have proven the involvement of the neutrophil in all these injuries as a result of proteolytic enzymes secreted from cytoplasmic granules, free radicals produced by respiratory burst, cytokines released after tissue infiltration. In that context, ischemic preconditioning (IPC), that are short episodes of ischemia before ischemia reperfusion, was proved to be protective against these injuries with less activation of neutrophils. However the knowledge about the underlying mechanism operating in the neutrophil after surgical trauma, ischemia reperfusion and preconditioning is preliminary. Objective: To deeply analyze the impact of these conditions (ST, IR and IPC) on the neutrophil proteome and phosphoproteome. Methodology: We did hematological analysis along proteomics and phospho proteomics through high throughput nLC-MS/MS analysis by orbitrap using iTRAQ labeling, phospho peptide enrichments, and HILIC pre-fractionation. Neutrophils from control, ST, IR and IPC conditions after extraction were processed for proteomic analysis. Statistical package using R based on cluster analysis led to the detection of differentially regulated proteins in all conditions. Results: The evaluation of the hematological parameters before and after ST, IR or IPC on blood cells stated alteration in size, number and shape of lymphocytes, RBCs, platelets and specially neutrophils (granulocytes). In the analysis, a clear increase in neutrophil count after ST and IR with such increase prevented by IPC. A total of 393 proteins were found differentially regulated between control and trauma groups. Most of the common proteins found regulated in trauma and IR seem to be related to apoptosis (caspase-3), cell motility (PAK2) and signal transduction in IL5, IL6 and TNF and proteasomal degradation in neutrophil. Higher oxygen species production and dysfunction of directional neutrophil migration (PKC delta) with increase in the life span of neutrophils are early important events that can finally result into more tissue damage and infection. The total proteomic analysis of rat neutrophils after IPC led to the identification of 2437 protein groups assigned to five different clusters with significantly up and downregulated proteins in IR and IPC. Cluster based KEGG pathways analysis revealed up-regulation of chemokine signaling, focal adhesion, leukocyte transendothelial migration, actin cytoskeleton, metabolism and Fc gamma R mediated phagocytosis, whereas downregulation in ribosome, spliceosome, RNA transport, protein processing in endoplasmic reticulum and proteasome, after intestinal ischemic preconditioning. The phosphoregulated proteins containing domains and motifs in the regulated peptides after IR and IPC led to the identification of some of important players such as chemokine, Fc gamma, GPCR, migration and pro/anti-apoptotic pathways. The phosphoproteins from alternative splicing was the pathway presenting the most remarkable regulation with a p-value of 0.0001. The regulation in expression as well as in phosphorylation, the presence of motifs and domains led to the identification of kinases and phosphatases including Fgr, GRK2, PKC delta, ptpn6 and ptprc in neutrophils after IR whereas stk38, pkn1, syk, and inpp5d in neutrophil due to IPC. The highest protein-protein interaction was shown by Fgr and Ptp receptors. Conclusion: We concluded that the changed stimulus produced after ST, IR and IPC led to the huge alteration in proteins expression and phosphorylation events in the neutrophil proteome as mentioned in our work, that leads to final destructive and protective phenotype of neutrophils respectively

Abstract Heart muscle has to work constantly throughout the life and its energy metabolism is heavily dependent on a continuous supply of oxygen. Energy metabolism must be effectively regulated to meet the demands of changing workloads in different circumstances. If the oxygen supply is interrupted, the function of the heart is easily disturbed and cells injured. Calcium metabolism is of great importance in these pathological conditions. In this thesis respiratory regulation was studied by non-destructive optical methods in mouse heart. The myoglobin-deficient mouse was used as an experimental model to avoid the artefact caused by intracellular myoglobin. Results show that increased consumption of energy and oxygen lead to concomitant reduction of cytochrome aa3 and oxidation of flavoproteins. This finding supports the view that cell respiration in intact myocardium is dominantly regulated at the level of the respiratory chain. The intracellular Ca2+ accumulation during ischemia is one of the major causes of irreversible ischemia-reperfusion injury. Ischemic preconditioning (IPC) has been shown to protect the heart muscle significantly from ischemic damage. In this thesis Ca2+ accumulation during ischemia and reperfusion was studied in perfused rat heart using Fura-2 as a fluorescent Ca2+ indicator. As there is a significant decrease in intracellular pH during prolonged ischemia, the pH-dependency of Fura-2 signal was taken into account. It was found that IPC attenuates Ca2+accumulation during ischemia and this was connected to a decrease in mitochondrial membrane potential. Both IPC and the pharmacologically induced preconditioning with the mitoKATP opener diaxozide were shown to be associated with increased production of superoxide monitored by means of lucigenin chemiluminescence. The superoxide production correlated with the oxidation-reduction state of flavoproteins. We also describe here a method for measuring of intracellular free Ca2+ in mouse heart during ischemia by simultaneous monitoring of Fura-2 and the pH probe BCECF fluorescence by means of dual wavelength excitation of both probes. The paradoxical decrease of Fura-2 fluorescence during ischemia indicating decreasing intracellular Ca2+ concentration was due to the pH effect on the dissociation constant of the Fura-2-Ca2+ complex. When the pH-dependency of Fura-2 was compensated, an extensive Ca2+ accumulation during ischemia was detected. Much of the previous literature on this subject must be re-evaluated because the pH-dependency of intracellular Ca2+ probes has been largely overlooked.

La méthode de préservation d’organes la plus utilisée actuellement en transplantation rénale est la conservation statique en hypothermie. Cependant, ce mode de conservation induit des dommages inhérents aux lésions du syndrome d’ischémie/reperfusion (I/R). Cette étude a eu pour objectif d’identifier de nouvelles conditions de préservation des greffons, afin de limiter les lésions d’I/R, en modulant la température de conservation ou par ajout d’un transporteur d’oxygène. Nous avons utilisé deux modèles : in vitro avec des cellules endothéliales et in vivo en autotransplantation rénale chez le porc.Les résultats ont confirmé les effets délétères de la conservation à 4°C contrairement à des conservations à 19°C, 27°C et surtout 32°C, permettant d’obtenir une activité métabolique, une viabilité et une intégrité cellulaire supérieures ainsi qu’une diminution des marqueurs de l’inflammation et du stress oxydant. Nous avons aussi démontré les bénéfices d'un nouveau transporteur d’oxygène, M101, dans deux des solutions de conservation les plus utilisés, UW et HTK. L'utilisation de M101 en conservation statique permet une meilleure reprise de fonction à court terme et une réduction de la fibrose, cause principale de la perte du greffon. Enfin, nous avons montré une conservation des bénéfices de M101 à des doses réduites et déterminé que cette protection était due à une multifonctionnalité de la molécule, combinant un transporteur d’oxygène, une activité superoxyde dismutase et une taille importante (permettant de réguler la pression oncotique). Ce travail a montré de nouvelles pistes de réflexion vers une préservation, et donc une qualité, supérieure des organes à transplanter. / The most used preservation method in renal transplantation is hypothermic cold storage (CS). However, this method induces damages inherent to the ischemia/ reperfusion (I /R) syndrome.My study was aimed at identifying new grafts preservation conditions, to limit I/R damage, by varying storage temperature or by adding an oxygen carrier.We used two models: in vitro with endothelial cells and in vivo in pig renal autotransplantation. The results confirmed the deleterious effects of 4°C storage in contrast to conservations at 19°C, 27°C and above 32°C, resulting in improved metabolic activity, cellular viability and integrity as well as a significant reduction in markers of inflammation and oxidative stress. Then we demonstrated the benefits of a new oxygen carrier, M101, in the two most used preservation solutions, UW and HTK. Indeed, use of M101 in CS protocols improved short-term function recovery and reduced fibrosis development, main cause of graft loss. Finally, we have shown that the benefits of M101 were preserved at lower doses and we determined that this protection was due to a multifunctionality of the molecule, combining oxygen transport, superoxyde dismutase activity and a large size (regulating oncotic pressure). This work permitted the uncovering of new concepts towards improved organ preservation and quality for transplantation.

The effect of cold acclimation on body of mammals has been studied for many decades by using relatively low temperatures for acclimation (6-10 řC). The results of these experiments have shown the important role of the adrenergic and thyroid system during acclimation and negative impact on renal system at the same time. In contrast, a recent study on winter swimmers suggests a possibility of positive influence of hardening on cardiovascular system. There is no available study investigating a relationship between cold adaptation and ischemia-reperfusion injury. The aim of this study was to establish a protocol of isolated rat heart and its fixation at our workplace. Furthermore, to find the impact of mild cold acclimation on the ischemia-reperfusion injury of rat. Methods of ex vivo heart perfusion and fixation were successfully established. The effect of 5 weeks long cold acclimation in 10 ± 2 řC on left ventricle ischemia-reperfusion injury was observed. Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)

Ischemic heart disease is the leading cause of death and disability worldwide. The effects of ischemic heart disease are usually attributable to the detrimental effects of acute myocardial ischemia/reperfusion (I/R) injury. The aim of the thesis was to contribute to current effort to clarify the basis of mechanisms that could save the heart from I/R injury. The whole thesis is based on four studies; while the first three are published, the fourth one has been under revision. In the first study, we proved the involvement of nitric oxide (NO) in the cardioprotective mechanism of chronic hypoxia (CH). We described that exogenously increased availability of NO as well as inhibition of phosphodiesterase type 5 led to increased myocardial tolerance of normoxic and chronically hypoxic rats. The effects of both interventions were not additive, suggesting that NO is included in cardioprotective signaling of CH. Second study continued in investigating molecular mechanisms underlying cardioprotection induced by CH. We showed that infarct size-limiting effect of adaptation to CH was accompanied by increased myocardial concentration of tumor-necrosis factor alpha (TNF-α) and TNF-α receptor R2. In the third study, we examined the effect of dexrazoxane (DEX), the only clinically approved drug against...