O Brasil possui o maior rebanho bovino comercial do mundo com sua produção baseada, predominantemente, em animais de origem zebuína (Bos indicus), com níveis do potencial genético de produção inferiores aos animais Bos taurus. Com a possibilidade de emprego de técnicas de genética molecular, a seleção de indivíduos melhoradores para acasalamento e multiplicação repercutem nos índices de produtividade e produção. A utilização de melhores métodos de estudo da variação genética no nível mole cular representa benefícios especialmente nos casos de resistência a doenças, já que essas características apresentam baixa herdabilidade e são afetadas pelo ambiente. O estudo da genética molecular visando o aumento da saúde da glândula mamária de bovinos apresenta a vantagem de poder selecionar animais em idades precoces, antes da produção, para ambos os sexos e, no caso dos machos reprodutores, sem a necessidade de aguardar por informações da saúde da glândula mamária observada somente na descendência dos animais. Para identificar genes com responsabilidade de conferir resistência à mastite bovina, a doença mais importante da bovinocultura, foram realizados diversos experimentos que envolveram um gene do complexo principal de histocompatibilidade (MHC – Major Histocompatibility Complex). Os experimentos com o gene BoLA-DRB3, do MHC, permitiram identificar um alelo novo, desenvolver uma técnica mais eficiente de genotipagem de animais e verificar a distribuição dos alelos em animais da raça Gir Leiteira. Foram também construídas biliotecas de cDNA utilizando a metodologia de ORESTES e tecido de glândula mamária de animais europeus e zebuínos infectados com Staphylococcus aureus . 6.481 sequências expressas (ESTs), obtidas por meio da metodologia de ORESTES, foram depositadas em bases públicas como o GenBank (http://www.ncbi.nih.nlm.gov/) e TIGR (http://www.tigr.org), sendo 5.950 provenientes de animais Bos indicus, o que significou um aumento de vinte vezes no volume de informações disponíveis sobre o transcriptoma de bovinos zebuínos ao tempo deste estudo. / Brazil is the largest cattle commercial herd in the world, mainly based in zebu (Bos indicus) with lower genetic potential than taurus-derived animals. Molecular genetics brought the possibility of better selection of animals for breeding, which increases production levels. The use of molecular methods for studying genetic variation is especially advantageous for disease resistance because of low herdability and envir onment effects. Selection by means of molecular genetics in dairy cattle can be done before production, for males and females. To identify genes responsible for conferring resistance to Mastitis, the most important cattle disease, we studied one gene from the MHC (Major Histocompatibility Complex). The experiments with this MHC gene (BoLA-DRB3) identified a new allele in cattle, developed a genotyping technique, and estimate allelic frequencies for Dairy Gir cows (Bos indicus). CDNA libraries from mammary gland tissues infected with Staphylococcus aureus were also constructed and characterized. 6,481 ESTs (Expressed Sequence Tags) were deposited in GenBank (http://www.ncbi.nih.nlm.gov/) and TIGR (http://www.tigr.org), being 5,950 from Bos indicus cows, which increased by 20-fold the volume of sequence data from the zebu transcriptome, at the time when this study was conducted.

A ocorrência de doenças em soja tem aumentado nos últimos anos, provocando grandes perdas em plantios comerciais e exigindo respostas rápidas da pesquisa para desenvolvimento e aplicação de técnicas de controle. Mais de 40 doenças afetam a cultura da soja em todo o mundo e dentre elas estão a ferrugem asiática (Phakopsora pachyrhizi Sydow) e a septoriose ou mancha parda (Septoria glycines Hemmi). Estas doenças estão disseminadas em praticamente todas as regiões produtoras de soja do Brasil. Os objetivos desse trabalho foram mapear o gene que confere resistência a P. pachyrhizi presente na cultivar de soja FT-2 e QTLs envolvidos na resistência a S. glycines, utilizando uma população de plantas F2 derivada do cruzamento entre as cultivares FT-2 (resistente) e Davis (suscetível). Marcadores microssatélites foram testados nos genitores, sendo os polimórficos utilizados para genotipar as plantas da geração F2. Progênies F3:2 e F4:2 foram obtidas e avaliadas para reação às doenças. Para a ferrugem da soja foram detectados cinco marcadores associados ao caráter, sendo que dois deles (Satt079 e Satt307) flanqueiam o gene dominante de resistência, que foi mapeado no grupo de ligação C2 da soja. Uma eficiência de seleção de 100% foi obtida com o uso simultâneo destes dois últimos marcadores, indicando que os mesmos podem ser ferramentas úteis para a seleção assistida de genótipos homozigóticos resistentes. Para a mancha parda, análises de regressão e de variância foram realizadas para identificar associações significativas entre marcadores e QTLs devido a efeitos aditivos e não aditivos do caráter. Foi realizado, também, o mapeamento por intervalo dos QTLs. As análises de regressão detectaram maior número de marcadores ligados a QTLs do que o mapeamento por intervalo; houve concordância entre os resultados dos dois métodos em apenas um caso, no qual o marcador Satt277, pertencente ao grupo de ligação C2, foi relacionado significativamente ao caráter. / The occurrence of soybean diseases that causes large yield losses in commercial fields has increased in recent years forcing research to face the challenge of providing quick responses to develop control techniques. More than 40 diseases affect soybeans worldwide, among them the Asian rust (Phakopsora pachyrhizi Sydow) and brown spot (Septoria glycines Hemmi). These diseases are spread in practically all Brazilian soybean cropping areas. The objectives of this work was to map the resistance gene to P. pachyrhizi and the QTLs involved in the resistance to S. glycines in the soybean cultivar FT-2, using an F2 plant population derived from the cross between FT-2 (resistant) and Davis (susceptible). SSR markers were tested in the parents and those showing polymorphism were used to screen plants of the F2 generation. F3:2 and F4:2 progenies were evaluated for disease reaction. Five markers associated to soybean rust resistance were detected and two (Satt079 and Satt307) are flanking a dominant resistance gene that was mapped in the C2 soybean linkage group. An efficiency of 100% was obtained with the simultaneous use of those markers for selection, which indicated that they could be useful in marker-assisted selection of resistant homozygous genotypes. For brown spot resistance, regression analyses and ANOVAs were performed to identify significant associations between markers and resistance QTL’s showing additive and non-additive effects. The interval mapping of the QTL’s was also performed. The regression analyses detected more markers linked to QTL’s than the interval analyses. Only the Satt277 marker (soybean linkage group C2) was significantly associated to the trait by both detection methods.

Um dos principais riscos associados às culturas inseticidas que expressam toxinas da bactéria Bacillus thuringiensis (Bt) é a evolução de resistência em pragas alvo, processo governado por fatores genéticos e bioecológicos que se inter-relacionam. Um dos parâmetros chave que influenciam a evolução de resistência é a freqüência inicial do alelo de resistência na população da praga alvo (FreqInicial). Devido à complexidade desse processo, experimentos para estudar sua evolução em larga escala são praticamente impossíveis. Modelos matemáticos de simulação têm sido utilizados para estimar a freqüência do alelo de resistência (FreqR) à toxina Bt ao longo das gerações da praga. O risco de resistência foi estimado utilizado o modelo de Caprio, incorporando incerteza ao parâmetro FreqInicial. Essa abordagem, denominada análise de incertezas, possibilita estimar o risco ao longo das gerações da praga, quantificado pela probabilidade de FreqR exceder um valor crítico. Os principais objetivos deste trabalho foram: (i) discutir o uso de análise de incertezas no contexto da estimação do risco de resistência e (ii) avaliar o efeito de diferentes distribuições da freqüência inicial do alelo de resistência (FreqInicial) sobre as estimativas de risco. Foi desenvolvido um software (RRiskBt), em linguagem Visual BASIC que permite quantificar o risco de resistência utilizando análise de incertezas. Os resultados da análise de incertezas indicaram que as estimativas de risco são afetadas pela distribuição de FreqInicial de modo diferenciado ao longo das gerações. As estimativas do risco de resistência, considerando a distribuição Normal para FreqInicial, são similares àquelas considerando a distribuição Triangular quando as referidas distribuições têm a mesma variância. O uso da distribuição Uniforme, ao invés da Normal ou Triangular em função da falta de informação sobre FreqInicial, leva à superestimação das estimativas de risco de resistência nas gerações iniciais e subestimação nas gerações subseqüentes à geração na qual a freqüência crítica é atingida. A análise de sensibilidade de FreqR a variações nos parâmetros FreqInicial ou DFRes possibilita estimar a geração a partir da qual a estimativa de FreqR independe da variação do parâmetro em questão dentro de um intervalo de valores possíveis preestabelecido. A utilização da análise de incertezas possibilita estimar a geração da praga alvo a partir da qual o risco de resistência é superior a 0,99, independentemente da distribuição utilizada para caracterizar a incerteza associada a FreqInicial. / One of the main risks associated to transgenic crops expressing Bacillus thuringiensis (Bt) toxins is the pest resistance evolution, process driven by genetic and ecological inter related factors. A key parameter that influences the rate of resistance evolution is the initial frequency of the resistance allele in the pest population (FreqInicial). Due to complexity of that process, large scale field experiments to investigate resistance evolution are practically impossible. Mathematical simulation models have been utilized to estimate the R allele frequency (FreqR) along pest generations. The resistance risk was estimated using the deterministic Caprio’s model, incorporating uncertainty to FreqInicial. That approach, called uncertainty analysis, allows to estimate resistance risk along generations. The risk is quantified by the probability of FreqR exceeding a critical value. The main objectives of this work were: (i) to discuss the use of uncertainty analysis in the context of risk resistance estimation and (ii) to evaluate the effect of different FreqInicial input probability distributions on the risk estimates. A software (RRiskBt) was developed in Visual BASIC language to quantify risk of pest resistance evolution to Bt toxins using uncertainty analysis. The results of uncertainty analysis showed that the influence of FreqInicial input distributions on the risk estimates changes along pest generations. The risk estimates considering input Normal distribution for FreqInicial are similar to those ones obtained considering Triangular distribution if their variances are equal. The use of Uniform distribution instead the Normal or Triangular due to lack of information about FreqInicial, leads to super estimation of risk estimates for the initial generations and sub estimation for the generations after the generation for which the critical frequency is achieved. The sensitivity analysis of FreqR to FreqInicial or DFRes allows to estimate the generation after which the FreqR estimates become independent of changes in the particular parameter. The uncertainty analysis allows to estimate the pest generation after which the resistance risk is higher than 0.99, independently of the FreqInicial input distribution.

Neste trabalho teve-se por objetivo estimar parâmetros genéticos e avaliar o potencial agronômico em gerações F2 e F3:2 de cruzamentos do tipo adaptado x exótico em soja, quanto ao potencial de gerar descendentes agronomicamente superiores e com resistência à ferrugem asiática. Ademais, procurou-se estudar a resistência a doenças de final de ciclo (DFC). Os experimentos nas gerações F2 e F3:2 foram conduzidos em 2007 e 2007/08, respectivamente, em áreas experimentais do Departamento de Genética, ESALQ/USP, Piracicaba, SP, Brasil. Foram utilizados como genitores exóticos resistentes: 1) PI 200487 (Kinoshita), 2) PI 471904 (Orba), 3) PI 459025 (Bing nan) e 4) PI 200526 (Shira Nuhi); e, como genitores adaptados, mas suscetíveis à ferrugem, foram utilizados os genótipos: 1) IAC-100, 2) MGBR 46 (Conquista), 3) BRSMT (Pintado), 4) BRS-154 e 5) BRS-232. Foram avaliados 27 cruzamentos em F2, sendo dez com recíprocos e sete sem recíprocos, e mais os nove genitores. Na geração F3:2 foram avaliados dois cruzamentos: Conquista x Orba e IAC-100 x Kinoshita; cada cruzamento foi avaliado em dois experimentos principais. Um destes experimentos foi protegido com aplicações dos fungicidas Impact Duo & Opera para controle da ferrugem e das DFC, enquanto que o outro recebeu apenas o fungicida Derosal para controle das DFC. Foram avaliadas 40 progênies F3:2 por recíproco de cada cruzamento. Além dos experimentos principais, foram instalados três experimentos auxiliares com 12 genótipos: quatro genitores exóticos, cinco genitores adaptados e três genótipos adicionais (BR-16, IAS-5 e OC-4). Cada experimento auxiliar recebeu um tratamento diferenciado de fungicida: Impact Duo & Opera, Derosal e Controle (sem aplicação de fungicida); o contraste do Impact Duo & Opera vs Derosal forneceu uma estimativa do efeito da ferrugem, enquanto que o contraste entre Derosal e Controle estimou o efeito das DFC. Os resultados levaram às seguintes conclusões: a) a estratégia de se usar diferentes tipos de fungicidas mostrou-se eficiente para estimar a reação das plantas à ferrugem e a DFC, em termos de produtividade de grãos; b) em relação às notas de severidade da ferrugem, a discriminação genotípica foi melhor observada a partir de 97 dias (S2) e 104 dias (S3) após a semeadura, respectivamente para genitores nos experimentos auxiliares e cruzamentos; c) no cultivo de outono (geração F2 e genitores), o hábito de crescimento indeterminado foi um caráter importante para o desempenho favorável dos genótipos; d) foram identificadas fontes de resistência/tolerância à ferrugem e a DFC entre os genitores exóticos e também, adaptados e adicionais; e) em F2, os cruzamentos envolvendo o genitor Orba foram os mais promissores e os cruzamentos com o genitor Shira Nuhi foram os menos promissores; o caráter valor agronômico mostrou-se eficiente na seleção de cruzamentos, pelos altos coeficientes de herdabilidade, observados no sentido amplo; f) em F3:2, o cruzamento IAC-100 x Kinoshita mostrou-se mais promissor do que o cruzamento Conquista x Orba, para o desenvolvimento de linhagens com níveis apropriados de resistência à ferrugem e produtividade de grãos; g) nas duas gerações as diferenças entre recíprocos ocorreram apenas em situações pontuais. / This work aimed to estimate genetic parameters and evaluate the agronomic potential in F2 and F3:2 generations of adapted x exotic soybean crosses, concerning the potential to generate progenies with higher agronomic offspring and with resistance to Asian soybean rust. Moreover, the resistance to late season leaf diseases (LSLD) was studied. The experiments in F2 and F3:2 generations were carried out during 2007 and 2007/08, respectively, in the Department of Genetics, ESALQ/USP, Piracicaba, SP, Brazil. As resistant exotic parents were used: 1) PI 200487 (Kinoshita), 2) PI 471904 (Orba), 3) PI 459025 (Bing nan) and 4) PI 200526 (Shira Nuhi); and as adapted parents, but susceptible to soybean rust, were used: 1) IAC-100, 2) MGBR 46 (Conquista), 3) BRSMT (Pintado), 4) BRS-154 and 5) BRS-232. Twenty seven crosses in generation F2, ten with reciprocals and seven without reciprocals were evaluated, plus the nine parents. In F3:2 generation, two crosses were evaluated: Conquista x Orba and IAC-100 x Kinoshita. Each cross was evaluated in two main experiments, one of them was protected with applications of the Impact Duo & Opera fungicides, to control soybean rust and LSLD, while the other experiment was spraied with Derosal to control only the LSLD. For each reciprocal cross, were evaluated 40 progenies in F3:2. Besides the main experiments, three auxiliary experiments were installed, with twelve genotypes: four exotic parents, five adapted parents and three additional parents (BR-16, IAS-5 and OC-4). Each experiment received one differential treatment of fungicide: Impact Duo & Opera, Derosal and Control (no applications of fungicide); the contrast Impact Duo & Operal vs. Derosal gave an estimate of the Asian soybean rust effect, while the contrast between Derosal and Control estimated the LSLD effect. The results led to the following results: a) the strategy of using different types of fungicides were effective in estimating the response of plants to rust and LSLD, in terms of grain yield; b) in relation to the notes of severity of rust, genetic discrimination was better observed from 97 days (S2) and 104 days (S3) after sowing, respectively for parents in the auxiliary experiments and crosses; c) in the cultivation of autumn (parents and F2 generation), the indeterminate growth habit was an important character to the favorable performance of the genotypes; d) sources of resistance/tolerance to rust and LSLD were identified among exotic, adapted and additional parents; e) In F2 generation, crosses having Orba as parent were the most promising and crosses involving Shira Nuhi were the less promising; agronomic value (VA) showed to be efficient for cross selection, by the high magnitude of the heritability coefficient, observed in broad sense; f) In F3:2 generation, the cross IAC-100 x Kinoshita showed more promising than Conquista x Orba cross, for the development of lines with appropriate levels of resistance to soybean rust and high grain yield; g) in the two generations, the differences between reciprocals occurred only in specific situations.

Na região dos cerrados, as principais culturas de cobertura utilizadas para a produção de palha no sistema de plantio direto são o milheto (Pennisetum glaucum R. BR.) e as aveias (Avenas spp.). No entanto, a resposta dessas espécies vegetais frente ao nematóide das lesões (Pratylenchus brachyurus) e o das galhas (Meloidogyne incognita) são escassas. O objetivo do presente trabalho é de verificar a resposta de genótipos de milhetos, aveias e outras coberturas vegetais a Pratylenchus brachyurus e de aveias a Meloidogyne incognita sob condições controladas. Desenvolveram-se quatro experimentos no total, no experimento 1, os cultivares de milhetos testados foram resistentes ao nematóide (FR<1,0) com exceção da cultivar ADR 500 (população BA). No experimento 2, as aveias pretas contribuíram para a redução populacional (resistentes) de P. brachyurus, fato oposto, pode ser verificado para as aveias branca e amarela (suscetíveis). No terceiro experimento, diferentemente do verificado no experimento 1, os milhetos se mostraram suscetíveis a P. brachyurus, e, o sorgo BRS-800 foi a cobertura que mais incrementou a densidade do nematóide, equiparando-se estatisticamente com a soja BRS 133. No quarto experimento, verificou-se aumento da densidade das três populações de M. incognita nas aveias pretas testadas, em contraposição à redução verificada na aveia branca UFRGS 17 e amarela São Carlos. / In Cerrado region, the main cover crop used in no tillage system are the pearl millet (Pennisetum glaucum) and the oats (Avena spp.). However, the response of these vegetable species to lesion nematode (Pratylenchus brachyurus) and to root-knot nematode (Meloidogyne incognita) is scarce. The aim of the present work was verify the response of the pearl millet genotypes, oats and other cover crops to P. brachyurus and of oats to M. incognita under greenhouse conditions. Four experiments were done; in experiment 1, the pearl millet cultivars tested were resistant to nematode (FR<1.0) with exception of the cultivar ADR 500 (population BA). In experiment 2, the black oats reduced the P. brachyurus population (resistant); contrarily, white and yellow oats were susceptible. In third experiment, the pearl millets showed as susceptible to P. brachyurus, and the sorghum BRS-800 was the cover crop more susceptible to nematode, statistically closed to soybean BRS 133. In experiment 4, black oats increased the three populations of M. incognita tested, instead the reduction verified in white oat UFRGS 17 and yellow São Carlos.

A incidência e severidade da mancha de cercospora, causada por Cercospora zeae-maydis Tehon & Daniels, aumentou significativamente em território brasileiro a partir do ano 2000, sendo hoje considerada uma das principais doenças foliares da cultura do milho. Mesmo assim, poucos estudos com este patossistema foram realizados no Brasil. Este trabalho teve por objetivo determinar meio de cultura e regime luminoso para adequada esporulação de C. zeae-maydis, estudar a reação de um grupo de 118 linhagens endogâmicas de milho quanto a resistência ao patógeno em dois ambientes distintos (Indianópolis-MG e Jardinópolis-SP), observar aspectos microscópicos da esporulação, germinação e penetração em hospedeira suscetível e avaliar diferenças morfológicas, genéticas e de agressividade entre isolados coletados na região centro-sul do país. Os resultados indicaram que a melhor esporulação do fungo foi obtida em meio V8 e suco de tomate temperado quando submetidos a fotoperíodo 12/12h (luz/escuro). Quanto a reação das linhagens à doença, foi possível verificar interação diferencial significativa entre genótipo de milho e os dois ambientes, indicando que fatores ambientais ou patogênicos, distintos entre os locais, podem ter contribuído para os discrepantes comportamentos de alguns genótipos. Também foi possível verificar elevado nível de resistência em 12 linhagens em ambos locais, demonstrando a existência de genótipos mais estáveis para resistência com possibilidade de uso em programas de melhoramento da cultura. Através da análise do padrão de restrição gerado pela digestão da região ITS-5.8S do rDNA, de 104 locos AFLP e de mensurações morfométricas dos conídios, foi possível verificar a existência de dois grupos geneticamente distintos de C. zeae-maydis em território brasileiro. Estes são relatados na literatura como grupos I e II ou espécies afins (siblings species). Estes grupos foram detectados em todos os locais de coleta do território brasileiro, com exceção de Goiás, onde o grupo I não foi observado. Quanto aos aspectos microscópicos deste patógeno, foi possível verificar que sob condições ambientais adequadas a germinação dos esporos ocorre 13 horas após o contato do esporo com a hospedeira, e a penetração, via estômato, tem início 16 horas após a inoculação. Também foi observado o fenômeno da conidiação microcíclica nos isolados brasileiros. Vinte e seis por cento daqueles pertencentes ao grupo I produziram microconídios, enquanto nenhum do grupo II apresentou esta característica. Deste modo, este é o primeiro relato da existência deste fenômeno no grupo I e ausência no grupo II. Estes estudos demonstram que a população brasileira de C. zeae-maydis se assemelha àquelas existentes nos Estados Unidos e na África, com a prevalência dos dois grupos genéticos. / The incidence and severity of cercospora leaf spot, caused by Cercospora zeae-maydis Tehon & Daniels, increased significantly in Brazil in 2000, being considered today one of the major leaf disease of the crop. Despite this, few researches about the pathosystem come being carried in Brazil. The aims of this work were to identify the suitable culture media and light conditions for sporulation of C. zeae-maydis; to study the reaction of 118 mayze genotypes to pathogen in two different locations (Indianópolis - Minas gerais State and Jardinópolis - São Paulo State); to observe some microscopical aspects of esporulation, germination and penetration in a susceptible maize genotype; and finally to assess morphological and genetic differences among a group of isolates collected in center-south Brazil. The results showed that the better culture media for esporulation was the V8 media and tomato juice, under 12-hours photoperiod. Concerning to genotype reaction to disease, it was possible to verify significant interaction between genotypes and environment, indicanting that environmental or pathogenic factors, distinct between locations, may have influenced the reactions of some genotypes. It was possible to identify highly level of resistance in 12 lines in both places, evidencing the existence of stable genotypes that can be used in breeding programs. Analysis of restriction fragments from ITS-5.8S of rDNA, 104 AFLP loci, and conidial measurements, showed the existence of two genetically divergent groups of C. zeae-maydis in Brazil. These groups are similar to the ones reported previously reported as I and II groups or siblings species. Both groups were detected in all sampled regions, except Goiás State where no isolates from group I were detected. Concerning to microscopic traits, it was possible to verify that the brazilian isolates of this pathogen have the ability for production of microconidia. Twenty six percent of the isolates of the group I produced microconidia, while none of the group II showed this trait. Thus, this is the first report with presence of MC in the group I but absence in the group II. The results showed that Brazilian isolates are very similar to isolates from USA and Africa, occurring both genetic groups.

Os inibidores inibidores de serino proteinases do tipo Bowman-Birk (BBI) possuem dois sítios ativos e são encontrados em plantas das famílias Fabaceae e Poaceae. Neste trabalho foi apresentada a estrutura primária e o padrão de expressão de 14 seqüências expressas (EST, expressed sequence tags) de BBI putativos encontradas no banco de dados do "Projeto Transcriptoma da Cana-de-açúcar" (SUCEST). Estas quatorze seqüências foram utilizadas em conjunto com outras 87 seqüências de BBI previamente descritas e depositadas no banco de dados "GenBank" para a construção de árvores filogenéticas da família BBI. A análise filogenética mostrou que os BBI de monocotiledôneas e dicotiledôneas podem ser claramente separados em diferentes grupos e a topologia das árvores filogenéticas sugere um padrão evolutivo diferente das famílias de BBI em plantas. Os inibidores de dicotiledôneas são bem conservados e acumularam diferenças sutis durante a evolução. Em contrapartida, os inibidores de monocotiledôneas são altamente variáveis, indicando a ocorrência de um processo evolutivo interessante, baseado em eventos de duplicação intragênica e mutação. Dois inibidores de serino proteinases, um de tripsina e outro de quimotripsina, derivados do gene que codifica o inibidor Bowman-Birk de soja, foram expressos na superfície do fago filamentoso M13 e utilizados para a construção de bibliotecas de variantes. Para tal foram feitas mutações em quatro aminoácidos do sítio ativo destes inibidores e duas bibliotecas de expressão na superfície de fagos filamentosos foram construídas. Posteriormente, estas bibliotecas foram utilizadas para a seleção de variantes que melhor interagiam com a tripsina bovina e de Diatraea saccharalis e com as enzimas digestivas presentes no extrato intestinal desta praga. Os variantes selecionados foram seqüenciados, analisados e caracterizados. Os resultados mostraram que a técnica de expressão na superfície de fagos filamentosos foi eficiente para selecionar novos inibidores. Além disto, com as mutações realizadas, foi possível transformar a alça de inibição de quimotripsina em uma alça de inibição de tripsina. / The Bowman-Birk inhibitors (BBIs) are double headed inhibitors of serine proteinase found in plants from Fabaceae and Poaceae families. We describe the primary structure and the gene expression profile of 14 putative BBIs from the sugarcane expressed sequence tag (SUCEST) database and show how we used these newly discovered sequences together with 87 previously described BBI sequences from the "GenBank" database to construct phylogenetic trees for the BBI family. Phylogenetic analysis revealed that BBI-type inhibitors from monocotyledonous and dicotyledonous plants could be clearly separated into different groups, while the overall topology of the BBI tree suggests a different pattern of evolution for BBI families in flowering plants. We also found that BBI proteinase inhibitors from dicotyledonous plants were well conserved, accumulating only slight differences during their evolution. In addition, we found that BBIs from monocotyledonous plants were highly variable, indicating an interesting process of evolution based on internal gene duplications and mutation events. Two serine-type proteinase inhibitors, a trypsin and a chymotrypsin, both derived from the soybean Bowman-Birk inhibitor, were expressed on the surface of a filamentous phage. Site mutations were made in four positions of the reactive sites of these inhibitors and two phage-display libraries were constructed. Later, these libraries were used to select better ligands to the bovine and Diatraea saccharalis trypsin and to the midgut enzymes of this insect pest. The selected variants were sequenced, analyzed and characterized. The results showed that the phage-display technique is efficient to select new proteinase inhibitors. Furthermore, it was possible to modify the chymotrypsin loop into a trypsin loop using the library constructed by the insertion of a degenerated primer.

Este trabalho objetivou investigar a existência de polimorfismos de seqüência nucleotídica (SNPs "single nucleotide polymorphisms") em fragmentos genômicos de cana-de-açúcar homólogos a genes de resistência. Para tal, iniciadores sintéticos homólogos às extremidades de uma seqüência expressa identificada (ESTs "expressed sequence tag") como homóloga ao gene Xa1 de arroz (EST SCCCCL3080E03.g) e outra ao gene Rp1-D de milho (EST SCCCCL3080B03.g) foram utilizados para amplificar, em duplicata, fragmentos genômicos de variedades de cana-de-açúcar. Em seguida, os fragmentos foram clonados e seqüenciados. No caso do primeiro EST, foram obtidas seqüências de 119 insertos de uma variedade resistente (SP804966) e 156 de uma variedade suscetível (SP80180) a Xanthomonas albilineans. No segundo caso, foram obtidas seqüências de 167 insertos de uma terceira variedade resistente (R570) e 135 de outra suscetível (SP811763) a Puccinia melanocephala. Para cada EST considerado, as seqüências foram comparadas por meio do programa DNA Sequencher 3.0 (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI). Nesta análise, somente foram consideradas seqüências reproduzíveis, isto é, que ocorreram nas duas repetições. No caso de ambos ESTs, a comparação de seqüências entre variedades possibilitou a identificação de quatro a seis fragmentos distintos. A comparação entre variedades, por sua vez, revelou a existência de até duas seqüências comuns. Presume-se que estas seqüências reproduzíveis e confirmadas por meio de digestões de clones representativos de cada uma com enzimas de restrição, correspondam a seqüências alélicas. Iniciadores foram sintetizados com base em polimorfismos encontrados entre os diferentes alelos. No entanto, tentativas de amplificar alelos específicos por meio destes iniciadores se revelaram infrutíferas. Tal insucesso deve-se possivelmente à condição polialélica da cana-de-açúcar, que faz com que polimorfismos entre dois alelos sejam compensados por monomorfismos entre estes e os demais alelos. Assim, a utilização de SNPs como marcadores moleculares baseados em PCR em cana-de- açúcar mostra-se mais complexa quando comparada a plantas diplóides. / The objective of this work was to investigate the existence of single nucleotide polymorphisms (SNPs) in genomic fragments homologous to resistance genes in sugarcane. For this purpose, primers were designed based on the sequence of the extremities of an identified expressed sequence tag (ESTs) similar to the Xa1 gene of rice (EST SCCCCL3080E03.g) and another to the maize Rp1-D gene (EST SCCCCL3080B03.g). These primers were used to amplify genomic fragments of sugarcane varieties in duplicate. The fragments were then cloned and sequenced. In the case of first EST, sequences of 119 inserts from a resistant variety (SP804966) and 156 from a susceptible variety (SP80180) to Xanthomonas albilineans were analyzed. In the case of the second EST, sequences of 167 inserts from a third variety (R570) and 135 of a fourth one (SP811763), resistant and susceptible respectively to Puccinia melanocephala, were analyzed. Sequences were compared using the program DNA Sequencher 3.0 (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI). In this analysis, only reproducible sequences were considered, that is, sequences that occurred in both replicates. Four to six different sequences were identified within varieties whereas comparisons among varieties revealed the existence of up to two sequences in common. These reproducible sequences, which were further confirmed through digestion of representative clones with appropriate restriction enzymes, could correspond to allelic sequences. Primers were designed based on the SNPs detected among these so-called alleles. However, attempts to amplify specific alleles using these primers were unsuccessful. This could be due to the polyallelic condition of sugarcane in which polymorphisms between two alleles could be compensated by monomorphisms between these and other alleles. Thus the use of SNPs as PCR-based molecular markers is not as straightforward in sugarcane as in diploid species.

Amplamente disseminada pelo país, causando prejuízos em viveiros e plantios comerciais, a ferrugem do eucalipto, causada pelo fungo Puccinia psidii, é atualmente uma das mais preocupantes doenças em eucalipto. A seleção de genótipos resistentes é facilitada quando informações sobre o controle genético da resistência e estratégias eficientes de seleção, como a seleção assistida por marcadores, estão disponíveis. Este trabalho foi conduzido com o objetivo de compreender melhor o controle da resistência à ferrugem sob condições de campo e identificar marcadores moleculares ligados a genes de resistência a este patógeno. A herança da resistência foi estudada em quatorze progênies, obtidas a partir de cruzamentos e auto-cruzamentos controlados entre quatro clones híbridos inter-específicos de E. grandis x E. urophylla, contrastantes para a resistência. Os resultados indicaram a existência de um loco de grande efeito fenotípico e multialélico. Marcadores AFLP e RGA ligados ao loco de resistência foram identificados em uma progênie segregante por meio da análise de segregantes agrupados. O loco de resistência foi localizado no grupo de ligação 3, próximo ao marcador Embra 181. Um marcador AFLP(E12M32_165) e um RGA (AluI/NBS3_600) foram identificados a 4,3 e 6,8 cM do loco de resistência, respectivamente, em repulsão com o alelo de resistência. O marcador AluI/NBS3_600, apresenta grande potencial de uso na seleção assistida por marcadores, especialmente no viveiro antes dos genótipos serem testados em campo, minimizando assim os custos envolvidos nas instalações de áreas experimentais. / Widely disseminated all over the country, damaging nurseries and plantation areas, eucalyptus rust, caused by the fungus Puccinia psidii, is currently the most concerning eucalyptus disease. The selection of resistant genotypes is facilitated when information about the genetic control of resistance and quick selection strategies such as marker assisted selection, are available. This objective of this study was to better understand the control of rust resistance under field conditions and identify molecular markers linked to resistance genes. The mode of inheritance was analyzed in fourteen progenies obtained from controlled crosses and self-crosses between four interspecific hybrid clones of E. grandis x E. urophylla with contrasting phenotypes regarding rust resistance. The results suggested the existence of a single multiallelic locus with major phenotypic effects. However, this locus appears to be complex, multiallelic, and organized in clusters of resistance genes with interaction between the clusters. Some of these alleles may confer resistance to many pathogen isolates/races or even to other genetically related pathogens found near the geographic origin of eucalyptus. Using the strategy of bulked segregant analysis, AFLP and RGA linked markers to resistance were identified in one of the progenies. The resistance locus was located in linkage group 3, next to the Embra 181 marker locus. One AFLP (E12M32_165) and one RGA marker (AluI/NBS3_600) were located at 4.3 and 6.8 cM from the resistance locus, respectively, in repulsion phase with the resistance allele. The AluI/NBS3_600 marker has potential to be used in marker assisted selection, especially in the initial steps of selection in the nursery before field tests, thus minimizing the costs of field trials.

A cana-de-açúcar (Saccharum ssp.) é uma das culturas agrícolas mais importantes da história da humanidade. Foi em Nova Guiné, seu provável centro de origem, que o homem teve o primeiro contato com a planta em seu estado silvestre. Atualmente, o Brasil lidera a lista dos 80 países produtores de cana-de-açúcar. É o primeiro também em exportação de seus derivados, seguido, respectivamente, pela Austrália, Tailândia, Guatemala e África do Sul. A área plantada no Brasil está próxima dos 7 milhões de hectares. A cana-de-açúcar, assim como a grande diversidade de culturas de interesse agronômico, é hospedeira de uma série de patógenos que podem limitar sua produção, dentre os quais, destaca-se a bactéria Leifsonia xyli subsp. xyli, agente causal do raquitismo-da-soqueira (RSD). O RSD é considerado uma das mais importantes doenças da cana-de-açúcar que limita a produção no mundo todo e seu controle está fundamentado na adoção de um conjunto de medidas preventivas, pois poucas são as informações sobre materiais resistentes à doença e não existe um produto químico que a controle eficientemente. Historicamente, a dificuldade do diagnóstico do RSD, na maioria dos casos, é conseqüência da ausência de sintomas externos e pela não ocorrência de sintomas internos em determinados cultivares de cana-de-açúcar e neste sentido, técnicas de imunologia, molecular e de microscopia de contraste de fases têm sido bastante empregadas. A hipótese da possível correlação entre a anatomia vascular e a resistência de plantas a patógenos, é um assunto freqüentemente discutido por pesquisadores e poderia elucidar os mecanismos envolvidos na resistência da planta ao patógeno. Assim, o presente trabalho teve como objetivo geral avaliar a resistência/suscetibilidade de 10 variedades comerciais de canade- açúcar RB, mais a variedade CB 49-260 incluída como padrão suscetível, correlacionando os danos apresentados por análises de componentes de produção tecnológicos e biométricos amostrados no campo, com a morfologia e quantificação de conjunto de feixes vasculares e os níveis de infecção detectados nos diagnósticos. Os resultados mostraram que as variedades RB 72 454, RB 83 5486, RB 86 7515, RB 92 8064, RB 92 5211, RB 92 5345 e RB 92 5268 comportaram-se como variedades suscetíveis. A RB 85 5156 comportou-se como variedade de resistência intermediária As variedades RB 85 5536 RB 85 5453, comportaram-se como tolerantes. Os danos apresentados tiveram relação direta com as concentrações do patógeno inoculadas no início do experimento, ou seja, quanto maior a concentração de inóculo, maiores foram os danos ocorridos nas variedades menos tolerantes. Contudo, não há correlações entre o tamanho médio do metaxilema e o número de feixes vasculares por área com a resistência da planta. / Sugarcane (Saccharum ssp.) is one of the most important cultures in the history of the humanity. The center of origin is probably New Guinea, where people had the first contact with the plant in wild state. Presently, Brazil leads the list of the 80 sugarcane producing countries. Brazil is also the first in exporting sugarcane by-products, followed by Australia, Thailand, Guatemala and South Africa, respectively. The are grown in Brazil ranges 7 million hectares. As well as a great diversity of cultures of agronomical interest, sugarcane is host of a large number of pathogens which can limit its production. Among them, one can emphasize, Leifsonia xyli subsp. xyli, causal agent of ratoon stunting disease (RSD). RSD is considered one of the most important diseases of sugarcane limiting yield worldwide and the control is based on the adoption of a set of preventative measures, since the information about resistant materials and efficient chemical products are scarce. Historically, RSD diagnosis has been difficult because there are no definitive external symptoms and internal symptoms do not develop adequately in all varieties. Serological, molecular and microscopy techniques have been widely used to diagnose RSD. The hypothesis of the possible correlation among vascular anatomy and plant resistance has been discussed by researchers and could elucidate the resistance mechanisms involved in the resistance of plants to the pathogens. Thus, the overall objective of the present study was to evaluate the resistance/susceptibility of 10 RB sugarcane commercial varieties including CB 49-260 as a susceptible standard, correlate the damages presented by the analysis of technological and biometric production components of field samples, with the morphology and quantification of set of vascular bundles and the level of infections detected on the diagnostics. The results showed that varieties RB 72 454, RB 83 5486, RB 86 7515, RB 92 8064, RB 92 5211, RB 92 5345 and RB 92 5268 were susceptible. RB 85 5156, had a intermediary resistance and varieties RB 85 5536 and RB 85 5453 both showed tolerant behavior. The injuries presented had a direct relationship with the inoculum concentration, in other words, the higher the inoculum concentration the higher the injuries with the less tolerant varieties. However, there is no correlation between the average length of the metaxilem and the number of vascular bundles per area in plant resistance.