Este trabalho teve dois objetivos distintos, o primeiro foi realizar um levantamento da micoflora associada a grãos ardidos de híbridos comerciais de milho pertencentes à empresa Dow AgroSciences e o outro foi avaliar linhagens de milho tropical para a resistência a podridão da espiga, incidência de grãos ardidos e produção de fumonisinas por Fusarium verticillioides. Para o primeiro objetivo, coletou-se grãos de dois híbridos (2B587 e 2B710) cultivados em diferentes localidades do Brasil durante a safra verão e safrinha, sob as zonas macro-climáticas SA (subtropical alta), SB (subtropical baixa), TA (tropical alta), TB (tropical baixa) e TT (tropical de transição) afim de, realizar a determinação da incidência fúngica através do método do papel de filtro com congelamento. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com quatro repetições de 50 grãos de cada amostra. Os resultados indicaram Fusarium spp. e Penicillium spp. como os fungos de maior incidência nos grãos, sendo que na safra verão o comportamento dos híbridos em relação a incidência desses fungos variou de acordo com a zona climática. Na safrinha, o híbrido 2B710 foi o mais resistente a Fusarium spp. e Penicillium spp. independente da zona climática. Para o segundo objetivo, seis linhagens tropicais de milho, previamente classificadas como resistentes (R1, R2 e R3) e suscetíveis (S1, S2 e S3) a F. verticillioides pela Dow AgroSciences foram cultivadas na estação experimental da companhia, localizada no município de Jardinópolis/SP durante a safra verão e safrinha. O ensaio consistiu de dois tratamentos (inoculados e não inoculados), sendo que a inoculação foi feita através da pulverização 2 mL de uma suspensão de 106 conídios/ml no estigma da espiga e nas espigas não inoculadas a doença ocorreu por meio de infecção natural. A avaliação de severidade foi feita por uma escala de notas de 0 a 7, a incidência foi avaliada através da porcentagem de grãos ardidos em sub - amostras de 200 grãos de cada tratamento por repetição e a detecção dos níveis de fumonisinas foi realizada pelo método de Elisa. O delineamento experimental foi em blocos ao acaso com três repetições. Os resultados obtidos na safra verão indicaram uma variação na severidade de 1,2 a 4,3, na incidência de grãos sintomáticos de 13,7 a 46% e os níveis de fumonisinas detectados entre as linhagens variaram de 5,5 µg/g a 41 µg/g. Na safrinha, não houve diferenças significativas comparada à safra verão para a severidade, mas houve uma redução na incidência de grãos sintomáticos que variaram de 4,2% a 22,7% e redução nos níveis de fumonisina, os quais ficaram entre 1,5 µg/g a 22,7 µg/g. Nas duas safras, as linhagens R2 e R3 comportaram-se como mais resistentes a produção de fumonisinas e a R1 comportou-se como mais resistente a podridão da espiga e incidência de grãos ardidos, demonstrando que não houve correlação entre severidade da doença e incidência de grãos ardidos com níveis de fumonisinas. / This work aimed to survey the mycoflora associated to damaged grains of commercial hybrid maize provided by the company Dow AgroScience and to assess the resistance levels of six tropical inbred lines to ear rot, incidence of damaged grains and of fumonisins production by Fusarium veticillioides. For the first objective, two hybrids (2B587 and 2B710) were collected and cultivated in different regions in Brazil, during the normal season and the late-summer plantings, known as safrinha, on macro-climatic zones SA (high subtropical), SB (low subtropical), TA (high tropical), TB (low tropical) and TT (tropical transition). The fungal incidence determination was made through the deep - freezing blotter test. The experimental design was totally randomized with four replicates of 50 grains each sample. The results showed Fusarium spp. and Penicillium spp. as the most prevalent fungi, and the incidence of such fungi in each hybrid varied according to the climatic zone. In the late-summer plantings, the 2B710 hybrid was the most resistant to Fusarium spp. and Penicillium spp., independent of the climatic zone. For the second aim, six inbreed lines of tropical maize, previously classified as resistant (R1,R2 and R3) and susceptible (S1,S2 and S3) to F. verticillioides by Dow AgroSciences were cultivated in the experimental station of the company, localized in Jardinópolis / SP during the normal season and the late-summer plantings. The tests were made by two kinds of treatment (inoculated and non inoculated), and the inoculated treatment was made by spraying 2 mL of a 106 conidia/mL suspension onto the silk channel of the corn ear and, in the no inoculated ones, the disease occurred by natural infection. Severity was evaluated using a scale of 0 to 7, whereas the incidence was evaluated by counting the damaged grains in sub samples of 200 grains. Fumonisins levels detection were determined by the ELISA method. The experimental design was made in random blocks with three replicates. The results, in the normal season indicated a severity variation of 1.2 to 4.3, and in the symptomatic grains, the incidence was from 13.7 to 46% and the detected fumonisins levels among the inbreed lines ranged from 5.5 µg/g to 41 µg/g. No statistical differences between the normal season and the late-summer plantings were observed, concerning severity. However, there was a decrease in symptomatic grains, ranging from 4.2% to 22.7%, as well as a decrease in fumonisins levels, from 1.5 µg to 22.7 µg. The R2 and R3 inbreed lines showed more resistance to fumonisins production and R1 showed higher resistance to corn ear rot and damaged corn grains incidence. It was concluded that there was no relation between the disease severity and the of incidence damaged grains with high fumonisins levels.

O basidiomiceto Crinipellis perniciosa (Stahel) Singer (Tricholomataceae), é um parasita hemibiotrófico causador da doença Vassoura-de-Bruxa do cacaueiro (Theobroma cacao) . Os sintomas da vassoura incluem o excesso de brotações em ramos e almofadas florais, abortamento de flores e frutos novos e formação de manchas necróticas nos frutos em maturação. Causando perda na produção. Para a identificação de genes diferencialmente expressos no hospedeiro, no período assintomático, duas bibliotecas subtrativas foram construídas confrontando o genótipo suscetível ‘ICS 39’ e o resistente ‘CAB 214’, inoculados. Uma análise detalhada de 23 genes por PCR quantitativo revelou diferenças na cinética da indução no período assintomático. A indução dos genes no genótipo suscetível em resposta ao C. perniciosa foi atrasada e reduzida, e no resistente houve uma indução mais rápida e intensa, com dois momentos de indução (24 e 120 horas após inoculação). Os genes e mecanismos de patogenicidade Crinipellis perniciosa são amplamente desconhecidos. Genes presumíveis de patogenicidade de Crinipellis perniciosa foram identificados em uma biblioteca enriquecida por hibridização subtrativa supressiva para genes induzidos sob baixa disponibilidade de Nitrogênio. Oito genes foram avaliados para expressão in vitro e em plantas inoculadas por amplificação quantitativa de transcritos reversos (RT-qPCR) e, dos sete expressos diferencialmente sob a carência de N, seis foram induzidos durante os períodos assintomáticos, corroborando a hipótese de convergência na via de sinalização para estresse nutricional abiótico e a patogênese. / The basidiomycete Crinipellis perniciosa (Stahel) Singer (Tricholomataceae) is the causal agent of witches' broom disease in Theobroma cacao (cacao). The hemibiotrophic pathogen infects meristematic tissues (shoots, flower cushions, single flowers and developing fruits). Hypertrophic growth of infected buds (?brooms?) is the most dramatic symptoms, but economic losses result from pod infection. To identify genes differentially expressed in the host during the symptomless stage, two subtractive suppressive libraries were constructed, subtracting in both directions transcripts from the inoculated susceptible genotype ‘ICS 39’ and from the resistant ‘CAB 214’. Quantitative reverse transcription amplification (RT-qPCR) of 23 genes identified as differentially expressed revealed distinct kinetics of gene induction at the asymptomatic stage. Expression induction in the susceptible genotype in response to C. perniciosa was delayed and limited, while in the resistant, there was a quicker and more intense reaction, with two peaks of gene induction at 48 and 120 h after inoculation.. Pathogenicity genes and mechanisms of Crinipellis perniciosa are laregly unknown.. Putative pathogenicity genes from Crinipellis perniciosa were identified in a cDNA library enriched by subtractive suppressive hybridization for genes induced under limiting Nitrogen. The eight genes were analysed for expression by quantitative amplification of reversed transcripts (RT-qPCR) in vitro and inoculated plants, and from the seven differentially expressed under N deprivation, six were induced under the symptomless stage of the disease, corroborating the hypothesis of convergence between the signal pathway for nutritional stress and pathogeneis.

A cultura do milho (Zea mays L.) apresenta grande importância cultural, social e econômica, tanto no Brasil como no mundo. Entre os fatores que contribuem grandemente para a diminuição de sua produtividade estão as doenças. A mancha de cercospora ou cercosporiose, causada pelo fungo Cercospora zeae-maydis Tehon & Daniels, é uma das principais doenças da cultura em vários países. Uma vez que o uso de híbridos resistentes é a medida mais eficiente para o seu controle, a caracterização e a discriminação de genótipos de milho quanto ao nível de resistência e de isolados do patógeno quanto ao nível de agressividade é uma etapa fundamental de qualquer programa de melhoramento. Isolados de C. zeae-maydis podem ser classificados em dois grupos genéticos, denominados I e II, segundo análise por marcadores AFLP e por restrição da região intergênica espaçadora do rDNA 5.8S. No Brasil, há ocorrência dos dois grupos, mas nos Estados Unidos há uma prevalência do grupo I sobre o grupo II, ao passo que em países do sul da África verifica-se somente a presença de indivíduos do grupo II. Presentemente, não há nenhum relato sistemático sobre diferenças em agressividade entre indivíduos destes grupos. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a agressividade de 20 isolados de C. zeae-maydis dos grupos genéticos I e II quando inoculados em um híbrido de milho suscetível e também testar o comportamento de 10 linhagens de milho frente a oito isolados em dois ambientes para verificar a possível presença de interação diferencial entre isolado, linhagem e local. Para tanto, os isolados foram cultivados em sementes de sorgo para produção de inóculo. Sementes colonizadas foram depositadas no cartucho das plantas e as avaliações foram realizadas utilizando-se escalas diagramáticas. No experimento em casa de vegetação foi verificada uma variação em agressividade entre os isolados do grupo genético I, do grupo genético II e entre os grupos. Observou-se ainda que isolados pertencentes ao grupo genético II são, em média, mais agressivos que isolados do grupo genético I. Este é o primeiro relato de diferenças em agressividade entre os grupos genéticos. No experimento em campo não foram observadas diferenças significativas quanto à agressividade dos isolados avaliados em Jardinópolis (SP) e Indianópolis (MG). Entretanto, observou-se forte interação entre linhagens e locais, indicando que o ambiente exerce influência na doença. Dessa forma, recomendam-se avaliações em ambientes diferentes e a utilização de isolados mais agressivos e pertencentes aos dois grupos genéticos a fim de otimizar a discriminação de genótipos de milho com relação à resistência a C. zeae-maydis. / Maize (Zea maydis L.) is of great social, cultural and economical importance in Brazil and in the world. Maize diseases are the main factors that reduce crop yield. Gray leaf spot, caused by the fungus Cercospora zeae-maydis Tehon & Daniels, is one of the most important diseases in many countries. Given that the disease can be controlled by the use of resistant maize hybrids, the characterization and discrimination of maize genotypes according to their level of resistance and of pathogen isolates according to their aggressiveness are fundamental steps in any breeding program. Isolates of C. zeae-maydis can be classified into two genetic groups, named I and II, by analysis with AFLP markers and restriction of the intergenic spacer region of the 5.8S rDNA. In Brazil, both groups occur whereas in the United States isolates from group I prevail and in some South African countries only isolates from group II can be found. Presently, there are no systematic reports on differences in aggressiveness between these groups. Therefore, the objective of this study was to evaluate the aggressiveness of 20 isolates of C. zeae-maydis from both genetic groups when inoculated in a susceptible maize hybrid and also to test the reaction of 10 maize inbreds to eight C. zeae-maydis isolates in two environments in order to assess the possible occurrence of differential interaction between isolates, inbreds, and locations. Isolates were cultivated in sorghum seeds for innoculum production. Colonized seeds were placed into the whorl of the plants and the disease reaction was evaluated using a diagrammatic scale. In the greenhouse experiment significant variation in aggressiveness was observed among isolates of group I, group II and between groups. Also, it was observed that isolates from group II were, on average, more aggressive than isolates from group I. This is the first report on differences in aggressiveness between the two genetic groups of C. zeae-maydis. In the field experiment no significant differences were observed in aggressiveness among isolates evaluated in Jardinópolis (SP) and Indianópolis (MG) for the inbreds tested. However, a strong interaction between reactions of maize inbreds and regions was observed indicating that the environment influences the disease. Thus, evalutions in several locations with aggressive isolates from both groups is recommended in order to optimize the discrimination of maize genotypes regarding their resistance to C. zeae-maydis.

Citrus tristeza virus (CTV) ocorre em quase todas as áreas produtoras de citros do mundo. O controle da doença se baseia, principalmente, no uso de porta-enxertos tolerantes e na premunização das copas. A obtenção de copas de laranjas doces ou de porta-enxerto de laranja azeda transgênicos resistentes ao CTV permitiria retornar a um uso mais intensivo deste excelente porta-enxerto. Com isso, esse trabalho buscou avaliar linhagens transgênicas de laranja doce (Citrus sinensis) e obter plantas transgênicas de laranja azeda (Citrus aurantium) para a resistência ao CTV, a fim de oferecer uma outra alternativa para o controle desta doença em citros. Foram avaliadas plantas transgênicas de laranja doce cv. Valência e cv. Hamlin contendo três diferentes construções gênicas. Uma contendo uma sequência sense (684 pb) do gene da capa protéica do CTV (pCTV-CP), outra contendo uma sequência conservada (559 pb) do CTV (pCTV-SC) e uma do tipo hairpin, contendo sequências sense e antisense do gene da capa protéica separadas por um íntron (pCTV-dsCP). Dez linhagens transgênicas de cada construção gênica e de cada cultivar foram previamente confirmadas por análises de Southern blot e RT-PCR, totalizando 60 linhagens transgênicas. Tais linhagens foram clonadas e enxertadas sobre limão Cravo (C. limonia) e laranja azeda (C. aurantium), totalizando 360 plantas. Essas plantas, juntamente com plantas não transgênicas utilizadas como controle, foram inoculadas com o CTV por meio de Toxoptera citricida virulífero. As técnicas de ELISA indireto utilizando anticorpo monoclonal contra a capa protéica do CTV ou de Real-time PCR utilizando primers amplificadores dos genes p20 e p23 do genoma do CTV foram utilizadas para detectar o vírus nas plantas avaliadas, 4 semanas após as inoculações. Ocorreu variação na resistência ao vírus nas diferentes construções transgênicas utilizadas e entre clones de uma mesma planta. Alguns clones não foram infectados com o vírus mesmo após a quarta inoculação, indicando uma possível resistência ao patógeno. Um total de 30 experimentos de transformação genética de laranja azeda foram realizados, utilizando como explantes segmentos internodal, de epicótilo e de cotilédone associado ao hipocótilo. O teste de GUS permitiu a identificação de duas gemas com reação positiva (0,13% de eficiência de transformação). Tais gemas foram enxertadas in vitro sobre citrange Carrizo, mas apenas uma gema se desenvolveu. A planta obtida foi aclimatizada em casa-de-vegetação. / Citrus tristeza virus (CTV) occurs in almost all citrus-growing areas of the world. Control of citrus tristeza relies mainly on the use of tolerant rootstocks and scion cross protection. Obtaining transgenic sweet oranges cultivars or sour orange resistant to CTV would allow a better use of this excellent rootstock. This way, the aim of this work was to evaluate transgenic sweet orange (Citrus sinensis) lines and to obtain transgenic sour orange (Citrus aurantium) for the resistance to CTV, in order to offer another alternative for the control of the disease in citrus. Transgenic sweet orange cv. Valencia and cv. Hamlin containing three different genetic constructs were evaluated. One gene construct contains a sense sequence (684 pb) of the coat protein gene of CTV (pCTV-CP), another contains a conserved sequence (559 pb) of CTV (pCTV-SC), and the last one a hairpin type, containing the sense and antisense sequences of the coat protein gene separated by an intron (pCTV-dsCP). Ten transgenic lines of each gene construct and each cultivar were previously confirmed by Southern blot and RT-PCR analysis, totalizing 60 transgenic lines. These lines were cloned and grafted into C. limonia and into C. aurantium, totaling 360 plants. The plants, along with non-transgenic plants used as control, were challenged four times with the CTV by means of viruliferous Toxoptera citricida. Indirect ELISA using monoclonal antibody against the CTV coat protein or the Real-time PCR using primers to amplify the CTV genes p20 and p23 were used to detect the virus in the tested plants, 4 weeks after inoculation. Variation in the virus resistance was observed among different transgenic constructs and different clones of the same plant. Some clones were not infected with the virus even after the fourth inoculation, indicating a possible resistance to the pathogen. A total of 30 genetic transformation experiments of sour orange were performed, using as explants internodal segments, epicotyl segments and cotyledon fragment with hypocotyl attached. GUS reaction detected two shoots positive (transformation efficiency of 0,13%). These shoots were in vitro grafted in Carrizo citrange, but only one shoot developed. The plant obtained was acclimatized in greenhouse.

A ferrugem da soja (Phakopsora pachyrhizi Sydow e Sydow) foi constatada pela primeira vez no Brasil na safra 2000/01, e representa até o momento, um importante desafio para os programas de melhoramento genético de soja. As cultivares e linhagens inicialmente identificadas como resistentes, tiveram sua resistência quebrada já na safra 2002/03, pela ocorrência de prováveis novas raças do patógeno. Por consequência, a longevidade da resistência genética vertical foi colocada em risco, e o desenvolvimento de trabalhos através da utilização da tolerância é a alternativa. Como suporte para a manutenção da longevidade do controle genético da ferrugem, este trabalho objetivou testar estratégias de seleção de genótipos de soja para tolerância à ferrugem, na ausência de genes principais de resistência. Os experimentos foram conduzidos durante os anos agrícolas 2004/05 e 2005/06 em diferentes locais administrados pelo Departamento de Genética, ESALQ/USP, município de Piracicaba, SP. Foi utilizado o delineamento experimental de blocos casualizados com repetições estratificadas em conjuntos experimentais e testemunhas comuns aos conjuntos experimentais. Em 2004/05, no local Anhembi, 60 linhagens experimentais mais quatro testemunhas suscetíveis à ferrugem (BR-16, FT-2000, Conquista e IAC-100), foram avaliadas em três experimentos com e sem fungicidas (Controle, Derosal e Impact). Em 2005/06, as 26 melhores linhagens para tolerância à ferrugem, selecionadas em 2004/05, foram novamente avaliadas através dos três experimentos (Controle, Derosal e Impact) juntamente com as testemunhas (BR-16, IAC-100 e BRS-232), nos locais Anhembi, ESALQ e Areão. Contrastes das médias de produtividade de grãos entre os experimentos de fungicidas, e uma adaptação do modelo de regressão de Eberhart e Russel, foram utilizados para medir a ação da ferrugem e das doenças de final de ciclo (DFC) sobre as linhagens, com o intuito de realizar seleção de linhagens tolerantes. A ferrugem reduziu a produtividade de grãos mas não alterou significativamente o ciclo e o peso de mil sementes, bem como não alterou as outras características agronômicas estudadas. As duas estratégias de seleção propostas e utilizadas neste trabalho, foram eficientes para separar os efeitos das doenças (ferrugem e DFC), e identificar e selecionar genótipos tolerantes na ausência de genes principais de resistência, viabilizando a seleção de linhagens tolerantes. Houve associação entre tolerância à ferrugem, DFC e resistência ao nematóide de cisto da soja. / Soybean rust (Phakopsora pachyrhizi Sydow and Sydow) was first recorded in Brazil during the 2000/01 season and, even today, represents an important challenge to soybean breeding. The cultivars and lines initially identified as resistant had their resistance breakdown on the 2002/03 season, probably by the occurrence of new races of the pathogen. Consequently, the longevity of the vertical genetic resistance was put in risk and the development of works through the use of tolerance is the alternative. As support for the maintenance of the longevity of the genetic control of rust, this work aimed to evaluate strategies for selection of genotypes to rust tolerance in the absence of major resistance genes. The experiments were conducted during the agricultural years of 2004/05 and 2005/06 in different locations administered by the Department of Genetics ESALQ/USP, Piracicaba, SP. It was used the randomized complete-block design with replications stratified in experimental sets with common checks. In 2004/05 at Anhembi, 60 experimental lines and four rust-susceptible checks (BR-16, FT-2000, Conquista and IAC- 100), were evaluated in three experiments with and without fungicides (Control, Derosal and Impact). In 2005/06, the 26 best lines for rust tolerance, selected in 2004/05, were evaluated again through the three experiments (Control, Derosal and Impact) together with the checks (BR-16, IAC-100 and BRS-232), in the locations Anhembi, ESALQ and Areão. Contrasts of seed yield means among the fungicide experiments, and an adaptation of the regression model of Eberhart and Russel, were used to measure the action of rust and late season leaf diseases (LSLD) on the lines, with the intention of selecting tolerant lines. Rust reduced the seed yield but did not significantly alter the cycle or the weight of one thousand seeds, just as there was no significant change in other agronomical traits studied. Both selection methodologies were efficient to separate the effects of the diseases (rust and LSLD) and identify and select tolerant genotypes at the absence of major resistance genes, enabling the selection of tolerant lines. There was an association between rust, LSLD tolerance and soybean cyst nematode resistance.

No Brasil a citricultura está entre as culturas de maior importância. A produtividade dessa cultura no país ainda é considerada baixa e esse fato se deve, em parte, a diversas pragas e doenças. Dentre as doenças, tem-se a tristeza, causada pelo Citrus tristeza virus (CTV). Esse patógeno também pode estar relacionado com outra importante doença da cultura, a morte súbita dos citros (MSC). Com isso, o CTV ganhou ainda maior expressão. Uma alternativa para controlar viroses de plantas é a obtenção de plantas transgênicas resistentes a esses patógenos. Este trabalho objetivou caracterizar com análise molecular e avaliar a resistência ao CTV de plantas transgênicas de laranja Valência (Citrus sinensis L. Osbeck), contendo fragmentos do genoma do CTV, em três construções gênicas diferentes. A transgenia das plantas foi confirmada por análises de Southern blot. A transcrição do transgene foi avaliada por RT-PCR. O material foi inoculado com duas borbulhas infectadas pelo isolado Pêra- IAC, enxertadas no porta-enxerto abaixo do ponto de enxertia da copa transgênica, e pelo vetor Toxoptera citricida infectado. Após quatro semanas da inoculação, para avaliar a resistência ao vírus, brotações da copa transgênica foram submetidas ao teste de ELISA sanduíche indireto com anticorpo monoclonal contra a proteína da capa protéica do CTV. Os resultados indicaram variação na resistência à translocação do vírus nas diferentes construções transgênicas utilizadas e entre clones de uma mesma planta. Todas as linhagens transgênicas inoculadas indicaram a presença do vírus em pelo menos uma das três repetições avaliadas, quando inoculadas por enxertia. Quando inoculadas pelo vetor algumas plantas apresentaram todos os seus clones com baixos valores de absorbância, indicando uma possível resistência ao patógeno. / In Brazil, citrus is one of the most important cultures. The productivity of this culture in the country is still considered low and this fact is due to several pests and diseases that affect the crop. Among the diseases there is the tristeza, caused by Citrus tristeza virus (CTV). This pathogen can also be related with another important disease, the citrus sudden death. Therefore, CTV acquired much more significance. This work aimed to characterize with molecular analysis and to evaluate the resistance to CTV of transgenic Valência plants (Citrus sinensis L. Osbeck), containing genomic fragments of CTV, in three different transgenic constructs. The plants were confirmed as transgenic by Southern blot. The transcription of the transgene was evaluated by RT-PCR. The transgenic plants were challenged with a weak strain of CTV, CTV-IAC, by bud inoculation with two infected bubbles, and by the infected vector Toxoptera citricida. After four weeks of inoculation, the evaluation of viral replication in the transgenic seious was done by ELISA indirect sandwich with monoclonal antibody against the CTV coat protein. The results indicated variation of the resistance to the translocation of the virus between the different transgenic constructs used and between clones of the same plant. All the inoculated plants indicated the presence of the virus in, at least, one of the three evaluated clones, when inoculated by grafting. When inoculated by the vector some plants had all their clones with low values of virus, indicating a possible resistance to the pathogen.

A utilização de técnicas biotecnológicas como a transformação genética, tem auxiliado os programas de melhoramento de plantas perenes. Essa técnica já é utilizada em citros com sucesso, principalmente para obtenção de plantas tolerantes a doenças. O presente trabalho teve três objetivos: 1.transformação genética do porta-enxerto limão ‘Cravo’ com o gene bacteriopsina (bO), relacionado com ativação de mecanismos de defesa da planta como morte programada de células e produção de ácido salicílico, com o intuito de aumentar a resistência a gomose de Phytophthora; 2. transformação genética das principais variedades copas de laranja doce (‘Hamlin’, ‘Valência’, ‘Natal’ e ‘Pêra’) com o gene da cecropina. Esse gene possui atividade antibacteriana, tornando-se possível fonte de resistência a cancro cítrico e clorose variegada dos citros e; 3. avaliar a viabilidade da utilização de um promotor específico de xilema em citros. As transformações foram efetuadas pelo sistema indireto via Agrobacterium tumefaciens, utilizando segmentos juvenis de epicótilo. Testes moleculares foram realizados e confirmaram a inserção dos genes descritos acima. No caso do limão ‘Cravo’ duas plantas foram regeneradas. Na transformação das variedades copa com o gene da cecropina, diferentes taxas de eficiência foram observadas, sendo que melhores resultados foram obtidos para laranja ‘Valência (3,3-4,5 %) e laranja ‘Hamlin’ (2,5-3,0 %) em comparação com laranja ‘Natal’ (1,6-2,0 %) e laranja ‘Pêra’ (0,5 %). Plantas de laranja ‘Valência’ também foram transformadas com o promotor da fenilalamina amônia-liase. Além das transformações, dois bioensaios foram instalados: um com as plantas de limão ‘Cravo’, visando avaliar resistência a gomose de Phytophthora e outro, com laranja ‘Valência’ transformada com o gene da cecropina. No primeiro caso, propagaram-se por enxertia plantas transgênicas de limão ‘Cravo’ e, após seis meses fez-se a inoculação com Phytophtora nicotianae, que consistiu na introdução de agulha contaminada com propágulos do patógeno, numa altura de 10 cm acima da região da enxertia. Vinte e cinco dias após aferiu-se o comprimento e área das lesões, bem como observou-se a presença de goma. Comparando-se o desempenho das duas linhagens transgênicas com o limão ‘Cravo’ não transformado, uma delas apresentou menor área a lesão. Já para as plantas com o gene cecropina um ensaio com folha destacada foi realizado, em que as mesmas foram perfuradas com auxílio de uma agulha e, posteriormente, pulverizadas com uma suspensão da bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri e, mantidas em tubo de centrífuga (50 mL), onde os pecíolos permaneciam em contato com água estérial (2 mL). Avaliou-se o período necessário para o aparecimento das primeiras lesões e o tamanho das lesões após quinze dias. Uma planta transgênica apresentou maior resistência perante a testemunha. Nas plantas transformadas com o promotor da fenilalamina amônia-liase, testes para observar a expressão do gene GUS foram realizados e comprovaram a capacidade desse promotor em direcionar os genes para a região dos vasos condutores. Os resultados obtidos nesse trabalho são pioneiros em citros, utilizando os genes bO, cecropina e o promotor PAL. / Application of modern biotechnology techniques, as genetic transformation, has helped breeding programs of perennial plant species. This technique is already successfully used in citrus in several countries, mostly to the production of more disease-tolerant plants. Present work had three objectives as it follows: 1. genetic transformation of Rangpur lime rootstock with the bacterio-opsin(bO) gene, related to the activation of plant defense mechanisms such as programmed cell death and salicylic acid production, towards the increase of the tolerance to Phytophthora gummosis; 2. genetic transformation of main sweet orange scion varieties (Hamlin, Valência, Natal and Pêra) with cecropin gene. This gene products present antibacterial activity, becoming a possible source for citrus canker and variegated chlorosis tolerance and. 3. to test the viability of the use of a xylem-specific promoter (phenylalanine ammonia lyase) in citrus. Transformations were performed by direct system via Agrobacterium tumefaciens, using juvenile citrus epicotyl segments, which showed to be feasible in citrus, once transgenic plants were obtained for all proposed genes. Molecular tests were conduced and confirmed the insertion of the genes described above. In the case of Rangpur lime two plants were regenerated; in the transformation of canopy varieties with cecropin gene, different efficiency rates were observed, and the best results were obtained for Valencia sweet orange (3.3-4.5 %) and Hamlin sweet orange (2.5-3.0 %), compared to Natal sweet orange (1.6-2.0 %) and Pêra sweet orange (0.5 %). Plants of Valência variety were also transformed with the phenylalanine ammonia lyase promoter, resulting in 15 diverse transformation events. Beyond transformations, two bioessays were installed: one with Rangpur lime plants, aiming to evaluate tolerance to gummosis caused by Phytophthora, and another with Valência sweet orange transformed with cecropin gene. In the first case Rangpur lime transgenic plants were propagated through grafting and, after six months, were inoculated with Phytophtora, by introducing a contaminated needle containing the pathogen propagules, at 10 cm above the grafting region; 25 days later the experiment evaluation was conduced, consisting on measuring the lenght and area of lesions, as well as on the observation of gum. Comparing the performance of Rangpur lime transgenic lines with that of a non-transformed Rangpur lime, one plant presented higher tolerance to gummosis. Although, for the cecropin-gene plants, it was conduced an essay with destached leaves, where these were punched by a needle and then sprayed with a bacterial suspension of Xanthomonas axonopodis pv. citri; they were kept in centrifuge tubes (50 mL), where petioles mantained contact with sterile water (2 mL). After 15 days, the necessary period to the first lesions appearance and their size were evaluated. One transgenic plant showed a higher tolerance in comparison to control. In plants transformed with phenylalanine ammonia lyase promoter, tests to observe gus gene expression were performed and comproved its ability to promote and direct gene activity to conductive vessels. This work results are the first in citrus using bO and cecropin genes, and PAL promoter.

O Huanglongbing (HLB) é uma das doenças mais ameaçadoras para citricultura mundial e, até o momento, não foi encontrada resistência na base genética do gênero Citrus. A doença é causada pela bactéria Candidatus Liberibacter spp., endêmica de floema. Portanto, na busca por uma planta transgênica resistente ao HLB é desejável avaliar construções gênicas em que o gene de interesse se expresse preferencialmente na região em que a bactéria coloniza a planta, ou seja, no floema. Assim, o objetivo deste trabalho foi a obtenção de plantas transgênicas via Agrobacterium tumefaciens, de citrange Carrizo [Poncirus trifoliata (L.) Raf. x Citrus sinensis (L.) Osbeck] e de laranja doce [Citrus sinensis (L.) Osbeck] cultivares Hamlin, Valência e Pêra, contendo o gene uidA (GUS) sob o controle dos promotores Citrus pholem protein 2 (CsPhP2), Arabidopsis thaliana pholem protein 2 (AtPhP2) e Arabidopsis thaliana sucrose transporter 2 (AtSuT2), para verificar se esses promotores regulam a expressão do gene repórter na região do floema. Foram utilizados segmentos de epicótilo de plântulas germinadas in vitro e como agente de seleção de regeneração de plantas transgênicas foi utilizado o gene nptII, que confere resistência ao antibiótico canamicina. Dos brotos regenerados foi coletada uma amostra de material para a realização do ensaio histoquímico com X-GLUC. Os brotos que formaram coloração azulada confirmaram a integração do transgene, sendo esses enxertados em porta enxertos previamente germinados e estiolados in vitro. A partir do número de explantes introduzidos, número explantes responsivos, número de brotos regenerados e número de brotos regenerados GUS positivos calculou-se a eficiência de transformação genética dos experimentos. Para a confirmação da transformação genética de laranja Hamlin foram realizadas análises de PCR e Southern blot de três plantas GUS positivas aclimatizadas. Também foram feitos cortes histológicos manuais para melhor visualização da reação histoquímica de GUS das plantas de laranja Hamlin Southern blot positivas. Todos os experimentos de transformação regeneraram pelo menos um broto GUS positivo. As plantas de laranja Hamlin analisadas por PCR e Southern blot analisadas foram confirmadas como transformadas com uma inserção do transgene. Plantas nas quais foram realizados cortes histológicos indicaram expressão diferencial das construções gênicas no floema. / Huanglongbing (HLB) is one of the most threatening diseases to worldwide citriculture and till the present moment, no resistance has been found in citrus genetic basis. This disease has Candidatus Liberibacter spp. as the pathogenic agent, an endemic phloem bacterium. Therefore, in the search for a transgenic plant resistant to HLB, it is desirable to evaluate constructions in which the gene of interest is expressed, preferentially, in tissues where the bacteria grow, i.e., in the phloem. Therefore, this work aimed to obtain transgenic plants of Carrizo citrange [Poncirus trifoliata (L.) Raf. x Citrus sinensis (L.) Osbeck], and of Hamlin, Valencia, and Pera sweet oranges [Citrus sinensis (L.) Osbeck], via Agrobacterium tumefaciens, containing uidA (GUS) gene, controlled by the promoters Citrus pholem protein 2 (CsPhP2), Arabidopsis thaliana pholem protein 2 (AtPhP2) and Arabidopsis thaliana sucrose transporter 2 (AtSuT2), in order to check if these promoters drive the reporter gene expression in the phloem. For the transformation, in vitro germinated seedlings epicotil segments were used. The gene nptII, which confers resistance to the antibiotic kanamycin, was used as the selective system. From the regenerated shoots, a tissue sample was collected to perform the X-GLUC histochemical analysis. The regenerated shoots colored in blue were considered transgenic, and these were grafted on in vitro grown rootstocks. The transformation efficiency of each experiment was calculated based on the number of introduced explants, responsive explants, number of regenerated shoots, and number of GUS positive regenerated shoots. In order to confirm the genetic transformation of Hamlin sweet orange, PCR and Southern blot analyses of three positive GUS acclimatized plants were performed. Anatomic slices for better visualization of blue color formed by GUS reaction were also made. All transformation experiments regenerated at least one GUS positive shoot. Plants of Hamlin sweet orange analyzed by PCR and Southern blot are transformed and have one transgene insertion. Anatomical analyses indicated preferential expression of the transgenes in the phloem.

O Brasil é o maior produtor de laranja doce do mundo. O histórico da citricultura brasileira é marcado por uma sucessão de doenças causadas por diferentes agentes etiológicos. Entre as principais doenças que afetam a cultura, têm levado a maiores prejuízos, as bacterianas, com destaque para o cancro cítrico causado por Xanthomonas citri subsp. citri e o Huanglongbing associado a três espécies de \"Candidatus Liberibacter\". Devido à ausência de cultivares de laranja doce resistentes a estas doenças, a transformação genética é uma alternativa promissora para obtenção de plantas resistentes. Uma das estratégias no uso da transgenia para conferir ação contra bactérias é a inserção de genes que codificam peptídeos antimicrobianos como o D4E1, um peptídeo sintético, que tem apresentado eficiência no controle de doenças fúngicas e bacterianas de várias culturas, in vivo e in vitro. Este trabalho foi realizado com o objetivo de obter plantas transgênicas de laranja doce das cultivares \'Hamlin\', \'Pêra\' e \'Valência\', via Agrobacterium tumefaciens, expressando o gene D4E1, dirigido pelos promotores CaMV35S (Cauliflower mosaic virus 35S promoter) de expressão constitutiva ou pelo AtPP2 (Arabidopsis thaliana phloem protein 2) com expressão preferencial no floema, visando obter plantas resistentes a doenças bacterianas. Foram obtidas 13 plantas transgênicas da cultivar \'Hamlin\', 10 da cultivar \'Pêra\' e 8 da cultivar \'Valência\', contendo a construção gênica CaMV35S/D4E1 e 19 plantas transgênicas da cultivar \'Hamlin\', 6 da cultivar \'Pêra\' e 15 da cultivar \'Valência\' contendo a construção gênica AtPP2/D4E1. As plantas transgênicas apresentaram um a três eventos de inserção do T-DNA no genoma. Os níveis de expressão do transgene dirigido pelo promotor de expressão preferencial no floema foi menor comparado ao das plantas contendo o transgene dirigido pelo promotor de expressão constitutiva. Os resultados da expressão do transgene permitem selecionar plantas com maior expressão de cada uma das construções gênicas, para que, futuramente, estas sejam multiplicadas e avaliadas quanto à resistência ao cancro cítrico e ao HLB. / Brazil is the largest sweet orange producer in the world. The history of the Brazilian citrus industry is marked by a series of diseases caused by different etiologic agents. Among the diseases affecting the culture, those caused by bacteria are the ones that have caused more significant losses, especially the citrus canker caused by Xanthomonas citri subsp. citri, and huanglongbing (HLB) associated with three \"Candidatus Liberibacter\" bacteria species. Due to the absence of genetic resistance to these diseases in commercial sweet orange cultivars, the genetic transformation is a promising alternative to produce resistant plants. One of the strategies to produce transgenic resistant plants to bacteria is the use of genes that code for antimicrobial peptides, such as D4E1, a antimicrobial synthetic peptide, which has shown efficient results controlling diseases caused by bacteria and fungi in several crops, through in vitro and in vivo experiments. The aim of this study was to produce \'Hamlin\', \'Pêra\' and \'Valencia\' sweet orange transgenic plants, via Agrobacterium tumefaciens, expressing the D4E1 gene driven by the constitutive promoter Cauliflower mosaic virus (CaMV35S) or Arabidopsis thaliana phloem protein 2 (AtPP2), a promoter preferentially expressed in the phloem. It was possible to regenerate 13 \'Hamlin\' transgenic lines, 10 \'Pêra\' transgenic lines and 8 \'Valencia\' transgenic lines bearing the gene construct CaMV35S/D4E1, whereas 19 \'Hamlin\' transgenic lines, 6 \'Pêra\' transgenic lines and 15 \'Valencia\' transgenic lines bearing the AtPP2/D4E1 gene construct were regenerated. The transgenic plants had one to three T-DNA insertion events in the genome. The transgene expression levels in transgenic plants for D4E1 gene driven by the phloem preferential promoter were lower than the transgenic expression levels of the transgene driven by the constitutive promoter. Transgene expression levels results may allow the selection of those plants with higher expression levels of each genetic construct for future multiplication and evaluation for citrus canker and HLB resistance.

A alface é a principal hortaliça folhosa do Brasil. A podridão negra das raízes causada pelo fungo Thielaviopsis basicola vem limitando o cultivo da alface americana ´Lucy Brown`. Os objetivos desta pesquisa foram: determinar a reação das cultivares comerciais de alface à T. basicola; elucidar a herança da resistência de alface ao patógeno e selecionar alface americana resistente ao patógeno a partir de variantes da ‘Lucy Brown`. Inocularam-se 37 cultivares de alface usando o isolado patogênico L1 de T. basicola, na fase juvenil. Para todos os ensaios a avaliação foi feita na fase juvenil através de uma escala de notas de acordo com a severidade da doença de 1 (ausência de sintomas) a 5 (mais de 90% das raízes severamente afetadas). A seleção de progênies resistentes ao patógeno foi feita a partir de variantes da ´Lucy Brown` pelo método genealógico usando um critério qualitativo para uniformidade, qualidade da cabeça e adaptação para o cultivo nas condições de verão. As cultivares do tipo crespa e batávia foram resistentes ao patógeno. As do tipo lisa e americana apresentaram variação inter-varietal quanto à reação a T. basicola. A herança da reação de alface a T. basicola foi devido a um gene dominante, designado de Tb. As progênies elites S4 derivadas da alface ´Lucy Brown` foram resistentes ao patógeno, uniformes e estáveis para o mérito hortícola no cultivo de verão. / Lettuce is the major leafy crop in Brazil. Lettuce black root rot (LBRR) caused by Thielaviopsis basicola is one the most limiting disease for the crisphead lettuce cv. Lucy Brown. Research focuses were: cultivars reaction to the pathogen; resistance inheritance elucidation and selections of LBRR resistant variants from cv. Lucy Brown. About 37 cultivars were screened using L1 pathogenic strain of T. basicola at juvenile stage. The reaction reading was made for all trials at juvenile stage using a severity disease scale from 1 (absence of symptoms) to 5 (with more than 90% of root rots). Selection of LBRR variants derived from Lucy Brown was made by pedigree selection and using selective criteria of line uniformity, heading qualities and adaptation for summer season slotting planting. Leaf lettuce Grand Rapids and Batavia types were resistant. There was inter-varietal occurrence of crisphead and butterhead resistance and other susceptible to LBRR. The inheritance to LBRR resistance in lettuce was due to a dominant gene designated as Tb. Elite LBRR resistant S4 lines derived from the crisphead cv. Lucy Brown were identified by their uniformity and stability for summer crop adaptation.