As metaloproteases (MPs) são proteínas que participam em diversos processos fisiológicos e patológicos. Neste trabalho, relatamos a identificação de MPs em três carrapatos de importância econômica: Ixodes persulcatus (Ip-MPs), Rhipicephalus sanguineus (Rs-MPs) e Rhipicephalus microplus (BrRm-MPs). O perfil transcricional em vários tecidos e fases de vida mostra que MPs são transcritas em glândula salivar durante a alimentação de fêmeas e não são transcritos no macho (com exceção de uma MP, BrRm-MP4) e ovos, o que sugere que esta família da proteínas são componentes funcionais necessários para interferir nas defesas do hospedeiro, apoiando o processo de hematofagia. A presença de um sítio de ligação de zinco, uma dobra“Met-turn” e um domínio rico em cisteína na região C-terminal indica que todas os transcritos obtidos codificam para a família de MPs reproplisina (metzincina). Uma das MPs de R. microplus (BrRm-MP4) foi selecionada para uma investigação mais aprofundada quanto ao potencial como um antígeno vacinal, devido ao seu padrão de transcrição ubíquos e devido àprevisão in silico de epítopos imunogênicos, em comparação com as demais MPs identificadas. BrRm-MP4 recombinante (rBrRm-MP4) foi expressa em Escherichia coli e testadas como um antígeno contra infestação de R. microplus. Imunoblot mostrou que o soro de bovinos imunizados com rBrRm-MP4 reconhece BrRm-MP4 da glândula salivar, ovário e larvas de R. microplus. Comparando com o controle, a vacinação com rBrRm-MP4 proporcionou uma redução de 43% no número de fêmeas adultas, redução de 14,80% na postura de ovos e redução de 17,53 % na capacidade de eclosão da larva, realizando um proteção total de 60% estatisticamente significativa. Os resultados indicam que rBrRm-MP4 é um potencial candidato a ser incluído como imunógeno em uma vacina anti-carrapato. / Metalloproteases (MPs) are proteins participating in several physiological and pathological processes. Here, we report the identification of MPs in three economically important ticks: Ixodes persulcatus (Ip-MPs), Rhipicephalus sanguineus (Rs-MPs) and Rhipicephalus microplus (BrRm-MPs). Transcriptional profile in various tissues and life stages revealed the presence of all MPs transcripts in salivary glands during feeding stages and absence in males (except one MP, BrRm-MP4) and eggs, suggesting this family proteins are functional components required to interfere with host defenses, supporting tick hematophagy. The presence of a zinc binding site, a “Met-turn” and C-terminal cysteine rich domain indicates all obtained transcripts encode for proteins belonging to the reproplysin (metzincin) family of MPs. A R. microplus MP (BrRm-MP4) was selected for further investigation concerning its potential as a vaccinal antigen due to its ubiquitous transcription pattern and in silico prediction of immunogenic epitopes, comparing to other obtained MPs. Recombinant BrRm-MP4 (rBrRm-MP4) was expressed in Escherichia coli and tested as an immune-protective antigen against R. microplus infestation. Immunoblot showed specific antibodies against rBrRm-MP4 in immunized calves sera. Sera from immunized calves recognized BrRm-MP4 in R. microplus salivary gland, ovary and larvae. Comparing to ticks reared non-vaccinated calves, rBrRm-MP4 provided 43% reduction in adult female number, 14.80% reduction in egg laying and 17.53% reduction in larva hatching capacity, performing an overall 60% statistically significant protection. We assume rBrRm-MP4 is a potential candidate to be included as immmunogen for further development in an anti-tick vaccine.

As metaloproteases (MPs) são proteínas que participam em diversos processos fisiológicos e patológicos. Neste trabalho, relatamos a identificação de MPs em três carrapatos de importância econômica: Ixodes persulcatus (Ip-MPs), Rhipicephalus sanguineus (Rs-MPs) e Rhipicephalus microplus (BrRm-MPs). O perfil transcricional em vários tecidos e fases de vida mostra que MPs são transcritas em glândula salivar durante a alimentação de fêmeas e não são transcritos no macho (com exceção de uma MP, BrRm-MP4) e ovos, o que sugere que esta família da proteínas são componentes funcionais necessários para interferir nas defesas do hospedeiro, apoiando o processo de hematofagia. A presença de um sítio de ligação de zinco, uma dobra“Met-turn” e um domínio rico em cisteína na região C-terminal indica que todas os transcritos obtidos codificam para a família de MPs reproplisina (metzincina). Uma das MPs de R. microplus (BrRm-MP4) foi selecionada para uma investigação mais aprofundada quanto ao potencial como um antígeno vacinal, devido ao seu padrão de transcrição ubíquos e devido àprevisão in silico de epítopos imunogênicos, em comparação com as demais MPs identificadas. BrRm-MP4 recombinante (rBrRm-MP4) foi expressa em Escherichia coli e testadas como um antígeno contra infestação de R. microplus. Imunoblot mostrou que o soro de bovinos imunizados com rBrRm-MP4 reconhece BrRm-MP4 da glândula salivar, ovário e larvas de R. microplus. Comparando com o controle, a vacinação com rBrRm-MP4 proporcionou uma redução de 43% no número de fêmeas adultas, redução de 14,80% na postura de ovos e redução de 17,53 % na capacidade de eclosão da larva, realizando um proteção total de 60% estatisticamente significativa. Os resultados indicam que rBrRm-MP4 é um potencial candidato a ser incluído como imunógeno em uma vacina anti-carrapato. / Metalloproteases (MPs) are proteins participating in several physiological and pathological processes. Here, we report the identification of MPs in three economically important ticks: Ixodes persulcatus (Ip-MPs), Rhipicephalus sanguineus (Rs-MPs) and Rhipicephalus microplus (BrRm-MPs). Transcriptional profile in various tissues and life stages revealed the presence of all MPs transcripts in salivary glands during feeding stages and absence in males (except one MP, BrRm-MP4) and eggs, suggesting this family proteins are functional components required to interfere with host defenses, supporting tick hematophagy. The presence of a zinc binding site, a “Met-turn” and C-terminal cysteine rich domain indicates all obtained transcripts encode for proteins belonging to the reproplysin (metzincin) family of MPs. A R. microplus MP (BrRm-MP4) was selected for further investigation concerning its potential as a vaccinal antigen due to its ubiquitous transcription pattern and in silico prediction of immunogenic epitopes, comparing to other obtained MPs. Recombinant BrRm-MP4 (rBrRm-MP4) was expressed in Escherichia coli and tested as an immune-protective antigen against R. microplus infestation. Immunoblot showed specific antibodies against rBrRm-MP4 in immunized calves sera. Sera from immunized calves recognized BrRm-MP4 in R. microplus salivary gland, ovary and larvae. Comparing to ticks reared non-vaccinated calves, rBrRm-MP4 provided 43% reduction in adult female number, 14.80% reduction in egg laying and 17.53% reduction in larva hatching capacity, performing an overall 60% statistically significant protection. We assume rBrRm-MP4 is a potential candidate to be included as immmunogen for further development in an anti-tick vaccine.

As metaloproteases (MPs) são proteínas que participam em diversos processos fisiológicos e patológicos. Neste trabalho, relatamos a identificação de MPs em três carrapatos de importância econômica: Ixodes persulcatus (Ip-MPs), Rhipicephalus sanguineus (Rs-MPs) e Rhipicephalus microplus (BrRm-MPs). O perfil transcricional em vários tecidos e fases de vida mostra que MPs são transcritas em glândula salivar durante a alimentação de fêmeas e não são transcritos no macho (com exceção de uma MP, BrRm-MP4) e ovos, o que sugere que esta família da proteínas são componentes funcionais necessários para interferir nas defesas do hospedeiro, apoiando o processo de hematofagia. A presença de um sítio de ligação de zinco, uma dobra“Met-turn” e um domínio rico em cisteína na região C-terminal indica que todas os transcritos obtidos codificam para a família de MPs reproplisina (metzincina). Uma das MPs de R. microplus (BrRm-MP4) foi selecionada para uma investigação mais aprofundada quanto ao potencial como um antígeno vacinal, devido ao seu padrão de transcrição ubíquos e devido àprevisão in silico de epítopos imunogênicos, em comparação com as demais MPs identificadas. BrRm-MP4 recombinante (rBrRm-MP4) foi expressa em Escherichia coli e testadas como um antígeno contra infestação de R. microplus. Imunoblot mostrou que o soro de bovinos imunizados com rBrRm-MP4 reconhece BrRm-MP4 da glândula salivar, ovário e larvas de R. microplus. Comparando com o controle, a vacinação com rBrRm-MP4 proporcionou uma redução de 43% no número de fêmeas adultas, redução de 14,80% na postura de ovos e redução de 17,53 % na capacidade de eclosão da larva, realizando um proteção total de 60% estatisticamente significativa. Os resultados indicam que rBrRm-MP4 é um potencial candidato a ser incluído como imunógeno em uma vacina anti-carrapato. / Metalloproteases (MPs) are proteins participating in several physiological and pathological processes. Here, we report the identification of MPs in three economically important ticks: Ixodes persulcatus (Ip-MPs), Rhipicephalus sanguineus (Rs-MPs) and Rhipicephalus microplus (BrRm-MPs). Transcriptional profile in various tissues and life stages revealed the presence of all MPs transcripts in salivary glands during feeding stages and absence in males (except one MP, BrRm-MP4) and eggs, suggesting this family proteins are functional components required to interfere with host defenses, supporting tick hematophagy. The presence of a zinc binding site, a “Met-turn” and C-terminal cysteine rich domain indicates all obtained transcripts encode for proteins belonging to the reproplysin (metzincin) family of MPs. A R. microplus MP (BrRm-MP4) was selected for further investigation concerning its potential as a vaccinal antigen due to its ubiquitous transcription pattern and in silico prediction of immunogenic epitopes, comparing to other obtained MPs. Recombinant BrRm-MP4 (rBrRm-MP4) was expressed in Escherichia coli and tested as an immune-protective antigen against R. microplus infestation. Immunoblot showed specific antibodies against rBrRm-MP4 in immunized calves sera. Sera from immunized calves recognized BrRm-MP4 in R. microplus salivary gland, ovary and larvae. Comparing to ticks reared non-vaccinated calves, rBrRm-MP4 provided 43% reduction in adult female number, 14.80% reduction in egg laying and 17.53% reduction in larva hatching capacity, performing an overall 60% statistically significant protection. We assume rBrRm-MP4 is a potential candidate to be included as immmunogen for further development in an anti-tick vaccine.

Própolis é uma substância resinosa produzida por Apis mellifera, contendo principalmente resinas vegetais e cera das próprias abelhas. É usada na colmeia para diversas finalidades, como vedar aberturas, reparar as células e envolver invasores que foram mortos na colméia, além de contribuir para a quase constância da temperatura dentro da colmeia (28 - 30oC). A própolis é importante para as abelhas, pois é responsável pela manutenção de um ambiente quase estéril, agindo contra bactérias, fungos e até larvas invasoras. Em virtude do amplo espectro de atividades biológicas e farmacológicas associadas a esse produto, a própolis vem sendo extensivamente utilizada em medicina alternativa, bem como na indústria cosmética e alimentícia. Apesar dos numerosos estudos já realizados com própolis, os poucos que foram feitos visando ao uso em veterinária relacionavam-se a combate de endoparasitas. Muitas doenças de animais vêm acometendo o homem atualmente, tais como as transmitidas pelos carrapato vermelho do cão (Rhipicephalus sanguineus) e carrapato-estrela (Amblyomma cajennense). Problemas de saúde para o gado e queda da produtividade pecuária é causada pelo carrapato do boi (Rhipicephalus microplus). Além disso, é crescente o interesse de profissionais veterinários pelo uso de produtos naturais, sobretudo em relação aos animais domésticos. Vale lembrar que o uso indiscriminado de acaricidas levou à seleção de carrapatos resistentes, de modo que outras estratégias para o controle dessas pragas são de grande importância. Com isso, o intuito do presente projeto foi a determinação da atividade de extratos brutos de própolis brasileira e seus constituintes no controle de carrapatos específicos e generalistas. Foram preparados extratos clorofórmicos de amostras de própolis verde de Lavras (MG) e própolis preta de Picos (PI), anteriormente analisadas quimicamente. Os extratos foram concentrados à secura e redissolvidos para administração a carrapatos mantidos em laboratório. Os ensaios com extratos brutos foram realizados in vitro para avaliar seu efeito nos artrópodos, empregando-se o teste de pacote de larvas. Foram realizados isolamentos biomonitorados, na tentativa de obtenção de substâncias ativas presentes nas própolis analisadas. O extrato bruto de Picos não revelou atividade acaricida. Por outro lado, o extrato bruto de Lavras mostrou-se bastante ativo e, então, foi fracionado por cromatografia em coluna de gel de sílica. As frações resultantes foram novamente avaliadas em ensaios in vitro em carrapatos. Novo fracionamento e novos bioensaios foram realizados, e foi identificada uma subfração com atividade acaricida. Análises por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) foram desenvolvidas e quatro substâncias majoritárias (ácido 2,2-dimetil-cromeno-6-propenoico-dicafeoil glucosídeo, artepilina-C, bacarina e ácido 2,2-dimetil-cromeno-8-prenil-6-propenoico) dessa subfração ativa foram isoladas em CLAE-preparativo. As substâncias obtidas foram identificadas por meio de análises espectroscópicas correntes em química de produtos naturais (IV, UV, massas e RMN). Por fim, novos bioensaios foram realizados com a espécie de carrapato mais suscetível, Rhipicephalus microplus, porém não se observou atividade acaricida significativa para as substâncias isoladas. Assim sendo, talvez a alta atividade acaricida constatada na subfração ativa seja decorrente do sinergismo entre substâncias. / Propolis is a resinous substance produced by bees Apis mellifera, containing mainly plant exudates and bee waxes. It is used in the hive to close holes, repair cells and involve intruders that are killed inside the hive. Propolis is important to the bees, as it is responsible for the maintenance of the hive as a sterile environment, acting against bacteria, fungus and even invading larvae. Because of the wide range of biological and pharmacological activities of propolis, it has been extensivelly used in alternative medicine, as well as in cosmetic and food industries. However, few studies have been developed concerning the use of propolis to animal health. Nowadays, many animal diseases have affected humans, such as those transmited by ticks, the brown dog tick (Rhipicephalus sanguineus) and the star tick (Amblyomma cajennense). Cattle health problems and decrease of livestock productivity is caused by the cattle tick (Rhipicephalus microplus). In addition, the interest of veterinary professionals toward the use of natural products to animal health is increasing, mainly for the treatment of domestic animals. It is worth remembering that the indiscriminate use of acaricides leads to resistence selection. Thus, new strategies are of great importance for tick control. Hence, the aim of this project was to determine the activity of crude extracts of Brazilian propolis and their constituents for the control of specific and generalist ticks. Chloroform extracts were prepared from samples of green propolis from Lavras (state of Minas Gerais) and black propolis from Picos (state of Piauí), previously analyzed chemically. The extracts were concentrated to dryness and redissolved for ticks administration in laboratory. The bioassays were carried out in vitro to verify the effectivness of the extracts using the larval package test. Bioassays-guided isolations were carried out to obtain active constituents presented in the studied samples. The crude extract of propolis sample from Picos did not show any acaricide activity. On the other hand, the sample propolis from Lavras showed high activity, and then was fractionated by colunm chromatography in silica gel. The fractions obtained were tested, and a subfraction with acaricide activity was obtained. Analyses by high performance liquid chromatography (HPLC) were developed and four compounds (2,2-dimethyl-cromene-6-propenoic-dicafeoyl glucoside acid, artepillin-C, baccarin and 2,2-dimethyl-cromene-8-prenyl-6-propenoic acid) of the active subfraction were isolated using preparative HPLC. These compounds were identified by means of current spectroscopic analysis in chemistry of natural products (IR, UV, mass and NMR). Finally, new bioassays were carried out with the most susceptible tick specie, Rhipicephalus microplus, but no effect was observed testing the isolated compounds. Thus, probably the high acaricidal activity observed in the active subfraction was due to a synergism among the subfraction constituents.

Carrapatos são animais hematófagos transmissores de diversas doenças para animais e seres humanos. O Rhipicephalus (Boophilus) microplus é um ectoparasito específico de bovinos. É responsável por importantes perdas econômicas na pecuária de países produtores de carne e leite. O aumento de populações de carrapatos resistentes aos principais acaricidas usados e a possível contaminação ambiental e dos produtos derivados como carne e leite impõem estudos para desenvolver novos métodos de controle. O controle imunológico é uma estratégia comprovadamente viável, porém ainda falta encontrar antígenos suficientemente eficientes. Uma das estratégias para atingir esse fim é o estudo de proteínas participantes de processos fisiológicos de grande importância para o carrapato, como é a aquisição e digestão de sangue. Proteínas pertencentes à superfamília das serpinas (serine protease inhibitors) participam do controle de diversos processos fisiológicos em mamíferos, inclusive coagulação sanguínea, fibrinólise e ativação do sistema complemento. Uma vez que carrapatos possuem informação para a síntese de serpinas, supõe-se que algumas têm como função perturbar a homeostase de seus hospedeiros. Analisando banco de sequências de cDNA identificamos 16 sequências que codificam serpinas no carrapato bovino, que foram nomeadas RmS (R. microplus serpin). Análises por RT-PCR mostraram que na maioria dos tecidos e estágios de desenvolvimento do parasito há expressão das RmS. Todas as sequências identificadas mostram conservação com serpinas de outras espécies de carrapatos. Aproximadamente 41% das RmS (7 de 16) provavelmente são secretadas, pois possuem predição para peptídeo-sinal. Assim como em outras serpinas, todas RmS possuem entre 1 e 4 sítios para N-glicosilação. Modelos tridimensionais revelam conservação de estrutura terciária das RmS analisadas com outras serpinas de mamíferos. Devido à presença de peptídeo-sinal, conservação com serpinas de outros carrapatos e presença em saliva, que foi revelada pelo estudo proteômico preliminar da saliva do parasito, RmS-3 foi escolhida para estudos mais pormenorizados. Para isso, a sequência codificadora foi clonada e ela foi obtida em forma recombinante. Anticorpos policlonais produzidos contra a proteína recombinante revelaram a presença da proteína em todos os tecidos analisados, e também na saliva, o que sugere participar na modulação das respostas do hospedeiro. / Ticks are hematophagous animals vectors of several human and animal diseases. Rhipicephalus (Boophilus) microplus is a bovine-specific ectoparasite. It is causes significant economic losses in livestock-producing countries. Increasing tick acaricide-resistant populations and, possible contamination on the environmental and on bovine-derived products contamination such as meat and milk impel the study of new control methods. Immunological control is a strategy proved to be feasible, but it requires really efficient antigens. A strategy to achieve this purpose is the study of proteins acting in physiological processes of major importance for the tick, as blood intake and digestion. Proteins belonging to the superfamily of serpins (serine protease inhibitors) have a role in several mammalian physiological processes, including blood coagulation, fibrinolysis and complement activation. As ticks encode information for serpins synthesis it is assumed they disrupt homeostasis their hosts. Through analysis of the cDNA sequences database, we identified 16 sequences coding for serpins in cattle tick, which were named RmS (R. microplus serpin). RT-PCR analyses showed RmSs are expressed in most tick tissues and developmental stages. All identified sequences are conserved concerning other tick species serpins. Around 41% of RmS (7 out 16) are probably secreted, since they have sequences predicting for signal peptide. Similarly as other serpin, all RmSs have 1 to 4 N-glycosylation sites. Protein modeling showed all RmSs have a conserved tertiary structure with other mammal serpins. RmS-3 was chosen for further studies due to presence of signal peptide, conservation with serpin inform other ticks and the presence in saliva revealed by an initial a proteomic study of tick saliva. In these studies, its gene was cloned RmS-3 was obtained as a recombinant protein. Polyclonal antibodies were against the recombinant protein showed RmS-3 presence in all analyzed tissues and also in saliva, suggesting it have a role disturbing host responses.

Carrapatos são artrópodos hematófagos distribuídos por todo o mundo e vetores de diversas doenças. Como todos os hematófagos, os carrapatos possuem um arsenal de moléculas que inibe a resposta hemostática do hospedeiro, o que viabiliza o repasto sanguíneo bemsucedido. O carrapato bovino Rhipicephalus (Boophilus) microplus é um carrapato de um só hospedeiro e considerado o mais importante parasito de animais domésticos da América Latina. O R. microplus causa sérios danos aos bovinos, direta, e principalmente, devido à espoliação de sangue que leva à anemia e diminuição da produção de leite e do ganho de peso; e, indiretamente, via a transmissão de patógenos, como Babesia spp. e Anaplasma spp. O R. microplus é também um modelo interessante para o estudo das relações parasitohospedeiro, visto que ele permanece fixado ao mesmo hospedeiro durante toda a sua vida parasitária, o que leva em torno de três semanas. Os objetivos deste trabalho são explorar os mecanismos farmacológicos da saliva do carrapato R. microplus capazes de modular o sistema hemostático, bem como o papel que esta modulação desempenha na relação parasito-hospedeiro. Nesse sentido, este estudo foi organizado em duas partes. Primeiramente, foi realizada uma investigação sobre os parâmetros hemostáticos em bovinos infestados por carrapatos. Em um segundo momento, foram estudados os mecanismos da saliva do carrapato envolvidos na inibição da hemostasia, assim como a habilidade do soro de bovinos repetidamente infestados (que apresentam resistência imunológica naturalmente adquirida contra o carrapato bovino) em interferir na ação antihemostática da saliva do carrapato. Na primeira parte do estudo, foi demonstrado que bovinos experimentalmente infestados com 20.000 larvas de R. microplus apresentam uma diminuição na capacidade de agregação plaquetária (em resposta a colágeno e ADP), bem como na coagulação sanguínea (evidenciada por um aumento nos tempos de tromboplastina parcialmente ativado e de protrombina), enquanto a contagem de plaquetas e os níveis de fibrinogênio aumentaram significativamente ao longo da infestação. Na segunda parte, foi demonstrado que a saliva de R. microplus: (i) apresenta atividade inibitória in vitro sobre a agregação plaquetária induzida por colágeno; (ii) inibe a indução de ativação endotelial; e (iii) reduz a trombogênese in vivo. Ademais, o soro de bovinos repetidamente infestados (RIBS) foi capaz de bloquear parcialmente a atividade anticoagulante e antitrombótica da saliva e totalmente a modulação da ativação endotelial, ao passo que o RIBS não apresentou nenhum efeito sobre a inibição da agregação plaquetária. O conjunto dos dados apresentados permite um melhor entendimento dos fenômenos que ocorrem no hospedeiro durante o parasitismo, e também fornece mais subsídios para uma maior compreensão do processo de hematofagia e dos mecanismos fisiopatológicos que regem a relação parasitohospedeiro. / Ticks are blood-feeding arthropods widely distributed in the world and vectors of several diseases. Like all hematophagous animals, ticks resort to a variety of molecules in order to avoid the host hemostatic response, which in turn allow a successful blood-meal. The cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus is an one-host tick, and is considered the most harmful parasite of domesticated animals in Latin America. R. microplus causes expressive injuries to bovines, directly, mainly due to blood spoliation, leading to anemia, and diminution of milk production and weight gain. Indirectly the tick is responsible for the transmission of pathogens such as Babesia spp. and Anaplasma spp. R. microplus is also a consistent model to study the parasite-host relationship, since it remains attached to the same host throughout the whole parasitic stage, which lasts around three weeks. This work aims at exploring the pharmacological mechanisms of R. microplus tick saliva able to modulate hemostasis, and the role of this modulation in tick-host relationship. In this sense, this study was organized in two parts: firstly, an investigation about the hemostatic parameters in tick infested bovines was performed. Secondly, the tick salivary mechanisms involved in the inhibition of hemostasis were studied, and the ability of serum from repeatedly infested bovines (which displays natural acquired immunological resistance to the cattle tick) to interfere in anti-hemostatic activity of tick saliva was also investigated. In the first part of this study it was shown that calves experimentally infested with 20,000 R. microplus larvae display a decrease in platelet aggregation (in response to collagen and ADP) as well as in coagulation ability (evinced by an increase in activated partial thromboplastin time and prothrombin time), whereas platelet blood count and fibrinogen level significantly increased during the course of infestation. In the second part of this work, it was demonstrated that R. microplus saliva: (i) displays in vitro inhibitory activity upon collagen-induced platelet aggregation; (ii) inhibits the induction of endothelial activation; and (iii) reduces thrombogenesis in vivo. Moreover, repeated infested bovine sera (RIBS) were shown to be able to partially block the delay of coagulation and the antithrombotic effect of saliva, and to totally abolish the modulation of endothelium activation, in spite of the fact that RIBS has no effect on the inhibition of platelet aggregation. The set of data presented in this work allows a better understanding of the phenomena occurring in the host during parasitism, and also gives more insights to improve the understanding of the hematophagy process and the pathophysiological mechanisms behind host-tick interaction.

O metabolismo da quitina em fungos envolve diversos processos, tais como a manutenção da parede celular metabolicamente ativa, a nutrição básica e também diferentes aspectos da virulência. Quitinases são enzimas pertencentes às famílias 18 e 19 das glicosil hidrolases (GH18 e GH19) e são responsáveis pela hidrólise das ligações β-1,4 da quitina. Este homopolímero linear composto de unidades de N-acetil-glicosamina é um componente essencial da parede celular de fungos e do exoesqueleto de artrópodes. Inúmeras quitinases foram atribuídas a atividades estruturais, morfogênicas, autolíticas e nutricionais em células fúngicas. No entomopatógeno Metarhizium anisopliae, as quitinases também estão envolvidas na virulência. Os genomas de fungos filamentosos exibem um número maior de genes que codificam para quitinases do que os genomas de bactérias ou de leveduras. Uma busca realizada no genoma de M. anisopliae identificou 24 genes que pertencem à família 18 das glicosil hidrolases, incluindo os três genes que codificam quitinases previamente determinados e nomeados de chit1, chi2 e chi3. Essas quitinases putativas foram classificadas, com base na organização de seus domínios e em análises filogenéticas, nos subgrupos previamente descritos A, B e C e em um novo subgrupo D. Além disso, três outras proteínas GH18 puderam ser classificadas como endo-N-acetil-glicosaminidases putativas, enzimas que estão associadas com deglicosilação e foram, portanto, classificadas em um novo subgrupo E. O perfil transcricional dos genes GH18 foi avaliado por qPCR utilizando RNA extraído de oito diferentes condições de cultivo, representando diferentes estágios de desenvolvimento ou diferentes estados nutricionais. Esses transcritos dos genes GH18 foram detectados em pelo menos um dos diferentes estágios de desenvolvimento de M. anisopliae validando, portanto, os genes propostos. Nem todos os membros de um mesmo subgrupo apresentaram padrões iguais de expressão sob as diferentes condições. A determinação das quitinases e ENGases de M. anisopliae e um estudo mais detalhado envolvendo o papel dessas enzimas em funções morfológicas ou nutricionais irá permitir um entendimento mais amplo do potencial quitinolítico deste fungo entomopatogênico altamente infectivo. Com o objetivo de avançar no estudo das quitinases de M. anisopliae, vetores para a construção de mutantes nulos para os quatro genes de quitinases do sgC foram gerados e, utilizando a metodologia de agrotransformação para fungos, linhagens transformantes foram obtidas. Análises genéticas e fenotípicas múltiplas serão realizadas para avaliar as alterações induzidas pelos mutantes de quitinases do sgC. / Fungal chitin metabolism involves diverse processes such as metabolically active cell wall maintenance, basic nutrition, and different aspects of virulence. Chitinases are enzymes belonging to the glycoside hydrolase family 18 (GH18) and 19 (GH19) and are responsible for the hydrolysis of β-1,4-linkages in chitin. This linear homopolymer of N-acetyl-β-Dglucosamine is an essential constituent of fungal cell walls and arthropod exoskeletons. Several chitinases have been directly implicated in structural, morphogenetic, autolytic and nutritional activities of fungal cells. In the entomopathogen Metarhizium anisopliae, chitinases are also involved in virulence. Filamentous fungi genomes exhibit a higher number of chitinase-coding genes than bacteria or yeasts. The survey performed in the M. anisopliae genome has successfully identified 24 genes belonging to glycoside hydrolase family 18, including three previously experimentally determined chitinase-coding genes named chit1, chi2 and chi3. These putative chitinases were classified based on domain organization and phylogenetic analysis into the previously described A, B and C chitinase subgroups, and into a new subgroup D. Moreover, three GH18 proteins could be classified as putative endo-N-acetyl-β-D-glucosaminidases, enzymes that are associated with deglycosylation and were therefore assigned to a new subgroup E. The transcriptional profile of the GH18 genes was evaluated by qPCR with RNA extracted from eight culture conditions, representing different stages of development or different nutritional states. The transcripts from the GH18 genes were detected in at least one of the different M. anisopliae developmental stages, thus validating the proposed genes. Moreover, not all members from the same chitinase subgroup presented equal patterns of transcript expression under the eight distinct conditions studied. The determination of M. anisopliae chitinases and ENGases and a more detailed study concerning the enzymes' roles in morphological or nutritional functions will allow comprehensive insights into the chitinolytic potential of this highly infective entomopathogenic fungus. In order to proceed on the study of M. anisopliae chitinases, four vectors to sgC chitinases single gene knockouts were developed by using Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, and a few mutant strains were recovered. Multiple phenotypic and genetic analyses will be performed to evaluate the modifications induced by sgC chitinase gene mutant strains after their validation.

Carrapatos são ectoparasitos hematófagos que causam grandes impactos na saúde pública e na produção animal devido à sua capacidade vetorial e também pelos distúrbios associados diretamente ao parasitismo. O carrapato Rhipicephalus microplus é considerado o parasito mais importante de bovinos na América Latina e Oceania. Os carrapatos permanecem fixados ao hospedeiro por um longo período de tempo, e a saliva representa um fator crucial na relação parasito-hospedeiro. Os carrapatos secretam na saliva um conjunto de moléculas com atividades que modulam as respostas de defesa do hospedeiro frente ao parasitismo, tais como as reações do sistema hemostático e do sistema imune inato e adaptativo. Considerando a importância econômica do carrapato R. microplus, e o papel da saliva no parastismo, pouco se sabe sobre a composição proteica da saliva desse parasito. Os objetivos desse trabalho são caracterizar o proteoma da saliva do carrapato R. microplus em diferentes momentos da fase de alimentação no hospedeiro bovino e caracterizar três serpinas salivares. Neste sentido, este estudo foi organizado em três partes. Primeiramente, fizemos uma análise proteômica da saliva de fêmeas adultas em dois estágios de ingurgitamento, compreendendo fêmeas parcialmente ingurgitadas e fêmeas totalmente ingurgitadas. Num segundo momento, analisamos mais a fundo a variação dos componentes proteicos salivares das fêmeas, expandindo a análise proteômica para nove fases de ingurgitamento do parasito. Esses dados mostraram que a saliva de R. microplus é uma amostra proteica complexa, com variação nos diferentes tempos de alimentação. Entre as classes de proteínas identificadas, podemos citar proteínas relacionadas com metabolismo de heme e ferro; proteínas relacionadas com processos de oxidação e detoxificação; enzimas como as serino-proteases, cisteíno-proteases, metaloproteases; inibidores de proteases da família das serpinas, cistatinas, TIL e Kunitz; peptídeos antimicrobianos; e famílias de proteínas específicas e conservadas em carrapatos. A terceira parte do trabalho objetivou a caracterização de três serpinas que foram identificadas na saliva (RmS-3, RmS-6 e RmS-17). Essas proteínas foram expressas em Pichia pastoris e foram utilizadas em ensaios de caracterização funcional contra um painel de 16 proteases relacionadas com os sistemas de defesa do hospedeiro, revelando um perfil de inibição sobre proteases pró-inflamatórias e prócoagulantes. Os dados apresentados neste trabalho contribuem para o entendimento do papel de proteínas salivares durante o parasitismo pelo carrapato R. microplus. / Ticks are hematophagous ectoparasites with worldwide distribution impacting on public health and animal production due to their vectorial capacity and also for disorders associated directly to parasitism. The tick Rhipicephalus microplus is considered the most important parasite of cattle in Latin America and Oceania. As hematophagous ectoparasites which remain attached to the host for a long period of time, the saliva of ticks represent a crucial factor in host-parasite relationship. The tick saliva comprises an arsenal of molecules with activities modulating the host defense responses trigged against tick feeding, such as the reactions of the hemostatic system, the innate immune system and the adaptive immune system. Considering the economic importance of the tick R. microplus, little is known about the protein composition of the saliva of this parasite. The aims of this study were to characterize the R. microplus tick saliva proteome at different feeding times, and to characterize three salivary serpin that were identified in the saliva of this parasite. Thus, this study was organized into three parts. Firstly, we conducted a proteomic analysis of female saliva in two developmental stages of adult tick feeding, including partially engorged and fully engorged females. Secondly, we analyzed in depth the variation of salivary protein components, expanding proteomics analysis to nine stages of tick feeding. These data showed that the R. microplus saliva is a complex protein sample, with variations in different feeding times. Among the classes of identified proteins, we can mention proteins related to heme and iron metabolism; proteins related to oxidation and detoxification processes; enzymes such as serine proteases, cysteine proteases, metalloproteases; proteases inhibitors belonging to serpin family, cystatins, TIL, and Kunitz; antimicrobial peptides; and families of tick-specific and conserved proteins. The third part of the study aimed to characterize three serpins that have been identified in saliva (RmS-3, RmS-6 and RmS-17). These proteins were expressed in Pichia pastoris and were used for functional characterization against a panel of 16 host proteases related to defense systems. Results revealed an inhibition profile for pro-inflammatory and pro-clotting proteases. The data presented here contributes to understanding the role of salivary proteins into tick-host relationship.

Carrapatos são artrópodos hematófagos distribuídos por todo o mundo e vetores de diversas doenças. Como todos os hematófagos, os carrapatos possuem um arsenal de moléculas que inibe a resposta hemostática do hospedeiro, o que viabiliza o repasto sanguíneo bemsucedido. O carrapato bovino Rhipicephalus (Boophilus) microplus é um carrapato de um só hospedeiro e considerado o mais importante parasito de animais domésticos da América Latina. O R. microplus causa sérios danos aos bovinos, direta, e principalmente, devido à espoliação de sangue que leva à anemia e diminuição da produção de leite e do ganho de peso; e, indiretamente, via a transmissão de patógenos, como Babesia spp. e Anaplasma spp. O R. microplus é também um modelo interessante para o estudo das relações parasitohospedeiro, visto que ele permanece fixado ao mesmo hospedeiro durante toda a sua vida parasitária, o que leva em torno de três semanas. Os objetivos deste trabalho são explorar os mecanismos farmacológicos da saliva do carrapato R. microplus capazes de modular o sistema hemostático, bem como o papel que esta modulação desempenha na relação parasito-hospedeiro. Nesse sentido, este estudo foi organizado em duas partes. Primeiramente, foi realizada uma investigação sobre os parâmetros hemostáticos em bovinos infestados por carrapatos. Em um segundo momento, foram estudados os mecanismos da saliva do carrapato envolvidos na inibição da hemostasia, assim como a habilidade do soro de bovinos repetidamente infestados (que apresentam resistência imunológica naturalmente adquirida contra o carrapato bovino) em interferir na ação antihemostática da saliva do carrapato. Na primeira parte do estudo, foi demonstrado que bovinos experimentalmente infestados com 20.000 larvas de R. microplus apresentam uma diminuição na capacidade de agregação plaquetária (em resposta a colágeno e ADP), bem como na coagulação sanguínea (evidenciada por um aumento nos tempos de tromboplastina parcialmente ativado e de protrombina), enquanto a contagem de plaquetas e os níveis de fibrinogênio aumentaram significativamente ao longo da infestação. Na segunda parte, foi demonstrado que a saliva de R. microplus: (i) apresenta atividade inibitória in vitro sobre a agregação plaquetária induzida por colágeno; (ii) inibe a indução de ativação endotelial; e (iii) reduz a trombogênese in vivo. Ademais, o soro de bovinos repetidamente infestados (RIBS) foi capaz de bloquear parcialmente a atividade anticoagulante e antitrombótica da saliva e totalmente a modulação da ativação endotelial, ao passo que o RIBS não apresentou nenhum efeito sobre a inibição da agregação plaquetária. O conjunto dos dados apresentados permite um melhor entendimento dos fenômenos que ocorrem no hospedeiro durante o parasitismo, e também fornece mais subsídios para uma maior compreensão do processo de hematofagia e dos mecanismos fisiopatológicos que regem a relação parasitohospedeiro. / Ticks are blood-feeding arthropods widely distributed in the world and vectors of several diseases. Like all hematophagous animals, ticks resort to a variety of molecules in order to avoid the host hemostatic response, which in turn allow a successful blood-meal. The cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus is an one-host tick, and is considered the most harmful parasite of domesticated animals in Latin America. R. microplus causes expressive injuries to bovines, directly, mainly due to blood spoliation, leading to anemia, and diminution of milk production and weight gain. Indirectly the tick is responsible for the transmission of pathogens such as Babesia spp. and Anaplasma spp. R. microplus is also a consistent model to study the parasite-host relationship, since it remains attached to the same host throughout the whole parasitic stage, which lasts around three weeks. This work aims at exploring the pharmacological mechanisms of R. microplus tick saliva able to modulate hemostasis, and the role of this modulation in tick-host relationship. In this sense, this study was organized in two parts: firstly, an investigation about the hemostatic parameters in tick infested bovines was performed. Secondly, the tick salivary mechanisms involved in the inhibition of hemostasis were studied, and the ability of serum from repeatedly infested bovines (which displays natural acquired immunological resistance to the cattle tick) to interfere in anti-hemostatic activity of tick saliva was also investigated. In the first part of this study it was shown that calves experimentally infested with 20,000 R. microplus larvae display a decrease in platelet aggregation (in response to collagen and ADP) as well as in coagulation ability (evinced by an increase in activated partial thromboplastin time and prothrombin time), whereas platelet blood count and fibrinogen level significantly increased during the course of infestation. In the second part of this work, it was demonstrated that R. microplus saliva: (i) displays in vitro inhibitory activity upon collagen-induced platelet aggregation; (ii) inhibits the induction of endothelial activation; and (iii) reduces thrombogenesis in vivo. Moreover, repeated infested bovine sera (RIBS) were shown to be able to partially block the delay of coagulation and the antithrombotic effect of saliva, and to totally abolish the modulation of endothelium activation, in spite of the fact that RIBS has no effect on the inhibition of platelet aggregation. The set of data presented in this work allows a better understanding of the phenomena occurring in the host during parasitism, and also gives more insights to improve the understanding of the hematophagy process and the pathophysiological mechanisms behind host-tick interaction.

Carrapatos são animais hematófagos transmissores de diversas doenças para animais e seres humanos. O Rhipicephalus (Boophilus) microplus é um ectoparasito específico de bovinos. É responsável por importantes perdas econômicas na pecuária de países produtores de carne e leite. O aumento de populações de carrapatos resistentes aos principais acaricidas usados e a possível contaminação ambiental e dos produtos derivados como carne e leite impõem estudos para desenvolver novos métodos de controle. O controle imunológico é uma estratégia comprovadamente viável, porém ainda falta encontrar antígenos suficientemente eficientes. Uma das estratégias para atingir esse fim é o estudo de proteínas participantes de processos fisiológicos de grande importância para o carrapato, como é a aquisição e digestão de sangue. Proteínas pertencentes à superfamília das serpinas (serine protease inhibitors) participam do controle de diversos processos fisiológicos em mamíferos, inclusive coagulação sanguínea, fibrinólise e ativação do sistema complemento. Uma vez que carrapatos possuem informação para a síntese de serpinas, supõe-se que algumas têm como função perturbar a homeostase de seus hospedeiros. Analisando banco de sequências de cDNA identificamos 16 sequências que codificam serpinas no carrapato bovino, que foram nomeadas RmS (R. microplus serpin). Análises por RT-PCR mostraram que na maioria dos tecidos e estágios de desenvolvimento do parasito há expressão das RmS. Todas as sequências identificadas mostram conservação com serpinas de outras espécies de carrapatos. Aproximadamente 41% das RmS (7 de 16) provavelmente são secretadas, pois possuem predição para peptídeo-sinal. Assim como em outras serpinas, todas RmS possuem entre 1 e 4 sítios para N-glicosilação. Modelos tridimensionais revelam conservação de estrutura terciária das RmS analisadas com outras serpinas de mamíferos. Devido à presença de peptídeo-sinal, conservação com serpinas de outros carrapatos e presença em saliva, que foi revelada pelo estudo proteômico preliminar da saliva do parasito, RmS-3 foi escolhida para estudos mais pormenorizados. Para isso, a sequência codificadora foi clonada e ela foi obtida em forma recombinante. Anticorpos policlonais produzidos contra a proteína recombinante revelaram a presença da proteína em todos os tecidos analisados, e também na saliva, o que sugere participar na modulação das respostas do hospedeiro. / Ticks are hematophagous animals vectors of several human and animal diseases. Rhipicephalus (Boophilus) microplus is a bovine-specific ectoparasite. It is causes significant economic losses in livestock-producing countries. Increasing tick acaricide-resistant populations and, possible contamination on the environmental and on bovine-derived products contamination such as meat and milk impel the study of new control methods. Immunological control is a strategy proved to be feasible, but it requires really efficient antigens. A strategy to achieve this purpose is the study of proteins acting in physiological processes of major importance for the tick, as blood intake and digestion. Proteins belonging to the superfamily of serpins (serine protease inhibitors) have a role in several mammalian physiological processes, including blood coagulation, fibrinolysis and complement activation. As ticks encode information for serpins synthesis it is assumed they disrupt homeostasis their hosts. Through analysis of the cDNA sequences database, we identified 16 sequences coding for serpins in cattle tick, which were named RmS (R. microplus serpin). RT-PCR analyses showed RmSs are expressed in most tick tissues and developmental stages. All identified sequences are conserved concerning other tick species serpins. Around 41% of RmS (7 out 16) are probably secreted, since they have sequences predicting for signal peptide. Similarly as other serpin, all RmSs have 1 to 4 N-glycosylation sites. Protein modeling showed all RmSs have a conserved tertiary structure with other mammal serpins. RmS-3 was chosen for further studies due to presence of signal peptide, conservation with serpin inform other ticks and the presence in saliva revealed by an initial a proteomic study of tick saliva. In these studies, its gene was cloned RmS-3 was obtained as a recombinant protein. Polyclonal antibodies were against the recombinant protein showed RmS-3 presence in all analyzed tissues and also in saliva, suggesting it have a role disturbing host responses.