Infestações com Rhipicephalus microplus, o carrapato dos bovinos, causam enormes prejuízos econômicos para a pecuária. Os carrapatos estão desenvolvendo resistência aos carrapaticidas que, além dessa desvantagem, deixam resíduos em carne e leite. Vacinas anticarrapato representam uma alternativa sustentável de controle de infestações, mas as atualmente disponíveis têm efeitos parciais e transitórios. Surge, assim, a necessidade de identificar novos antígenos vacinais. Para alcançar esse objetivo este trabalho explora o fato de que bovinos apresentam fenótipos contrastantes e herdáveis de infestações que são específicos de certas raças. Além disso, o nível de imunidade do hospedeiro afeta a transcrição de genes de glândulas salivares do carrapato, órgão que produz proteínas que medeiam o parasitismo. A hipótese de trabalho é a que os diferentes níveis da imunidade anticarrapato do hospedeiro afetam, também, a composição salivar do parasita. Assim, em carrapatos alimentando-se em hospedeiros resistentes as proteínas que são cruciais ao parasitismo poderão estar ausentes ou deficientes na sua saliva e por isso os carrapatos não terminam sua refeição de sangue. A neutralização dessas mesmas proteínas pela imunidade humoral pode ter o mesmo efeito e por isso, essas proteínas constituem bons antígenos vacinais. Assim, o objetivo do trabalho foi identificar novos antígenos vacinais em saliva de fêmeas e glândulas salivares de ninfas, machos e fêmeas de carrapatos alimentados em hospedeiros resistentes e suscetíveis, bem como em larvas não alimentadas oriundas de ovos de fêmeas alimentadas nestes mesmos hospedeiros. Para isso, foram empregadas abordagens de sequenciamento de nova geração \"RNA-Seq\" (454) e abordagens proteômicas, como análise diferencial em gel (DIGE) e Western Blots (imunoproteoma) seguido de sequenciamento de massa, além da tecnologia de identificação de proteínas multidimensionais (ou Multidimensional Protein Identification Technology, MudPIT) para descrever o proteoma das glândulas salivares e da saliva de fêmeas. A análise transcriptômica resultou no sequencimanto de 1.999.086 reads que permitiu identificar e classificar 11.676 sequências codificadoras (CDS), muitas das quais (3.600 CDS) contêm peptídeo sinal que é indicativo de secreção, portanto podendo estar presente na saliva e Resumo Gustavo Rocha Garcia apresentar função importante na hematofagia. Por meio de MudPIT, identificamos 321 proteínas salivares diferentes, além de 126 proteínas no DIGE e 266 proteínas nos imunoproteomas. Muitas dessas proteínas podem ser consideradas antígenos potenciais por estarem associadas com a hematofagia/parasitismo, tais como proteases, nucleases, inibidores de proteases, peptídeos antimicrobianos, proteínas de fixação, entre outros, inclusive proteínas ainda não caracterizadas. A maioria dos genes codificantes dessas proteínas está mais expressa em carrapatos alimentados em hospedeiros suscetíveis, principalmente em carrapatos machos. Além disso, muitas dessas proteínas não são reconhecidas por soros bovinos, inclusive soros de bovinos infestados, embora soros de bovinos infestados e resistentes ao carrapato apresente a maioria das reatividades. O conjunto dos resultados sugere que em nível de proteína a composição da saliva também é afetada pelos diferentes níveis de imunidade dos hospedeiros, além de variar com o ciclo de vida do carrapato. Desse modo, concluímos que as estratégias de investigação empregadas foram satisfatórias para identificar um conjunto de antígenos salivares do carrapato R. microplus que representam proteínas alvos para compor vacinas multicomponentes anticarrapato. / Infestation with Rhipicephalus microplus, the cattle tick, causes huge economic losses to livestock. Ticks are developing resistance to acaricides that, besides this disadvantage, leave residues in meat and milk. The anti tick vaccines represent a sustainable alternative of the infestations control, but the currently available has partial and transient effects. Thus arises the need to identify new vaccine antigens. To achieve this goal, this work explores the fact that cattle exhibit contrasting phenotypes and inheritable of infestations that are specific to certain breeds. Furthermore, the level of immunity of the host affects gene transcription tick salivary gland, organ that produces proteins that mediate the parasitism. The working hypothesis is that different levels of anti tick immunity of host affect also the salivary composition of the parasite. So in ticks feeding on resistant hosts the proteins that are crucial to parasitism may be absent or deficient in their saliva, and by this the ticks do not finish your meal blood. The neutralization of these same proteins by humoral immunity can have the same effect and by this, these proteins are good vaccine antigens. So, the aim of the study was to identify new vaccine antigens in saliva from females and salivary glands of nymphs, males and females of ticks fed on resistant and susceptible hosts as well as in unfed larvae originating from eggs of females fed on these same hosts. To this, were employed sequencing approaches of new generation \"RNA-Seq\" (454) and proteomic approaches, such as differential analysis in gel (DIGE) and Western Blots (immunoproteomics) followed by sequencing mass, besides the Multidimensional Protein Identification Technology (MudPIT) to describe the proteome of the salivary glands and saliva of females. The transcriptomics analysis identified 11,676 coding sequences (CDS), many of which (3,600 CDS) contain predicted signal peptide indicative of secretion, therefore may be present in saliva and provide an important function in blood feeding. Through MudPIT, we identify 321 different salivary proteins, besides 126 proteins in DIGE and 266 proteins in immunoproteomics. Many of these proteins may be considered as potential antigens to be associated with the blood meal/ parasitism, such as proteases, nucleases, protease inhibitors, antimicrobial peptides, proteins of attachment, among Abstract Gustavo Rocha Garcia others, including proteins not yet characterized. Most of the genes encoding of these proteins are more expressed in ticks fed on susceptible hosts, especially in male ticks. Moreover, many of these proteins are not recognized by bovine sera, including sera from infested hosts, although sera from infested and resistant host to tick present the most reactivities. The overall results suggest that in protein level, the composition of saliva is also affected by the different levels of immunity of the host, besides vary with the tick life cycle. Thus, we conclude that the research strategies employed were satisfactory to identify a set of tick salivary antigens from R. microplus that represent target proteins for composing anti tick multicomponent vaccines.

O carrapato Rhipicephalus microplus é o vetor da bactéria Anaplasma marginale, agente etiológico da anaplasmose bovina. Este trabalho teve como objetivo a caracterização molecular e funcional das vias de sinalização Toll, Imd, Jnk e Jak/Stat do R. microplus. Através de análises in silico, a maioria dos genes que compõe as vias de sinalização de R. microplus foi identificada. Além disso, verificou-se uma modulação negativa da expressão dos genes dessas vias, nas células BME26, pela infecção por A. marginale. Após o silenciamento dos genes codificadores dos fatores de transcrição das vias de sinalização, através da técnica de RNAi, em carrapatos R. microplus, observou-se que o fator de transcrição Relish (Imd) está envolvido no controle da A. marginale, possivelmente através do peptídeo antimicrobiano microplusina. Com este trabalho, ampliamos o conhecimento sobre o sistema imune de carrapatos para compreender melhor a interface vetor-patógeno. / The cattle tick Rhipicephalus microplus is the vector of the bacteria Anaplasma marginale, the etiological agent of bovine anaplasmosis. This study aimed to evaluate the molecular and functional role of the signaling pathways Toll, Imd, Jnk, and Jak/Stat in R. microplus. An in silico analysis allowed the identification of several genes of these signaling pathways. In addition, there was a negative modulation of expression of genes of these pathways in the tick cell line BME26 upon infection with A. marginale. The silencing of some transcription factor genes via RNA interference in ticks indicated that the transcription factor Relish (from the Imd pathway) was involved in the control of bacterial infection, possibly via regulation of the expression of the antimicrobial peptide microplusin. This study helped elucidate the role of the immune system of ticks in the vector-pathogen interface.

Os carrapatos são artrópodes hematófagos, vetores de doenças. Vacinas são uma alternativa para o seu controle, já que esses parasitas durante a infestação, estimulam as respostas imunes do hospedeiro, as quais são implicadas em sua rejeição. As glândulas salivares do parasita são importantes para permitir a alimentação e para mediar os mecanismos de escape às defesas do hospedeiro. Diversas evidências indicam que ocorre reatividade cruzada entre espécies de carrapatos e que reações de hipersensibilidade cutânea tardia (DTH) são correlacionadas com resistência ao carrapato. A possibilidade de vacinar cachorros que são parasitados pelo R. sanguineus com antígenos do carrapato do boi, o R microplus, foi investigada por meio da análise in silico de 45 GIs de R microplus clonados em vetor plasmidial (TOPO VR2001), dentre os quais 14 Gls de R microplus se revelaram mais similares a sequências do R sanguineus, e foram empregados para avaliar: 1) A capacidade em elicitar reações cutâneas tardias em cobaias imunes a carrapatos por meio de infestações prévias com R sanguineus. 2) A capacidade de vacinas contendo GIs individuais em afetar infestações de camundongos com adultos de R sanguineus. 3) a capacidade do GI induzir anticorpos específicos após vacinação em camundongos. Dos 14 GIs testados, apenas dois não induziram reações cutâneas, quatro não afetaram nenhum parâmetro parasitológico da infestação, e três não induziram a produção de anticorpos nesses animais. Dentre os GIs, sete foram escolhidos para compor uma vacina multigênica contra o carrapato do cão R sanguineus. A vacina foi capaz de induzir resistência á infestação por R sanguineus em camundongos e em cachorros vacinados evidenciadoa pela diminuição do número de fêmeas que conseguiram colocar ovos, do peso médio da massa de ovos produzidos por essas fêmeas, do índice reprodutivo dessas fêmeas, e da taxa de eclosão das larvas, demonstrando que GIs de R microplus podem ser alvos para formulação de uma vacina contra o carrapato R sanguineus. / Ticks are arthropod vectors of disease. Vaccines are an alternative to chemicals for controlling ticks because during infestations these parasites stimulate host immune responses such as delayed hypersensitivity skin reactions (DTH), which are involved in their rejection and are correlated with resistance to ticks. Tick salivary glands are important for the parasite to acquire blood meals because their products mediate escape mechanisms from host defenses. The possibility of vaccinating dogs against infestations with the brown dog tick, Rhipicephalus sanguineus, with antigens derived from salivary glands of the cattle tick, R. microplus, was investigated by in silica analysis of 45 genes from R. microplus. These genes were targeted because of their putative biological function and had been cloned into the plasmid vector TOPO VR2001. Of them, 14 were chosen to be evaluated in a vaccine because their sequences were the most similar to several genes expressed in salivary glands of R. sanguineus. The plasmids containing the genes of interest (GIs) were used to assess: 1) The ability of the product of the genes to elicit delayed skin reactions in guinea pigs immune to ticks by previous infestations with R sanguineus. 2) The ability of individual GIs delivered as DNA vaccines to affect infestations of mice with adult R sanguineus. 3) The ability of the genes to induce specific antibodies after vaccination in mice. Only two of the 14 genes delivered to guinea pigs via intradermal injection of DNA did not elicit delayed skin reaction, four used in a vaccine did not affect any parameter of tick infestations, and three did not induce production of antibodies in these animals after DNA vaccination. Of the 14 genes, seven were chosen to formulate a multigene vaccine against the dog tick R. sanguineus. The vaccine was able to significantly affect several parameters of infestations by R sanguineus in vaccinated dogs and mice. This was reflected in the reduction of the number of females that were able to lay eggs, of the average weight of the egg mass produced by these females, of the reproductive rate of these females, and of hatching rate of larvae, demonstrating that GIs from R microplus may be targets for development of a vaccine against the tick R sanguineus.

Submitted by Rosivalda Pereira (mrs.pereira@ufma.br) on 2017-06-14T16:54:49Z No. of bitstreams: 1 AlbertoLopes.pdf: 7651509 bytes, checksum: 542872f26d9cc8bf6b0b65d8a7151d16 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-14T16:54:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AlbertoLopes.pdf: 7651509 bytes, checksum: 542872f26d9cc8bf6b0b65d8a7151d16 (MD5) Previous issue date: 2015-07-07 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPQ) / Fundação de Amparo à Pesquisa e ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico do Maranhão (FAPEMA) / The tick Rhipicephalus microplus is the major cattle ectoparasite of the world accounting for losses of billions of dollars that directly affect the return of such livestock. Its control is difficult due to the resistance of ticks to all chemical bases commercially available miticides. Acaricidal activity of terpenes has been evaluated in several studies that show satisfactory results, indicating these compounds are potential sources of new acaricidal products. The aim of this work was to select terpenes with potential activity against enzyme acetylcholinesterase (AChE) from R. microplus. Properties of the molecular volume, geometric parameters and vibrational terpenes were obtained from quantum chemical calculations the density functional theory level. Bioinformatic methodologies were applied to study the interaction of terpenes identified in essential oils of Citrus spp. and Lippia spp. with three AChE R. microplus. Since there are no available experimental structures, models of the three AChE were generated by homology modeling and then refined by molecular dynamics simulations. Soon after, were studies of molecular docking to detect best energy conformation of interaction and molecular dynamics simulations of this complex were carried out to study the behavior of this interaction. Our results suggest that the known acaricide activity of carvacrol is associated with its interaction with AChEs, while the acaricide activity of thymol is not associated with inhibition of that enzyme. Also, as expected, showed an excellent interaction coumafos acaricide and reports the first record of interaction of AChE from R. microplus with gammamuuruleno and elemol terpenes, molecules with few studies and that now configure themselves as candidates potential new acaricidal products. / O carrapato Rhipicephalus microplus é o principal ectoparasita da bovinocultura mundial sendo responsável por perdas de bilhões de dólares que afetam diretamente o retorno de tal produção animal. Seu controle é difícil devido à resistência dos carrapatos a todas as bases químicas de acaricidas comercialmente disponíveis. A atividade acaricida de terpenos tem sido avaliada em vários estudos que mostram resultados satisfatórios, indicando que estes compostos são fontes potenciais de novos produtos acaricidas. O objetivo desse trabalho foi selecionar terpenos com potencial atividade sobre a enzima acetilcolinesterase (AChE) de R. microplus. As propriedades do volume molecular, os parâmetros geométricos e vibracionais de terpenos foram obtidos a partir de cálculos de química quântica no nível da teoria do funcional de densidade. Metodologias de bioinformática foram aplicadas para estudar a interação de terpenos identificados em óleos essenciais de Citrus spp. e Lippia spp. com as três AChE de R. microplus. Como não existem estruturas experimentais disponíveis, modelos das três AChE foram gerados por modelagem por homologia e em seguida refinadas por simulações de dinâmica molecular. Logo após, foram realizados estudos de docagem molecular para detectar a melhor conformação energética de interação e simulações de dinâmica molecular desse complexo foram realizadas para estudarmos o comportamento dessa interação. Os resultados sugerem que a conhecida atividade carrapaticida do carvacrol está associada com a sua interação com a AChE, enquanto que a atividade carrapaticida do timol não está associado com a inibição dessa mesma enzima. Além disso, como esperado, mostrou uma excelente interação do carrapaticida cumafós e relata o primeiro registro da interação da AChE de R. microplus com os terpenos gama-muuruleno e elemol, moléculas com poucos estudos e que a partir de agora configuram-se como candidatos potenciais para novos produtos acaricidas.

Made available in DSpace on 2016-04-28T20:15:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Wendell Marcelo de Souza Perinotto.pdf: 801461 bytes, checksum: 1968d4da38ce1a3b31453946416d435c (MD5) Previous issue date: 2010-02-05 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / Recent studies have indicated the possibility of difference in susceptibility between different populations of ticks, while undergoing treatment with entomopathogenic fungi. To assess whether this difference actually occurs, this study intents to verify the in vitro effect of fungi Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana on two distinct populations of Rhipicephalus (B.) microplus collected from different properties. Experiments were conducted on engorged females, eggs and larvae. To evaluate the effect of fungi female reproductive parameters were observed. In eggs, the hatch percentage was evaluated, and in larvae, the mortality rate was analyzed. Five groups were formed (108, 107 con?dia/ml of M. anisopliae; 108, 107 con?dia/ml of B. bassiana and control group) with 10 repetitions each. The specimens were immersed in one ml of the suspension for three minutes and the control group was exposed only to diluent. The results showed that the fungi were efficient, influencing all females s reproductive parameters of both properties. To verify the susceptibility of different populations statistical analysis were carried out comparing the treatments on females of different origins. The following parameters presented significant difference: periods of the pre oviposition, larvae hatch and egg production index. Furthermore, B. bassiana was more effective than M. anisopliae on engorged female. In the bioassay with eggs the hatch percentage ranged between 3.1 and 49.5% in one property and from 3.4 to 42.7% in another, but there was no significant difference between the two populations at this stage of R. (B.) microplus. At the bioassay with larvae the mortality percentage of larvae ranged from 91.8 to 98.7% in one and 71.0 to 94,0% in another property. Moreover, the average lethal time (LT 90) ranged from 19.52 to 27.51 days in one of the properties and 22.89 to 37.31 days in the other. Through these results, it can be concluded the entomopathogenic fungi used in this study are effective in controlling this tick species. However, different populations have variation in their susceptibility to B. bassiana and M.anisopliae. / Estudos recentes indicaram a possibilidade de diferen?a na susceptibilidade entre popula??es distintas de carrapatos, quando submetidos ao tratamento com fungos entomopatog?nicos. Para avaliar se ocorre realmente essa diferen?a, foi avaliada a a??o in vitro dos fungos M. anisopliae e B. bassiana sobre duas popula??es distintas de R. (B.) microplus, oriundas de diferentes propriedades. Foram realizados bioensaios sobre f?meas ingurgitadas, ovos e larvas. Para avaliar o efeito dos fungos sobre as f?meas observaram-se os par?metros reprodutivos. Para ovos analisou-se o percentual de eclos?o das larvas e sobre larvas analisaram-se o percentual de mortalidade e tempo m?dio letal. Foram formados cinco grupos por propriedade (108, 107 con?dios/ml de M. anisopliae; 108, 107 con?dios/ml de B. bassiana e controle) com 10 repeti??es cada. No tratamento, as esp?cimes foram imersas em um ml da suspens?o testada durante tr?s minutos e o grupo controle foi exposto apenas ao diluente. Os resultados obtidos demonstraram que os fungos influenciaram na maioria dos par?metros reprodutivos das f?meas de ambas as propriedades. Para verificar a susceptibilidade das popula??es distintas, foram realizadas an?lises estat?sticas comparando os tratamentos sobre as f?meas de diferentes origens. Pode-se observar que houve diferen?a significativa nos seguintes par?metros: per?odos de pr?-postura, per?odo de eclos?o das larvas e ?ndice de produ??o de ovos. Al?m disso, pode-se observar que o isolado Bb 986 de B. bassiana foi mais patog?nico do que o isolado Ma 959 de M. anisopliae sobre f?meas ingurgitadas, promovendo um percentual de controle de 49%. No bioensaio com ovos, a redu??o do percentual de eclos?o das larvas variou entre 3,1 a 49,5% em uma propriedade e 3,4 a 42,7% em outra, por?m n?o houve diferen?a significativa entre as duas popula??es nesta fase do R. (B.) microplus. No bioensaio com larvas o percentual de mortalidade das larvas variou de 91,8 a 98,7% em uma e 71,0 a 94,0% em outra propriedade. Al?m disso, o tempo m?dio letal (LT 90) foi de 19,52 a 27,51 dias em uma das propriedades e de 22, 89 a 37,31 dias na outra. Atrav?s destes resultados, pode-se concluir que os fungos entomopatog?nicos utilizados neste estudo s?o capazes de agir sobre esta esp?cie de carrapato. No entanto, popula??es distintas apresentam varia??o na sua susceptibilidade ? B. bassiana e M. anisopliae.

O carrapato bovino Rhipicephalus (Boophilus) microplus é o principal vetor da riquétsia Anaplasma marginale, o agente etiológico da anaplasmose, uma doença que acomete os rebanhos e causa sérios prejuízos econômicos à pecuária no Brasil. Estabelecemos em nosso laboratório o cultivo da linhagem de células BME26 que são originárias do R. (B.) microplus e também a infecção dessas células por A. marginale, um patógeno que é naturalmente transmitido pelo carrapato. Detectamos que a expressão gênica da defensina e da ixodidina nas células é aumentada frente à infecção por A. marginale, embora nenhuma alteração da expressão gênica da microplusina foi constatada. As células foram expostas a microorganismos inativados por calor e LPS, sendo que a expressão gênica da microplusina é aumentada frente a todos os estímulos. Na exposição das células BME26 com a bactéria Microccocus luteus, a expressão gênica da defensina e da ixodidina não foi alterada e no estimulo com leveduras a expressão gênica da ixodidina foi reprimida. Frente à infecção por A. marginale detectamos, aumento expressão da defensina e ixodidina. Os genes da microplusina e defensina foram silenciadas por RNAi em células infectadas por A. marginale, mas não houve alteração no número de riquétsias / The cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus is the main vector of the rickettsia Anaplasma marginale, the etiological agent of anaplasmosis, a disease that affects cattle and causes serious economic losses to the Brazilian cattle industry. We established in our laboratory the embryonic cell culture line BME26 from R. (B.) microplus and infection by A. marginale, a pathogen naturally transmitted by R. (B.) microplus. We verified that defensin and ixodidin gene expression increased in these cells after an infection by A. marginale and no alteration in microplusin gene expression was detected. The BME26 cells were exposed to heat-inactivated microorganims or to LPS, microplusin gene expression increased after all stimuli. After exposure of BME26 cells to Micrococcus luteus, expression levels of defensin and ixodidin did not change and ixodidin gene expression reduced after exposure of these cells to yeast. In the infection by A. marginale we detected defensin and ixodidin gene expression. Also, microplusin and defensin genes were silenced by RNA interference (RNAi) in A. marginale-infected BME26 cells, but we did not observe alteration in the number of MSP4 rickettsias

A oviposição é um estágio vulnerável do ciclo de vida de carrapatos. Rhipicephalus microplus, como todos Ixodidae e Argasidae, possui uma glândula especializada, o órgão de Gené, que produz uma cera que é depositada na superfície do ovo durante a oviposição. Além de restringir a perda excessiva de água, a cera atua como uma barreira contra o ataque de organismos invasores. Em R.microplus, como em outros carrapatos, há poucos estudos demonstrando atividade antimicrobiana em ovos. Ainda mais, não há na literatura relato de atividade antibiofilme em ovos de carrapatos e nem mesmo em qualquer outro artrópode. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a hipótese da existência de mecanismos de defesa em ovos de R. microplus contra biofilmes bacterianos. O extrato água/metanol da cera dos ovos apresentou atividade contra o biofilme de Pseudomonas aeruginosa sem afetar a sua viabilidade. Esse extrato também demonstrou efeito antibiótico contra Staphylococcus epidermidis. Nós identificamos a molécula com ambas atividades (antibiofilme e antibiótica) como N-(3-sulfooxy-25-cholest-5-en-26-oyl)-L-isoleucina (boophiline). Na busca por possíveis mecanismos responsáveis pelo efeito antibiofilme de boophiline contra P. aeruginosa, 14 genes foram analisados por qRT-PCR. Boophiline inibe a expressão de fliC (flagelo) e cdrA (componente estrutural da matriz), cujos produtos são necessários para a formação do biofilme de P. aeruginosa. Monosfosfato de guanosina dimérico cíclico (c-di-GMP) é um importante segundo mensageiro característico de bactérias Gram-negativas. Altos níveis intracelulares de c-di-GMP promovem o estilo de vida séssil enquanto baixos níveis induzem o comportamento móvel. De acordo com essa afirmação, nós encontramos que boophiline aumenta a motilidade swarming de P. aeruginosa. Desta forma, nos questionamos se o mecanismo de ação de boophiline estaria envolvido com c-di-GMP já que o sistema quorum sensing não foi afetado pela molécula. Interessantemente, quando os níveis de c-di-GMP foram aumentados pela superexpressão de uma diguanilato ciclase, boophiline não inibiu efetivamente a formação de biofilme. Uma explicação para esse resultado é que boophiline interfere em uma via específica regulada por c-di-GMP, o que explicaria não termos obtido um decréscimo no nível total deste segundo mensageiro. Contrariamente, boophiline foi bactericida contra S. epidermidis. Mudanças morfológicas significativas foram observadas em células tratadas com a molécula, as quais foram severamente danificadas. Boophiline levou a formação anormal de septo, rompimento da membrana bacteriana e extravasamento do material intracelular. Adicionalmente avaliamos o potencial antibiofilme e anti-protozoário de filtrados de cultura obtidos de bactérias isoladas de tecidos de R. microplus. Quatorze filtrados de cultura bacteriano apresentaram notável atividade contra o biofilme de P. aeruginosa e S. epidermidis e foram citotóxicos contra Tritrichomonas foetus. Nosso trabalho é pioneiro em demonstrar a existência de proteção contra biofilmes em ovos de carrapatos bem como de bactérias associadas a carrapatos como produtoras de moléculas bioativas. Além disso, nós demonstramos que boophiline é uma nova molécula antibiofilme, sendo a primeira vez relatado na literatura que um composto age inibindo cdrA. Os dados obtidos em nosso estudo poderiam estimular novas abordagens em áreas como fisiologia e controle de artrópodes, genética e fisiologia de microrganismos e controle de biofilmes. / The oviposition is a vulnerable stage of the tick life cycle. Rhipicephalus microplus, as all Ixodidae and Argasidae, has a specialized gland, the Gene’s organ, which produce a wax that is smeared on egg surface during oviposition. In addition to restricting excessive water loss, wax acts as a barrier to attack by invading organisms. In R. microplus, as in other ticks, there are few studies showing antimicrobial activity in eggs. Moreover, there is no report of antibiofilm activity in tick eggs nor in any other arthropod. The objective of our study was to evaluate the hypothesis of the existence of defense mechanisms against bacterial biofilms in R. microplus eggs. The eggs wax water/methanol extract showed activity against Pseudomonas aeruginosa biofilm without affecting its viability. This extract also presented an antibiotic effect against Staphylococcus epidermidis. We have identified the molecule anti-biofilm and antibiotic as N-(3-sulfooxy-25-cholest-5-en-26-oyl)-L-isoleucine (boophiline). In the search for possible mechanisms responsible by antibiofilm effect of boophiline against P. aeruginosa, 14 genes were evaluated by qRT-PCR. We showed that boophiline inhibits the expression of fliC (flagellum) and cdrA (matrix structural component), whose products are necessary for biofilm formation in P. aeruginosa. Bis-(3’–5’)-cyclic dimeric guanosine monophosphate (c-di-GMP) is an important second messenger, characteristic of Gram-negative bacteria. High intracellular levels of c-di-GMP promote a sessile mode of growth, while low levels promote motile behavior. In line with this, we found that boophiline increases swarming motility, which raised the question whether it acts by altering c-di-GMP levels. Interestingly, when c-di-GMP levels were increased by overexpression of a diguanilate cyclase, boophiline no longer inhibited biofilm formation. One explanation for these results is that boophiline interferes with a specific c-di-GMP-regulated pathway, which would explain we have not obtained a decrease in the total level of this second messenger. Conversely, boophiline had a bactericidal effect against S. epidermidis. Significant morphological changes were observed in the boophiline-treated cells, which appeared to be severely damaged. Boophiline was found to cause abnormal septum formation, bacterial membrane disruption, and extravasation of intracellular material. Additionally, our work also aimed to evaluate the potential antibiofilm and anti-protozoa of culture filtrates obtained from bacteria isolated of R. microplus tissues. Fourteen bacterial culture filtrates showed remarkable activity against of P. aeruginosa and S. epidermidis biofilms, and were cytotoxic against Tritrichomonas foetus. Our work is pioneer in demonstrating the existence of protection mechanisms in tick eggs against biofilms, and ticks-associated bacteria as producers of bioactive molecules. Furthermore, we demonstrated that boophiline is a new antibiofilm molecule, and is the first reported in the literature that a molecule inhibits cdrA. The data obtained in our study could stimulate new approaches in areas such as the physiology and control of arthropods, the genetics and physiology of microorganisms, and biofilm control.

This research was aimed to evaluate in vivo effects of citronella oil on cattle ectoparasites. Two experiments with different levels of citronella oil (I) and the relationships with phytotherapic and the synthetic acaricide (II) were evaluated. In experiment I, twenty Holstein cows were allocated in four groups of five animals. The treatments were: negative control, amitraz at 0.025% and citronella oil at 3 and 4%. Engorged ticks and flies (horn fly, stably fly and domestic fly) were evaluated on animals before (mean of days -3, -2, -1) and at 3; 7 and 14 days after treatment. The efficacy of control ticks was 89.2; 36.5 and 35.8% for amitraz and citronella oil at 3 end 4% respectively, on 14th day post-treatment. Lower control of flies was observed for phytotherapic treatments. In experiment II, fifteen Holstein cows were allocated in three groups of five animals. The treatments were: negative control, amitraz at 0.025% and citronella oil at 4%. Engorged ticks and flies were evaluated on animals before (mean of days -3, -2, -1) and at 7; 14; 21 and 28 days after treatment. In 28 days there was need to reapply the amitraz to control engorged ticks. The relationship among the number of application was the 1:2.5 for amitraz and citronella oil, respectively. The efficacy in control ticks were 71.8 and 30.9% for amitraz and citronella oil at 4% respectively. Lower control of flies was observed for phytotherapic treatment. / O objetivo desta pesquisa foi avaliar in vivo diferentes níveis de óleo de citronela em ectoparasitas de bovinos. Foram conduzidos dois experimentos com diferentes níveis de óleo de citronela (I) e a relação de banho entre o produto fitoterápico e um acaricida sintético (II). No experimento I, foram utilizadas 20 vacas da raça Holandês, distribuídas em quatro grupos de cinco animais cada um. Os tratamentos foram constituídos pelo controle negativo, amitraz a 0,025%, óleo de citronela a 3 e 4%. Para avaliação foram contadas fêmeas ingurgitadas de carrapato e moscas (mosca-dos-chifres, mosca-dos-estábulos e mosca doméstica) antes (média dos dias -3, -2, -1) e após a aplicação dos produtos nos dias 3; 7 e 14. A eficácia no controle do carrapato foi de 89,2; 36,5 e 35,8% para o amitraz e óleo de citronela a 3 e 4%, respectivamente. Verificou-se baixo controle de moscas nos tratamentos constituídos pelo fitoterápico. No experimento II, foram utilizadas 15 vacas da raça Holandês, distribuídas em três grupos de cinco animais cada um. Os tratamentos foram constituídos pelo controle negativo, amitraz a 0,025% e óleo de citronela a 4%. Para avaliação foram contadas fêmeas ingurgitadas de carrapato e moscas antes (média dos dias -3, -2, -1) e após a aplicação dos produtos nos dias 7; 14; 21 e 28. Aos 28 dias, houve necessidade de se reaplicar o amitraz para controlar a infestação com carrapato. A relação entre o número de aplicações foi de 1:2,5 para amitraz e citronela, respectivamente. A eficácia no controle do carrapato foi de 71,8 e 30,9% para o amitraz e óleo de citronela a 4%, respectivamente na média pós-tratamento. Verificou-se baixo controle de moscas no tratamento constituído pelo fitoterápico.

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA12MA085.pdf: 1033063 bytes, checksum: 0a30ec4e0c41956b0ca10ba8c2ae2ddb (MD5) Previous issue date: 2012-03-06 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Ticks can transmit diseases causing pathogens such as the spotted fever and Lyme disease to humans and Ehrlichiosis, Babesiosis and Anaplasmosis to animals, among others. Thus the knowledge about the ixodid fauna is very important for establishing public health programs and epidemiological surveillance. In order to identify ticks in the state of Santa Catarina were examined ticks from domestic and wild animals that passed through the screening process of the Veterinary Clinical Hospital of the Center for Science Agroveterinary CAV/UDESC and animals found dead on the highways of six mesoregions of the state the Santa Catarina: Sul, Grande Florianópolis, Vale do Itajaí, Planalto Serrano, Norte and Oeste. It also analyzed the material from the collection of the Laboratory of Parasitology and Parasitic Diseases of the CAV/UDESC. The identifications were made according to the dichotomous keys of Aragão (1936) and Battesti et al. (2006). In the Sul region were identified Amblyomma aureolatum, A. ovale and Rhipicephalus (Boophilus) microplus parasitizing dogs, and a sample of A. longirostre found on a man. In the Grande Florianópolis R. (B.) microplus, Rhipicephalus sanguineus, A. aureolatum and A. ovale parasite of dogs; A. fuscum in ferret (Mustela putorius) and R. (B.) microplus, A. cajennense and Anocentor nitens in horses. Were identified in the Planalto Serrano R. (B.) microplus, R. sanguineus, A. aureolatum, A. ovale, A. tigrinum and A. cajennense parasitizing dogs, A. aureolatum parasitizing cat, graxaim (Cerdocyon thous), graxaim field (Pseudalopex gymnocercus), ocelot (Leopardus pardalis), bush dog (Cerdocyon thous), lion bay (Puma concolor) and puma (Puma concolor), A. dubitatum a capybara (Hydrochoerus hydrochoeris), A. rotundatum in puma (Puma concolor) and snake (Bohtrops) and R. (B.) microplus parasitizing deer (Mazama americana) and horse. In the Norte Region R. sanguineus, A. aureolatum, A. ovale and A. tigrinum parasitizing dogs, A. nitens in horses. In Vale do Itajaí have been identified R. (B.) microplus, R. sanguineus, A. aureolatum, A. ovale and A. cajennense in dogs, and A. cajennense and A. nitens in horses. Amblyomma ovale and A. aureolatum into a frog (Bufo marinus); A. dubitatum a capybara and A. aureolatum in wild cat (Leopardus tigrinus). In the Oeste region were identified R. (B.) microplus, R. sanguineus and A. aureolatum in dogs. The cattle were excluded from the study are known to suffer parasitism by R. (B.) microplus throughout the state. From the data obtained it appears a wide distribution of ixodid throughout the state and in different hosts and the species A. cajennense, A. dubitatum, A. fuscum, A. longirostre e A. rotundatum were identified by the first time ever in Santa Catarina / Os carrapatos são potenciais transmissores de patógenos causadores de doenças como a Febre Maculosa e Doença de Lyme ao homem, e da Erliquiose, Babesiose e Anaplasmose aos animais, entre outros. Sendo assim, o conhecimento a cerca da fauna de ixodídeos é de grande importância para o estabelecimento de programas de saúde pública e vigilância epidemiológica. Com o objetivo de identificar ixodídeos no estado de Santa Catarina foram examinados carrapatos de animais domésticos e silvestres que passaram pelo processo de triagem do Hospital de Clínicas Veterinárias do Centro de Ciências Agroveterinárias CAV/UDESC e de animais encontrados mortos em rodovias das seis mesorregiões do estado de Santa Catarina: Sul, Grande Florianópolis, Vale do Itajaí, Planalto Serrano, Norte e Oeste. Foi analisado ainda o material da coleção do Laboratório de Parasitologia e Doenças Parasitárias do CAV/UDESC. As identificações foram realizadas de acordo com as chaves dicotômicas de Aragão (1936) e Battesti et al. (2006). Na Região Sul foram identificadas Amblyomma aureolatum, A. ovale e Rhipicephalus (Boophilus) microplus parasitando cães, e uma amostra de A. longirostre encontrada sobre um homem. Na Região da Grande Florianópolis R. (B.) microplus, Rhipicephalus sanguineus, A. aureolatum e A. ovale parasitando cães; A. fuscum em furão (Mustela putorius) e R. (B.) microplus, A. cajennense e Anocentor nitens em equinos. No Planalto Serrano foram identificadas R. (B.) microplus, R. sanguineus, A. aureolatum, A. ovale, A. tigrinum e A. cajennense parasitando cães; A. aureolatum parasitando gato, graxaim (Cerdocyon thous), graxaim do campo (Pseudalopex gymnocercus), jaguatirica (Leopardus pardalis), cachorro do mato (Cerdocyon thous), leão baio (Puma concolor) e puma (Puma concolor); A. dubitatum em capivara (Hydrochoerus hydrochoeris); A. rotundatum em puma (Puma concolor) e cobra (Bohtrops); e R. (B.) microplus parasitando equino e veado (Mazama americana). Na Região Norte, R. sanguineus, A. aureolatum, A. ovale e A. tigrinum parasitando cães e A. nitens em equinos. No Vale do Itajaí foram identificados R. (B.) microplus, R. sanguineus, A. aureolatum, A. ovale e A. cajennense em cães; e A. cajennense e A. nitens em equinos. Amblyomma ovale e A. aureolatum em sapo (Bufo marinus); A. dubitatum em capivara e A. aureolatum em gato do mato (Leopardus tigrinus). Na região Oeste foram identificadas R. (B.) microplus, R. sanguineus e A. aureolatum em cães. Os bovinos foram excluídos do estudo por sabidamente sofrerem parasitismo por R. (B.) microplus em todo o Estado. Pelos dados obtidos constata-se uma ampla distribuição dos ixodídeos em todo o Estado e em diferentes hospedeiros, sendo as espécies A. cajennense, A. dubitatum, A. fuscum, A. longirostre e A. rotundatum identificadas pela primeira vez em Santa Catarina

Os ecossistemas naturais encontram-se sob forte pressão humana o que promove fragmentação e destruição de grandes áreas nativas. Estas mudanças favorecem situações impróprias para o parasita levando ao surgimento ou ressurgimento de doenças infecciosas/parasitárias. Consequentemente, tem se tornado importante pesquisas de fluxo epidemiológico de carrapatos entre animais e ambiente auxiliando a identificação do papel desses vetores na dispersão de patógenos. As coletas ocorreram na Fazenda Experimental Capim Branco – Uberlândia, MG, entre 2015 e 2017. Para a coleta de carrapatos em vida livre foi utilizado o arraste de flanela e a armadilhas de CO2 e nos animais a inspeção visual. Em áreas campestres a maior prevalência foi de Amblyomma sculptum, seguida por Rhipicephalus microplus e Amblyomma dubitatum. Nos piquetes de ovinos coletou R. microplus e Amblyomma spp., com predominância de ninfas de A. sculptum no inverno. Em áreas florestais A. sculptum e A. dubitatum foram os mais frequentes embora a quantidade de A. sculptum tenha sido maior tanto na mata ribeirinha quanto na mata semidecídua. Ainda em área florestal encontrou em menor quantidade R. microplus, Ixodes loricatus e Amblyomma longirostre. Observou uma maior eficiência de coleta de agregados de larvas por arraste enquanto a armadilha de gelo foi mais adequada para ninfas e adultos do gênero Amblyomma. Foi visto também que áreas florestais são constantemente mais infestadas do que áreas campestres. O gado em sua maioria apresentava R. microplus, mas a presença de A. sculptum foi observada com frequência em menor quantidade. Constatando que o parasitismo por este carrapato não é acidental. Dermacentor nitens, A. sculptum e R. microplus foram encontrados em cavalos, respectivamente seguindo a prevalência. Os cães apresentavam Rhipicephalus sanguineus além de A. sculptum e por fim, em pequenos mamíferos não voadores a presença de A. sculptum e I. loricatus, espécie predominante. Nenhum carrapato foi encontrado em ovinos. Consequentemente nota-se que a espécie A. sculptum está presente em diferentes ambientes e também em bovinos, equinos, cães e pequenos mamíferos. Sugerindo ser um carrapato importante no Cerrado pelo fato de ser o vetor mais comum associado à febre manchada no Brasil. / Natural ecosystems are under severe human pressure which promotes fragmentation and destruction of large native areas. These changes favor situations unfit for the parasite leading to the emergence or reemergence of infectious/parasitic diseases. Consequently, epidemiological studies of ticks between animals and environment have become important, helping to identify the role of these vectors in the dispersion of pathogens. The samples were collected in the Experimental Farm Capim Branco - Uberlândia, MG, in 2015 to 2017. For the collection free living ticks use a dragging flag and CO2 traps and for the animals used visual inspection. In rural areas the highest prevalence was of Amblyomma sculptum, followed by Rhipicephalus microplus and Amblyomma dubitatum. In the sheep area collected R. microplus and Amblyomma spp., with predominance of A. sculptum nymphs in winter. In forest areas A. sculptum and A. dubitatum were the most frequent although the A. sculptum was higher in the “ribeirinha” area the semideciduous area. Still in the forest it found in smaller quantity R. microplus, Ixodes loricatus and Amblyomma longirostre. Observed a greater efficiency for the drag in the aggregate of larvae while the ice trap was more suitable for nymphs and adults of the Amblyomma spp. It has also been seen that forest areas are constantly more infested than rural areas. The majority ticks of the cattle were R. microplus, but the presence of A. sculptum was frequently observed in less quantity. The parasitism on cattle by tick is not accidental. Dermacentor nitens, A. sculptum and R. microplus were found in horses, respectively, following the prevalence. The dogs presented Rhipicephalus sanguineus and A. sculptum and finally, in non volant small mammals the presence of I. loricatus was dominant, but A. sculptum was not discarded. No ticks were found in sheep. Consequently it is noted that the A. sculptum is present in different environments as in cattle, horses, dogs and small mammals. It suggests to be an important tick in the Cerrado and the most common vector associated with spotted fever in Brazil. / Tese (Doutorado)