Submitted by CLARISSA HELENA SANTANA null (santana.chs@gmail.com) on 2016-03-21T18:17:24Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_Clarissa_Helena_Santana.pdf: 1159982 bytes, checksum: 1160868d6c0bff2c67119202847275c7 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-03-22T17:26:26Z (GMT) No. of bitstreams: 1 santana_ch_me_jabo.pdf: 1159982 bytes, checksum: 1160868d6c0bff2c67119202847275c7 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-22T17:26:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 santana_ch_me_jabo.pdf: 1159982 bytes, checksum: 1160868d6c0bff2c67119202847275c7 (MD5) Previous issue date: 2016-02-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A bovinocultura é um setor com importante destaque no agronegócio brasileiro. O carrapato Ripicephalus (Boophilus) microplus é responsável por perdas econômicas significativas aos pecuaristas e é vetor de hemoparasitoses como Anaplasma spp e Babesia spp. Sabe-se que os bovinos Bos taurus taurus são mais susceptíveis à infestação por carrapatos do que Bos taurus indicus. Acredita-se que o mesmo ocorra para a infecção por Babesia bovis. Neste trabalho, foram avaliados, em duas colheitas, 355 bovinos da raça Angus, pertencentes a uma fazenda de Uruguaiana-RS, nos quais foram realizadas contagens de carrapatos e colheitas de amostras de sangue para quantificação de B. bovis, pela técnica de qPCR, e genotipagem com chip de 150.000 marcadores SNP. Para qPCR utilizaram-se sequências iniciadoras que flanqueiam um fragmento do gene do citocromo B (mt-cytB), como oligonucleotídeos iniciadores. Após genotipagem dos bovinos com o chip Gene Seek Genomic Profiler™ (GGP-HD) da Illumina Infinium®, foi realizado imputação de genótipos, para recuperação de genótipos faltantes, e controle de qualidade. Foi realizada análise de associação genômica ampla (GWAS), para cada uma das características, infecção por B. bovis e resistência a carrapatos, através do método denominado “Single Step Genomic BLUP” (ssGBLUP). Todos os animais apresentaram infestação por carrapatos e infecção por B. bovis, determinada pela qPCR, e altos valores médios para ambas as características. Algumas regiões cromossômicas foram identificadas como significativas para as características estudadas, sendo que, sete dos cromossomos identificados no presente estudo já haviam sido descritos em outros trabalhos. Neste sentido, o presente estudo corrobora com outros resultados indicando que a técnica de qPCR é um método sensível de detecção de B. bovis em animais Angus e que as regiões genômicas identificadas como significativas podem ser importantes para a variação das características estudadas. / The cattle industry is a sector with importance in the Brazilian agribusiness. The Ripicephalus (Boophilus) microplus is responsible for economic losses and is a vector for hemoparasitoses, such as Anaplasma spp and Babesia spp. It is known that the Bos tauros animals are more susceptible to infestation by ticks when compared with infestation in Bos indicus animals. It is believed that the same behavior keeps for infection by Babesia bovis. They were evaluated, in two collections, 355 Angus cattle, from a farm in Uruguaiana city, estate of Rio Grande do Sul, where were performed tick counts, quantification of B. bovis by qPCR and genotyping with a 150K chip. Were used as primers, in the qPCR, sequences that flanking the fragment of the cytochrome b gene. The technique was standardized and optimized using specimens of isolates of B. bovis. After genotyping, imputation was carried out, for recovery of missing genotypes, and quality control. Genome association analysis was performed (GWAS), to each of the characteristics, through the method called "Single Step Genomic BLUP" (ssGBLUP). All animals showed tick infestation and infection by B. bovis and high average values for both characteristics. Some regions on chromosomes were identified as significant to the characteristics tick infestation and infection by B. bovis, and seven chromosomes, identified in the present study, were already described in other studies. The present study agrees with other results indicating that the qPCR technique is a sensitive method to detecting B. bovis in Angus and genomic regions identified may be significant for the variation of these characteristics.

Made available in DSpace on 2015-08-20T17:09:42Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-02-20. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-20T17:26:36Z : No. of bitstreams: 1 000836155.pdf: 1638926 bytes, checksum: 52f2a08fe8d649d36c3c14e8c319fe60 (MD5) / Considerando a grande importância do Rhipicephalus (Boophilus) microplus, na produção de bovinos, o presente estudo teve como objetivo avaliar a sazonalidade deste artrópode em bovinos mantidos em pastagem de Brachiaria decumbens. Para tanto, foi pesquisada a dinâmica populacional durante 12 meses no município de Formiga, Minas Gerais. Vinte e quatro bovinos com oito a 12 meses de idade foram submetidos à infestação natural pelo carrapato. Contagens de fêmeas parcialmente ingurgitadas, 4,5 a 8,0 mm (partenóginas), foram computadas do lado esquerdo de cada bovino, nos períodos -2,-1 e zero. Utilizando-se as médias das contagens de carrapatos nas referidas datas, efetuou-se a randomização, para obtenção de dois grupos com infestações equitativas, os quais foram mantidos em piquetes separados. Para estudo da sazonalidade, as contagens foram realizadas nos períodos 3, 7, 14, 21, 28, e a cada 14 dias, durante 12 meses. Para verificar a incidência ectoparasitária com os efeitos climáticos, foram colhidos do posto climatológico do município, os seguintes dados: temperatura máxima e mínima, precipitação pluvial e umidade relativa do ar. Tratamentos táticos foram realizados, via tópica (pulverização), com uma formulação contendo Cipermetrina 15% + Clorpirifos 25% + Butóxido de Piperonila 15 + Citronela 1%, em todas as datas nas quais as quantificações de carrapatos ultrapassavam 30 partenóginas, em média. Como coadjuvante ao projeto, foram, ainda, realizadas pesagens dos animais e colheitas de fezes para contagens de ovos por grama de fezes (OPG) a cada 28 dias, sendo os mesmos tratados, com Fosfato de Levamisole injetável, na dose de 4,7 mg/kg, atingindo média de OPG ≥ 300. A carga média parasitária por animal e os desvios padrões do grupo I foi de 18,7(±11,7) e para o grupo II de 25,9 (±22,6), sendo realizados 15 tratamentos carrapaticidas nos dois grupos. As contagens de OPG apresentaram-se mais... / Considering the great importance of Rhipicephalus (Boophilus) microplus in cattle, the present study aimed to evaluate the seasonality of this arthropod in cattle maintained in pastures of Brachiaria decumbens. To that end, were investigated the population dynamics for 12 months in the city of Formiga, Minas Gerais. Twenty-four cattle with eight to 12 months of age were subjected to natural infestation by ticks. Counts of partially engorged females, from 4,5 to 8,0 mm (engorged), were computed on the left side of each animal, at times -2, -1 and zero. Using the mean on those dates tick counts, randomization was executed, to obtain two groups with fair infestations, which were kept in separate paddocks. To study of seasonality, the counts were recorded at 3, 7, 14, 21, 28, and every 14 days for 12 months. To check the ectoparasitic incidence with the climatic effects, were collected from the climatological station of the city, the following data: maximum and minimum temperature, rainfall and relative humidity. Tactical treatments were performed, topically (spray) with a formulation containing Cypermethrin 15 % + Chlorpyrifos 25% + Piperonyl butoxide 15 + Citronella 1% on all the dates on which tick measurements exceed 30 engorged on average. As an adjunct to the project, were also carried weights of animals and faeces samples for egg counts per gram of feces (EPG) every 28 days, and they are treated with injectable Levamisole Phosphate at a dose of 4,7 mg/kg, reaching average of EPG ≥ 300. The mean parasite load per animal and group I standard deviation was 18,7 (± 11,7) and group II 25,9 (± 22,6) and were performed 15 acaricide treatments in both groups. The EPG counts were more elevated in the months of December and May, and made two treatments in each group, a total of four anthelmintic treatments throughout the study. There was no statistical difference between the mean weight of the two analyzed groups (p>0,05), as well ...

Os carrapatos estão distribuídos por todo mundo e impactam tanto a saúde animal quanto humana. A espécie Rhipicephalus (Boophilus) microplus é o principal parasita que afeta a bovinocultura nas regiões tropicais e subtropicais do globo, causando grandes prejuísos econômicos. Os métodos de controle estão baseados no uso de acaricidas químicos, o que resulta na seleção de populações resistentes e no risco de poluição do meio ambiente e dos alimentos. As vacinas têm-se mostrado um método de controle factível, e representam uma alternativa ao uso de acaricidas químicos. No entanto, dez anos após a disponibilização da primeira vacina comercial contra carrapatos, ainda não foi encontrada uma formulação capaz de alcançar a proteção necessária para dispensar o uso de agentes químicos. Sendo assim, estudar a biologia do parasita e conhecer mecanismos de importância fisiológica pode ser uma boa estratégia para encontrar moléculas alvo que possam ser usadas como antígenos no desenvovimento de uma vacina eficaz. Com este objetivo, nesta tese foi estudada a reprodução em carrapatos e avaliada a eficácia de uma enzima evolvida neste processo como antígeno vacinal. Foram abordados os processos de vitelogênese e de embriogênese. Em uma primeira etapa, usando carrapatos da espécie Amblyomma hebraeum como modelo, foi investigada a atuação do hormônio 20- hidroxiecdisona (20E) e de fatores adicionais, presentes na hemolinfa, na captação de vitelogenina (Vg) pelos oócitos. Neste trabalho, verificamos que existem diferentes estratégias de controle da captação de Vg pelo ovário nos carrapatos Ixodide, e que para que ocorra capatação de Vg pelos oócitos de A. hebraeum é necessaário um fator adicional presente na hemolinfa das fêmeas. Uma vez que o desenvolvimento do embrião depende da disponibilidade do material do vitelo estocado nos oócitos, a segunda parte da tese explorou uma cisteíno endopeptidase envolvida na degradação de vitelina (Vt) em ovos do carrapato R. microplus denominada Vitellin Degrading Cysteine endopeptidase (VTDCE). As enzimas da classe das cisteíno endopeptidases estão amplamente distribuidas nas fêmeas deste carrapato. Os estudos com VTDCE mostraram que esta é uma enzima de origem materna, com provável síntese extraovariana e transporte pela hemolinfa, até ser internalizada pelos oócitos. A VTDCE está presente durante todo o desenvolvimento embrionário, assim como em larvas. Interessantemente, esta cisteíno endopeptidase apresenta a propriedade de se associar a Vt por um outro sítio, além do sítio ativo. A VTDCE é a enzima mais eficiente na degradação de vitelina (Vt) em ovos de R. microplus, e devido a sua importância fisiológica, a VTDCE foi testada como antígeno em experimento de vacinação de bovinos e desafio com larvas de R. microplus. Os parâmetros mais afetados nos carrapatos alimentados em bovinos vacinados, com relação aos controles, foram o peso das fêmeas ingurgitadas (19,3 %) e a fertilidade dos ovos (17,6 %). Relacionado os parâmetros análisados, vimos que este antígeno confere uma proteção de 21% aos animais imunizados quando infestados por R. microplus. A proteção parcial alcançada pela VTDCE pode ser complementar a de outros antígenos no desenvolvimento de um coquetel antigênico contra carrapatos, uma vez que nenhum antígeno encontrado até o momento foi capaz de oferecer a proteção necessária para ser empregado individualmente na composição de uma vacina. Estudos como os realizados nesta tese contribuem para o melhor entendimento da biologia dos carrapatos, assim como para o desenvolvimento de novos e melhores métodos de controle desses parasitas. / Ticks are distributed worldwide impacting human and animal health. The cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus is the main parasite that affects livestock in tropical and subtropical regions of world, causing large economical losses. Tick control methods are based on the application of chemical acaricides, which has resulted in selection of resistant ticks and a potential risk of environmental pollution and food contamination. Vaccines have been shown to be a feasible tick control method that offers a cost-effective, environmentally friendly alternative to chemical control. However, ten years after the commercialization of the first vaccine against ticks, to identify tickprotective antigens remains a limiting step in the development of an efficient formulation that would avoid the use of chemical acaricides. In face of this situation, to study the parasite biology and understanding physiological important mechanisms could be a good strategy to find new targets to be used in an efficient vaccine. In order that, this thesis subject was to investigate the reproduction process in ticks and to evaluate the efficiency of an enzyme involved in this process as vaccinal antigen. The process of vitellogenesis and embryogenesis were studied. In the first part, using Amblyomma hebraeum ticks as model, the role of 20- hydroxiecdisone and additional hemolymph borne factors in vitellogenin (Vg) uptake by oocytes were investigated. Our findings showed that there are different strategies to control Vg uptake by ovary in Ixodide ticks. Additionally, for Vg uptake in A. hebraeum ovaries, a vitellogenin uptake factor (VUF) present in female hemolymph is required. As embryo development depends on the availability of yolk material stored into the oocytes, in the second part we studied a cysteine endopeptidase involved in Vt digestion in R. microplus eggs, named vitellin-degrading cysteine endopeptidase (VTDCE). Cysteine endopeptidase enzymes are widely distributed in these tick females. Studies with VTDCE demonstrate that it is a maternal derived endopeptidase involved in a route including extraovarian synthesis, transport, and ovary uptake, before internalization by oocytes. VTDCE is present during all tick development, as well as in larva. Interestingly, this cysteine endopeptidase is able to associate with Vt in another site than the active site. VTDCE showed to be the most efficient Vt hydrolytic enzyme in R. microplus eggs. So, supported by its physiological role, VTDCE was used as antigen in bovine vaccination and R. microplus challenge experiment. The most affected biological parameters in ticks fed on vaccinated animals were weight of engorged ticks (19.3 %), and egg fertility (17.6 %). Relating the biological parameters analyzed, bovine vaccination with VTDCE as antigen resulted in an overall protection of 21%. Therefore, this partial protection could be complementary in the formulation of an antigenic cocktail against tick, once there is not one single protein that achieves the protection level necessary for an efficient and practical vaccine development. Studies like that contribute to the better understanding of tick biology, as well as to the development of new and more efficient methods of control.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-07-05Bitstream added on 2014-06-13T19:35:10Z : No. of bitstreams: 1 000735861.pdf: 1757660 bytes, checksum: fe912f998b0eeae4266b156b3428c7fe (MD5) / Os extratos vegetais têm sido importantes fontes de substâncias com diferentes estruturas químicas expressando diversas atividades deletérias contra os parasitas. A presente pesquisa teve como objetivo avaliar a ação antiparasitária de Artemisia annua in vivo. Para tal, foram propostos dois estudos: um utilizando bovinos naturalmente infestados e outro usando ovinos artificialmente infectados. Experimento I: foram selecionadas vinte novilhas com peso médio de 280 kg para avaliar a eficácia carrapaticida sobre R. (Boophilus) microplus. As mesmas foram divididas em dois grupos experimentais, um grupo que recebeu por via oral 200g/dia de A. annua em cocho coletivo e outro não recebeu. As contagens foram realizadas nos dias 0, 3, 7, 21, 35, 42, 49, 56, pós tratamento.Foi realizada a quantificação de artemisinina por cromatografia líquida de alta eficiência. Os resultados das três contagens de carrapatos com o valor referente às médias do dia foi 96,55. Nas contagens posteriores não observou-se diferença significativa entre ambos os grupos. Experimento II: Para avaliar a atividade antihelmíntica, foi conduzido um estudo controlado utilizando-se vinte e quatro ovinos machos Santa Inês com peso médio de 20 Kg artificialmente infectados com H. contortus e randomizados em quatro grupos homogêneos com seis animais cada, sendo, controle não tratado (Grupo I), Controle positivo tratado com levamizol 10 mg/kg (GII), A. annua a 10% (GIII) e A. annua a 20% (GIV). Contagens de OPG foram realizadas nos dias -3, -2, - 1, 0 (dia do tratamento), 3, 7, 10, 14, 17, 21, 24 e 28 pós-tratamento. De acordo com as quantificações estatísticas, foram observadas eficácias persistentes de 92,57% e de 85,00% no grupo controle positivo tratado com levamizol. Nota-se não houve diferença significativa entre ambos os grupos. Portanto, os resultados obtidos possibilitam inferir que A. annua administrada via... / Vegetal extracts has been important sources for substances with different chemical structures that express several deleterious activities against parasites. The present study focused on evaluating the anti-parasitic action of Artemisia annua in vivo. For such, two experiments were proposed: one using naturally infested animals and a second one with artificially infected sheep. Experiment I: twenty heifers weighing around 280 kg were selected in order to evaluate the acaricidal efficacy of the compound against Rhipicephalus (Boophilus) microplus. These animals were divided in two experimental groups: one being held as a control group and the second one were animals received, orally, 200 g/day of A. annua in a collective trough on days 0, 3, 7, 21, 35, 42, 49 and 56, post-treatment. Artemisinine was quantified through high performance liquid chromatography. Results of the three tick counts, regarding the average values, was of 96.55. In subsequent counts, no significant difference was observed between both groups. Experiment II: To evaluate the anthelmintic efficacy of the compound, a controlled trial was conducted using 24 male sheep, from the “Santa Inês” breed, with an average weight of 20 Kg, artificially infected with H. contortus. These animals were randomized in four homogeneous groups with six animals each, being: untreated control (Group I); positive control, treated with levamisole at 10 mg/kg (Group II); A. annua at 10% (Group III) and A. annua at 20% (Group IV). EPG counts were conducted on days -3, -2, -1, 0 (treatment day), 3, 7, 10, 14, 17, 21, 24 and 28 post-treatment. According to statistical quantifications, persistent efficacies of 92.57% and 85.00% were observed in the positive controls, treated with levamisole. It is possible to note that no significant difference was observed between the other groups. Therefore, the obtained results allow inferring that Artemisia annua ...

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:57Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-02-26Bitstream added on 2014-06-13T19:57:03Z : No. of bitstreams: 1 righi_ts_me_jabo.pdf: 553705 bytes, checksum: 2dd4db0ec51d6a6dd66d6d8999eecc41 (MD5) / Uma nova formulação medicamentosa contendo doramectina 3,5%, administrada vias subcutânea e intramuscular, na dose de 1mL/50kg de peso corporal (700 μg/kg), foi avaliada em quatro experimentos. No primeiro experimento foram determinados parâmetros farmacocinéticos em plasma de bovinos machos e fêmeas. Quanto à atividade carrapaticida, foram conduzidos dois ensaios, um utilizando bovinos com infestação experimental e outro com animais naturalmente parasitados por Rhipicephalus (Boophilus) microplus. A eficácia anti-helmíntica da referida formulação foi avaliada em 12 bovinos necropsiados portadores de nematodioses gastrintestinais (infecção natural). Para a determinação dos parâmetros farmacocinéticos, as amostras de plasma foram examinadas por meio de cromatografia líquida de ultra eficiência. Os resultados obtidos mostraram que não houve interferência da via de administração nos parâmetros Cmax, AUC (0-t), AUC (t- ), AUC (0- ) e MRT. Valor de T1/2 el foi significativamente superior quando a nova formulação foi administrada via subcutânea. A concentração plasmática máxima, foi atingida mais rapidamente nos animais tratados via intramuscular. A eficácia antiixodídica da nova formulação doramectina 3,5% (stall test) alcançou índices superiores a 95% em 21 datas experimentais. A ivermectina 3,15% e a moxidectina 10% atingiram percentuais de eficácia acima de 90%, em 30 e 11 datas, respectivamente. O número de teleóginas desprendidas dos grupos tratados com doramectina 3,5% e moxidectina 10%, não diferiram estatisticamente (P>0,05) ao longo de todo o experimento. Estas duas formulações foram estatisticamente superiores (P<0,05) à ivermectina 3,15% em 27 e 16 datas pós-tratamento. Os efeitos deletérios da doramectina 3,5% sobre a performance reprodutiva de teleóginas, foram estatísticamente... / A new drug formulation containing 3.5% doramectin, administered subcutaneous or intramuscular dose of 1mL/50kg body weight (700 mg / kg) was evaluated in four experiments. In the first experiment were determined in plasma pharmacokinetic parameters of male and female cattle. Regarding the activity ticks were conducted two experiments, one using experimental infestation with cattle and other animals with naturally parasitized by Rhipicephalus (Boophilus) microplus. The anthelmintic efficacy of this formulation was evaluated in 12 cattles with necropsied nematodiosis gastrointestinal (natural infection). For the determination of pharmacokinetic parameters, plasma samples were analyzed by liquid chromatography ultra efficiency The results showed that there was no interference route of administration of the parameters Cmax, AUC (0-t), AUC (t- ) AUC (0 - ) and MRT. Value T1/2 el was significantly higher when the new formulation was administered subcutaneously. The maximum plasma concentration was reached earlier in the animals treated intramuscularly. The efficacy of anti-ixodídica new formulation doramectin 3.5% (stall test) levels reached greater than 95% in 21 experimental days. The moxidectin and ivermectin 3.15% percentage reached 10% efficiency above 90% in dates 30 and 11 respectively. The number of detached ticks groups treated with 3.5% doramectin and moxidectin 10%, not statistically different (P> 0.05) throughout the experiment. These two formulations were significantly higher (P <0.05) at 3.15% ivermectin in dates 27 and 16 post-treatment. The deleterious effects of doramectin 3.5% on the reproductive performance of engorged females were statistically superior (P <0.05) at the 3.15% ivermectin. A new formulation and doramectin 1% significantly reduced (P <0.05), scores of females... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Alvimar José da Costa / Banca: Gilson Pereira de Oliveira / Banca: Claudio Alexandro Sakamoto / Resumo: Uma nova formulação medicamentosa contendo doramectina 3,5%, administrada vias subcutânea e intramuscular, na dose de 1mL/50kg de peso corporal (700 μg/kg), foi avaliada em quatro experimentos. No primeiro experimento foram determinados parâmetros farmacocinéticos em plasma de bovinos machos e fêmeas. Quanto à atividade carrapaticida, foram conduzidos dois ensaios, um utilizando bovinos com infestação experimental e outro com animais naturalmente parasitados por Rhipicephalus (Boophilus) microplus. A eficácia anti-helmíntica da referida formulação foi avaliada em 12 bovinos necropsiados portadores de nematodioses gastrintestinais (infecção natural). Para a determinação dos parâmetros farmacocinéticos, as amostras de plasma foram examinadas por meio de cromatografia líquida de ultra eficiência. Os resultados obtidos mostraram que não houve interferência da via de administração nos parâmetros Cmax, AUC (0-t), AUC (t- ), AUC (0- ) e MRT. Valor de T1/2 el foi significativamente superior quando a nova formulação foi administrada via subcutânea. A concentração plasmática máxima, foi atingida mais rapidamente nos animais tratados via intramuscular. A eficácia antiixodídica da nova formulação doramectina 3,5% (stall test) alcançou índices superiores a 95% em 21 datas experimentais. A ivermectina 3,15% e a moxidectina 10% atingiram percentuais de eficácia acima de 90%, em 30 e 11 datas, respectivamente. O número de teleóginas desprendidas dos grupos tratados com doramectina 3,5% e moxidectina 10%, não diferiram estatisticamente (P>0,05) ao longo de todo o experimento. Estas duas formulações foram estatisticamente superiores (P<0,05) à ivermectina 3,15% em 27 e 16 datas pós-tratamento. Os efeitos deletérios da doramectina 3,5% sobre a performance reprodutiva de teleóginas, foram estatísticamente... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: A new drug formulation containing 3.5% doramectin, administered subcutaneous or intramuscular dose of 1mL/50kg body weight (700 mg / kg) was evaluated in four experiments. In the first experiment were determined in plasma pharmacokinetic parameters of male and female cattle. Regarding the activity ticks were conducted two experiments, one using experimental infestation with cattle and other animals with naturally parasitized by Rhipicephalus (Boophilus) microplus. The anthelmintic efficacy of this formulation was evaluated in 12 cattles with necropsied nematodiosis gastrointestinal (natural infection). For the determination of pharmacokinetic parameters, plasma samples were analyzed by liquid chromatography ultra efficiency The results showed that there was no interference route of administration of the parameters Cmax, AUC (0-t), AUC (t- ) AUC (0 - ) and MRT. Value T1/2 el was significantly higher when the new formulation was administered subcutaneously. The maximum plasma concentration was reached earlier in the animals treated intramuscularly. The efficacy of anti-ixodídica new formulation doramectin 3.5% (stall test) levels reached greater than 95% in 21 experimental days. The moxidectin and ivermectin 3.15% percentage reached 10% efficiency above 90% in dates 30 and 11 respectively. The number of detached ticks groups treated with 3.5% doramectin and moxidectin 10%, not statistically different (P> 0.05) throughout the experiment. These two formulations were significantly higher (P <0.05) at 3.15% ivermectin in dates 27 and 16 post-treatment. The deleterious effects of doramectin 3.5% on the reproductive performance of engorged females were statistically superior (P <0.05) at the 3.15% ivermectin. A new formulation and doramectin 1% significantly reduced (P <0.05), scores of females... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

O extrato n-hexano de Calea serrata demonstrou atividade acaricida contra larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus e R. sanguineus. A enzima acetilcolinesterase (AChE), responsável por hidrolisar a acetilcolina nas sinapses colinérgicas, tem sido alvo de pesticidas e sua inibição pelos organofosforados levam à paralisia e morte de artrópodes. O uso intensivo de acaricidas / inseticidas tem provocado resistência em artrópodes, a qual pode estar relacionada com maior atividade de enzimas de detoxicação, como a glutationa-S-transferase (GST). O objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade acaricida do componente isolado do extrato n-hexano, o precoceno II, e do óleo essencial de C. serrata, assim como, determinar a composição química do referido óleo. Com intuito de compreender o mecanismo de ação acaricida do extrato n-hexano de C. serrata, foi investigado o efeito deste extrato sobre a atividade in vitro da AChE em larvas de R. microplus e em estruturas cerebrais de ratos Wistar machos, bem como sobre a modulação da atividade da GST em larvas de R. microplus. O óleo essencial e o precoceno II, o composto isolado, mostraram atividade larvicida. O óleo essencial apresentou diferentes sesquiterpenos em sua constituição química, além de precoceno II. O extrato nhexano de C. serrata inibiu significativamente a atividade in vitro da AChE em larvas de R. microplus e em estruturas cerebrais de ratos. O extrato n-hexano de C. serrata inibiu significativamente a atividade in vitro da GST. Compostos do extrato n-hexano de C. serrata podem ser potenciais inibidores de AChE e de GST, os quais podem contribuir para a sua toxicidade para os carrapatos. Considerando que o aumento da atividade da GST poderia reduzir a eficiência de carrapaticidas, é possível supor que C. serrata possa ser usada como um adjuvante no controle de R. microplus. Os resultados obtidos também suportam a possibilidade de que a inibição da acetilcolinesterase seja um possível mecanismo de ação do extrato n-hexano de C. serrata. / It has been demonstrated that the n-hexane extract of Calea serrata had acaricidal activity against larvae of R. microplus and R. sanguineus. Acetylcholinesterase (AChE), an enzyme that hydrolyses acetylcholine at cholinergic synapses, is a target for pesticides and its inhibition by organophosphates leads to paralysis and death of arthropods. Extensive uses of acaricides/inseticides have induced resistance in arthropods, which can be related to higher activity of detoxification enzymes, such as glutathione-S-transferase (GST).The aims of the present study were to evaluate the acaricide activity of isolated constituent of n-hexane extract, the precocene II, and the essential oil of C.serrata, in addition to determine the chemical composition of essential oil. In order to understand the mechanism of the acaricidal action of C. serrata n-hexane extract, we investigated the effect of this extract on in vitro anticholinesterase activity of larvae from R. microplus and in brain structures of male Wistar rats, as well as, we investigated the effect of C. serrata on GST activity of larvae from R. microplus.The essential oil and the isolated compound, precocene II, showed larvicidal action. Several sesquiterpenes were detected in the essential oil of C. serrata. The n-hexane extract significantly inhibited in vitro acetylcholinesterase activity in R. microplus larvae and rat brain structures. The n-hexane extract of C. serrata inhibited significantly GST activity. Compounds of n-hexane extract from C. serrata may be potential inhibitors of AChE and GST, which may contribute to its tick toxicity. Considering that higher GST activities would reduce the efficiency of the pesticides, we can also suppose that C. serrata may be at least used as an adjuvant in tick control. The results support that inhibition of acetylcholinesterase is a possible mechanism of action of hexane extract at C. serrata.

Lectins are tissue specific carbohydrate binding proteins with possible functions in invertebrate immunity and pathogen transmission. The main goal of this study was to identify hemolymph lectins in three different tick species. Three proteins with molecular weights of 58 kDa, 75 kDa and 180 kDa were detected in all investigated species using antibodies directed against hemagglutination activity of Rhipicephalus appendiculatus hemolymph. These proteins were characterized by biochemical methods such as Schiff/periodate staining, lectin blotting, enzymatic deglycosylation, hemagglutination analysis, immunoblotting, and mass spectrometry.

Introdução: Rhipicephalus microplus é um parasito importante na bovinocultura. Novas estratégias de controle dependem de um maior entendimento da sua fisiologia e da relação parasito-hospedeiro, e moléculas envolvidas na aquisição e digestão de sangue são alvos interessantes. Objetivo: determinar o mecanismo de ação do inibidor de coagulação BmGTI (Boophilus microplus Midgut Thrombin Inhibitor). Metodologia: BmGTI foi obtido a partir do homogenato de intestino de fêmeas de R. microplus parcialmente ingurgitadas utilizando técnicas de cromatografia de troca iônica, gel filtração e afinidade por trombina. A atividade inibitória foi monitorada pelo ensaio de coagulação do fibrinogênio induzida por trombina. A preparação de BmGTI foi avaliada por SDS-PAGE e analisada por LC-MS/MS. A provável ORF de BmGTI foi clonada no plasmídeo pPIC9, expressa em Pichia pastoris e purificada. Diferentes razões molares de trombina:rBmGTI foram examinadas para atividade inibitória de trombina sobre a clivagem do fibrinogênio em pH 7,5. E64 foi usado para bloquear o sítio ativo de rBmGTI e o ensaio de inibição foi realizado. Diferentes razões molares de trombina:rBmGTI foram incubadas e analisadas por SDS-PAGE para verificar interações entre as proteases. A atividade de rBmGTI sobre o fibrinogênio foi analisada pela incubação de ambos. Resultados e Discussão: Baseado na m/z dos fragmentos trípticos de BmGTI sua sequência foi identificada como BmCL1, uma catepsina Llike protease ativa em pH ácido, mas sem capacidade de hidrolisar substrato sintético em pH ≥7,0. rBmCL1/BmGTI foi expressa em P. pastoris como próenzima e após ativação, a enzima foi purificada. Diferentes razões molares de trombina:rBmCL1/BmGTI foram ensaiadas; quando a concentração de rBmCL1/BmGTI estava 64 vezes maior do que a de trombina, esta apresentou atividade residual de 37%. Quando rBmCL1/BmGTI teve seu sítio ativo bloqueado por E64, não houve inibição da atividade de trombina sobre fibrinogênio. A análise do fibrinogênio por SDS-PAGE, após incubação com rBmCL1/BmGTI, mostrou que as cadeias α e β do fibrinogênio são hidrolisadas. Conclusão: A partir destes resultados, concluímos que BmGTI inibe a coagulação sanguínea pela hidrólise das cadeias α e β do fibrinogênio. / Introduction: Rhipicephalus microplus is an important parasite of cattle. New strategies for control depend on a better knowledge of its physiology and hostparasite relationship, and molecules involved in acquisition and digestion of blood meal are interesting targets. Objectives: to determine how BmGTI (Boophilus microplus Midgut Thrombin Inhibitor) inhibits coagulation. Materials and Methods: BmGTI was obtained from partially engorged females midguts homogenate through ion exchange, size exclusion and thrombin-affinity chromatographies. Thrombin inhibition activity was measured by thrombin-induced fibrinogen clotting assay. BmGTI preparation was checked by SDS-PAGE and analyzed by LCMS/ MS. BmGTI putative ORF was cloned in pPIC9 plasmid, expressed in Pichia pastoris and purified. Different molar ratios of thrombin:BmGTI were examined for inhibitory activity of thrombin upon fibrinogen cleavage at pH 7.5. E64 was used to block BmGTI active site and inhibitory activity was assayed. Different molar ratio of thrombin:BmGTI were incubated and analyzed by SDS-PAGE to verify proteaseinhibitor interactions. BmGTI direct activity upon fibrinogen was analyzed after incubation by SDS-PAGE. Results and Discussion: Based on m/z of the BmGTI tryptic fragments it was identified as BmCL1, a cathepsin L-like proteinase active at acidic pH, but unable to hydrolyze synthetic substrate at pH ≥7.0. BmCL1/BmGTI was expressed in P. pastoris as pro-enzyme and after activation the enzyme was purified. Different molar ratios of thrombin:rBmCL1/BmGTI were assayed, and when rBmCL1/BmGTI concentration was 64-fold higher than thrombin concentration, this enzyme residual activity was 37%. When rBmCL1/BmGTI has its active site blocked with E-64, it was unable to inhibit thrombin activity upon fibrinogen. Analysis by SDS-PAGE of fibrinogen after incubation with rBmCL1/BmGTI showed that fibrinogen chains α and β were hydrolyzed. Conclusion: Based on these results, we concluded that rBmGTI/BmCL1 inhibits blood coagulation through hydrolyzes of fibrinogen chain- α and β.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Núcleo de Medicina Tropical, Progragama de Pós-graduação em Medicina Tropical, 2012. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-01-04T13:40:56Z No. of bitstreams: 1 2012_VivianeMedeirosSilva.pdf: 8808644 bytes, checksum: 9d9dc0f5cdac4641c66122653211e830 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-02-04T12:53:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_VivianeMedeirosSilva.pdf: 8808644 bytes, checksum: 9d9dc0f5cdac4641c66122653211e830 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-02-04T12:53:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_VivianeMedeirosSilva.pdf: 8808644 bytes, checksum: 9d9dc0f5cdac4641c66122653211e830 (MD5) / No Brasil, a leishmaniose visceral canina (LVC) é causada pelo parasito Leishmania chagasi, (sin. L. infantum). Considera-se que a principal via de transmissão da LV é por meio da picada de flebotomíneos infectados. Entretanto, formas alternativas têm sido investigadas e a picada ou ingestão de carrapatos infectados poderia ter relevância epidemiológica. A presença de L. chagasi em Rhipicephalus sanguineus poderia explicar a transmissão do parasito na população canina em locais onde há baixa frequência de flebotomíneos. O objetivo deste trabalho foi detectar a presença de Leishmania spp. em R. sanguineus coletados em cães naturalmente infectados no Distrito Federal. O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da Faculdade de Medicina da Universidade de Brasília. Os carrapatos foram obtidos de uma amostra de conveniência composta por 48 cães entregues por seus donos à Diretoria de Vigilância Ambiental da Secretaria de Saúde do Distrito Federal com diagnóstico suspeito ou confirmado de LVC, por meio de testes sorológicos, ou cães recolhidos por ocasião da realização do inquérito rotineiro do programa de controle de LVC no DF. Foi coletado sangue venoso dos 48 cães para avaliação sorológica da infecção por Leishmania spp por meio das técnicas imunoenzimática e imunofluorescência indireta, ambas com antígeno bruto de L. major; do teste imunocromatográfico rápido de duplo percurso com antígeno recombinante K28 e aplicação da técnica de PCR para amplificação de alvos de DNA gênero-específicos. Após a identificação dos espécimes de R. sanguineus, os carrapatos foram armazenados em pools de até 10 espécimes, separando-os em grupos de machos, fêmeas e ninfas. Os carrapatos foram dissecados para retirar o intestino e glândulas salivares para extração de DNA e posterior amplificação da região conservada de 120pb de kDNA e 234pb do gene hsp70 de Leishmania spp. por meio da PCR e para cultura em meio NNN modificado. Os produtos amplificados de kDNA foram ainda submetidos à digestão com as endonucleases Hae III e BstUI e ao sequenciamento genético para identificação das espécie do parasito. Foram realizados esfregaços em lâminas coradas com Giemsa para observação direta de formas de Leishmania spp. A positividade das técnicas sorológicas aplicadas ao sangue canino foi de 66,6% pelo ELISA, destes, 81,2% pela RIFI e 56,2% do total pelo DPP, e ainda, 70,8% dos cães apresentaram pelo menos um dos três testes com resultados reagentes ou positivos. Foram coletados 130 espécimes de R. sanguineus dos 27 cães que se apresentaram ectoparasitados. Houve sucesso no isolamento em cultura de Leishmania spp. de cinco pools de glândulas salivares e intestinos de carrapatos coletados em quatro cães. O sequenciamento do kDNA amplificado pela PCR a partir destas amostras demonstrou homologia com sequências de Leishmania spp. Os produtos amplificados de kDNA a partir de amostra sanguínea de um dos cães apresentou homologia com sequência de L. braziliensis, no entanto, a homologia do material amplificado a partir dos carrapatos coletados desse cão foi com uma sequência de L. infantum. A cultura analisada por eletroforese de isoenzimas foi identificada como L. infantum. A infecção por Leishmania nos cães, dos quais foram coletados os pools de carrapatos positivos na cultura, foi confirmada pela PCR. A lâmina do pool de machos de um dos cães foi a única a apresentar formas flageladas de tripanossomatídeos, cuja identificação não foi possível pela morfometria. Os resultados obtidos indicam que R. sanguineus que se alimentam naturalmente em cães naturalmente infectados por L. infantum apresentam DNA do parasito no intestino e glândulas salivares, confirmam a presença de L. infantum viável nestes ectoparasitos,e a possibilidade de isolar L. infantum em meio de cultura. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / In Brazil, canine visceral leishmaniasis (CVL) is caused by the parasite Leishmania chagasi (syn. L. infantum). It is considered that the principal route of transmission of the VL is through the bite of infected sand flies. However, alternative methods have been investigated and bites or ingestion of infected ticks could have epidemiological relevance. The presence of L. chagasi in Rhipicephalus sanguineus could explain the transmission of the parasite in the canine population in areas where there are low frequency of sand flies. The objective of this study was to detect the presence of Leishmania spp. in R. sanguineus collected from dogs naturally infected in the District Federal. The project was approved by the Ethics Committee on Animal Use of the UNB Faculty of Medicine. Ticks were obtained from a convenience sample consisting of 48 dogs delivered by their owners to the Environmental Surveillance Directory of Health Department of the District Federal with suspected or confirmed diagnosis of CVL, through tests, or dogs collected during the day routine investigation of the control program LVC in DF. Venous blood was collected from 48 dogs for serologic evaluation of infection by Leishmania spp. by means of ELISA and indirect immunofluorescence techniques, both with crude antigen of L. major, the immunochromatographic dual path assays with recombinant K28 and amplification of genus specific DNA targets by PCR. After identification of specimens of R. sanguineus ticks were stored in pools of up to 10 specimens, separating them into groups of males, females and nymphs. Ticks were dissected to remove the gut and salivary glands for DNA extraction and subsequent amplification of 120pb of the conserved region of kDNA and 234pb of the hsp70 gene of Leishmania spp. by PCR. Ticks sample were also cultured in modified NNN culture medium. The amplified products of kDNA were further subjected to digestion with restriction endonucleases Hae III and BstUI and gene sequencing to identify the parasite species. Smears were prepared on slides stained with Giemsa for observation of Leishmania spp. forms. The positivity of serological techniques applied to canine blood was 66.6% by ELISA. Among positive samples, 81.2% were also positive by IFA and 56.2% by DPP, then, 70.8% of dogs had at least one of the three tests with positive results. We collected 130 specimens of R. sanguineus of the 27 dogs that had ectoparasites. Isolation of Leishmania spp. was successfull in five pools of salivary glands and intestines of ticks collected from four dogs. Sequencing kDNA amplified by PCR from these samples revealed homology with sequences of Leishmania spp. The amplified products of kDNA in a blood sample from one of the dogs showed sequence homology to L. braziliensis, however, the amplified material from ticks collected from this dog had homology with L. infantum sequence. The isolate analyzed by mulilocus enzyme electrophoresis was identified as L. infantum. The Leishmania infection in dogs where we collected the pools of ticks which had successful parasite isolation in culture was confirmed by PCR. The smear of the pool of male ticks collected from one dog was the only positive for flagellated trypanosomatidae whose identification was not possible by morphometry. Our results indicate that R. sanguineus feeding naturally in dogs naturally infected by L. infantum had parasite DNA present in the intestine and salivary glands, confirm the presence of viable L. infantum in these ectoparasites, and the possibility of isolation of L. infantum in culture medium.