As diarréias, em animais neonatos, constituem numa enfermidade mórbida de distribuição mundial e os rotavirus têm sido apontados como uma das principias causas de gastroenterites de origem viral, especialmente nos países onde a suinocultura é explorada de forma intensiva. Este estudo teve por objetivo ampliar os conhecimentos da incidência e de rotavírus em suínos através das técnicas de aglutinação em látex (LATEX) e eletroforese em gel de poliacrilamida (EGPA). Foram anlisadas 329 amostras de fezes diarréicas de leitões entre os meses de março de 2007 a março de 2008, provenientes de uma granja localizada no município da serra gaúcha. O resultado da identificação de rotavírus por LATEX usando o kit Rotavírus Latex® , foi de 11.6% (38/329) e de 7.9% para EGPA (26/329). A metodologia para determinação de rotavírus por LATEX, mostrou ser mais eficiente que a de eletroforese em gel de poliacrilamida na detecção rotavirus, com uma sensibilidade de 88.4%, especificidade de 95%, valor preditivo positivo de 60.5% e um valor preditivo negativo de 99% e uma correlação de 94.5%. A caracterização molecular das amostras positivas identificou apenas o genótipo G5 e o padrão eletroforético longo em EGPA como vírus circulante no rebanho suíno. Não foram identificadas amostras com misturas de genótipos ou infecções múltiplas e a distribuição sazonal do rotavírus, nesta fazenda, teve picos de incidência entre os meses mais frios do ano. / Diarrhea, in newborn animals, is a morbid disease that exists worldwide; rotaviruses have been considered one of the main causes of gastroenteritis of viral origin, especially in countries where pig farming is intensively explored. The objective of this study was to extend the knowledge about the incidence of rotavirus in pigs, using the latex agglutination test (LAT) and polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). This work analyzed 329 samples of diarrheic piglets between March 2007 and March 2008, from a farm in a municipality in Serra Gaúcha. Using LAT, for identification the Rotavirus Latex® kit, 11.6% (38/329) of the samples were considered positive, and, using PAGE, 7.9% (26/329) were positive. LAT was considered more sensitive than PAGE in the detection of rotaviruses, showing a sensitivity of 88.4% and a specificity of 95%, positive predictive value of 60.5%, negative predictive value of 99% and a correlation of 94.5%. The molecular characterization of the positive samples identified only the G5 genotype and a long electrophoretic profile in EGPA as the only type of rotavirus circulating in the pig herd. Neither samples with mixed genotype nor multiple infections were identified, and the seasonal distribution of the virus on this farm had higher incidence during the coldest month.

Orientador: Maria Silvia Viccari Gatti / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T09:06:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Martini_IzabelJulien_M.pdf: 1690786 bytes, checksum: ad68ca07a7cffdeef9fcdd571b9ae911 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Gastroenterites e diarréias, doenças comuns em humanos, são responsáveis por altas taxas de morbidade e mortalidade em todo o mundo. Os rotavírus são um dos principais agentes dessas doenças, acometendo principalmente crianças com idade inferior a três anos. Esses vírus pertencem à família Reoviridae, gênero Rotavirus, não envelopados e de simetria icosaédrica. Seu genoma é composto por 11 segmentos de RNA dupla fita que podem separar os rotavírus em sete grupos (RV-A a RV-G), dada a migração desses segmentos em eletroforese em gel de poliacrilamida (EGPA). Os RV-A estão mais frequentemente associados a infecções no homem e em outros animais. Os rotavírus apresentam três camadas protéicas concêntricas, com o capsídeo externo contendo a proteína VP4 e a glicoproteína VP7, indutoras de anticorpos neutralizantes. Variações nas seqüências de nucleotídeos dos segmentos genômicos que codificam para essas proteínas diferenciam os rotavírus em genotipos G (VP7) e [P] (VP4). A distribuição desses genótipos é variável nos diferentes países e a utilização da técnica de semi-nested RT-PCR permite a caracterização dos genotipos circulantes, o que é importante para a definição de estratégias vacinais contra esses vírus. O uso de diferentes vacinas contra a rotavirose vem sendo implementado, inclusive no Brasil. Nesse trabalho o objetivo foi caracterizar os genotipos de rotavírus associados a surtos de diarréia em humanos, ocorridos na cidade de Campinas, SP, Brasil, nos anos de 2003 e 2004. Das 328 amostras de fezes estudadas, 98 foram positivas para rotavírus em EGPA, sendo 96 delas RV-A e duas RV-C. Todas as amostras positivas em EGPA para RV-A e outras 96 amostras negativas nesse teste foram submetidas à genotipagem G (G1 a G6 e G8 a G10) e P (P[4] e P[8]). Com os resultados obtidos concluiu-se que a técnica de seminested RT-PCR foi mais sensível na detecção de rotavírus (73,9%) que a EGPA (50,0%) (?2=67,06, valor-p= 0,000 e Kappa= 0,52).Os genotipos de rotavírus mais freqüentes nas amostras coletadas no ano de 2003 (n=38) foram: G1P[8] (38,4%), G3P[8] (15,4%), G5P[8], G9P[8] (7,8%) e G2P[4] (3,9%). Para as amostras enviadas em 2004 (n=290) os genotipos mais freqüentes foram: G3P[8] (18,7%), G9P[8] (13,9%), G1P[8] (8,4%), G5P[8] (6,0%) e G4P[8] (5,4%). A proporção de identificação do genotipo G1P[8] no ano de 2004 foi significativamente maior no ano de 2004 (Z= 3,07; valor-p=0,002). O genotipo emergente G9 foi identificado em 13,5% (n= 26) das amostras estudadas. Infecções mistas com os genotipos G1 e G2, G1 e G8, G2 e G3, G3 e G5 e G5 e G8 foram identificadas em oito amostras de fezes (4,1%). Nas regiões Sul e Sudoeste de Campinas, consideradas como menos favorecidas socio-economicamente, foi verificada maior variabilidade de genotipos circulantes nos dois anos de análise. Os dados obtidos poderão contribuir para a verificação da eficácia da vacina em uso no Brasil contra a rotavirose / Abstract: Gastroenteritis and diarrhea are a important cause of morbidity and mortality worldwide. Rotavirus is the most important etiologic agent of these disorders in infants and young children. These viruses, which form a genus of the Reoviridae family, are icosahedral, non-enveloped and their genome consists of 11 segments of double stranded RNA. When submitted to electrophoresis in polyacrylamide gels the RNAds of rotaviruses classify these viruses into seven groups (RV¿A to RV-G). Group A rotaviruses have been established as the most common cause of severe infections in human and other animals worldwide. The genome of rotaviruses is surrounded by three concentric protein layers. The outer capsid consists of VP4 and VP7 that carry neutralization and protective antigens and allow classification into P and G genotypes, respectively. The VP7 serotype is designated as G serotype (VP7 is a glycoprotein), whereas the VP4 serotype is designated as [P], from protease-sensitive. Many studies have been showed fluctuations in the distribution of rotavirus G-P combinations in many countries, using the seminested RT-PCR. These data, in relation of the circulation of different rotavirus genotypes, are important to establish rotavirus vaccine programs. Since a universal immunization of infants with rotavirus vaccine was introduced in Brazil, it becomes important to characterize rotavirus genotypes associated with diarrhea in humans from Campinas, SP, Brazil, in the years of 2003 and 2004. From 328 faecal samples, 98 were positive to rotavirus in polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), being 96 of them belonging to group A and two to RV-C. All the positive samples in PAGE for RV-A and another 96 negative samples to this test were submitted to semi-nested RT-PCR for G (G1 to G6 and G8 to G10) and P (P[4] and P[8]) genotypes determination. The results obtained showed that that semi-nested RT-PCR was more sensitive to the detection of rotavirus (73.9%) than the PAGE (50.0%) (?2=67.06, p= 0,000 and Kappa= 0,52). In 2003, in 38 faecal samples analyzed were identified as the genotypes G1P[8] (38.4%), G3P[8] (15.4%), G5P[8] (7.8%), G9P[8] (7.8%) and G2P 4] (3.9%). For the samples sent in 2004 (n=290), the genotypes G3P[8] (18.7%), G9P[8] (13.9%), G1P[8] (8.4%), G5P[8] (6.0%) and G4P[8] (5.4%) were identified. The genotype G1P[8] was identified in a higher proportion in 2004 than in 2003 (Z=3.07; p=0.002). The emergent genotype G9 was detected in 13.5% of the samples studied. Mixed infections, with G1 and G2, G1 and G8, G2 and G3, G3 and G5 and G5 and G8 were identified in eight faecal samples (4.1%). In the regions of South and Southwestern of Campinas, both of them considered as less socio-economically favored, a high variability of genotypes circulating in the two years of the study was verified. With these data will be able to contribute to the verification of the effectiveness of vaccines in use in Brazil against rotaviruses / Mestrado / Microbiologia / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Submitted by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2013-03-18T22:13:13Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_EficaciaClinicaVacina.pdf: 66114716 bytes, checksum: 787dcfd6b603abd9f8aa5a7844e0815d (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva(arosa@ufpa.br) on 2013-03-20T17:15:37Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_EficaciaClinicaVacina.pdf: 66114716 bytes, checksum: 787dcfd6b603abd9f8aa5a7844e0815d (MD5) / Made available in DSpace on 2013-03-20T17:15:37Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_EficaciaClinicaVacina.pdf: 66114716 bytes, checksum: 787dcfd6b603abd9f8aa5a7844e0815d (MD5) Previous issue date: 1999 / Acumulam-se evidências presentemente, indicando que o efetivo controle das gastroenterites por rotavírus só poderá ser alcançado com o advento de um imunizante eficaz para uso nos primeiros meses de vida. Com o objetivo de avaliar a eficácia da vacina geneticamente rearranjada, rhesus-humana, tetravalente (RRV-TV, 4 X 10(4) pfu/dose) frente aos parâmetros clínicos mais relevantes das gastroenterites por rotavírus, procedeu-se ao reexame de 91 episódios diarréicos em crianças no âmbito de uma investigação prévia conduzida em Belém, Pará, Brasil. As informações para o estudo foram obtidas a partir de dados contidos em fichas utilizadas na rotina de vigilância dos episódios diarréicos, bem como daqueles com registro clínico diário enquanto persistisse a diarréia. A eficácia relativa foi especificamente avaliada frente aos seguintes indicadores clínicos de gravidade: a) duração da diarréia; b) número máximo de evacuações líquidas/semilíquidas por dia; c) duração dos vômitos; d) número máximo de vômitos/24h; e) febre (temperatura retal); f) desidratação; e g) necessidade de tratamento. A gravidade clínica global das gastroenterites por rotavírus foi determinada por um sistema de escores (somatória máxima de 20 pontos) que permitiu classificar os episódios diarréicos em: leves (0-8), moderados a severos (9-14) e muito graves (>14). Uma significativa (p<0,05) proteção conferida pela RRV-TV foi observada em cinco das sete condições clínicas avaliadas, quais sejam: a) duração da diarréia (episódios puros, eficácia de 52%); b) número máximo de evacuações líquidas/semilíquidas por dia (todos os episódios, 42% e os puros, 53%); c) número máximo de vômitos (todos, 56% e os puros, 62%); d) desidratação (todos, 46%) Elevados índices de proteção foram obtidos frente aos episódios associados ao sorotipo G2, durante o segundo ano de acompanhamento, se considerados o número máximo e a duração de vômitos: 90% e 100% respectivamente. Ainda em relação ao tipo G2, a eficácia cumulativa foi de 100% contra os episódios com escore clínico >14. Taxas similares de eficácia frente às infecções mistas (35%) e puras (37%) foram registradas nos dois anos de estudo. Embora não se tenha registrado proteção quanto aos casos leves (escores de 0 a 8), a RRV0TV foi 75% (p=0,02) eficaz contra os episódios mais graves de gastroenterites por rotavírus; houve tendência à proteção contra todos os quadros diarréicos e os puros, com escores clínicos de 9 a 14: 44% (p=0,06) e 45% (p=0,08), respectivamente. Os resultados do estudo sustentam o conceito vigente de que a RRV-TV parece proteger seletivamente contra os quadros diarréicos revestidos de maior gravidade clínica. / There is currently growing evidence that infantile rotavirus gastroenteritis will be controlled only through the development of an effective vaccine targeted for use in early childhood. This study was conducted with the aim of assessing the protective efficacy of the lower-titer rhesus-human reassortant rotavirus tetravalent vaccine (RRV-TV, 4 x 104 ) against the major clinical indicators of severity cases of rotavirus diarrhoea; for this, were re-examined 91 rotavirus-associated diarrhoeal episodes that were recorded during an efficacy trial carried out previously in Belem, Para, Brazil. The source of information for study were the data recorded in field forms used to perform the routine surveillance for diarrhoeal episodes, as well as those forms in which daily clinical records were made while diarrhoea persisted. Relative efficacy was specifically against the following clinical parameters: a) duration of diarrhoea; b) maximum number of liquid /semiliquid stools per day; c) duration of vomiting episodes/24h; d) maximum number of vomiting episodes / 24h; e) fever (rectal temperature); f) dehydration; and g) need for treatment. The overall clinical severity of rotavirus gastroenteritis has been graded using a numerical twenty-point scoring system (i.e., maximum of 20 points) which allowed the classification of diarrhoeal cases in mild (0-6 scoring interval), moderate/severe (9- 14) and very severe (>14). A significant (p<0.05) protection conferred by RRV-TV was observed in five of the seven clinical parameters under analysis, as follows: a) duration of diarrhoea (52%, pure rotavirus diarrhoea; b) maximum number of liquid/semi-liquid stools per day (42% and 53% against all- and- pure diarrhoeal episodes, respectively); c) maximum number of vomiting (56% and 62% for all-andpure diarrhoeal cases, respectively); d) dehydration (42% and 48% against all-andpure cases of diarrhoea, respectively); and e) the need for rehidration (42% and 46% for all-and-pure cases, respectively). High protective efficacy levels were achieved against rotavirus type G2-related diarrhoea during the second year of follow-up, if considered both the number-and-the maximum number vomiting episodes: 90% and 100%, respectively. Also for G2 type, the overall cumulative protection of 100% against those episodes scored greater than 14. Similar rates of protection against mixed - (35%) and - pure (37%) rotavirus gastroenteritis were yielded after two years of follow-up. While no efficacy was achieved against mild (0- 8 scored) diarrhoea, RRV-TV was 75% (p = 0.02) efficacious against the very severe cases of rotavirus gastroenteritis; there was a tendency for protection against alland- pure diarrhoeal episodes with clinical scores ranging from 9 to 14: 44% (p = 0.06) and 45% (p = 0.08), respectively. The results of study support the view that RRV-TV appears to selectively protect against the most severe rotavirus disease.

Gastrenterites virais em cães são doenças transmissíveis infecciosas com importância para a saúde animal, como as causadas por Parvovírus canino e Coronavírus canino (CCoV) e saúde pública, como no caso dos rotavírus. Rotavírus em cães são encontrados com baixa freqüência, tanto em cães com diarréia quanto sadios, mas sua importância como reservatório para a rotavirose humana já é conhecido. O CCoV, pertencente ao grupo 1 do gênero Coronavirus, ocorre sob a forma dos genótipos I e II, amplamente distribuídos mundialmente e implicados em diarréia moderada, mas podendo levar a elevada letalidade no caso de patótipos altamente patogênicos. No Brasil, a ocorrência de rotavírus do sorogrupo A em cães é um fato conhecido, mas, no caso do CCoV, existe, até o momento, apenas uma investigação relatando sua ocorrência, sem dados de diversidade molecular. A presente investigação teve por objetivos avaliar o papel de cães jovens com enterite sintomática, bem como sadios, como reservatórios de rotavírus, estudar a freqüência de ocorrência de Coronavírus canino (CCoV) em amostras fecais destes animais e estudar a diversidade molecular das amostras de CCoV encontradas. Para tato foram colhidas 100 amostras fecais de cães não vacinados, entre 1 e 180 dias de idade entre 2007 e 2008, sendo 50 com diarréia e 50 sem diarréia no momento da colheita, nos Municípios de São Paulo, São Bernardo do Campo, Santo André, São Caetano do Sul, Taboão da Serra, Itapecerica da Serra e uma aldeia indígena em Parelheiros. Às amostras foi aplicada a técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) para a detecção de rotavírus e uma RT-PCR dirigida ao gene da proteína de membrana M do CCoV (nucleotídeos 337 a 746) para a detecção deste vírus, sendo os fragmentos detectados submetidos a seqüenciamento de DNA. As seqüencias obtidas, traduzidas em aminoácidos, foram utilizadas para a construção de uma árvore genealógica enraizada de distância com o algoritmo Neighbor-Joning e modelo de Poisson com 100 repetições de bootstrap. Nenhuma das amostras resultou positiva para rotavirus, enquanto que 47 foram positivas para CCoV, com freqüência significativamente superior nos animais com diarréia. Vinte e dois dos 47 fragmentos de DNA obtidos resultaram em seqüências viáveis de DNA, sendo 12 classificadas como CCoV Tipo I e 10 como Tipo II, tendo sido encontrada uma sublinhagem exclusivamente brasileira para o Tipo II. Em relação à amostra vacinal de CCoV submetida ao seqüenciamento de DNA, a maior identidade ocorreu com o grupo Tipo II sublinhagem 01, com um valor de 100%, seguido de 97,2% para o Tipo II sublinhagem 02 (a linhagem brasileira) e 93,2% para o Tipo I. Sugere-se que a diversidade de CCoV encontrada seja derivada da elevada freqüência de ocorrência deste vírus, o que pode aumentar a probabilidade de divergências e de possíveis falhas vacinais por diferenças entre a amostra vacinal (Tipo II) e as amostras de campo (Tipos I e II), e, dessa forma, a vacina não diminuiria a transmissão e novas linhagens de CCoV emergiriam. Conclui-se que cães jovens com enterite sintomática, bem como sadios, não tiveram papel como reservatório para rotavírus, considerando-se a região geográfica e o período de colheita de amostras. O CCoV ocorreu com uma freqüência de 47% na população canina estudada, com freqüência estatisticamente significativamente superior naqueles com diarréia do que naqueles sem diarréia. Finalmente, amostras brasileiras de CCoV, com base em seqüenciamento parcial do gene codificador da proteína de membrana M, ocorrem tanto como tipo I quanto II, sendo que, para o tipo II, há uma lihangem tipicamente brasileira. / Viral canine gastroenteritis is infectious transmissible diseases with importance for animal health, as those caused by Canine parvovirus and Canine coronavirus (CCoV) and public health, as in the case of rotavirus. Canine rotavirus occurs at low frequencies, both in diarrheic and health dogs, but the importance of dog as reservoirs for human rotaviruses is known. CCoV belongs to group 1 of the genus Coronavirus and occurs as genotypes I and II, worldwide distributed and implicated in mild diarrhea, but high pathogenic types might lead to high lethality. In Brazil, the occurrence of serogroup A rotavirus in dogs is already known but, in the case of CCoV, theres a single report on the occurrence of this virus, with no data on its molecular diversity. The aims of the present investigation were to evaluate the roles of diarrheic and health young dogs as reservoirs of rotavirus, to study the occurrence of CCoV in these animals and to assess the molecular diversity of the strains found. One hundred fecal samples were collected from unvaccinated dogs between 2007 and 2008 (50 with diarrhea and 50 health dogs) in the Municipalities of São Paulo, São Bernardo do Campo, Santo André, São Caetano do Sul, Taboão da Serra, Itapecerica da Serra and in an indian community in Parelheiros. The samples were submitted to polyacrilamide gel electrophoresis (PAGE) for rotavirus detection and to an RT-PCR targeted to the membrane M protein gene (nucleotides 337 to 746) of CCoV for the detection of this virus; amplicons were then submitted to DNA sequencing and the putative amino acids sequences were used to build a rooted distance genealogic tree with the Neighbor-Joinng algorithm and he Poisson correction with 1,000 bootstrap replicates. No sample was positive to rotavirus, while 47 out of the 100 samples were positive for CCoV, with a statistically significative higher frequency for the dogs with diarrhea. Twenty-two out of the 47 ampicons resulted in viable sequences, being 12 classified as CCoV Type II and 10 as Type I; besides, and exclusively Brazilian sub lineage was found for Type II. Regarding the vaccine strain, the highest identity was found to Type II sub linage 02 (10%), followed by 97.2% for Type II sub linage II (the Brazilian sub linage) and 93.2% for Type I. Its suggested that the high diversity for CCoV detected is a consequence of the high frequency of occurrence of this virus, what might increase the probability of the emergence of divergence and possible vaccine failures due to differences amongst the vaccine strain (Type II) and field strains (Types I and II) and thus vaccination would not decrease the transmission and new lineages would emerge. It can be concluded that both health and diarrheic young dogs have played no role as reservoirs for rotavirus taking into account the geographic area and the time of samples collection. CCoV ocurred at a frequecy of 47%, with a higher frequency in the diarreic animals. Finally, Brazilian strains of CCoV, based on partial M gene sequences, occur as both type I and II, while, for Type II, a typical Brazilian lineage was described.

O coronavírus bovino (BCoV) e rotavírus (RV) são importantes agentes da diarréia neonatal bovina, causando grandes perdas econômicas. O BCoV é também responsável pela disenteria de inverno em vacas adultas e por desordens respiratórias e o RV possui um aspecto zoonótico de importância na saúde pública. Este estudo teve o objetivo de desenvolver uma multiplex hemi-nested RT-PCR para detecção simultânea de BCoV e RV do grupo A com a utilização de um controle interno. Para tanto, foram desenhados três primers dirigidos ao gene N de BCoV (306pb) e três primers dirigidos ao gene VP1 do RV do grupo A (228pb); para o controle interno, foram utilizados dois primers dirigidos ao mRNA do gene mitocondrial bovino ND5 (191pb). Foram utilizados como controles positivos a amostra Kakegawa de BCoV (título HA de 256), a amostra 8209 de rotavírus do grupo A (título viral de 101.66TCID50%/200µL) e suspensão de células MDBK para o controle interno. A extração de RNA foi realizada com o reagente comercial TRIzol, de acordo com as recomendações do fabricante. Foram realizados gradientes de temperatura para a determinação da temperatura ótima de hibridação para cada par de primers, resultando em 50ºC para PCR e 55ºC para a hemi-nested. Doze protocolos com diferentes concentrações de Taq DNA polymerase, MgCl2, primers e DNA-alvo foram testados. Para determinação do limiar de detecção, o protocolo final foi utilizado em diluições dos dois vírus em suspensão de amostras fecais negativas para BCoV e RV adicionadas de 10% de suspensão de células MDBK, obtendo o limiar de detecção de 10-8 para os dois vírus e aplicado em amostras fecais de bezerros (53) e vacas adultas (22). Todas as amostras foram previamente testadas para BCoV por uma nested RT-PCR dirigida ao gene RdPd, sendo 15 positivas, e para rotavírus pela PAGE, sendo 3 positivas. Para a multiplex, 15 amostras foram positivas para BCoV e 6 para rotavírus. O seqüenciamento de DNA das amostras positivas para multiplex demonstrou a especificidade do teste. Uma concordância ótima foi encontrada para BCoV (0,833) e substancial para rotavírus (0,648) calculada pela estatística kappa, comparando-se com os testes de referência. Estes resultados demonstram que a padronização da multiplex foi eficiente para a detecção de BCoV e RV, com elevadas sensibilidade e especificidade. Além disso, o diagnóstico simultâneo dos dois agentes permite um diagnóstico rápido e a um menor custo devido à utilização de reduzidas quantidades de reagentes e mão de obra, fornecendo uma importante ferramenta para o diagnóstico e estudo da etiologia da diarréia em bovinos. / Bovine coronavirus (BCoV) and rotavirus (RV) are important agents of neonatal diarrhea in cattle, causing large economic losses. BCoV is also responsible for winter dysentery in adult cattle and respiratory disorders and RV has a zoonotic aspect of importance in public health. This study aimed to develop a multiplex hemi-nested RT-PCR for simultaneous detection of BCoV and RV of group A with an internal control. For this purpose, three primers were designed targeting the N gene of BCoV (306pb) and three primers targeting to the VP1 gene of group A RV (228pb); for internal control, two primers targeting to the mRNA of ND5 bovine mitochondrial gene (191pb) were used. Positive controls were BCoV Kakegawa strain (HA titer 256), group A bovine rotavirus strain 8209 (viral titer of 101.66TCID50%/200µL), and MDBK cells suspension for internal control. The RNA extraction was performed with the commercial reagent TRIzol. Temperature gradients were carried out for each primers pair for the determination of the optimal hybridization temperatures, resulting in 50°C for PCR and 55°C for the hemi-nested. Twelve protocols were tested with different concentrations of Taq DNA polymerase, MgCl2, primers and target DNA. The final protocol was used in 10-fold dilutions of the two viruses in suspension of fecal sample negative for BCoV and RV added to 10% of MDBK cells suspension, obtaining the detection limit of 10-8 for the two viruses, and applied to 75 fecal samples from calves (53) and cows (22). All samples were previously tested for BCoV by a nested RT-PCR to RdPd gene, being 15 positive; and for rotavirus by PAGE, being 3 positive. For multiplex, 15 samples were positive for BCoV and 6 for RV. The DNA sequencing of multiplex-positive samples substantiates the specificity of the test. A great agreement was found for BCoV (0.833) and substantial for RV (0.648) by calculating the kappa statistic in comparison to the reference tests. These results demonstrate that the multiplex standard was effective in the detection of BCoV and RV, with high sensitivity and specificity. In addition, simultaneous diagnosis of both agents allows a faster and at lower cost diagnosis due to use of smaller quantities of reagents and labor, providing an important tool for the diagnosis and study on the etiology of diarrhea in cattle.

As diarréias neonatais constituem-se em um dos mais importantes fatores econômico e sanitário nas granjas suínas, quer pela mortalidade, quer pelas perdas agregadas ao atraso no desenvolvimento dos leitões, à profilaxia e ao manejo. Os rotavírus ocupam lugar de destaque pela rápida disseminação dentro do plantel, bem como pelo potencial zoonótico, dada a probabilidade de rearranjo ou recombinação genética entre amostras humanas e animais O objetivo deste trabalho foi detectar a presença de rotavírus a partir de 277 amostras fecais de leitões com quadro clínico de diarréia, provenientes dos Estados do Rio Grande do Sul (RS), Santa Catarina (SC), Paraná (PR), Mato Grosso do Sul (MS), Mato Grosso (MT), São Paulo (SP), Rio de Janeiro (RJ) e Minas Gerais (MG) entre os anos de 2009 e 2011 e analisar o perfil eletroforético de migração dos segmentos genômicos bem como diferenças de eletroferótipos nas amostras positivas, pela técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE). Das 277 amostras fecais diarréicas de leitões analisadas, 25 foram positivas (25/277= 9%). De conformidade com os Estados de origem, foram verificadas as frequências de 20% (1/5) no RS, 11,1% (1/9) em SC, 12,5% (1/8) no PR, 15,3% (6/39) em MS, 14,2% (3/21) em MT, 6,7% (5/74) em SP, 0% (0/7) no RJ e 7% (8/114) em MG. Pela análise da migração eletroforética dos segmentos genômicos, todas as 25 amostras positivas apresentaram perfil eletroforético compatível com o RV-A, tal como a amostra padrão NCDV com migração característica em quatro classes ou agregados [4-2-3- 2]. Foram observadas pequenas diferenças na velocidade de migração de um ou mais segmentos dentro da mesma classe. Estes resultados evidenciam a importância da PAGE como metodologia de diagnóstico e de investigações epidemiológicas nas rotaviroses suínas. / The neonatal diarrhea constitute one of the most important economic and health factors in pig farms either by death or by the aggregate losses to the delay in the development of piglets, prophylaxis and management. Rotaviruses have a prominent role by the rapid spread within the herd, as well as the zoonotic potential, given the likelihood of genetic reassortment or recombination between human and animal samples. The objective of this study was to detect the presence of rotavirus from fecal samples from 277 piglets with clinical cases of diarrhea, from the states of Rio Grande do Sul (RS), Santa Catarina (SC), Paraná (PR), Mato Grosso do Sul (MS), Mato Grosso (MT), São Paulo (SP), Rio de Janeiro (RJ) e Minas Gerais (MG) between the years 2009 and 2011 and to analyze the electrophoretic migration of genomic segments and electropherotype differences in positive samples, by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) technique. From 277 piglets diarrheal stool samples analyzed, 25 were positive (25/277 = 9%). In accordance with the States of origin, were observed frequencies of 20% (1/5) in the RS, 11.1% (1/9) in SC, 12.5% (1/8) in PR, 15.3 % (6/39) in MS, 14.2% (3/21) in MT, 6.7% (5/74) in SP, 0% (0/7) in Rio de Janeiro and 7% (8/114) in MG. For the analysis of the electrophoretic migration of genome segments, all 25 positive samples showed electrophoretic profile compatible with the RV-A as a standard sample NCDV, showing characteristic fourth class or aggregates [4-2-3-2]. We observed small differences in the migration speed of one or more segments within the same class. These results highlight the importance of PAGE as a method of diagnosis and epidemiological investigations in the porcine rotavirus.

Os rotavírus, membros da família Reoviridae, são uma importante causa de diarreia em mamíferos e aves. São partículas icosaédricas não envelopadas e seu genoma é formado por 11 segmentos de RNA fita dupla que codificam seis proteínas estruturais e seis proteínas não estruturais. O objetivo deste estudo foi caracterizar os genes codificadores das proteínas não estruturais (NSP1-5) e estruturais (VP1-4, VP6-7) dos rotavírus do grupo A em aves de criações comerciais (corte, postura, matrizeiros e avozeiros) localizadas em 12 estados brasileiros, seguido de análises de recombinação e pressão de seleção das amostras definidas. Um total de 226 amostras fecais foram triadas através de reações de RT-PCR tendo como alvo a amplificação da VP6 e NSP5. A frequência de ocorrência, baseada em cada uma destas provas, variou de 9,7% a 18,14%, respectivamente. Em seguida, 10 das amostras positivas foram processadas com primers específicos visando a amplificação dos demais genes, seguido do sequenciamento nucleotídico e filogenia baseada no método de maximum likelihood, tendo como modelos de substituição GTR (NSP1-3, VP1-3, VP4, VP6, VP7) e HKY (NSP4, NSP5) e 1.000 repetições de bootstrap. Foram definidas sequências parciais para os genes codificadores da VP1-4, VP6-7 e NSP1-4 e sequências completas para NSP5. As respectivas árvores demonstraram que as dez amostras definidas se agruparam em clados aviários previamente descritos. Duas constelações genotípicas foram caracterizadas: G19-P[31]-I11-R6-C6-M7-A16-N6-T8-E10-H8 e G19-P[31]-I4-R4-C4-M4-A16-N4-T4-E4-H4. Estes genotipos são tipicamente encontrados em aves, mas quando analisados em conjunto, esta é a primeira descrição destas constelações. Eventos de recombinação foram observados nos genes NSP2, VP1, VP3 e VP7. Pelo menos um códon com pressão de seleção positiva foi encontrado nos genes codificadores das proteínas NSP1, VP2 e VP3. Este estudo propicia um melhor entendimento acerca da epidemiologia e diversidade viral circulante nas criações aviárias brasileiras, servindo de base para o estabelecimento de medidas profiláticas mais eficazes. / Rotaviruses are members of the Reoviridae family and they are a common cause of acute diarrhea in several mammalian and avian species. They are non-enveloped icosahedral particles and its genome comprises 11 segments of double-stranded RNA, which encodes six structural proteins (VP1-4, VP6-7) and six nonstructural proteins (NSP1-6). The objective of this study was to characterize the RVA nonstructural and structural proteins coding genes (NSP1-NSP5, VP1-VP4, VP6 and VP7) from fecal samples from avian farms (broiler breeders, poultry, laying hens, and grandparents) raised in Brazilian commercial farms from 12 states, followed by recombination and selection pressure analysis from samples defined here. A total of 226 fecal samples were screened using a RT-PCR technique targeting the amplification of the VP6 and NSP5. The frequency of occurrence, using these techniques, ranging from 9.7% to 18,14%, respectively; and from these, ten samples were further processed with specific primers to amplify the remaining genes, followed by respective nucleotide sequencing of the amplicons and phylogeny based on method maximum likelihood, as substitutions models GTR (NSP1-3, VP1-3, VP4, VP6, VP7) and HKY (NSP4, NSP5) and 1.000 bootstrap repetitions. Partial nucleotide sequences of VP1-4, VP6-7, and NSP1-4, and complete from NSP5, were obtained in this study. The phylogenetic trees depicted that the ten Brazilian rotavirus strains segregated with previous avian RVA described elsewhere. Two avian genotype constellations have been characterized here: G19-P[31]-I11-R6-C6-M7-A16-N6-T8-E10-H8, and G19-P[31]-I4-R4-C4-M4-A16-N4-T4-E4-H4. These genotypes are typically found in avian species, although when analyzed together, this is the first report of such constellations. Recombination events were observed in NSP2, VP1, VP3, and VP7 coding genes. At least on positive selected site was observed in NSP1, VP2, and VP3 genes. This study provides a better understanding of rotavirus epidemiology, by the definition of genetic variability of circulating strains.

Gastrenterites virais em cães são doenças transmissíveis infecciosas com importância para a saúde animal, como as causadas por Parvovírus canino e Coronavírus canino (CCoV) e saúde pública, como no caso dos rotavírus. Rotavírus em cães são encontrados com baixa freqüência, tanto em cães com diarréia quanto sadios, mas sua importância como reservatório para a rotavirose humana já é conhecido. O CCoV, pertencente ao grupo 1 do gênero Coronavirus, ocorre sob a forma dos genótipos I e II, amplamente distribuídos mundialmente e implicados em diarréia moderada, mas podendo levar a elevada letalidade no caso de patótipos altamente patogênicos. No Brasil, a ocorrência de rotavírus do sorogrupo A em cães é um fato conhecido, mas, no caso do CCoV, existe, até o momento, apenas uma investigação relatando sua ocorrência, sem dados de diversidade molecular. A presente investigação teve por objetivos avaliar o papel de cães jovens com enterite sintomática, bem como sadios, como reservatórios de rotavírus, estudar a freqüência de ocorrência de Coronavírus canino (CCoV) em amostras fecais destes animais e estudar a diversidade molecular das amostras de CCoV encontradas. Para tato foram colhidas 100 amostras fecais de cães não vacinados, entre 1 e 180 dias de idade entre 2007 e 2008, sendo 50 com diarréia e 50 sem diarréia no momento da colheita, nos Municípios de São Paulo, São Bernardo do Campo, Santo André, São Caetano do Sul, Taboão da Serra, Itapecerica da Serra e uma aldeia indígena em Parelheiros. Às amostras foi aplicada a técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) para a detecção de rotavírus e uma RT-PCR dirigida ao gene da proteína de membrana M do CCoV (nucleotídeos 337 a 746) para a detecção deste vírus, sendo os fragmentos detectados submetidos a seqüenciamento de DNA. As seqüencias obtidas, traduzidas em aminoácidos, foram utilizadas para a construção de uma árvore genealógica enraizada de distância com o algoritmo Neighbor-Joning e modelo de Poisson com 100 repetições de bootstrap. Nenhuma das amostras resultou positiva para rotavirus, enquanto que 47 foram positivas para CCoV, com freqüência significativamente superior nos animais com diarréia. Vinte e dois dos 47 fragmentos de DNA obtidos resultaram em seqüências viáveis de DNA, sendo 12 classificadas como CCoV Tipo I e 10 como Tipo II, tendo sido encontrada uma sublinhagem exclusivamente brasileira para o Tipo II. Em relação à amostra vacinal de CCoV submetida ao seqüenciamento de DNA, a maior identidade ocorreu com o grupo Tipo II sublinhagem 01, com um valor de 100%, seguido de 97,2% para o Tipo II sublinhagem 02 (a linhagem brasileira) e 93,2% para o Tipo I. Sugere-se que a diversidade de CCoV encontrada seja derivada da elevada freqüência de ocorrência deste vírus, o que pode aumentar a probabilidade de divergências e de possíveis falhas vacinais por diferenças entre a amostra vacinal (Tipo II) e as amostras de campo (Tipos I e II), e, dessa forma, a vacina não diminuiria a transmissão e novas linhagens de CCoV emergiriam. Conclui-se que cães jovens com enterite sintomática, bem como sadios, não tiveram papel como reservatório para rotavírus, considerando-se a região geográfica e o período de colheita de amostras. O CCoV ocorreu com uma freqüência de 47% na população canina estudada, com freqüência estatisticamente significativamente superior naqueles com diarréia do que naqueles sem diarréia. Finalmente, amostras brasileiras de CCoV, com base em seqüenciamento parcial do gene codificador da proteína de membrana M, ocorrem tanto como tipo I quanto II, sendo que, para o tipo II, há uma lihangem tipicamente brasileira. / Viral canine gastroenteritis is infectious transmissible diseases with importance for animal health, as those caused by Canine parvovirus and Canine coronavirus (CCoV) and public health, as in the case of rotavirus. Canine rotavirus occurs at low frequencies, both in diarrheic and health dogs, but the importance of dog as reservoirs for human rotaviruses is known. CCoV belongs to group 1 of the genus Coronavirus and occurs as genotypes I and II, worldwide distributed and implicated in mild diarrhea, but high pathogenic types might lead to high lethality. In Brazil, the occurrence of serogroup A rotavirus in dogs is already known but, in the case of CCoV, theres a single report on the occurrence of this virus, with no data on its molecular diversity. The aims of the present investigation were to evaluate the roles of diarrheic and health young dogs as reservoirs of rotavirus, to study the occurrence of CCoV in these animals and to assess the molecular diversity of the strains found. One hundred fecal samples were collected from unvaccinated dogs between 2007 and 2008 (50 with diarrhea and 50 health dogs) in the Municipalities of São Paulo, São Bernardo do Campo, Santo André, São Caetano do Sul, Taboão da Serra, Itapecerica da Serra and in an indian community in Parelheiros. The samples were submitted to polyacrilamide gel electrophoresis (PAGE) for rotavirus detection and to an RT-PCR targeted to the membrane M protein gene (nucleotides 337 to 746) of CCoV for the detection of this virus; amplicons were then submitted to DNA sequencing and the putative amino acids sequences were used to build a rooted distance genealogic tree with the Neighbor-Joinng algorithm and he Poisson correction with 1,000 bootstrap replicates. No sample was positive to rotavirus, while 47 out of the 100 samples were positive for CCoV, with a statistically significative higher frequency for the dogs with diarrhea. Twenty-two out of the 47 ampicons resulted in viable sequences, being 12 classified as CCoV Type II and 10 as Type I; besides, and exclusively Brazilian sub lineage was found for Type II. Regarding the vaccine strain, the highest identity was found to Type II sub linage 02 (10%), followed by 97.2% for Type II sub linage II (the Brazilian sub linage) and 93.2% for Type I. Its suggested that the high diversity for CCoV detected is a consequence of the high frequency of occurrence of this virus, what might increase the probability of the emergence of divergence and possible vaccine failures due to differences amongst the vaccine strain (Type II) and field strains (Types I and II) and thus vaccination would not decrease the transmission and new lineages would emerge. It can be concluded that both health and diarrheic young dogs have played no role as reservoirs for rotavirus taking into account the geographic area and the time of samples collection. CCoV ocurred at a frequecy of 47%, with a higher frequency in the diarreic animals. Finally, Brazilian strains of CCoV, based on partial M gene sequences, occur as both type I and II, while, for Type II, a typical Brazilian lineage was described.

O coronavírus bovino (BCoV) e rotavírus (RV) são importantes agentes da diarréia neonatal bovina, causando grandes perdas econômicas. O BCoV é também responsável pela disenteria de inverno em vacas adultas e por desordens respiratórias e o RV possui um aspecto zoonótico de importância na saúde pública. Este estudo teve o objetivo de desenvolver uma multiplex hemi-nested RT-PCR para detecção simultânea de BCoV e RV do grupo A com a utilização de um controle interno. Para tanto, foram desenhados três primers dirigidos ao gene N de BCoV (306pb) e três primers dirigidos ao gene VP1 do RV do grupo A (228pb); para o controle interno, foram utilizados dois primers dirigidos ao mRNA do gene mitocondrial bovino ND5 (191pb). Foram utilizados como controles positivos a amostra Kakegawa de BCoV (título HA de 256), a amostra 8209 de rotavírus do grupo A (título viral de 101.66TCID50%/200µL) e suspensão de células MDBK para o controle interno. A extração de RNA foi realizada com o reagente comercial TRIzol, de acordo com as recomendações do fabricante. Foram realizados gradientes de temperatura para a determinação da temperatura ótima de hibridação para cada par de primers, resultando em 50ºC para PCR e 55ºC para a hemi-nested. Doze protocolos com diferentes concentrações de Taq DNA polymerase, MgCl2, primers e DNA-alvo foram testados. Para determinação do limiar de detecção, o protocolo final foi utilizado em diluições dos dois vírus em suspensão de amostras fecais negativas para BCoV e RV adicionadas de 10% de suspensão de células MDBK, obtendo o limiar de detecção de 10-8 para os dois vírus e aplicado em amostras fecais de bezerros (53) e vacas adultas (22). Todas as amostras foram previamente testadas para BCoV por uma nested RT-PCR dirigida ao gene RdPd, sendo 15 positivas, e para rotavírus pela PAGE, sendo 3 positivas. Para a multiplex, 15 amostras foram positivas para BCoV e 6 para rotavírus. O seqüenciamento de DNA das amostras positivas para multiplex demonstrou a especificidade do teste. Uma concordância ótima foi encontrada para BCoV (0,833) e substancial para rotavírus (0,648) calculada pela estatística kappa, comparando-se com os testes de referência. Estes resultados demonstram que a padronização da multiplex foi eficiente para a detecção de BCoV e RV, com elevadas sensibilidade e especificidade. Além disso, o diagnóstico simultâneo dos dois agentes permite um diagnóstico rápido e a um menor custo devido à utilização de reduzidas quantidades de reagentes e mão de obra, fornecendo uma importante ferramenta para o diagnóstico e estudo da etiologia da diarréia em bovinos. / Bovine coronavirus (BCoV) and rotavirus (RV) are important agents of neonatal diarrhea in cattle, causing large economic losses. BCoV is also responsible for winter dysentery in adult cattle and respiratory disorders and RV has a zoonotic aspect of importance in public health. This study aimed to develop a multiplex hemi-nested RT-PCR for simultaneous detection of BCoV and RV of group A with an internal control. For this purpose, three primers were designed targeting the N gene of BCoV (306pb) and three primers targeting to the VP1 gene of group A RV (228pb); for internal control, two primers targeting to the mRNA of ND5 bovine mitochondrial gene (191pb) were used. Positive controls were BCoV Kakegawa strain (HA titer 256), group A bovine rotavirus strain 8209 (viral titer of 101.66TCID50%/200µL), and MDBK cells suspension for internal control. The RNA extraction was performed with the commercial reagent TRIzol. Temperature gradients were carried out for each primers pair for the determination of the optimal hybridization temperatures, resulting in 50°C for PCR and 55°C for the hemi-nested. Twelve protocols were tested with different concentrations of Taq DNA polymerase, MgCl2, primers and target DNA. The final protocol was used in 10-fold dilutions of the two viruses in suspension of fecal sample negative for BCoV and RV added to 10% of MDBK cells suspension, obtaining the detection limit of 10-8 for the two viruses, and applied to 75 fecal samples from calves (53) and cows (22). All samples were previously tested for BCoV by a nested RT-PCR to RdPd gene, being 15 positive; and for rotavirus by PAGE, being 3 positive. For multiplex, 15 samples were positive for BCoV and 6 for RV. The DNA sequencing of multiplex-positive samples substantiates the specificity of the test. A great agreement was found for BCoV (0.833) and substantial for RV (0.648) by calculating the kappa statistic in comparison to the reference tests. These results demonstrate that the multiplex standard was effective in the detection of BCoV and RV, with high sensitivity and specificity. In addition, simultaneous diagnosis of both agents allows a faster and at lower cost diagnosis due to use of smaller quantities of reagents and labor, providing an important tool for the diagnosis and study on the etiology of diarrhea in cattle.

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