Orientador: Sony Dimas Bicudo / Banca: Carlos Antonio de M. Bonfim / Banca: André Luis Rios Rodrigues / Resumo: Em 20 carneiros da raça Santa Inês com idade entre 60 e 135 dias, realizaramse observações semanais quanto ao grau de separação entre o pênis e o prepúcio, tentativas de colheita de sêmen com eletro ejaculador e análise microscópica a procura de presença de espermatozóides. As biometrias corporal e testicular foram mensuradas e após o período de observação os animais foram destinados ao abate comercial e os testículos retirados para análise. Os animais foram divididos em dois grupo distintos em relação a média de ganho de peso diário individual (Grupo 1 <191 g/dia, n=10 e Grupo 2 >191 g/dia, n=10). Animais de ambos os Grupos apresentaram valores crescentes (P<0,05) das biometrias corporais e testiculares no decorrer do experimento, não havendo diferença (P>0,05) entre os grupos. Constatou-se não haver diferença (P>0,05) em relação às medidas testiculares pré-abate, pós-abate através das biometrias, e volume testicular pós-abate pelo deslocamento de líquido. Os valores obtidos neste experimento foram característicos de animais pré-puberes. / Abstract: Twenty sheep males from Santa Inês breed, aging between 60 and 135 days were submitted to weekly observations in respect to the degree of separation between penis and prepuce. In addition semen collection using electro ejaculator followed by microscopy analysis and searching for presence of spermatozoa was performed. Corporal and testicular biometry were measured and after the observations were completed, the animals were conducted to commercial slaughter with removal of testicles for further analysis. The animals were divided in two distinct groups considering the average daily weight gain for each animal (Group 1 < 191 g/day, n=10 and Group 2 > 191 g/day, n=10). The animals from both groups presented increased values (P<0.05) of corporal biometry and testicles during the experiment period, with no difference between groups (P>0.05). No difference in measurements of testicles at pre and post slaughter was verified (P>0.05) regarding biometry and post slaughter testicular volume which were measured through liquid displacement. The values obtained in this experiment are typical traits from animals at the pre pubertal period. / Mestre

Orientador: Eunice Oba / Banca: Sony Dimas Bicudo / Banca: Frederico Ozanam Papa / Banca: Rubens Paes Arruda / Banca: Wilter Ricardo Russiano Vicente / Resumo: O objetivo deste trabalho foi avaliar a eficácia e o efeito dos crioprotetores glicerol (GLI) e dimetilacetamida (DMA) em duas concentrações (3 e 6%), em meio diluidor com e sem trealose (TRE), associada ou não ao EDTA, sobre a viabilidade espermática pós-descongelação. Para tanto, foram utilizadas quarenta e nove amostras de sêmen de 20 carneiros da raça Santa Inês. Os estudos foram divididos em três experimentos. O primeiro comparou as duas concentrações de GLI em meio com ou sem a TRE, associada ou não ao EDTA. O segundo experimento avaliou a DMA em duas concentrações (3 e 6%) em meio com ou sem TRE, associada ou não ao EDTA. O terceiro experimento testou os dois diluidores com os melhores resultados in vitro no experimento 1 e os dois do experimento 2. Todos os experimentos tiveram os parâmetros da cinética espermática avaliados subjetivamente e pela análise computadorizada (CASA). A análise da viabilidade espermática foi realizada através da associação das sondas fluorescentes iodeto de proprídio, JC-1 e FITC-PSA. Para a análise estatística das características avaliadas, foi empregado o programa estatístico (SAS), versão 5.0 (1996). A DMA a 6% apresentou toxicidade e a 3% demonstrou baixo efeito crioprotetor sobre o espermatozóide ovino. A adição da TRE promoveu efeito negativo sobre a cinética espermática, entretanto melhorou os níveis de integridade das membranas espermáticas pós-descongelação. O diluidor com GLI a 6% sozinho foi o protocolo mais eficaz para a manutenção da integridade espermática, entretanto a taxa de prenhez das fêmeas não diferiu entre os grupos / Abstract: The objective of this study was to evaluate the efficacy and the effect of the cryoprotectants glycerol (GLY) and dimethyl acetamide (DMA) in two grades (3 and 6%) in extender with and without trehalose (TRE) extender associated or not with EDTA, on the post-thawing sperm viability. For that, they were used forty nine semen samples of 20 rams of the Santa Inês breed. The studies were divided into three experiments. The first one compared the two GLY grades (3 and 6%) in extender with or without TRE, associated or not with EDTA. The second experiment evaluated the DMA at two concentrations (3 e 6%) in medium with or without TRE, associated or not with EDTA. The third one tested the two extenders with the best in vitro results in experiment 1 and the two from experiment 2. All experiments had the kinetics sperm parameters evaluated subjectively and by computer analysis (CASA). The sperm viability evaluation was performed through the multiple sperm parameter staining with propidium iodide, JC-1 and FITC-PSA. For the statistical analysis of the characteristics evaluated was used the statistical package (SAS), version 5.0 (1996). The DMA at 6% was toxic and at 3% had a poor cryoprotective effect for ram semen. The addition of TRE promoted negative effect on sperm kinetics, entertain improved levels of sperm membranes integrity post-thawing. The extender with GLI at 6% alone was the best protocol for maintaining the sperm integrity, however the pregnancy rates of the ewes did not present difference (P>0.05) among the groups / Doutor

Orientador: Marco Antonio Alvarenga / Abstract: The present work aimed to investigated several kinds of amides to freeze equine semen. Two ejaculates from 20 stallions of different breeds were used. All ejaculates with initial motility greater than 60 % were split and frozen in 0.5 ml French straws in a milk base extender (INRA 82) containing the different studied cryoprotectants. The post-thaw percentage of motility and other motility parameters wer evaluated using CASA .To evaluate cell viability fluorescent probes were used. Stains used were Carboxyfluorescein and propidium iodine (PI). The first experiment was designed to investigated the protective effect of 3 amides ; Dymethyl acetamide at 3 concentrations - 1, 3 and 5 % v/v; dymethyl formamide at 5% and methyl formamide at 5%. Differences on motion parameters between cryoprotectant treatments were determined by analysis of variance using SAS system. Utilization of amides significantly improved most of parameters evaluated when compared with Glycerol. Progressive motility evaluated by optical microscopy was higher (p< 0,0001) for semen that was frozen with MF 5% and DF5%. The progressive motility evaluated by CASA was higher for the MF 5 % and DA 3% groups. The electron microscopy evaluation showed that DA 5% and MF 5 % were superior in the ability to preserved the acrossomal integrity. The acrossomal status evaluated by fluorescence showed that the preservation was higher on the groups DA 5%, MF 5 % and DF5% (p<0.0001). On the second experiment the cryoprotective effect of two associations of glycerol (Gly) and dimethylformamide (DF) were tested ( Gly 3.5% + DF 1.5 % and DF 3.5% + Gly 1.5%)... (Complete abstract, click electronic address below). / Mestre

Orientador: Maria Denise Lopes / Resumo: Neste estudo foram utilizados 20 cães, sem raça definida, de fertilidade desconhecida, com pesos variando entre 15 e 20 Kg, sorologicamente negativos para leptospirose e brucelose canina. Após um período de condicionamento, foram colhidos seis ejaculados de cada cão, por manipulação digital do pênis, sendo três antes da deferentectomia e três após. O sêmen foi imediatamente analisado após a colheita, considerando os seguintes parâmetros: volume, cor, motilidade progressiva, vigor espermático, porcentagem de espermatozóides morfologicamente normais, pH, integridade de membrana (teste hiposmótico e coloração com sondas fluorescentes). Foram determinadas as concentrações de proteínas totais, cloretos totais, cálcio, potássio e sódio. A SDS-PAGE foi realizada utilizando-se duas concentrações de poliacrilamida, 13% e 22%, no gel de separação. Os géis foram corados com coomassie azul brilhante R-250, suas imagens digitalizadas e avaliadas num programa analisador de imagens, onde foram estimados os pesos moleculares e a densidade óptica integrada de cada banda, para cada amostra. Uma correlação negativa foi verificada entre o potássio e a motilidade progressiva, vigor espermático, resultados do teste hiposmótico e porcentagem de espermatozóides com integridade de membrana na coloração com sondas fluorescentes. Apenas o cálcio mostrou-se significativamente mais elevado após a deferentectomia. Foi verificado um total de 37 bandas antes da deferentectomia e 35 após. Antes da deferentectomia, encontrou-se uma correlação positiva e significativa entre duas bandas protéicas, B4 (67 kDa) e a B5 (58,6 kDa) e a motilidade progressiva, vigor espermático, porcentagem de espermatozóides morfologicamente normais, resultados do teste hiposmótico e porcentagem de espermatozóides com integridade de membrana na coloração com sondas fluorescentes... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo). / Abstract: In this study 20 mixed breed dogs (15 to 20 Kg of body weight) of unknown fertility were used. The dogs were negative in leptospyrosis and brucelosis tests. After a conditioning time, were collected six ejaculated of each dog by digital manipulation of penis, being three before and three after deferentectomy. Immediately, the semen was analyzed considering the following parameters: volume, color, spermatic motility, vigor, morphological forms of the spermatozoa, pH and membrane integrity (hypoosmotic test and fluorescent stain). The concentrations of total proteins, total chlorides, calcium, potassium and sodium were determined. The SDS-PAGE of each seminal plasma sample was carried out using two polyacrylamide concentrations, 13% and 22%, in the separation gel. The gels were stained with coomassie blue brilliant R-250, the images were digitalized and evaluated in a analyzer software, where the molecular weights were estimated, in accordance with a standard applied in each gel. The integrated optic density of each band for each sample was determined. A negative correlation was verified between the potassium and the spermatic motility, vigor, results of the hypoosmotic test and percentage of spermatozoa with integrity of membrane in the fluorescent stain. The calcium concentrations after of deferentectomy were significantly higher than before. A total of 37 bands before deferentectomy and 35 after were observed. Before the deferentectomy, a positive correlation was verified between two bands, B4 (67 kDa) and the B5 (58,6 kDa), and the spermatic motility, vigor, percentage of normal spermatozoa, results of the hypoosmotic test and percentage of spermatozoa with integrity of membrane in the stain fluorescent. Three bands were significantly different before and after the deferentectomy (B3, of 73,5 kDa, B29, of 7,8 kDa and B27, 3,6 kDa). Keywords: Dog; Seminal Plasma; Proteins; Electrophoresis, Electrolites. / Mestre

O primeiro experimento, teve o objetivo de comparar os efeitos da indução hormonal na qualidade espermática de Brycon insignis. Foram utilizados 12 reprodutores que tiveram uma alíquota do sêmen coletado e avaliado antes da indução hormonal (Ctrl) e em seguida foram divididos em tratamentos de acordo com o hormônio e dosagem recebida, Extrato de Hipófise de Carpa – EHC (T1 – 2,5 mg/kg-1 de peso vivo), análogos de GnRH sendo aplicado em duas dosagens diferentes (T2 – 0,7 mg/kg-1 de peso vivo e T3 – 1,4 mg/kg-1 de peso vivo). Dentre as análises utilizadas para comparar o efeito da indução e dos hormônios utilizados foram; taxa de motilidade – Ctrl (95%), T1 (100%), T2 (100%) e T3 (98%), onde foi observado um ligeiro aumento e concentração espermática – Ctrl (11,52 x109), T1 (4,37 x109), T2 (4,34 x109) e T3 (4,01 x109), que pode ser observado uma redução na concentração após a indução hormonal. No entanto a utilização de indutores hormonais não altera negativamente as características seminais de piabanha. No segundo experimento, o objetivo foi de avaliar a qualidade do sêmen diluído com três diluidores e resfriado a temperatura de 6 °C durante um período de 120 horas. Foram utilizados 32 machos, o liquido seminal era dividido em quatro tratamentos; sem diluição, diluído com BTS®, HBSS e ACP®, na proporção de 1:4 (sêmen:diluidor), as avaliações eram realizadas para; motilidade espermática, tempo de motilidade, morfologia espermática e vigor, no momento da diluição (tempo 0) e nos tempos seguintes de 24, 48, 72, 96 e 120 horas após a diluição. A taxa de fertilização e eclosão foi coletada apenas no momento da diluição do sêmen. Os resultados apontam que a diluição é eficaz para conservação do sêmen de C. macropomum, porém ainda por um curto período de tempo. A recomendação é que esse procedimento seja realiado com o diluidor BTS® por até 72 horas. No terceiro experimento, o objetivo foi classificar por meio de análise de clusters os reprodutores C. macropomum após a criopreservação seminal como sendo de baixo ou alto potencial de congelabilidade e correlacionar com as características do sêmen fresco e fenotípicas. Foram utilizados 25 machos, o sêmen de cada animal foi submetido ao mesmo protoloco de criopreservação que era composto de BTS®+DMF (90:10), e o sêmen diluído na proposção de 1:4. Os resultados demonstram que mesmo sobre as mesmas condições o liquido seminal apresenta diferentes variações, e através da análise de clusters foi possível diferenciar a formação de três grupos de reprodutores (G1, G2, G3). O G1 foi classificado como sendo de alta qualidade espermática após a criopreservação, porém as correlações demonstram que os animais com menor tamanho de cabeça apresentam FR melhores após a criopreservação, e possivelmente a MT pode ser utilizada como pré indicador de congelabilidade para reprodutores C. macropomum. / The first experiment aimed to compare the effects of hormonal induction on the spermatic quality of Brycon insignis. 12 broodstocks that had an aliquot of the semen collected and evaluated before to hormonal induction (Ctrl) were used and then divided into treatments according to the hormone and dosage received, Carpal Hypophysis Extract - EHC (T1 - 2.5 mg/Kg-1 live weight), GnRH analogs being administered in two different dosages (T2 - 0.7 mg/kg-1 live weight and T3 - 1.4 mg/kg-1 live weight). Among the analyzes used to compare the effect of induction and hormones used were: motility rate, that showed a slight increase, Ctrl (95%), T1 (100%), T2 (100%) and T3 (98%) and sperm concentraction wich may be observed a reduction, Ctrl (11.52 x109), T1 (4.37 x109), T2 (4.34 x109) and T3 (4.01 x109). However, the use of hormone inducers does not negatively affect the seminal characteristics of piabanha. In the second experiment, the objective was to evaluate the quality of semen of the Colossoma macropomum diluted with three extenders and cooled to 6 °C for a period of 120 hours. 32 males were used, the seminal fluid was divided into four treatments; Without dilution, diluted with BTSTM, HBSS and ACPTM, at the ratio of 1:4 (semen:extender), evaluations were performed for; Sperm motility, sperm motility and vigor, at the time of dilution (time 0) and at the following times of 24, 48, 72, 96 and 120 hours after dilution. The rate of fertilization and hatching was collected only at the time of the semen dilution. The results indicate that the dilution is effective for the conservation of semen of C. macropomum, but still for a short period of time. The recommendation is that this procedure be performed with the BTSTM thinner for up to 72 hours. In the third experiment, the objective was to classify by means of clusters analysis the C. macropomum broodstock after seminal cryopreservation as being of low or high freeze potential and to correlate with the characteristics phenotypic and fresh semen. 25 males were used, the semen from each animal was submitted to the same cryopreservation protocol that was composed of BTSTM+DMF (90:10), and the semen diluted in the 1:4 ratio. The results show that even on the same conditions, the seminal fluid presents different variations, and through the analysis of clusters it was possible to differentiate the formation of three broodstock groups (G1, G2, G3). G1 was classified as being of high spermatic quality after cryopreservation, but correlations show that animals with smaller head sizes have better fertilization rate after cryopreservation, and possibly motility time can be used as a pre-freeze indicator for C. macropomum.

O plasma seminal é uma fração do ejaculado masculino, produzido por contribuição de várias glândulas acessórias masculinas. Deveria ser reconhecido, como ocorre em outras espécies, como agente necessário ao “condicionamento” do endométrio, favorecendo o processo de implantação do embrião. A composição e conseqüente atividade imunossupressora do plasma seminal parece estar relacionados com o favorecimento da viabilidade da gravidez. Nessa tese, em estudo em que foram comparadas amostras de plasma seminal de pacientes considerados férteis frente a amostras de homens considerados inférteis (com oligozoospermia ou astenozoospermia) não foi encontrada diferença estatística entre níveis de diversas citocinas envolvidas no processo implantação. Amostras de plasma seminal dos dois grupos estudados demonstraram ter o mesmo potencial em diminuir a secreção de fator de necrose tumoral (TNF)-alfa e estimular a secreção de interleucina (IL)-6 e IL-8 por células mononucleares periféricas (PBMC), comprovando a atividade imunomoduladora do plasma seminal. A habilidade do sistema imune materno em manter tolerância frente ao feto pode ser reflexo do ambiente criado nos tecidos envolvidos e não somente de citocinas liberadas exclusivamente por células do sistema imune. Em outro estudo aqui apresentado, demonstrou-se que o perfil de expressão gênica de células endometriais epiteliais cultivadas in vitro pode ser modulado pela ação de plasma seminal em cultura. Análises de ontologia gênica apontam a regulação negativa de genes envolvidos com a resposta imune e estimulação de agentes envolvidos com a quimiotaxia, podendo estar relacionados com a expansão de linfócitos T reguladores observados durante gestações bem sucedidas. Regulação positiva de 133 genes e resolução negativa de 12 genes endometriais epiteliais foram descritas pela primeira vez nesse trabalho de tese e podem contribuir para a compreensão do processo envolvido na simbiose materno-fetal. Em ensaio clínico apresentado nessa tese envolvendo pacientes submetidas à Fertilização in vitro (FIV) ou Injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI) voluntárias a participar do estudo piloto duplo-cego, observou-se que pacientes que recebiam plasma seminal intracervical e intravaginal no dia da coleta dos oócitos exibiam maior taxa de gravidez do que a do grupo controle (salina). Ainda permanece pouco esclarecido o exato mecanismo pelo qual o plasma seminal é capaz de levar a aumento relativo de 45% na taxa de gravidez em mulheres que receberam plasma seminal, por vias intracervical e intravaginal, no dia da coleta dos oócitos. / Seminal plasma (SP) is a fraction of the masculine ejaculate, produced by contribution of some masculine accessory glands. Seminal plasma must be recognized, as it occurs in other species, as a necessary agent for “conditioning” of the endometrium, favoring the embryo implantation process. The SP imunossupressor activity seems to be responsible for the viability of the pregnancy. In this thesis, we compared SP from fertile patients with samples from infertile (oligozoospermia or astenozoospermia) patients. There were no significant differences between levels of several cytokines in the different groups. SP samples of both groups had similar effects in inhibiting TNF-alpha secretion and stimulating the secretion of IL-6 and IL-8 from peripheral mononuclear cells (PBMC), indicating that SP displays imunomoduladory activity. The ability of the maternal immune system in keeping tolerance to the embryo, can be related to the environment created in surrounding tissues and not only to cytokines produced by immune cells. We also show the profile genomic change of epithelial endometrial cells cultivated in vitro, under SP stimulation. Gene ontology analysis pointed genes related to negative regulation of genes enrolled in the immune response. SP stimulatory effect, on gene expression in endometrial epithelial cells, notably of chemokines, could be related with the expansion of T reg cells observed during successful gestations. Up-regulation of 133 genes and down-regulation of 12 epithelial endometrial genes might contribute to a better understanding of the process involved in the maternal-fetal symbiosis. In a clinical trial involving patients submitted to the FIV/ICSI and volunteers to participate of a double-blind pilot study. We observed that patients receiving SP by intracervical and intravaginal routes at the time of oocyte retrieval, showed greater pregnancy rates when compared to the control group (saline). The molecular mechanisms underlying the conditioning effect of SP, which could explain the 45% relative increase in pregnancy rate in patients receiving local seminal plasma treatment, remain to be established.

A criopreservação de sêmen humano é de grande importância para a medicina reprodutiva, porém esse processo pode causar danos ao espermatozóide devido, entre outros aspectos, à produção de espécies reativas de oxigênio, as quais podem lesar as biomoléculas. Tanto o resveratrol quanto o ácido ascórbico são compostos com reconhecida capacidade antioxidante, porém ainda pouco estudados em relação à prevenção de criodanos em espermatozóides humanos. Desta forma, o objetivo deste estudo foi analisar marcadores de danos oxidativos e parâmetros seminais antes e após a criopreservação de sêmen humano em presença e ausência de resveratrol e ácido ascórbico. Foram analisadas amostras de sêmen de 20 homens inférteis e 10 doadores com fertilidade comprovada. Indivíduos com azoospermia(ausência de espermatozoides), leucocitospermia (aumento da contagem de leucócitos seminais) ou sob uso de suplementação antioxidante foram excluídos do estudo. Os marcadores de estresse oxidativo incluíram a avaliação dos produtos reativos ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e a atividade das enzimas superóxido dismutase (Sod) e catalase (Cat). Os danos ao DNA foram quantificados pelo ensaio Cometa. Após a análise seminal padrão as amostras foram divididas em alíquotas, quais sejam: sem a adição de antioxidantes (controle), com 0,1 mM, 1,0 mM, e 10,0 mM de resveratrol e 10,0 mM de ácido ascórbico. Após uma hora de incubação as alíquotas foram criopreservadas em nitrogênio líquido a - 196°C, empregando-se o TEST-Yolk buffer como agente crioprotetor. Paralelamente, foram avaliados, ainda, os parâmetros séricos para TBARS, Sod, Cat e níveis de ácido úrico em homens inférteis e férteis. Os resultados mostraram que o uso de ácido ascórbico e resveratrol não causou nenhuma alteração na concentração e morfologia dos espermatozóides, porém nenhum dos antioxidantes foi capaz de prevenir a diminuição da motilidade induzida pelo processo de criopreservação. A criopreservação induziu uma diminuição na atividade da Sod em indivíduos inférteis e um aumento nos níveis de TBARS nas amostras de homens férteis e inférteis. Observou-se uma correlação negativa entre motilidade espermática e os valores de TBARS em homens inférteis, tanto em amostras pré-congelamento (-0,868, p<0,05) quanto em amostras pós-congelamento (-0,897, p<0,05). A adição de resveratrol às amostras, previamente ao processo de criopreservação, preveniu a diminuição da atividade da Sod em indivíduos inférteis e diminuiu os níveis de TBARS tanto em homens férteis como em inférteis. O ácido ascórbico foi capaz de minimizar os danos oxidativos a lipídios causados pela criopreservação, porém somente em sêmen de homens inférteis. Observou-se ainda que a criopreservação induziu um significativo aumento de danos ao DNA (principalmente dos tipos 2, 3 e 4) em homens férteis e inférteis. A adição de ácido ascórbico ao espermatozóide reduziu os danos ao DNA em homens inférteis, mas não em homens férteis. Por outro lado, o resveratrol foi capaz de reduzir os danos ao DNA tanto em homens férteis como em inférteis. Salienta-se, ainda, que o uso de 10,0mM de resveratrol foi capaz de evitar todos os danos ao DNA induzidos pela criopreservação em homens inférteis. Observou-se, também, que os indivíduos inférteis apresentaram níveis séricos mais elevados de TBARS, ácido úrico e atividade de Sod. Embora outros estudos sejam necessários, os dados apresentados neste trabalho indicam a possibilidade da utilização do resveratrol e ácido ascórbico em procedimentos de criopreservação de sêmen humano, principalmente naqueles onde a motilidade não seja essencial para ocorrer a fecundação como, por exemplo, a ICSI (injeção intracitoplasmática de espermatozóide). / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Cryopreservation of human semen is very important in reproductive medicine, but it may cause damages to the spermatozoa, probably due to the production of reactive oxygen species (ROS), which may cause structural damage to the biomolecules. Resveratrol and ascorbic acid are important antioxidants, however, until now, there are only few studies about its use in cryopreservation process. Therefore, the aim of this study was to analyze the oxidative stress markers and seminal standard parameters before and after the cryopreservation of human semen with and without these antioxidants. Ejaculated semen from 20 infertile men and 10 fertile donors, with proven fertility, were examined. Individuals with azoospermia, leukocytospermia or under antioxidant supplementation were excluded from the study. Oxidative stress markers including the determination of the levels of thiobarbituric acid reactive species (TBARS) and the activity of the antioxidant enzymes superoxide dismutase (Sod) and catalase (Cat). DNA damages were quantified by comet assay. After the evaluation of standard seminal assays, semen samples were divided into 5 aliquots, which were treated as follows: (a) without antioxidants; (b) with 0.1 mM of resveratrol; (c) with 1.0 mM of resveratrol; (d) with 10.0 mM of resveratrol and (e) with 10.0 mM of ascorbic acid. Samples were incubated for 1 hour and, then, they were cryopreserved in liquid nitrogen at -196°C. The TEST-Yolk buffer was used as cryoprotector agent in all the samples. Besides, it was evaluated, also, the seric values of TBARS, Sod, Cat and uric acid both in infertile and fertile men. The results showed that the use of ascorbic acid or resveratrol did not change the concentration and morphology of the spermatozoids. However, none of the antioxidants were able to prevent the decrease in the mobility induced by the cryopreservation process. Cryopreservation causes a decrease in Sod activity in infertile men and an increase of TBARS levels, both in infertile and fertile men. It was observed a negative correlation between spermatozoa motility and TBARS levels in infertile men, both before (-0, 868, p<0,05) and after (-0, 897, p<0,05) the cryopreservation process. Resveratrol was able to avoid the decrease in Sod activity in infertile men and the increase in TBARS levels both in infertile and fertile men samples. Ascorbic acid was able to reduce the oxidative lipid damages induced by cryopreservation only in infertile men. It was also observed that the cryopreservation process induced a significant increase of DNA damages (mainly types 2, 3 and 4) in infertile and fertile men. The addition of ascorbic acid reduces DNA damages only in infertile men. On the other hand, resveratrol was capable to reduce DNA damages both in infertile and fertile men. In fact, the use of 10.0mM of resveratrol was able to avoid all the DNA damages induced by the cryopreservation in infertile men. Infertile men showed high seric levels of TBARS, uric acid and Sod activity than the fertile men. Although other studies are necessary, the data presented in this work suggests the possibility to use resveratrol and ascorbic acid in human cryopreservation procedures, both for fertile and infertile men, at least, for ICSI (Intracytoplasmic Sperm Injection), as it does not need motile sperm for achieving pregnancy.

Os objetivos do estudo foram: (a) relatar os procedimentos no condicionamento dos machos reprodutores no período pré-pubere de criação, averiguando o percentual de montas com sucesso, volume do ejaculado e concentração espermática. (b) Avaliar o efeito da suplementação de vitamina A em machos reprodutores nos parâmetros: volume, motilidade, concentração espermática e alterações morfológicas. A pesquisa foi desenvolvida no Laboratório de Pesquisa em Suínos, da FMVZ-USP, utilizando-se de animais de linhagens híbridas sintéticas, provenientes de uma granja reprodutiva localizada no sudoeste de São Paulo, local este, onde foi realizada a seleção dos animais a partir de 70 dias de idade e com peso médio de 25,16 Kg. Aos 117 dias de idade foi realizada a inspeção dos aprumos, testículos, bolsa prepucial e pênis, sendo selecionados 12 animais, que foram transferidos para o referido laboratório, aos 193 dias de idade, com peso médio de 147,00 Kg. O condicionamento iniciou-se aos 210 dias de idade dos animais, e, após 8 semanas, todos os reprodutores já estavam saltando no manequim, havendo a estabilização das colheitas. A partir deste período os valores das características, volume e concentração tornaram-se estáveis, demonstrando-se a homogeneidade dos animais que serviram para a fase experimental subsequente, relativa à avalição dos efeitos da vitamina A em animais submetidos a suplementação de vitamina A e controle. Nesta segunda fase experimental, foram verificadas diferenças significativas (p< 0,05) quanto à motilidade, concentração espermática quantificada pela câmara de Neubauer e alterações morfológicas, não havendo significância quanto à concentração total e volume do ejaculado. Houve significância (p< 0,05) quanto ao tempo nas 25 colheitas, semanais, quanto a concentração, quantificada na câmara de Neubauer e total, não se evidenciando interação x tratamento. Inferiu-se com o estudo que, dada à condição metabólica diferencial dos animais de genéticas híbridas sintéticas, novas averiguações devem ser direcionada para a relação nutrição x reprodução, devem ser averiguadas, uma vez que, os efeitos positivos da suplementação da vitamina A na espermatogênese foram destacados, principalmente nas características que mais se relacionam com a formação da célula espermática / The objectives of the study were: (a) Report the procedures for the conditioning of boars in the pre pubescent period of the breeding, by checking the percentage of succeed mounts, semen\'s concentration and volume. (b) Evaluate the effect of the vitamin A supplementation in boars, related to the parameters: volume, motility, semen concentration and changes in the morphology of the spermatozoids. The research was developed in the Swine Research Laboratory from the FMVZ, University of São Paulo, Pirassununga campus. In the first phase of the trial, which corresponded to the conditioning of the boars to the semen\'s collection process, 12 boars were utilized. The boars for the experiment came from a breeding swine operation located at the southeast of the SP state and were born from a hybrid synthetic genetic line. They were 70 days old and weighted an average of 25.16 Kg. At 117 days of age the inspection of the legs, testicles, prepuce\'s bag and penis was done. 12 animals among the 24 were selected and, at 193 days of age and weighting an average of 147 kg, they were transferred to the boars\' unit of the referred Laboratory. The conditioning process started at 210 days of age and 8 weeks after all the boars were already mounting on the dummy, which completed the phase of the collections\' stabilization. From this period, the values of the characteristics (volume and concentration) become stable, showing the homogeneity of the animals, which were used in the next experimental phase, related to the evaluation of the vitamin A effects on both treatments (Control and Vitamin A supplementation). In this second experimental phase we found significant differences (p< 0.05) considering motility, semen concentration determined by the Neubauer chamber and changes in the morphology of the spermatozoids, while no significant differences were found considering semen\'s concentration and volume. There was significance (P<0.05) considering time in the 25 collections, weekly collections, concentrations, Neubauer chambers and the total, while the interaction time x movement was not significant. The study lead us to conclude that due to the differential condition of the animals which were born from the present hybrid genetics, it is necessary to study the relationship nutrition x reproduction, once the positive effects of the vitamin A supplementation in the semen production was emphasized, mostly in the characteristics that are related to the formation of the sperm cells.

Orientador: José Antonio Dell'Aqua Junior / Resumo: Entre as vantagens da criopreservação seminal, destacam-se a otimização do uso de garanhões com comprovada superioridade genética, pela possibilidade do armazenamento de sêmen mesmo fora da estação de monta e a quebra das barreiras geográficas, que torna possível a remessa deste material para qualquer parte do mundo. Contudo, o processo de congelação de sêmen causa danos à célula espermática, sendo a peroxidação lipídica e o estresse oxidativo, ocasionada pela produção anormal de espécies reativas de oxigênio (EROs), as principais injúrias. Desta maneira, para se obter uma melhor qualidade seminal após a descongelação, é necessário adicionar aos diluentes seminais elementos que desempenhem função antioxidante, visando conter o aumento dos níveis dos agentes oxidantes. Coenzima Q10 (CoQ10) é um agente lipossolúvel promotor de energia, tendo como principal função transportar prótons e elétrons no processo de síntese de ATP na membrana mitocondrial interna, através da cadeia de transporte de elétrons. Ainda, a CoQ10 atua como um potente antioxidante em diversos sistemas biológicos, tais como, lipoproteínas e membranas, protegendo-os contra a oxidação, inibindo a formação de hidroperóxidos e, consequentemente, prevenindo a peroxidação lipídica. Desta forma, o objetivo deste estudo foi avaliar a ação da coenzima Q10 (CoQ10) no espermatozoide de garanhões resistentes (RC) e sensíveis (SC) a congelação. Cada ejaculado (n=24) foi dividido em nove tratamentos e submetido à congelação,... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Made available in DSpace on 2015-01-26T13:21:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-06-18Bitstream added on 2015-01-26T13:30:36Z : No. of bitstreams: 1 000793038.pdf: 311432 bytes, checksum: 05eabed55effbe08dbab4cd9131bfedb (MD5) / A biotécnica mais utilizada em equinos no Brasil é a inseminação artificial com sêmen refrigerado. Apesar dos avanços, ainda há uma grande variação nos resultados de fertilidade em programas reprodutivos. A carnitina é um composto vitamínico que desempenha um papel importante no metabolismo energético, já que ela garante a produção de energia pelo espermatozoide através do estímulo de vias metabólicas. Além disso, ascarnitinas apresentam potente poder antioxidante, conferindo maior proteção durante o armazenamento.No entanto, sua utilização pós-ejaculação é pouco estudada, já que existem poucos relatos deste tipo de aplicação, sendo nenhum deles em equinos. Devido a isso, este trabalho foi dividido em dois experimentos. O objetivo do experimento 1 foi determinar a concentração ideal l-carnitina (LC) e acetil-l-carnitina (AC) na refrigeração de sêmen equino a 5ºC. No experimento 2, o objetivo foi avaliar os efeitos da melhor dose de LC e AC e sua associação sobre a viabilidade espermática através da citometria de fluxo. No experimento 1 foram utilizados dois ejaculados de 12 garanhões. Após a diluição com Botu-Sêmen® na concentração de 50 x 106 espermatozoides/mL, os ejaculados foram divididos em sete grupos: controle (C), tratado com 5 mmol/L (LC-1), 10 mmol/L (LC-2), 15 mmol/L (LC-3)de LC, tratado com 5 mmol/L (AC-1), 10 mmol/L (AC-2) e 15 mmol/L (AC-3) de AC e após foram refrigerados a 5ºC por 48 horas. Para o experimento 2 foram utilizados os mesmos animais e manipulação dos experimentos anteriores, entretanto, os grupos testados foram: Controle (C), tratado com 10 mmol/L de LC (LC), tratado com 10 mmol/L de AC (AC) e 10 mmol/L de LC + 10 mmol/L AC (LC+AC). A cinética espermática foi avaliada por análise computadorizada do movimento espermático e a integridade de membrana plasmática (IMP) por microscopia de epifluorescência no experimento 1 e 2, entretanto, ... / Over the years, technology for cooling semen has developed. However, despite progress, pregnancy rates are still variable between reproductive programs.Carnitine is a vitamin compound which plays an important role in energy metabolism, since it guarantees the sperm energy production by stimulating metabolic pathways. Furthermore, carnitine has a powerful antioxidant effect, providing greater protection to plasma membrane during storage.However, post-ejaculation use is poorly studied, being none in horses. The aim of experiment 1 was determine optimal concentration of lcarnitine (LC) and acetyl-l-carnitine (AC) in equine semen cooled at 5°C. In experiment 2, the objective was evaluate dose effects between LC, AC and their association on sperm viability by flow citometry. Two ejaculates from 12 stallions were used in both experiments. After dilution with Botu-Semen®to 50 x 106 spermatozoa/ml, each ejaculate was split into seven groups: control (C), treated with 5 mmol/L (LC-1), 10 mmol/L (LC -2), 15 mmol/L (LC-3) of LC, treated with 5 mmol /L (AC-1), 10 mmol/L (AC-2) and 15 mmol/L (AC-3) of ACand then cooled at 5°C for 48 hours. In second experiment, groups were divided in: control (C), treated with 10 mmol /l of LC (LC), treated with 10 mmol /L of AC (AC) and 10 mmol/L of LC + 10 mmol/L of AC (LC+AC).In both experiments,sperm kinetics was evaluated by computerized analysis (CASA) and plasma membrane integrity (IMP) by epifluorescence microscopy.Moreover, in experiment 2 were assessed DNA, ROS and Lipid Peroxidation (PEROX) by flow cytometry.All analysis were performed before cooling (T0), 24 (T24) and 48 hours (T48) after. According to the results of first experiment, LC groups had higher IMP and better values of kinetic than control. Groups treated with AC showed higher results of sperm kinetics after 24 hours of refrigeration and IMP in all analysed times. In second experiment, treated groups were ...