Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / Salmonella spp., principalmente el serotipo Enteritidis, causa serios problemas en la salud humana y animal, tanto en el país como en el mundo, además de grandes costos económicos. En aves, se promueven medidas de control, particularmente la disminución de su colonización. Este trabajo, realizado en pollas Leghorn comerciales experimentalmente infectadas, aplica dos biocontroladores, un probiótico y una mezcla de bacteriófagos nativos específicos contra Salmonella Enteritidis (S.E.), para determinar si los resultados de esta asociación aumentan, mantienen o disminuyen la colonización del patógeno. Complementariamente se determinó si esta asociación produce un cambio del peso en las aves. Se trabajaron cinco grupos de aves comerciales Leghorn de un día de edad cada uno, un grupo que sólo recibió probiótico, un grupo sólo con bacteriófagos y un grupo con probiótico más bacteriófagos. Otros dos grupos correspondieron a controles, sano sin tratamiento, y control de infección que fue inoculado con la misma cepa desafío a los siete días de edad. Las aves de un día de edad recibieron el probiótico vía aerosol en dosis única. La administración de la mezcla de tres bacteriófagos nativos se realizó a los seis días de edad, vía aerosol, con una multiplicidad de infección (MOI) de 103 ufp. Los grupos probiótico, bacteriófagos y probiótico más bacteriófagos, fueron inoculados con la cepa desafío S.E. nalr rifr (2,95 x 105 ufc/mL) a los siete días de edad. A los 14 días de edad se sacrificaron todas las aves, obteniéndose muestras individuales de “pool” de órganos internos (hígado, corazón y bazo) para bacteriología cualitativa y de ambos ciegos para bacteriología cualitativa y cuantitativa. Los resultados de bacteriología cualitativa demostraron que el uso de probiótico disminuyó a 75,7% la incidencia de S. Enteritidis en relación al grupo control de infección (100%); la mezcla de bacteriófagos a 80% y, cuando se utilizaron ambos biocontroladores la incidencia bajó significativamente a 38,7% (P<0,0001). Además, entre los grupos de aves con probiótico y el grupo de aves con probiótico más bacteriófagos se observó una diferencia significativa en la incidencia de P=0,0027. Entre el grupo de aves con bacteriófagos versus el grupo de aves con probiótico más bacteriófagos también hubo diferencia significativa en la incidencia (P=0,0010). Se demostró que si bien las terapias individuales obtuvieron buenos resultados, cuando se administraron ambas, los resultados se potenciaron. Los resultados de bacteriología cuantitativa demostraron que en relación al grupo control de infección, el recuento cecal de S. Enteritidis disminuyó en 1,69 log10 con el uso de ambos biocontroladores. Hubo diferencia significativa entre los grupos control de infección y probiótico más bacteriófagos (P=0,0003). En relación a las diferencias de pesaje observadas en los grupos experimentales, el grupos de aves con probiótico versus el grupo de aves con probiótico más bacteriófagos mostraron diferencia de sólo 1,1 g. de aumento de peso por ave, a favor del primero. Se concluye que tanto la terapia sólo con probiótico como la terapia sólo con bacteriófagos disminuyen efectivamente la colonización de S. Enteritidis y, al utilizar la terapia probiótico asociado a bacteriófagos los resultados se potenciaron. Por esto, el uso en conjunto de ambos biocontroladores sería efectivo como método para disminuir o evitar la colonización de S. Enteritidis en pollas Leghorn comerciales, presentándose como una posible real herramienta para la mejorar la sanidad en la producción avícola / proyecto Fondecyt nº 1060569

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / Las Enfermedades Transmitidas por Alimentos son un problema mundial en aumento. Uno de los agentes causales es Salmonella enterica serovar Enteritidis (SE), serotipo predominante en Chile y asociado a alimentos de origen animal, entre ellos, carne de pescado. Una forma reciente de controlar la presencia de SE en los alimentos, ya en uso internacional, es el biocontrol mediante bacteriófagos. Para poder realizar a futuro estudios ajustados al escenario nacional que permitan evaluar su efecto directamente en alimentos, es primordial contar previamente con protocolos de contaminación experimental de las muestras. Por esto, el presente estudio analizó protocolos de contaminación experimental con SE, en carne de salmón congelada fresca y ahumada, mantenida 10 días a temperatura de refrigeración y ambiente. Las variables analizadas fueron: presentación de los alimentos (molido y laminado) y técnica de contaminación (goteo con y sin homogeneización). En cada protocolo se determinó la menor dosis bacteriana (entre 102 a 106 UFC/mL) que lograra ≥ 80% de muestras contaminadas. Además, se evaluó la eficiencia de Piruvato de Sodio en la recuperación de SE en estas carnes contaminadas y refrigeradas. Las menores dosis que lograron ≥ 80% de muestras contaminadas fueron de 102 UFC/mL para todos los protocolos independiente de la temperatura, excepto salmón fresco molido sin homogeneizar refrigerado, cuya dosis fue 103 UFC/mL. Los cuatro protocolos comparados por cada matriz no presentaron diferencias estadísticas (p>0,05) en la bacteriología cualitativa (detección) y cuantitativa (recuentos). La adición de Piruvato de Sodio no generó diferencias estadísticamente significativas (p>0,05) en la recuperación de SE / Proyecto Fondecyt N° 1110038

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / Las Enfermedades Transmitidas por Alimentos representan un problema de salud pública creciente, siendo Salmonella spp. el patógeno más frecuentemente aislado en los brotes. En Chile, la mayor prevalencia la registra Salmonella Enteritidis (SE), aislado principalmente desde productos de origen animal como carnes de diferentes especies. En este trabajo se implementaron protocolos de contaminación experimental con SE en alimentos cárneos crudos de riesgo, como un paso previo para la investigación del uso de bacteriófagos líticos en la disminución de la carga bacteriana en estos alimentos. Se implementaron cuatro diferentes protocolos de contaminación experimental con SE en productos cárnicos crudos considerados como riesgosos: pollo, pavo, cerdo y bovino. Se determinó la menor dosis de inóculo bacteriano (102 hasta 106 UFC/mL), forma de aplicación del inóculo (goteo con/sin homogeneización) y forma de presentación de las carnes (molido y laminado) con las cuales se logró porcentajes ≥ 80% de contaminación de las muestras, mantenidas por 10 días a temperatura ambiente y de refrigeración. Además, se estudió la eficiencia del Piruvato de Sodio adicionado a los medios de cultivo en los recuentos de SE en las muestras contaminadas y almacenadas a temperatura de refrigeración. En la mayoría de los protocolos analizados se obtuvo elevados porcentajes de muestras contaminadas con bajas dosis de SE (102 UFC/mL y 103 UFC/mL) tanto a temperatura ambiente como en refrigeración, obteniendo recuentos similares entre protocolos. La adición de Piruvato de Sodio no produjo recuentos significativamente mayores (p > 0,05) que aquellos obtenidos sin la adición del suplemento / Proyecto FONDECYT 1110038

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / En Chile y el mundo, el aumento de la prevalencia de Salmonella enterica serotipo Enteritidis en enfermedades transmitidas por alimentos (ETAs), ha generado gran preocupación sanitaria y económica. La principal fuente de infección para el ser humano es el consumo de productos avícolas, aunque también se ha sugerido el rol de aves silvestres en la transmisión directa del agente, hacia personas y aves comerciales. El objetivo de este trabajo, fue determinar la diversidad fenotípica ligada a virulencia de cepas de S. Enteritidis, aislada desde aves comerciales, aves acuáticas y seres humanos en Chile y observar su asociación a estos hospederos. Los fenotipos de virulencia testeados in vitro fueron la supervivencia en acidez (pH3), en estrés oxidativo (H2O2/NaNO2) y hambruna. Bajo acidez, se observó diferencias significativas (p≤ 0,05) entre cepas a los 30min de ensayo. En estrés oxidativo (H2O2/NaNO2), se determinó diferencias (p≤ 0,05) entre cepas a los 30min y 3h respectivamente. Finalmente, bajo hambruna se observó diferencias (p≤ 0,05) entre cepas y entre hospederos en todos los días de medición (días 10, 20, 30 y 40). En conclusión, existe diversidad fenotípica ligada a virulencia entre cepas de S. Enteritidis y en el caso de hambruna, se evidenció que la diversidad también se asocia al hospedero de origen, lo que sugiere procesos de adaptación de la bacteria a condiciones específicas frente a la falta de nutrientes en cada uno de ellos o en el ambiente en que viven / Proyecto FONDECYT DE INICIACIÓN 11110398

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Las enfermedades transmitidas por los alimentos, son un importante problema de salud pública a nivel mundial, donde los agentes biológicos juegan un rol trascendental en su transmisión. Frente a esto, en los últimos años se han utilizado diversas tecnologías de naturaleza biológica, como los bacteriófagos, para controlar en forma efectiva Salmonella sp. en los alimentos. El objetivo de este estudio fue establecer la capacidad biocontroladora de una mezcla de fagos líticos nativos en la reducción de los recuentos de Salmonella Enteritidis (SE), en dos matrices alimentarias consideradas de riesgo como son salmón fresco congelado y salmón ahumado. Para llevar a cabo el objetivo se trabajó con dos grupos de 25 muestras cada uno: el grupo experimental se contaminó con SE y recibió la mezcla de fagos (MOI 104), mientras que el grupo control sólo se contaminó con la cepa desafío. La dosis de contaminación varió según la temperatura de incubación de las muestras. Una vez contaminado y aplicada la mezcla de fagos, las muestras se incubaron por 10 días a temperatura ambiente y a temperatura de refrigeración para luego realizarles recuento bacteriano. Al final del periodo del estudio se observó que la aplicación de la mezcla de fagos redujo (p < 0,0001), los recuentos de SE en ambas matrices alimentarias independiente de la temperatura de incubación, obteniéndose mayores reducciones en aquellas muestras mantenidas a temperatura ambiente (3,19 unidades logarítmicas de SE/g para salmón fresco congelado y 1,96 unidades logarítmicas de SE/g para salmón ahumado). Los resultados obtenidos en este estudio sugieren que la mezcla de fagos nativos es efectiva en la reducción de SE en carne de salmón ahumado y fresco congelado a temperatura ambiente y de refrigeración durante 10 días / Financiamiento: Proyecto Fondecyt 1110038

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / En el mundo, uno de los patógenos más frecuentemente aislado desde brotes causados por Enfermedades Transmitidas por los Alimentos es Salmonella spp. En Chile, el serotipo que posee la mayor prevalencia es Salmonella Enteritidis (S.E), aislado principalmente desde productos de origen animal como la carne de ave y otros productos cárnicos como las cecinas. Considerando que las medidas para controlar S.E en alimentos son de vital importancia, en este estudio se implementaron cuatro protocolos de inoculación experimental en cecinas, con el fin de disponer previamente de una herramienta fundamental que permita a futuro analizar nuevas tecnologías tendientes a disminuir este patógeno en los alimentos. Así, en este estudio se presentan los resultados de la inoculación experimental con S.E mediante cuatro protocolos en distintos tipos de cecinas, determinando tanto la dosis mínima (102 – 106 UFC/mL) y la mejor técnica de aplicación del inóculo (con homogeneización/sin homogeneización), como la forma de presentación de las matrices (laminado/molido) para lograr porcentajes de positividad a S.E ≥ 80%, tanto a temperatura ambiente como en refrigeración. Adicionalmente se estudia la eficiencia de la adición de Piruvato de Sodio en los medios de cultivo para la recuperación de S.E en cecinas contaminadas y almacenadas a temperatura de refrigeración. En las cecinas contaminadas se obtuvieron porcentajes de positividad ≥ 80% con la mayoría de los protocolos analizados y con bajas dosis de S.E (102 – 103 UFC/mL). La adición de Piruvato de Sodio no entregó diferencias estadísticamente significativas (p > 0,05) al compararlo con medios de cultivo sin suplemento / Proyecto FONDECYT 1110038

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La Salmonelosis es una de las enfermedades transmitidas por alimentos más importantes a nivel mundial. Ocasiona un cuadro gastroentérico y en casos extremos puede ser mortal. En Chile, el serotipo más frecuente es Salmonella Enteritidis, el cual está asociado al consumo de ovo productos, platos preparados, vegetales y carnes, entre ellas la de bovino. El biocontrol de Salmonella spp. en alimentos mediante el uso de bacteriófagos, es una medida complementaria a los métodos de prevención y control utilizados actualmente. En la presente investigación se analizó la actividad lítica de una mezcla de cinco bacteriófagos nativos sobre S. Enteritidis, en carne fresca de bovino contaminada experimentalmente, luego de diez días de almacenamiento. Se utilizaron dosis de contaminación de 103 UFC/mL y de 105 UFC/mL para temperatura ambiente (18 °C) y de refrigeración (2 a 8 °C) respectivamente, aplicando la mezcla de fagos con una MOI de 104. Se logró contaminar la totalidad de las muestras en todos los grupos experimentales. La administración de la mezcla de bacteriófagos logró reducir significativamente (p≤ 0,0001) los recuentos bacterianos promedios en 3,65 log UFC/g (5,29 log UFC/g grupo control versus 1,64 log UFC/g grupo experimental) a temperatura ambiente, y en 3,54 log UFC/g (4,42 log UFC/g grupo control versus 0,88 log UFC/g grupo experimental) a temperatura de refrigeración. Las reducciones bacterianas obtenidas demuestran el efecto lítico de la mezcla de fagos aplicada, sobre S. Enteritidis, en carne fresca de bovino contaminada / Financiamiento: Proyecto Fondecyt No. 1110038

Salmonella é um dos principais agentes de Doenças Transmitidas por Alimentos (DTA) em todo o mundo. No Rio Grande do Sul, uma cepa de Salmonella Enteritidis vem sendo identificada como o principal agente causador de DTA na última década, a qual foi nominada SE86. Quando comparada com outros sorovares de Salmonella, a SE86 demonstrou maior capacidade de adaptação ácida e térmica, além de maior resistência contra diferentes sanificantes. O presente estudo teve como objetivo investigar o envolvimento dos genes rpoS e dps na resistência ao hipoclorito de sódio e do gene ompR na adaptação ácida e resistência térmica da cepa S. Enteritidis SE86. Os genes avaliados foram atenuados pela técnica de Knockout e a expressão dos mesmos foi investigada pela técnica Epitope Tagging - 3 x FLAG. Os resultados demonstraram que a cepa mutante SE86, sem a presença do gene dps ( dps), demonstrou uma maior sensibilidade em relação à cepa SE86 Wild Type (WT), após a exposição ao hipoclorito de sódio a 200 ppm. As proteínas Rpos e Dps foram ativamente expressas nas mesmas condições de exposição ao hipoclorito de sódio, demonstrando assim a relação destes genes com o estresse oxidativo provocado por hipoclorito de sódio na SE86. O envolvimento do gene ompR na resistência térmica foi investigado após a adaptação ácida de SE86 WT e do mutante ompR. As células ácido adaptadas do mutante ompR foram completamente inativadas após 240 minutos de exposição a temperatura de 52º C, enquanto que as células WT resistiram até 300 minutos de exposição. A expressão da proteína OmpR foi observada por Western blotting e confirmou a relação da adaptação ácida com a maior resistência térmica da SE86. / Salmonella is one of the main agents of foodborne diseases worldwide. In Rio Grande do Sul, a clone of Salmonella Enteritidis has been identified as the main cause of foodborne diseases in the last decade, which was named SE86. The the present study aimed to investigate the involvement of rpoS and dps genes in resistance to sodium hypochlorite and ompR gene in acid adaptation and thermal resistance of the strain S. Enteritidis SE86. The genes evaluated were attenuated by knockout technique and their expression was determined by tagged (3XFLAG) strains. The results demonstrated that strain S. Enteritidis SE86 without the presence of dps gene ( dps) showed a higher sensitivity to the wild type strain SE86 (WT) when exposed to sodium hypochlorite at 200 ppm. Furthermore, RpoS and Dps proteins were actively expressed in these experimental conditions, thus demonstrating the relationship of these genes with oxidative stress in S. Enteritidis SE86 caused by sodium hypochlorite. The involvement of ompR gene in thermal resistance was observed after the acid adaptation of S. Enteritidis SE86 WT and ompR since cells adapted acid without the presence of ompR have been completely inactivated when exposed to 240 min at temperature of 52 °C, while WT cells resisted until 300 min of exposure. The expression of the OmpR protein by western blotting confirmed the necessity of the acid adaptation for that S. Enteritidis SE86 resists to high temperatures.

Orientador: Angelo Berchieri Junior / Coorientador: Oliveiro Caetano de Freitas Neto / Banca: Marcelo Brocchi / Banca: Jacqueline Boldrin de Paiva / Banca: Rosemeri de Oliveira Vasconcelos / Banca: Karin Werther / Resumo: Salmonella Enteritidis (SE) é responsável pela maioria dos casos de infecções alimentares em seres humanos e, geralmente, está associada ao consumo de produtos de origem avícola. Nas aves, SE coloniza o intestino, podendo sobreviver utilizando como substrato o 1,2 propanodiol (1,2-Pd) disponível neste ambiente, cujo metabolismo é viabilizado pela ação da enzima propanodiol desidratase, codificada por genes do operon pdu. A enzima propanodiol desidratase necessita de cianocobalamina como cofator enzimático, a qual é codificada pelos genes cobS e cbiA. Neste estudo, utilizou-se uma estirpe de SE e duas mutantes, sendo uma com os genes pduC, pduD, pduE defectivos (SE ΔpduCDE) e outra com os genes pduC, pduD, pduE, cobS e cbiA (SE ΔcobSΔcbiAΔpduCDE) inativados, na tentativa de avaliar a importância do 1,2-Pd para a colonização intestinal e invasão de órgãos durante a infecção de aves por SE. No primeiro experimento, estimou-se as quantidades das estirpes em baço, fígado e conteúdo cecal de aves de postura de variedades vermelha e branca. Um segundo ensaio foi realizado para verificação da excreção fecal, por meio de suabes cloacais. Aliado a isso, caracterizou-se a resposta imunológica em aves SPF desafiadas com estirpes de SE acima descritas por meio da avaliação das populações de linfócitos T CD4+ e TCD8+ em fígado e tonsilas cecais e também pela quantificação de genes responsáveis pela expressão das citocinas IL-6, CCL4, CXCLi2 e IL-22 em tonsilas cecais e IL-6 e IL-18 em baço. Observou-se que as estirpes mutantes foram capazes de colonizar o intestino e invadir o baço e fígado da mesma forma que a estirpe selvagem, sendo que as aves de postura de variedade vermelha foram mais susceptíveis a infecção sistêmica. Tanto a estirpe selvagem como as mutantes estimularam o mesmo perfil de resposta imune nas aves SPF. Portanto, os genes pduC, pduD, pduE, cobS e cbiA não são necessários para... / Abstract: Salmonella Enteritidis (SE) is responsible for majority of the cases of foodborne diseases in humans and usually is associated with the consumption of poultry origin products. In birds, SE colonizes the intestine and can survive using 1,2 propanodiol (1,2-Pd) as substrate. The metabolisation of the 1,2-Pd is possible by the action of propanodiol dehydratase enzyme, encoded by genes pdu operon. Cyanocobalamin, which is encoded by genes cobS and cbiA, is the cofactor required by propanodiol dehydratase. In this study, we used one SE wild type strain and two mutants, one with mutations in pduC, pduD and pduE genes (SE ΔpduCDE) and another with mutations of pduC, pduD, pduE, cobS and cbiA genes (ΔcobSΔcbiAΔpduCDE) in attempt to evaluate the importance of 1,2-Pd for intestinal colonization and invasion of organs during infection of birds. In the first experiment, bacterial counts for all strains were obtained from spleen, liver and cecal content of white and brown varieties of commercial egg-layers. In the second assay, faecal shedding of the strains was assessed by cloacal swabs. Additionaly, immunological responses were characterised by the assessment of T CD4+ and T CD8+ cell populations in liver and cecal tonsils from SPF (Specific Pathogen Free) chicks challenged with the three strains. Complementary transcripts of genes encoding the cytokines IL-6, CCL4, CXCLi2 and IL-22 in cecal tonsils, and IL-6 and IL-18 in liver were obtained for relative quantification by qRT-PCR. It was observed that SE mutant strains were able to colonise the intestine and invade spleen and liver in the same way as the wild type strain. Brown variety of birds was more susceptible to systemic infection than white birds. Furthermore, the immune response profiles triggered by the SE wild type and the two mutants in SPF chicks were very similar. Therefore, data for the present study suggest that pduC, pduD, pduE, cobS e cbiA genes would not be essencial to ... / Doutor

Salmonella is a common enteric pathogen and is the most frequently reported bacterial infection in the United States. The two most commonly reported serotypes causing human illness in the United States are Salmonella serotype Typhimurium and Salmonella serotype Enteritidis (SE). The incidence and number of foodborne outbreaks of SE started to increase in the 1970s and by 1994, SE was the most common Salmonella serotype reported to the Centers for Disease Control and Prevention (CDC). SE has been most commonly associated with consumption of shell eggs. Outbreak reports were obtained from the Foodborne Disease Outbreak Surveillance System (FDOSS) and analyzed. The number of outbreaks of SE has declined by 67% since 1990, likely as a result of the combined effect of on-farm interventions, public health policies, and food safety education messages. In addition to the decline in SE outbreaks, study findings demonstrate that there have been changes in the geographical distribution of SE outbreaks in the US. “Simple egg” foods and retail food settings have been the most commonly and consistently associated vehicles and food consumption and preparation settings with SE outbreaks in the US from 1973 to 2008.