In Legehennenbeständen wurde die Schutzwirkung von vier Impfprogrammen, die der Zentralverband der Deutschen Geflügelwirtschaft e.V. empfiehlt und einer Impfung nach der Hühner-Salmonellen-Verordnung untersucht. Unterschiede in den Impfschemata konnten unter den gewählten Versuchsbedingungen nicht festgestellt werden. Eine Impfung gegen Salmonellen garantiert keine vollständige Elimination des Erregers, sondern eine Reduktion der Besiedelung der Organe sowie der Ausscheidung und der Eikontamination. Auch eine zusätzliche Impfung mit Inaktivatimpfstoffen erbrachte keinen effektiveren Schutz vor Salmonella Enteritidis und Salmonella Thyphimurium. Die Schutzwirkung einer Impfung ist am besten, wenn die Salmonellen-Exposition gering ist.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Methoden und Strategien zu entwickeln, die auf der Ebene Primärproduktion Schwachstellen im Bezug auf das Vorkommen von Salmonellen beim Schwein schon möglichst vor der Schlachtung aufdecken, um gezielte Maßnahmen zur Verhinderung der Einschleppung und Verbreitung sowie zur Bekämpfung von Salmonellen im Schweinebestand zu ergreifen. Die Notwendigkeit dazu ergibt sich daraus, dass eine Salmonellen-Infektion im Schweinebestand in den meisten Fällen nicht mit krankheitsbedingten Symptomen verbunden ist, was dazu führt, dass diese Keime in der Herde meist unerkannt bleiben und mit infizierten Schweinen sowie Ferkeln von Betrieb zu Betrieb gelangen (BFR 2009a). Solche Tiere stellen bekanntlich auch die Ursache eines möglichen Eintrages in die Lebensmittelkette dar (PIOTOWSKI 2008). Die Ergebnisse einer EU-weiten Studie zu Salmonellen in Haltungsbetrieben mit Zuchtschweinen zeigten, dass in den meisten EU Mitgliedsstaaten diese Erreger anzutreffen sind und in allen Mitgliedsstaaten mit intensiver Schweineproduktion nachgewiesen werden konnten (EFSA 2009). Die Studie wurde nach einem von der EU vorgegebenem Studienplan zwischen dem 01. Januar und 31. Dezember 2008 durchgeführt. Dabei wurden in jedem Mitgliedsstaat mindestens 80% der Zuchtschweine erfasst und die Untersuchungen in Betrieben mit mindestens 50 Zuchtschweinen durchgeführt (HARTUNG 2010). Die Ergebnisse der Untersuchungen in der Bundesrepublik Deutschland zur EU-weiten Grundlagenstudie machten deutlich, dass von 2010 untersuchten Kotproben aus 201 Schweinebeständen 125 Proben (6,2%) positiv auf Salmonellen getestet wurden. Als positiv für Salmonella spp. erwiesen sich 45 Schweinebestände (22,4%). In diesen Betrieben waren in den meisten Fällen nur eine (15 Betriebe) bis zwei (elf Betriebe) von zehn untersuchten Kotproben positiv, was darauf hindeutet, dass nur wenige Tiere in den betroffenen Beständen Salmonellen ausscheiden (HARTUNG 2010). Mit der seit März 2007 geltenden „Verordnung zur Verminderung der Salmonellenverbreitung durch Schlachtschweine“ (Schweine-Salmonellen-Verordnung), wurde die europäische Verordnung zur Zoonosenbekämpfung VO EG 2160/2003 im Hinblick auf die Salmonellenproblematik bei Mastschweinen in Deutschland umgesetzt. Die mit dieser Verordnung ermittelten serologischen Befunde haben einen retrospektiven Charakter und erreichen den Schweinezüchter meist Wochen nach der Schlachtung. Daher können diese Befunde keinen Hinweis über die aktuelle Salmonellen-Situation im Schweinebestand geben. Ziel der Untersuchungen nach der SSV (Schweine-Salmonellen-Verordnung) ist nicht die Identifikation Salmonellen-infizierter Einzeltiere sondern, die Kategorisierung der Schweinemastbetriebe, um Schlachttiere aus Salmonellenbelasteten Betrieben gesondert dem Schlachtprozess zu unterziehen, die zur Kontrolle des Erfolgs eines Hygienemanagements auf Herdenbasis mittels der zugelassenen serologischen Tests erfolgen. Für die Untersuchung von Einzeltieren sind diese Tests aufgrund ihrer Konzeption nicht geeignet (RÖSLER 2006). Es fällt dem Inhaber eines Endmastbetriebes meist schwer die Schwachstellen im eigenen Schweinemastbetrieb aufzudecken und diese zu beheben. Schließlich wird in diesem Zusammenhang mit dem erwähnten serologischen Vorgehen eine größere Bedeutung dem Monitoring von Salmonellen im Bestand beigemessen, als der Prävalenz und das schnelle Erkennen von Veränderungen. Zur Prävention des Eintrages von Salmonellen in die Nahrungskette fehlen gezielte Methoden und Strategien, welche zeitnah dem Landwirt einen Hinweis über die aktuelle Situation im Schweinebestand geben können. Ein wirkungsvolles Vorgehen zur Verhinderung des Eintrages von Salmonellen in die Nahrungskette („Food Chain“) ist somit nur bei weitgehender Einbindung der Primärproduktion in das Vorgehen möglich, dazu muss aber der landwirtschaftliche Betrieb wissen welche Maßnahmen zur Eigenkontrolle er sinnvoller Weise bei einem vertretbaren Kostenansatz durchführen kann. Um dies zu ermöglichen, musste zuerst eine Analyse der Schwachstellen und die Identifizierung von effektiven Probenahmestellen in ausgewählten, unterschiedlich konzipierten Betrieben erfolgen. Gleichzeitig musste eine Nachweismethode entwickelt werden, die mit einer begrenzten Menge Probenmaterial von verschiedenen Probenahmeorten im Betrieb einen weitgehend sicheren und empfindlichen Salmonellennachweis ermöglicht. Dies geschah in zwei Schritten, zuerst in Langzeituntersuchungen ausgewählter Betriebe, gefolgt von einem zweiten Schritt zur Verizifierung der aus diesen Untersuchungen resultierenden Beprobungsstrategie. Zunächst wurden in sogenannten Langzeituntersuchungen verschiedene Probenpunkte mit fünf standardisierten Nachweisverfahren auf vier verschiedenen Schweinemastbetrieben vergleichend untersucht. Mit den Ergebnissen wurde die effektivste Nachweismethode sowie die aus praktischer Sicht anwendbaren Probennahmepunkte ermittelt. Mit den sich anschließenden sogenannten Querschnittsuntersuchungen konnten die ermittelten Probennahmepunkte und Nachweismethoden auf acht zufällig ausgewählten Schweinebetrieben angewandt und bestätigt werden.

Weltweit zählt die Salmonellose zu den am häufigsten vorkommenden Zoonosen und auch in Deutschland kommt ihr zunehmend eine sozialökonomische Bedeutung zu. Dabei stellen die maßgeblichen Übertragungs- und Infektionsquellen kontaminiertes Wasser und kontaminierte Lebensmittel dar, bei denen schätzungsweise 20 % auf kontaminiertes Schweinefleisch zurückzuführen sind. Dies verdeutlicht die Notwendigkeit einer Salmonellenbekämpfung. In den dafür geschaffenen gesetzlichen Grundlagen spielt vor allen Dingen der serologische Nachweis einer Salmonelleninfektion eine entscheidende Rolle. Dafür existieren derzeit in Deutschland vier nach § 17c des TSeuchG zugelassene ELISA-Testsysteme. Ziel der vorliegenden Arbeit war eine vergleichende Evaluierung dieser ELISA-Testsysteme zur serologischen Diagnostik von S. Infantis beim Schwein. Um die Tests zu evaluieren, wurden 19 Läuferschweine intragastral mit S. Infantis infiziert und über einen Untersuchungszeitraum von 123 Tagen serologisch mit allen vier ELISAs untersucht. Dabei erfolgte zeitgleich eine bakteriologische Untersuchung. Obwohl S. Infantis zu den schwach virulenten Erregern zählt, zeigten alle Probanden eine deutliche Klinik, die sich überwiegend in mittelgradiger Diarrhoe äußerte. Durch die bakteriologische Untersuchung wurde offenbar, dass alle Schweine bis zum Ende des Versuchszeitraumes eine intermittierende Ausscheidung von S. Infanits zeigten. Ebenso war bei allen Tiere eine Serokonversion nachweisbar, welche sich bei den angewandten Tests jedoch in deutlicher Diskrepanz der Testsensitivitäten äußerte. Zum Beispiel ergab die ermittelte Testsensitivität des Enterisol® Salmonellen-Diagnostikum™ am 53. Tag mittels vorgeschriebenen Cutoff-Wertes nach Schweine-Salmonellen-Verordnung eine Sensitivität von 20%, während diese bei dem isotypspezifischen Salmotype® Pig STM-WCE™ ELISA bei 93,3% lag. Während der Salmotype® PigScreen™ immerhin eine Sensitivität von 6,7% zeigte, erwies sich der HerdChek® Swine Salmonella™ an diesem Tag als nicht sensitiv. In der gesamten Untersuchung konnte nachgewiesen werden, dass sich der isotypspezifische Salmotype® Pig STM-WCE™ ELISA zur serologischen Diagnostik von S. Infantis am besten eignete, während die drei LPS-ELISA erst sehr spät positiv reagierten. Die Sensitivitätsverluste erwiesen sich als besonders stark, wenn die Auswertung der optischen Dichte durch den nach Schweine-Salmonellen-Verordnung angewandten Cutoff-Wert von 40 OD% erfolgte. Des Weiteren wurde deutlich, dass die Ergebnisse der Fleischsaftuntersuchung nicht immer mit denen des Endserums korrelierten. Insgesamt ist der Einsatz des Cutoff-Wertes von 40 OD% als kritisch zu betrachten und es stellt sich die Frage, ob es im Sinne des Verbraucherschutzes, nicht günstiger wäre, den Cutoff-Wert auf 20 oder 10 OD % herabzusetzen, wie dies inzwischen auch in Dänemark mit Erfolg durchgeführt wurde. Abschließend ist feststellbar, dass sich die Diagnostik von S. Infantis beim Schwein mit den vorgeschriebenen Testsystemen als schwierig erweist, da teilweise geringe Sensitivitäten vorlagen.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Methoden und Strategien zu entwickeln, die auf der Ebene Primärproduktion Schwachstellen im Bezug auf das Vorkommen von Salmonellen beim Schwein schon möglichst vor der Schlachtung aufdecken, um gezielte Maßnahmen zur Verhinderung der Einschleppung und Verbreitung sowie zur Bekämpfung von Salmonellen im Schweinebestand zu ergreifen. Die Notwendigkeit dazu ergibt sich daraus, dass eine Salmonellen-Infektion im Schweinebestand in den meisten Fällen nicht mit krankheitsbedingten Symptomen verbunden ist, was dazu führt, dass diese Keime in der Herde meist unerkannt bleiben und mit infizierten Schweinen sowie Ferkeln von Betrieb zu Betrieb gelangen (BFR 2009a). Solche Tiere stellen bekanntlich auch die Ursache eines möglichen Eintrages in die Lebensmittelkette dar (PIOTOWSKI 2008). Die Ergebnisse einer EU-weiten Studie zu Salmonellen in Haltungsbetrieben mit Zuchtschweinen zeigten, dass in den meisten EU Mitgliedsstaaten diese Erreger anzutreffen sind und in allen Mitgliedsstaaten mit intensiver Schweineproduktion nachgewiesen werden konnten (EFSA 2009). Die Studie wurde nach einem von der EU vorgegebenem Studienplan zwischen dem 01. Januar und 31. Dezember 2008 durchgeführt. Dabei wurden in jedem Mitgliedsstaat mindestens 80% der Zuchtschweine erfasst und die Untersuchungen in Betrieben mit mindestens 50 Zuchtschweinen durchgeführt (HARTUNG 2010). Die Ergebnisse der Untersuchungen in der Bundesrepublik Deutschland zur EU-weiten Grundlagenstudie machten deutlich, dass von 2010 untersuchten Kotproben aus 201 Schweinebeständen 125 Proben (6,2%) positiv auf Salmonellen getestet wurden. Als positiv für Salmonella spp. erwiesen sich 45 Schweinebestände (22,4%). In diesen Betrieben waren in den meisten Fällen nur eine (15 Betriebe) bis zwei (elf Betriebe) von zehn untersuchten Kotproben positiv, was darauf hindeutet, dass nur wenige Tiere in den betroffenen Beständen Salmonellen ausscheiden (HARTUNG 2010). Mit der seit März 2007 geltenden „Verordnung zur Verminderung der Salmonellenverbreitung durch Schlachtschweine“ (Schweine-Salmonellen-Verordnung), wurde die europäische Verordnung zur Zoonosenbekämpfung VO EG 2160/2003 im Hinblick auf die Salmonellenproblematik bei Mastschweinen in Deutschland umgesetzt. Die mit dieser Verordnung ermittelten serologischen Befunde haben einen retrospektiven Charakter und erreichen den Schweinezüchter meist Wochen nach der Schlachtung. Daher können diese Befunde keinen Hinweis über die aktuelle Salmonellen-Situation im Schweinebestand geben. Ziel der Untersuchungen nach der SSV (Schweine-Salmonellen-Verordnung) ist nicht die Identifikation Salmonellen-infizierter Einzeltiere sondern, die Kategorisierung der Schweinemastbetriebe, um Schlachttiere aus Salmonellenbelasteten Betrieben gesondert dem Schlachtprozess zu unterziehen, die zur Kontrolle des Erfolgs eines Hygienemanagements auf Herdenbasis mittels der zugelassenen serologischen Tests erfolgen. Für die Untersuchung von Einzeltieren sind diese Tests aufgrund ihrer Konzeption nicht geeignet (RÖSLER 2006). Es fällt dem Inhaber eines Endmastbetriebes meist schwer die Schwachstellen im eigenen Schweinemastbetrieb aufzudecken und diese zu beheben. Schließlich wird in diesem Zusammenhang mit dem erwähnten serologischen Vorgehen eine größere Bedeutung dem Monitoring von Salmonellen im Bestand beigemessen, als der Prävalenz und das schnelle Erkennen von Veränderungen. Zur Prävention des Eintrages von Salmonellen in die Nahrungskette fehlen gezielte Methoden und Strategien, welche zeitnah dem Landwirt einen Hinweis über die aktuelle Situation im Schweinebestand geben können. Ein wirkungsvolles Vorgehen zur Verhinderung des Eintrages von Salmonellen in die Nahrungskette („Food Chain“) ist somit nur bei weitgehender Einbindung der Primärproduktion in das Vorgehen möglich, dazu muss aber der landwirtschaftliche Betrieb wissen welche Maßnahmen zur Eigenkontrolle er sinnvoller Weise bei einem vertretbaren Kostenansatz durchführen kann. Um dies zu ermöglichen, musste zuerst eine Analyse der Schwachstellen und die Identifizierung von effektiven Probenahmestellen in ausgewählten, unterschiedlich konzipierten Betrieben erfolgen. Gleichzeitig musste eine Nachweismethode entwickelt werden, die mit einer begrenzten Menge Probenmaterial von verschiedenen Probenahmeorten im Betrieb einen weitgehend sicheren und empfindlichen Salmonellennachweis ermöglicht. Dies geschah in zwei Schritten, zuerst in Langzeituntersuchungen ausgewählter Betriebe, gefolgt von einem zweiten Schritt zur Verizifierung der aus diesen Untersuchungen resultierenden Beprobungsstrategie. Zunächst wurden in sogenannten Langzeituntersuchungen verschiedene Probenpunkte mit fünf standardisierten Nachweisverfahren auf vier verschiedenen Schweinemastbetrieben vergleichend untersucht. Mit den Ergebnissen wurde die effektivste Nachweismethode sowie die aus praktischer Sicht anwendbaren Probennahmepunkte ermittelt. Mit den sich anschließenden sogenannten Querschnittsuntersuchungen konnten die ermittelten Probennahmepunkte und Nachweismethoden auf acht zufällig ausgewählten Schweinebetrieben angewandt und bestätigt werden.

In Legehennenbeständen wurde die Schutzwirkung von vier Impfprogrammen, die der Zentralverband der Deutschen Geflügelwirtschaft e.V. empfiehlt und einer Impfung nach der Hühner-Salmonellen-Verordnung untersucht. Unterschiede in den Impfschemata konnten unter den gewählten Versuchsbedingungen nicht festgestellt werden. Eine Impfung gegen Salmonellen garantiert keine vollständige Elimination des Erregers, sondern eine Reduktion der Besiedelung der Organe sowie der Ausscheidung und der Eikontamination. Auch eine zusätzliche Impfung mit Inaktivatimpfstoffen erbrachte keinen effektiveren Schutz vor Salmonella Enteritidis und Salmonella Thyphimurium. Die Schutzwirkung einer Impfung ist am besten, wenn die Salmonellen-Exposition gering ist.

Die orale Aufnahme von Salmonellen stellt den natürlichen Infektionsweg für Mensch und Tier dar. Gelingt es den Salmonellen vom Darmlumen über das Darmepithel in den Organismus zu gelangen, können sie eine systemische Infektion hervorrufen (Septikämie, Typhus). Die Darmwand stellt die entscheidende Barriere dar, deren Abwehrfunktion bei Salmonelleninfektion im Rahmen dieser Arbeit charakterisiert werden sollte. Die Peyerschen Platten (PP), die in die Darmwand eingelagert sind und an den Bereich der M-Zellen angrenzen, stellen Lymphfollikel dar. In dem Grenzbereich zwischen M-Zellen und PP befinden sich viele Makrophagen und Dendritische Zellen. Diese Zellen sind als „antigen-presenting cells“ (APCs) besonders gut in der Lage, transloziertes Antigen aufzunehmen, es zu prozessieren und in Verbindung mit MHC-Komplexen auf ihrer Oberfläche zu präsentieren, um Effektorzellen des Immunsystems zu aktivieren. Es wurden Nachweismethoden für Salmonellenantigen und Salmonellen etabliert. Mit Hilfe eines spezifischen Antiserums konnte Salmonellenantigen über immunhistochemische und durchflusszytometrische Methoden nachgewiesen werden. Lebende Salmonellen wurden über die Ausplattierung auf XLD-Agarplatten detektiert. Isolierte Einzelzellen aus den PP wurden über Dichtegradientenzentrifugation in die Fraktion der phagozytierenden Zellen und in die Fraktion der B- und T-Zellen separiert und analysiert. Nach In-vitro-Infektion isolierter Dendritischer Zellen konnten über elektronen-mikroskopische Analyse Salmonellen in den Dendritischen Zellen nachgewiesen werden. 12 Stunden nach oraler Infektion der BALB/c-WT-Mäuse wurden über Ausplattierung Salmonellen in der Fraktion der phagozytierenden Zellen sowie der B-und T-Zellen der PP nachgewiesen. Der Anteil der infizierten Zellen war jedoch sehr niedrig. 4 Stunden nach oraler Infektion der Mäuse war ein ebenso großer Anteil der Salmonellen in den PP intrazellulär wie extrazellulär vorhanden. Salmonellenantigentragende Zellen wurden mit Hilfe der Durchflusszytometrie erfasst. So zeigte sich, dass bereits vier Stunden nach oraler Infektion ca. 0,09 % bis zu 0,61 % der Zellen aus Milz und den PP mit Salmonellenantigen beladen waren. Dies ist ein äußerst niedriger Anteil von Zellen, doch dieser niedrige Prozentsatz der antigenpräsentierenden Zellen reicht aus, um eine effektive Immunantwort zu induzieren. Histologische Untersuchungen auf Entzündungsreaktionen ergaben vier Stunden p.i. keinen Hinweis auf eine Entzündung. Mit elektronenmikroskopischen Untersuchungen konnten keine Salmonellen in den PP nachgewiesen werden. Der Vergleich der Organkeimlasten der PP der Mäuse mit und ohne Interleukin 12 (IL-12) zeigte signifikante Unterschiede. Während die Gesamtkeimzahl zweier PP in den Wildtypmäusen nur 7 Salmonellen betrug, konnten in den IL-12-defizienten Mäusen 28 bzw. 34 Salmonellen nachgewiesen werden. Das IL-12 wird als Reaktion auf einen entzündlichen Reiz gebildet, liegt aber auch in membrangebundener Form konstitutiv auf Makrophagen und Dendritischen Zellen vor. IL-12 spielt eine wichtige Rolle in der Aktivierung von Bakterizidiemechanismen. Deshalb ist es möglich, dass das IL-12 in den Wildtypmäusen zu einer verbesserten Abtötung der Bakterien führte. In den IL-12-defizienten Mäusen trug die Abwesenheit von IL-12 dazu bei, dass ein höherer Anteil der eingedrungenen Bakterien am Leben blieb. / The oral-faecal route is the general way for Salmonella to infect humans and animals. If Salmonella is able to reach the distal ileum and caecum, it can invade the mucosa and cause systemic diseases (septikemia, thyphoid fever). The gut mucosa is the most important barrier, which defense function will be characterised in this work. The PeyerŽs patches are lymphoid tissues and are located in the gut mucosa. They are colocalized with the M-cells in the gut epithelium. In this border region between epithelium and PeyerŽs patches reside a lot of macrophages and dendritic cells. These are antigen presenting cells and they can phagocytize antigen (bacteria), process antigen and present antigen in the lymphoid tissue to naive T-cells to activate them for a specific immune response. We established methods to detect Salmonella antigen and live Salmonellae. With a Salmonella-specific antiserum we could find Salmonella antigen by immunhistological and flow cytometric methods. Live Salmonellae were detected by plating on selective agar plates. Single cells were isolated from PeyerŽs patches and separated in phagocytic cells and B and T cells and analysed by several methods. After in vitro infection of isolated dendritic cells we detected Salmonellae in dendritic cells by electron microscopy. Therefore, Salmonellae are able to infect dendritic cells. 12 hours after oral infection Salmonellae could be detected in phagocytic cells and B and T cells isolated from PeyerŽs patches. The number of infected cells was very low in all cases. Four hours post infection there was about the same frequency of extracellular and intracellular Salmonellae. Salmonella antigen bearing cells were detected by single cell analysis four hours post infection. The analysis showed 0,09 % to 0,61 % cells of PeyerŽs patches or spleen positive for Salmonella antigen. This is only a low number of antigen-presenting cells, but it seems to be enough to induce an effective immune response. The bacterial burden in the PeyerŽs patches was different between mice with and without IL 12. While the bacterial burden of two PeyerŽs patches out of wild-type mice was only seven Salmonellae, two PeyerŽs patches of IL-12 knock out mice carried 28 to 34 Salmonellae. The number of infected cells was the same in wild-type and IL-12 knockout mice. IL-12 is produced during inflammatory responses to pathogens, but it is also available as a membrane-bound pool on macrophages and dendritic cells. It does not influence the phagocytic mechanisms, but has a very important role in inducing bactericidal activity. Therefore, it is possible that IL-12 in wild-type mice allows for a better killing of Salmonellae, while the lack of IL-12 in knockout mice leads to a reduced killing of Salmonellae.

Weltweit zählt die Salmonellose zu den am häufigsten vorkommenden Zoonosen und auch in Deutschland kommt ihr zunehmend eine sozialökonomische Bedeutung zu. Dabei stellen die maßgeblichen Übertragungs- und Infektionsquellen kontaminiertes Wasser und kontaminierte Lebensmittel dar, bei denen schätzungsweise 20 % auf kontaminiertes Schweinefleisch zurückzuführen sind. Dies verdeutlicht die Notwendigkeit einer Salmonellenbekämpfung. In den dafür geschaffenen gesetzlichen Grundlagen spielt vor allen Dingen der serologische Nachweis einer Salmonelleninfektion eine entscheidende Rolle. Dafür existieren derzeit in Deutschland vier nach § 17c des TSeuchG zugelassene ELISA-Testsysteme. Ziel der vorliegenden Arbeit war eine vergleichende Evaluierung dieser ELISA-Testsysteme zur serologischen Diagnostik von S. Infantis beim Schwein. Um die Tests zu evaluieren, wurden 19 Läuferschweine intragastral mit S. Infantis infiziert und über einen Untersuchungszeitraum von 123 Tagen serologisch mit allen vier ELISAs untersucht. Dabei erfolgte zeitgleich eine bakteriologische Untersuchung. Obwohl S. Infantis zu den schwach virulenten Erregern zählt, zeigten alle Probanden eine deutliche Klinik, die sich überwiegend in mittelgradiger Diarrhoe äußerte. Durch die bakteriologische Untersuchung wurde offenbar, dass alle Schweine bis zum Ende des Versuchszeitraumes eine intermittierende Ausscheidung von S. Infanits zeigten. Ebenso war bei allen Tiere eine Serokonversion nachweisbar, welche sich bei den angewandten Tests jedoch in deutlicher Diskrepanz der Testsensitivitäten äußerte. Zum Beispiel ergab die ermittelte Testsensitivität des Enterisol® Salmonellen-Diagnostikum™ am 53. Tag mittels vorgeschriebenen Cutoff-Wertes nach Schweine-Salmonellen-Verordnung eine Sensitivität von 20%, während diese bei dem isotypspezifischen Salmotype® Pig STM-WCE™ ELISA bei 93,3% lag. Während der Salmotype® PigScreen™ immerhin eine Sensitivität von 6,7% zeigte, erwies sich der HerdChek® Swine Salmonella™ an diesem Tag als nicht sensitiv. In der gesamten Untersuchung konnte nachgewiesen werden, dass sich der isotypspezifische Salmotype® Pig STM-WCE™ ELISA zur serologischen Diagnostik von S. Infantis am besten eignete, während die drei LPS-ELISA erst sehr spät positiv reagierten. Die Sensitivitätsverluste erwiesen sich als besonders stark, wenn die Auswertung der optischen Dichte durch den nach Schweine-Salmonellen-Verordnung angewandten Cutoff-Wert von 40 OD% erfolgte. Des Weiteren wurde deutlich, dass die Ergebnisse der Fleischsaftuntersuchung nicht immer mit denen des Endserums korrelierten. Insgesamt ist der Einsatz des Cutoff-Wertes von 40 OD% als kritisch zu betrachten und es stellt sich die Frage, ob es im Sinne des Verbraucherschutzes, nicht günstiger wäre, den Cutoff-Wert auf 20 oder 10 OD % herabzusetzen, wie dies inzwischen auch in Dänemark mit Erfolg durchgeführt wurde. Abschließend ist feststellbar, dass sich die Diagnostik von S. Infantis beim Schwein mit den vorgeschriebenen Testsystemen als schwierig erweist, da teilweise geringe Sensitivitäten vorlagen.

Die orale Aufnahme von Salmonellen stellt den natürlichen Infektionsweg für Mensch und Tier dar. Gelingt es den Salmonellen vom Darmlumen über das Darmepithel in den Organismus zu gelangen, können sie eine systemische Infektion hervorrufen (Septikämie, Typhus). Die Darmwand stellt die entscheidende Barriere dar, deren Abwehrfunktion bei Salmonelleninfektion im Rahmen dieser Arbeit charakterisiert werden sollte. Die Peyerschen Platten (PP), die in die Darmwand eingelagert sind und an den Bereich der M-Zellen angrenzen, stellen Lymphfollikel dar. In dem Grenzbereich zwischen M-Zellen und PP befinden sich viele Makrophagen und Dendritische Zellen. Diese Zellen sind als „antigen-presenting cells“ (APCs) besonders gut in der Lage, transloziertes Antigen aufzunehmen, es zu prozessieren und in Verbindung mit MHC-Komplexen auf ihrer Oberfläche zu präsentieren, um Effektorzellen des Immunsystems zu aktivieren. Es wurden Nachweismethoden für Salmonellenantigen und Salmonellen etabliert. Mit Hilfe eines spezifischen Antiserums konnte Salmonellenantigen über immunhistochemische und durchflusszytometrische Methoden nachgewiesen werden. Lebende Salmonellen wurden über die Ausplattierung auf XLD-Agarplatten detektiert. Isolierte Einzelzellen aus den PP wurden über Dichtegradientenzentrifugation in die Fraktion der phagozytierenden Zellen und in die Fraktion der B- und T-Zellen separiert und analysiert. Nach In-vitro-Infektion isolierter Dendritischer Zellen konnten über elektronen-mikroskopische Analyse Salmonellen in den Dendritischen Zellen nachgewiesen werden. 12 Stunden nach oraler Infektion der BALB/c-WT-Mäuse wurden über Ausplattierung Salmonellen in der Fraktion der phagozytierenden Zellen sowie der B-und T-Zellen der PP nachgewiesen. Der Anteil der infizierten Zellen war jedoch sehr niedrig. 4 Stunden nach oraler Infektion der Mäuse war ein ebenso großer Anteil der Salmonellen in den PP intrazellulär wie extrazellulär vorhanden. Salmonellenantigentragende Zellen wurden mit Hilfe der Durchflusszytometrie erfasst. So zeigte sich, dass bereits vier Stunden nach oraler Infektion ca. 0,09 % bis zu 0,61 % der Zellen aus Milz und den PP mit Salmonellenantigen beladen waren. Dies ist ein äußerst niedriger Anteil von Zellen, doch dieser niedrige Prozentsatz der antigenpräsentierenden Zellen reicht aus, um eine effektive Immunantwort zu induzieren. Histologische Untersuchungen auf Entzündungsreaktionen ergaben vier Stunden p.i. keinen Hinweis auf eine Entzündung. Mit elektronenmikroskopischen Untersuchungen konnten keine Salmonellen in den PP nachgewiesen werden. Der Vergleich der Organkeimlasten der PP der Mäuse mit und ohne Interleukin 12 (IL-12) zeigte signifikante Unterschiede. Während die Gesamtkeimzahl zweier PP in den Wildtypmäusen nur 7 Salmonellen betrug, konnten in den IL-12-defizienten Mäusen 28 bzw. 34 Salmonellen nachgewiesen werden. Das IL-12 wird als Reaktion auf einen entzündlichen Reiz gebildet, liegt aber auch in membrangebundener Form konstitutiv auf Makrophagen und Dendritischen Zellen vor. IL-12 spielt eine wichtige Rolle in der Aktivierung von Bakterizidiemechanismen. Deshalb ist es möglich, dass das IL-12 in den Wildtypmäusen zu einer verbesserten Abtötung der Bakterien führte. In den IL-12-defizienten Mäusen trug die Abwesenheit von IL-12 dazu bei, dass ein höherer Anteil der eingedrungenen Bakterien am Leben blieb. / The oral-faecal route is the general way for Salmonella to infect humans and animals. If Salmonella is able to reach the distal ileum and caecum, it can invade the mucosa and cause systemic diseases (septikemia, thyphoid fever). The gut mucosa is the most important barrier, which defense function will be characterised in this work. The PeyerŽs patches are lymphoid tissues and are located in the gut mucosa. They are colocalized with the M-cells in the gut epithelium. In this border region between epithelium and PeyerŽs patches reside a lot of macrophages and dendritic cells. These are antigen presenting cells and they can phagocytize antigen (bacteria), process antigen and present antigen in the lymphoid tissue to naive T-cells to activate them for a specific immune response. We established methods to detect Salmonella antigen and live Salmonellae. With a Salmonella-specific antiserum we could find Salmonella antigen by immunhistological and flow cytometric methods. Live Salmonellae were detected by plating on selective agar plates. Single cells were isolated from PeyerŽs patches and separated in phagocytic cells and B and T cells and analysed by several methods. After in vitro infection of isolated dendritic cells we detected Salmonellae in dendritic cells by electron microscopy. Therefore, Salmonellae are able to infect dendritic cells. 12 hours after oral infection Salmonellae could be detected in phagocytic cells and B and T cells isolated from PeyerŽs patches. The number of infected cells was very low in all cases. Four hours post infection there was about the same frequency of extracellular and intracellular Salmonellae. Salmonella antigen bearing cells were detected by single cell analysis four hours post infection. The analysis showed 0,09 % to 0,61 % cells of PeyerŽs patches or spleen positive for Salmonella antigen. This is only a low number of antigen-presenting cells, but it seems to be enough to induce an effective immune response. The bacterial burden in the PeyerŽs patches was different between mice with and without IL 12. While the bacterial burden of two PeyerŽs patches out of wild-type mice was only seven Salmonellae, two PeyerŽs patches of IL-12 knock out mice carried 28 to 34 Salmonellae. The number of infected cells was the same in wild-type and IL-12 knockout mice. IL-12 is produced during inflammatory responses to pathogens, but it is also available as a membrane-bound pool on macrophages and dendritic cells. It does not influence the phagocytic mechanisms, but has a very important role in inducing bactericidal activity. Therefore, it is possible that IL-12 in wild-type mice allows for a better killing of Salmonellae, while the lack of IL-12 in knockout mice leads to a reduced killing of Salmonellae.

Die Entwicklung einer mukosal verabreichbaren, effektiven DNA-Vakzine gegen Infektionskrankheiten oder Tumorerkrankungen auf der Basis invasiver attenuierter Bakterien ist eine vielversprechende Alternative zu bisherigen parenteralen Strategien der genetischen Vakzinierung. Innerhalb dieser Arbeit wurden Salmonellen-Impfstämme für die orale Übertragung eines eukaryontischen Expressionsplasmids mit dem kleinen Oberflächenantigen des Hepatitis-B-Virus (HBsAg) als Modellantigen optimiert. Die kontinuierliche Sezernierung von Plasmiden als filamentöse Phagenpartikel wurde als ein erster Ansatz getestet, um mit lebenden Bakterien eine DNA-Vakzine innerhalb infizierter Zellen freizusetzen. Die Salmonellen-vermittelte Phagensekretion in der Wirtszelle ist jedoch nicht effizient genug, die Expression des Transgens zu vermitteln. Alternativ wurde ein Ansatz gewählt, durch eine spontan induzierte Lyse der Impfbakterien, Plasmid-DNA in die Wirtszelle zu übertragen. Dazu wurde ein neuartiges bakterielles Autolysesystem etabliert, basierend auf einem Zwei-Phasen-Expressionssystem und von Bakteriophagen abgeleiteten Lysedeterminanten. Dieses System ermöglicht erstmals die kontinuierliche Freisetzung von Plasmid-DNA und Proteinen aus einzelnen, lysierenden Salmonellen innerhalb einer sonst gesunden bakteriellen Gesamtpopulation. Innerhalb infizierter COS7-Zellen führt die Freisetzung des porenformierenden Proteins Listeriolysin O durch autolytische Salmonellen zur Zerstörung der Vakuole, in der die Impfbakterien replizieren, und erleichtert somit den Transfer der Plasmid-DNA aus den Bakterien in das Zytoplasma der Wirtszelle. Die Lysedeterminante und die eukaryontische Expressionskassette für HBsAg wurden auf einem Plasmid kombiniert, sowie eine Kassette zur konstitutiven Expression des Histon-ähnlichen Proteins aus Thermotoga maritima (TmHU) in ein solches Konstrukt integriert. TmHU stabilisiert die Plasmiderhaltung unter nicht selektiven Bedingungen und besitzt das Potential, die Effizienz der DNA-Translokation innerhalb der Wirtszelle zu erhöhen. Durch die orale Gabe optimierter autolytischer Impfbakterien konnte eine potente HBsAg-spezifische Antikörperantwort sowie eine zytotoxische zelluläre Antwort induziert werden. Bereits die einmalige Gabe der autolytischen Bakterien induzierte eine höhere antigenspezifische Antikörperantwort, als die herkömmliche intramuskuläre DNA-Vakzine. Das im Rahmen dieser Arbeit entwickelte Konzept autolytischer Salmonellen stellt also eine neuartige, effiziente Strategie für den mukosalen DNA-Transfer dar. Die Übertragung des Konzeptes der Autolyse auf andere bakterielle Trägersysteme ist möglich und kann zur Erweiterung des Anwendungspektrums bakterieller Vektoren beitragen. / The development of an effective mucosal DNA vaccine against infectious diseases or tumors based on invasive attenuated bacteria is a very promising alternative to common parenteral routes of genetic vaccination. This work aimed at the optimization of Salmonella vaccine strains for the oral delivery of an eukaryotic expression plasmid encoding the small Hepatitis B Virus surface antigen (HBsAg), here used as model antigen. The continuous secretion of plasmids as filamentous phage particles was first tested as a mean for the delivery of the DNA vaccine by living bacteria inside infected host cells. However, Salmonella-mediated phage secretion inside cells did not suffice for the induction of transgene expression. As alternative approach, inducible spontanous lysis of bacteria was used to mediate the release of plasmid DNA into host cells. For this purpose a novel bacterial autolytic system was established on the basis of a two-phase expression system and lysis determinants derived from bacteriophages. This system allows for the first time the continuous release of plasmid DNA and proteins from only few lysing Salmonella within an otherwise healthy bacterial population. Inside COS7 cells the release of the pore-forming protein listeriolysin O by autolytic Salmonella mediates the destruction of the Salmonella-harbouring vacuole, thereby facilitating the transfer of plasmid DNA from bacteria into the host cell cytoplasm. The lysis determinant was combined with the eukaryotic expression cassette for HBsAg on one plasmid. In addition, a cassette for the constitutive expression of TmHU, a histon-like protein derived from Thermotoga maritima, was integrated in such vector. TmHU stabilizes the plasmid propagation in the absence of selective pressure and has the potential to increase the efficiency of plasmid translocation inside the host cell. The oral administration of the optimized autolytic bacteria stimulated a potent HBsAg-specific antibody response as well as a cytotoxic cellular response. Already a single inoculation of the oral vaccine induced a higher specific antibody response than the conventional intramuscular DNA vaccine. Therefore the concept of autolytic Salmonella carrier strains developed in this work constitutes a novel efficient strategy for mucosal DNA delivery. The transfer of this concept to other bacterial carriers is possible and may widen the application field for bacterial vectors.