Le nombre d’enfants nés par Assistance Médicale à la Procréation (AMP) dans le monde est estimé à plus de 5 millions, représentant jusqu’à 4% des naissances. Environ 10% des couples en âge de procréer sont actuellement infertiles, et leur apporter des techniques pour devenir parents est devenu un problème de santé publique. Cependant, l’innocuité de ces techniques n’a pas été totalement démontrée. Notamment, le risque de pathologies d’origine placentaire pourrait être augmenté. De plus, des issues périnatales défavorables, un risque majoré de malformations majeures et de pathologies liées à l’empreinte ont été rapportés chez ces enfants. Ceci soulève la question d’une éventuelle vulnérabilité épigénétique induite par l’AMP. L’objectif de ce travail de thèse était d’étudier la régulation épigénétique des gènes soumis à empreinte (GSE) et des éléments transposables (TE) dans le placenta et le sang de cordon d’enfants conçus par AMP comparés à des enfants conçus naturellement. En guise d’introduction, nous avons rédigé une revue détaillée des modifications phénotypiques et épigénétiques induites par l’AMP dans les embryons, le placenta et le sang de cordon chez l’Homme et sur les modèles animaux.Au cours de cette thèse, une cohorte de presque 250 patientes a été incluse prospectivement, répartie en 4 groupes de patientes selon la technique d’AMP et 4 groupes de témoins selon la durée d’infertilité.A partir de cette cohorte, la première question posée a été l’effet de la Fécondation in vitro (FIV) sur la méthylation de l’ADN et/ou la transcription des GSE et TE dans le sang de cordon et le placenta à la naissance. Pour cela, nous avons sélectionné 51 patientes enceintes après FIV avec ou sans ICSI avec transfert d’embryon frais à J2 et les avons comparées à 48 témoins enceintes dans l’année après l’arrêt de la contraception. Nous avons étudié la méthylation de l’ADN et l’expression de 3 GSE et 4 TE. Les niveaux de méthylation de l’ADN placentaire pour H19/IGF2, KCNQ1OT1, LINE-1 et ERVFRD-1 et le niveau d’expression placentaire d’ERVFRD-1 étaient plus bas dans le groupe FIV/ICSI que dans le groupe contrôle. Ces modifications épigénétiques pourraient faire partie des mécanismes de compensation développés pendant la grossesse après AMP, comme discuté dans notre revue.Ensuite, nous avons voulu déterminer si ces changements de méthylation de l’ADN des GSE pouvaient être associés à des modifications des histones. A partir de la cohorte précédente, nous avons sélectionné 16 patientes du groupe FIV/ICSI avec des niveaux de méthylation dans le placenta inférieurs au 5ème percentile pour au moins un des GSE étudiés. Elles ont été appariées à 16 témoins sur la parité, le sexe du nouveau-né et l’âge gestationnel à l’accouchement. Des marques permissives (H3K4me2 et me3 et H3K9ac) et répressives (H3K9me2 et me3) ont été étudiées. Les résultats ont révélé une quantité significativement augmentée de H3K4me2 dans le groupe FIV/ICSI pour H19/IGF2 et KCNQ1OT1. La quantité des deux marques répressives pour H19/IGF2 et SNURF était significativement abaissée dans le groupe FIV/ICSI.Ces données montrent que l’hypométhylation de l’ADN au niveau des GSE pourrait être associée à une augmentation des marques permissives et une diminution des marques répressives des histones, ce qui permettrait de favoriser un état « actif » de la chromatine au niveau de l’allèle normalement réprimé.Nos résultats, ainsi que les données de la littérature, renforcent l’hypothèse de potentiels mécanismes mis en place dans le placenta après AMP, utiles pour compenser des anomalies précoces de la placentation, qui seraient écrits à travers des modifications épigénétiques comme la méthylation de l’ADN mais aussi les modifications des histones.Bien que certaines questions restent en suspens, cette thèse a permis de bâtir les fondations de travaux futurs, notamment pour étudier l’impact de la congélation/décongélation des embryons et le rôle joué par l’infertilité en elle-même. / It is estimated that more than five million children have been born by Assisted Reproductive Technologies (ART) worldwide, representing up to 4% of all births. As around 10% of reproductive-aged couples are currently infertile, providing them with treatment options is a public health issue. However, the safety of these techniques has not been fully demonstrated. Notably, the rate of placenta-related adverse pregnancy outcomes could be increased after ART. Moreover, adverse perinatal outcomes, a higher risk of major malformations and imprinting disorders have also been reported in children born following ART. These issues combined raise the question of a potential ART-induced epigenetic vulnerability.The aim of this thesis was to investigate the epigenetic regulation of imprinted genes (IGs) and transposable elements (TEs) in the placenta and cord blood of children conceived by ART and to compare them to children conceived naturally.By way of introduction, we wrote a comprehensive review about phenotypic and epigenetic modifications induced by ART in embryos, placenta and cord blood either in human or animal models.Then, an extensive cohort of almost 250 patients was prospectively included, resulting in 4 groups of ART techniques and 4 groups of controls stratified on the time to pregnancy.From this cohort, the first question we investigated was the effect of in vitro fertilization (IVF) on DNA methylation and/or transcription of TEs and IGs in cord blood and placenta collected at birth. For this purpose, we selected 51 pregnant women after IVF with fresh embryo transfer at day -2 and compared them with 48 controls pregnant within 1 year of stopping contraception. We studied the DNA methylation and expression of 3 imprinted DMRs and 4 TEs. DNA methylation levels for H19/IGF2 and KCNQ1OT1 DMRs, LINE-1 and ERVFRD-1 in the placenta were lower in the IVF/ICSI group than in the control group. The expression level of ERVFRD-1 in the placenta was also lower in the IVF/ICSI group than in the control group. These modifications in epigenetic regulation may influence some compensation mechanisms developed throughout pregnancy after ART, as discussed in our review.We then intended to determine if these DNA methylation changes in IGs were associated with histone modifications. From the previously mentioned cohort, we selected the 16 patients from the IVF/ICSI group who presented with below the 5th percentile of percentage placenta DNA methylation for at least one of the previously studied DMRs. These patients were compared with 16 controls matched for parity, new-born sex, and gestational age at delivery. Permissive (H3K4me2 and me3 and H3K9ac) and repressive (H3K9me2 and me3) histone marks were studied. The results revealed a significantly higher quantity of H3K4me2 in the IVF/ICSI group than in the natural conception group for H19/IGF2 and KCNQ1OT1 DMRs. The quantity of both repressive marks at H19/IGF2 and SNURF DMRs was significantly lower in the IVF/ICSI group than in the natural conception group.These data demonstrate that DNA hypomethylation at imprinted DMRs may be associated with an increase in permissive histone marks and a decrease in repressive histone marks. This is consistent with a more “active” chromatin conformation on the normally repressed allele.Our findings, together with the literature data, reinforce the hypothesis that some mechanisms are established in the placenta after ART, probably to mediate placental plasticity and compensate primary disorders in trophoblastic invasion, and written through epigenetic changes such as DNA methylation but also histone modifications.Although some questions remain unanswered, this thesis paves the way for further original studies, notably to assess the impact of frozen-thawed embryo transfer and to decipher the role of infertility per se.

Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) sont des cellules souches adultes qui sont à l’origine des cellules des lignages ostéoblastique (O), adipocytaire (A) et chondroblastique (C). Les CSM ont initialement trouvées dans la moelle osseuse mais il en existe également dans d’autres tissus comme le sang de cordon ombilical (SCO). Dotées d’un potentiel régénératif, les CSM peuvent utilisées dans diverses pathologies dégénératives dans un but de réparation tissulaire. En outre, leurs propriétés immunosuppressives ont conduit à envisager leur utilisation dans un but d’immunomodulation comme lors des réactions de greffon contre l’hôte dans les greffes de cellules souches hématopoïétiques (CSH) allo-géniques. Le but essentiel de ce travail a été de comparer les caractéristiques des CSM issues du SCO en comparaison de celles issues de la moelle osseuse (MO). Dans l’optique d’applications en médecine régénérative, nous avons tout d’abord testé la possibilité d’utiliser, dans les milieux de culture d’expansion des CSM de SCO et de MO, un lysat plaquettaire d’origine humaine (HPL) comme substitut au sérum de veau fœtal (SVF) source possible de contaminations. / The mesenchymal stem cells (MSC) are adult stem cells which are at the origin of the ostebiastic lignage cells (O), adipocytes (A) and chondrobiasts (C). The MSC are initially found in the bone marrow (BM) but it also exists there in other tissues as the umbilical cord blood (UCB).Endowed with a regenerative potential, MSC can used in diverse degenerative pathologies in a purpose of tissular repair. Besides, their immunosuppressive properties allowed to envisage their use in a purpose of immunomodulation as during the reactions of transplant against the host in allogenic hematopoietic stem cell transplants (HSC). The essential purpose of this work was to compare the characteristics of the MSC derived from the UCB in comparison to those stemming from the bone marrow (BM).

La transplantation de sang de cordon ombilical (TSCO) est utilisée pour traiter les enfants atteints de maladies hématologiques en l’absence de donneurs apparentés compatibles. Elle est associée avec des risques plus élevés d’échec de greffe et d’infections opportunistes dans les premiers mois qui suivent la transplantation en comparaison avec une greffe de moelle osseuse. Par contre, la TSCO comporte un risque plus faible de maladie du greffon contre l’hôte et une incidence comparable de rechute de leucémie. Ces quatre complications impliquent directement les lymphocytes T. Dans le but de mieux comprendre le schéma particulier des évènements qui suivent la TSCO et d’améliorer le pronostic des patients, nous avons étudié le potentiel fonctionnel, la persistance et la reconstitution antivirale des lymphocytes T au sein d’un groupe d’enfants transplantés de sang de cordon ombilical (SCO). Étant donné que le SCO contient une majorité de lymphocytes T naïfs, nous avons étudié les lymphocytes T spécifiques au HLA-A2:Melan-A26-35 A27L; seul répertoire naïf et abondant caractérisé chez l’homme. Nous avons observé que les lymphocytes T du SCO se différencient en populations effectrices, s’oligoclonalisent, produisent de l’IFN-γ et lysent spécifiquement leur cible suite à la stimulation. Néanmoins, ces cellules produisent moins d’IFN-γ et sont moins bifonctionnelles que leurs homologues issus du sang périphérique d’adultes. Chez les patients, les lymphocytes T du SCO s’épuisent après la TSCO : ils s’oligoclonalisent dramatiquement, sont principalement en différenciation terminale, et une importante fréquence exprime PD-1 (« programmed death-1 ») dans les 3 à 6 premiers mois post-greffe. Très peu de patients sont capables de développer des réponses antivirales durant cette période et la fréquence de lymphocytes T qui expriment PD-1 semble aussi avoir un impact sur le risque subséquent de faire une rechute de leucémie. La deuxième vague de lymphocytes T émergeant à 6 mois post-TSCO mène à une population fonctionnelle et diversifiée. En conclusion, la fonctionnalité des lymphocytes T présents dans les 3 à 6 premiers mois post-TSCO doit être rétablie pour améliorer les risques d’infections opportunistes et de rechute de leucémie. / Umbilical cord blood (UCB) is increasingly used as a source of hematopoietic progenitor cells to treat a variety of disorders in children. UCB transplantation (UCBT) is associated with a reduced incidence of graft-versus-host disease, a robust graft-versus-leukemia effect, more frequent graft failures and a higher incidence of opportunistic infections (OI) compared to bone marrow transplantation; four processes in which donor-derived T lymphocytes are known to be predominantly involved. UCB T cells are mostly naïve. To examine the differential functionality of UCB T cells, CD8+ T cells specific for the melanoma-associated HLA-A2-restricted Melan-A26-35 A27L peptide were isolated from UCB and UCBT recipients, as it represents an abundant preimmune repertoire in human. Following in vitro stimulation, UCB T cells proliferated, oligoclonalized, acquired cell surface markers reflective of effector/memory differentiation, expressed cytolytic activity and produced IFN-γ. While functional properties of UCB T cells resembled their counterparts in adult peripheral blood, they were more likely to reach terminal differentiation following stimulation, produced less IFN-γ and were less frequently bifunctional (IFN-γ and cytolysis). Following UCBT, T cells became exhausted: they oligoclonalized dramatically, exhibited a terminal differentiation phenotype and a high frequency also expressed PD-1 (“ programmed death 1 ”) in the first 3-6 months post-UCBT. Moreover, very few patients developed an antiviral response during this period. Finally, the frequency of PD-1+ CD8+ T cells was significantly higher in subjects who subsequently experienced leukemic relapse. A second wave of T cells emerging at 6 months post-UCBT was observed and characterized by an increase in the repertoire diversity till 1 year, the development of a naïve population with polyfunctional potential and the progressive reconstitution of antiviral responses. This study reports to the biological properties of UCB-derived CD8+ T cells and provides a rationale for the characteristics of UCBT in terms of immune reconstitution and OI. These results also suggest that the first wave of CD8+ T cells in the first 3-6 months post-UCBT should be targeted in priority to improve both OI and leukemic relapse risks.

Résumé : L’obésité est un enjeu de société de première importance; elle est un facteur de risque de plusieurs maladies et engendre d’importantes dépenses en santé. Outre l’alimentation, la sédentarité et les prédispositions génétiques, il semble que l’environnement fœtal soit un facteur déterminant dans le développement de l’obésité. En effet, il a été démontré que les nouveau-nés exposés à un environnement intra-utérin défavorable ont un risque accru de développer, à l’adolescence et à l’âge adulte, l’obésité ainsi que les désordres métaboliques qui y sont associés. Le diabète gestationnel (DG) est l’une des complications de santé maternelle les plus fréquentes et est associé à un risque accru à long terme pour la santé métabolique de l’enfant. Malgré les nombreuses données probantes épidémiologiques concernant le phénomène de la programmation fœtale associée au DG, les mécanismes moléculaires impliqués ont été très peu étudiés. Il est cependant de plus en plus évident que l’épigénétique soit l’un de ces mécanismes. Cette thèse a pour objectif d’identifier les changements de méthylation de l’ADN, la modification épigénétique la plus stable et la plus connue, chez les nouveau-nés exposés in utero au DG. Dans un premier temps, la méthylation de l’ADN de 44 échantillons de placenta et de sang de cordon a été analysée à l’échelle du génome. Cette approche a permis de démontrer que les gènes épigénétiquement modifiés suite à une exposition au DG sont majoritairement retrouvés dans les voies biologiques associées aux maladies métaboliques. Des analyses dans une cohorte indépendante (n=80) ont confirmé l’effet de la glycémie maternelle sur la méthylation de l’ADN des gènes BRD2, LRP1B et CACNA1D impliqués dans la régulation du métabolisme des lipides et du glucose et du système rénine-angiotensine respectivement. Dans un second temps, l’approche par gènes candidats a démontré que l’exposition au DG est associée à la méthylation de l’ADN de gènes du métabolisme des lipides (LPL et ABCA1) du placenta. L’analyse de la méthylation de la LEP et de l’ADIPOQ dans le sang et les tissus adipeux de sujets sévèrement obèses a permis d’identifier des sites de méthylation pouvant potentiellement être utilisés dans le sang comme marqueur de susceptibilité à l’obésité. L’ensemble des résultats de cette thèse démontrent que le DG modifie le profil épigénétique de gènes impliqués dans les voies biologiques des maladies métaboliques (métabolisme énergétique et des lipides) et supportent l’importance de la méthylation de l’ADN dans la programmation de la santé métabolique du nouveau-né ayant été exposé in utero au DG. / Abstract : Obesity has reached epidemic proportions worldwide in both adult and childhood populations and is now recognized as a major public health issue. Obesity is associated with higher incidence of cardiometabolic complications including type 2 diabetes (T2D), dyslipidemia and hypertension as well as with increased health care costs. The fetal environment now appears, with genetics and the environment, as one cause of the obesity epidemic. Indeed, according to the fetal programming hypothesis, newborns exposed to a detrimental fetal environment are more susceptible to develop obesity, T2D and other related chronic disorders when they become teenagers or adults. Many studies have associated gestational diabetes mellitus (GDM) exposure with these long-term metabolic health risks for the newborn. Although, numerous studies show epidemiological evidence to support the fetal programming hypothesis, only a few studies have been undertaken to understand the underlying molecular mechanisms. However, several studies now suggest that epigenetics may be involved. The objective of this thesis is to study changes in DNA methylation, the more stable and studied epigenetic system, in newborns that have been exposed to GDM in utero. First, a genome-wide DNA methylation analysis (BeadChip) was performed in a sample set of 44 placenta and cord blood samples to identify genes and metabolic pathways dysregulated by GDM. This approach showed that genes epigenetically affected by GDM are predominantly involved in metabolic diseases. The associations between maternal glycemia and DNA methylation levels were confirmed, in an independent birth cohort, for BRD2, LRP1B and CACNA1D gene loci involved in the regulation of lipid and glucose metabolism and the renin-angiotensin system respectively. Then, using a candidate gene approach we reported that DNA methylation levels at gene loci involved in lipid metabolism (LPL and ABCA1) are modified in the placenta following exposure to GDM. Furthermore, analyses of LEP and ADIPOQ DNA methylation levels in blood and adipose tissues of severely obese men and women allowed the identification of CpG sites that might be used in blood as a marker of obesity susceptibility. Altogether the results of this thesis show that GDM affects the epigenetic signature of genes involved in metabolic disease pathways (energy and lipid metabolism) and support the role of DNA methylation in metabolic health programming of the newborn exposed to GDM.

Les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) sont des cellules dendritiques spécialisées, aussi connues sous le nom de cellules productrices d’interféron-α (IFN-α). Les pDC jouent un rôle essentiel dans l’induction de la réponse immunitaire antivirale, en reconnaissant les antigènes viraux via les Toll-like receptors (TLR) 7 et 9. Toutefois, les pDC du sang de cordon sont incapables de produire de l’IFN-α en réponse à une stimulation du TLR9, mais leur maturation en cellules présentatrices d’antigènes est normale. Dans le cadre de ce travail, nous nous sommes intéressés aux effets des facteurs immuno-régulateurs sécrétés par le placenta sur la différenciation et la fonction des pDC. Nous avons analysé l’effet, seules ou en combinaison, de la progestérone (PG), de l'interleukine (IL)-10 et du tumor growth factor (TGF)-β sur la différenciation et la fonction des pDC. Nous démontrons qu’à des niveaux supra-physiologiques ces trois facteurs modulent la différenciation et la production d’IFN-α des pDC. À des niveaux observés dans le sang de cordon, ces facteurs ont peu d’impact sur les pDC lorsque utilisés individuellement. Toutefois lorsque utilisés en combinaison, ils diminuent la production d’IFN-α. Nous avons aussi démontré que la PG, l’IL-10 et le TGF-β n’induisent pas l’expression des micro-ARN 146a et 155 par les pDC. Finalement nous démontrons que les niveaux de ces molécules sont plus élevés dans le sang de cordon que dans le sang d’adulte. Nos résultats révèlent le rôle important des facteurs immuno-régulateurs sécrétés par le placenta sur la fonction des pDC et en conséquence, sur la réponse immunitaire fœtale et néonatale. / Plasmacytoid dendritic cells (pDC) are specialized dendritic cells, also known as IFN-α producing cells. pDC are key inducers of immune responses following viral infections, by detecting viral antigens through the Toll-like-receptors (TLR) 7 and 9. Although cord blood pDC are unable to produce IFN-α after stimulation, they retain their capacity to mature into antigen presenting cells. To gain insights into the mechanisms of pDC regulation in cord blood, we investigated the effects of immune regulators secreted by the placenta on the differentiation and function of pDC. Using in vitro differentiated pDC, we analyzed the effect of progesterone (PG), IL-10 and TGF-β, separately or in combination, on pDC differentiation and activation. The data revealed that supra-physiological concentrations of these three factors could individually impair pDC differentiation and IFN-α production. Physiological concentrations of PG, IL-10 or TGF-β, individually, had low impact on pDC while in combination they were able to modulate IFN-α production. We also showed that PG, IL-10 or TGF-β failed to induce the expression of micro-RNA 146a and 155 in pDC. Lastly, our results indicated that PG, IL-10 and TGF-β were present at high levels in cord blood as compared to adult blood. These results, therefore, shed new light on the synergy of immune regulators secreted by the placenta and their impact on foetal and neonatal immune responses.

Human hematopoietic stem cells (HSCs) are defined by their capacity to self-renew and to differentiate into all blood lineages during an adult lifetime. Based on these unique properties, HSCs are used in transplantation procedures to treat various hematological diseases. However, the low number of HSCs in a graft limits the use of this treatment. To overcome this restrain, different approaches were established to expand HSCs ex vivo; yet, the absence of a reliable surface maker that correlates with HSC activity in culture made the assessment labor-intensive and time-consuming. Using a library of small molecules, we were able to identify pyrimidoindole derivative named UM171 as an agonist for HSC self-renewal. UM171 promotes ex vivo expansion of hematopoietic and stem cell progenitors (HSPC) independently of AhR suppression- a pathway reported by Boitano et al. to have the greatest effect in HSC expansion. Unlike AhR suppression that targets a hematopoietic population with limited proliferative potential, UM171 targets the long-term HSCs. Transcriptome analysis showed that UM171 reduces the levels of transcripts associated with lineage differentiation and induces the expression of genes encoding for membrane proteins, one of the best differentially expressed being the endothelial protein c receptor (EPCR). Cell sorting and transplantation experiments of EPCR expressing cells showed a high correlation with HSC activity. We demonstrated EPCR as a first reliable marker to enrich for HSC in culture and that it is required for HSPC function in vivo. These findings provide a valuable tool for clinical and research applications to optimize further HSPC expansion protocols and understand the molecular machinery that governs the HSC self-renewal. / Le terme de cellules souches hématopoïétiques (CSH) désigne une population rare de cellules capables de générer l’ensemble des lignages hématopoïétiques. Cette définition implique une capacité d’auto-renouvèlement, ainsi qu'un potentiel de prolifération et de différenciation important. La greffe de cellules souches hématopoïétiques est aujourd'hui une modalité thérapeutique pour le traitement de diverses maladies hématologiques et représente pour de nombreux patients un traitement de dernier recours. Malheureusement, le nombre limité de ces cellules dans une unité de sang de cordon est à l’origine du faible taux de réussite des greffes de sang de cordon chez l'adulte. Plusieurs stratégies sont actuellement mises en place pour permettre la multiplication de ces CSH ex vivo. Cependant, Il n’y a jusqu’à ce jour aucun critère ou marqueur phénotypique fiable permettant spécifiquement d'identifier ou d'isoler ces CSH amplifiées, et leur caractérisation reste un défi majeur pour les chercheurs. Dans le laboratoire, nous avons effectué un criblage à haut débit afin de tester le potentiel d’un grand nombre de molécules chimiques à multiplier des cellules souches dérivées de sang de cordon ombilical et nous avons ainsi identifié la molécule UM171, un dérivé pyrimido-indole, qui permet de multiplier par 10 le nombre de CSH et par 100 leur descendance. Nous avons démontré qu' UM171 permet de multiplier les CSH sans affecter la voie de signalisation de la protéine AhR, récemment impliquée dans l'auto-renouvèlement des CSH. L'analyse du transcriptome des CSH exposées à la molécule UM171 a permis d'identifier le récepteur endothélial à la protéine C (EPCR), comme marqueur de surface permettant de prédire le nombre et l'activité des CSH en culture et par conséquent de les isoler et de mieux les caractériser. En combinant des techniques de cytométrie de flux et d'ARN interférents avec des expériences de transplantation à long terme dans des souris immuno-déficientes, nous avons pu démontrer qu' EPCR peut être considéré non seulement comme un premier marqueur fiable pour enrichir les CSH en culture mais aussi qu'il est nécessaire pour la fonction de ces CSH in vivo. Les résultats de ces travaux représentent une avancée majeure pour accélérer les recherches et les applications cliniques sur l'expansion des CSH ex vivo et permettra de comprendre les mécanismes moléculaires qui régissent l'auto-renouvèlement des CSH.

La transplantation de sang de cordon ombilical (TSCO) est utilisée pour traiter les enfants atteints de maladies hématologiques en l’absence de donneurs apparentés compatibles. Elle est associée avec des risques plus élevés d’échec de greffe et d’infections opportunistes dans les premiers mois qui suivent la transplantation en comparaison avec une greffe de moelle osseuse. Par contre, la TSCO comporte un risque plus faible de maladie du greffon contre l’hôte et une incidence comparable de rechute de leucémie. Ces quatre complications impliquent directement les lymphocytes T. Dans le but de mieux comprendre le schéma particulier des évènements qui suivent la TSCO et d’améliorer le pronostic des patients, nous avons étudié le potentiel fonctionnel, la persistance et la reconstitution antivirale des lymphocytes T au sein d’un groupe d’enfants transplantés de sang de cordon ombilical (SCO). Étant donné que le SCO contient une majorité de lymphocytes T naïfs, nous avons étudié les lymphocytes T spécifiques au HLA-A2:Melan-A26-35 A27L; seul répertoire naïf et abondant caractérisé chez l’homme. Nous avons observé que les lymphocytes T du SCO se différencient en populations effectrices, s’oligoclonalisent, produisent de l’IFN-γ et lysent spécifiquement leur cible suite à la stimulation. Néanmoins, ces cellules produisent moins d’IFN-γ et sont moins bifonctionnelles que leurs homologues issus du sang périphérique d’adultes. Chez les patients, les lymphocytes T du SCO s’épuisent après la TSCO : ils s’oligoclonalisent dramatiquement, sont principalement en différenciation terminale, et une importante fréquence exprime PD-1 (« programmed death-1 ») dans les 3 à 6 premiers mois post-greffe. Très peu de patients sont capables de développer des réponses antivirales durant cette période et la fréquence de lymphocytes T qui expriment PD-1 semble aussi avoir un impact sur le risque subséquent de faire une rechute de leucémie. La deuxième vague de lymphocytes T émergeant à 6 mois post-TSCO mène à une population fonctionnelle et diversifiée. En conclusion, la fonctionnalité des lymphocytes T présents dans les 3 à 6 premiers mois post-TSCO doit être rétablie pour améliorer les risques d’infections opportunistes et de rechute de leucémie. / Umbilical cord blood (UCB) is increasingly used as a source of hematopoietic progenitor cells to treat a variety of disorders in children. UCB transplantation (UCBT) is associated with a reduced incidence of graft-versus-host disease, a robust graft-versus-leukemia effect, more frequent graft failures and a higher incidence of opportunistic infections (OI) compared to bone marrow transplantation; four processes in which donor-derived T lymphocytes are known to be predominantly involved. UCB T cells are mostly naïve. To examine the differential functionality of UCB T cells, CD8+ T cells specific for the melanoma-associated HLA-A2-restricted Melan-A26-35 A27L peptide were isolated from UCB and UCBT recipients, as it represents an abundant preimmune repertoire in human. Following in vitro stimulation, UCB T cells proliferated, oligoclonalized, acquired cell surface markers reflective of effector/memory differentiation, expressed cytolytic activity and produced IFN-γ. While functional properties of UCB T cells resembled their counterparts in adult peripheral blood, they were more likely to reach terminal differentiation following stimulation, produced less IFN-γ and were less frequently bifunctional (IFN-γ and cytolysis). Following UCBT, T cells became exhausted: they oligoclonalized dramatically, exhibited a terminal differentiation phenotype and a high frequency also expressed PD-1 (“ programmed death 1 ”) in the first 3-6 months post-UCBT. Moreover, very few patients developed an antiviral response during this period. Finally, the frequency of PD-1+ CD8+ T cells was significantly higher in subjects who subsequently experienced leukemic relapse. A second wave of T cells emerging at 6 months post-UCBT was observed and characterized by an increase in the repertoire diversity till 1 year, the development of a naïve population with polyfunctional potential and the progressive reconstitution of antiviral responses. This study reports to the biological properties of UCB-derived CD8+ T cells and provides a rationale for the characteristics of UCBT in terms of immune reconstitution and OI. These results also suggest that the first wave of CD8+ T cells in the first 3-6 months post-UCBT should be targeted in priority to improve both OI and leukemic relapse risks.

Les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) sont des cellules dendritiques spécialisées, aussi connues sous le nom de cellules productrices d’interféron-α (IFN-α). Les pDC jouent un rôle essentiel dans l’induction de la réponse immunitaire antivirale, en reconnaissant les antigènes viraux via les Toll-like receptors (TLR) 7 et 9. Toutefois, les pDC du sang de cordon sont incapables de produire de l’IFN-α en réponse à une stimulation du TLR9, mais leur maturation en cellules présentatrices d’antigènes est normale. Dans le cadre de ce travail, nous nous sommes intéressés aux effets des facteurs immuno-régulateurs sécrétés par le placenta sur la différenciation et la fonction des pDC. Nous avons analysé l’effet, seules ou en combinaison, de la progestérone (PG), de l'interleukine (IL)-10 et du tumor growth factor (TGF)-β sur la différenciation et la fonction des pDC. Nous démontrons qu’à des niveaux supra-physiologiques ces trois facteurs modulent la différenciation et la production d’IFN-α des pDC. À des niveaux observés dans le sang de cordon, ces facteurs ont peu d’impact sur les pDC lorsque utilisés individuellement. Toutefois lorsque utilisés en combinaison, ils diminuent la production d’IFN-α. Nous avons aussi démontré que la PG, l’IL-10 et le TGF-β n’induisent pas l’expression des micro-ARN 146a et 155 par les pDC. Finalement nous démontrons que les niveaux de ces molécules sont plus élevés dans le sang de cordon que dans le sang d’adulte. Nos résultats révèlent le rôle important des facteurs immuno-régulateurs sécrétés par le placenta sur la fonction des pDC et en conséquence, sur la réponse immunitaire fœtale et néonatale. / Plasmacytoid dendritic cells (pDC) are specialized dendritic cells, also known as IFN-α producing cells. pDC are key inducers of immune responses following viral infections, by detecting viral antigens through the Toll-like-receptors (TLR) 7 and 9. Although cord blood pDC are unable to produce IFN-α after stimulation, they retain their capacity to mature into antigen presenting cells. To gain insights into the mechanisms of pDC regulation in cord blood, we investigated the effects of immune regulators secreted by the placenta on the differentiation and function of pDC. Using in vitro differentiated pDC, we analyzed the effect of progesterone (PG), IL-10 and TGF-β, separately or in combination, on pDC differentiation and activation. The data revealed that supra-physiological concentrations of these three factors could individually impair pDC differentiation and IFN-α production. Physiological concentrations of PG, IL-10 or TGF-β, individually, had low impact on pDC while in combination they were able to modulate IFN-α production. We also showed that PG, IL-10 or TGF-β failed to induce the expression of micro-RNA 146a and 155 in pDC. Lastly, our results indicated that PG, IL-10 and TGF-β were present at high levels in cord blood as compared to adult blood. These results, therefore, shed new light on the synergy of immune regulators secreted by the placenta and their impact on foetal and neonatal immune responses.

Le sang de cordon ombilical et placentaire constitue aujourd’hui une ressource biologique prisée puisqu’il contient des cellules souches et un haut taux d’hémoglobine utilisées lors de traitements thérapeutiques. Considérant les applications actuelles et celles envisagées dans le futur, le sang de cordon peut être mis en banque privée pour un usage autologue ou familiale. Il peut également être donné à une banque publique pour des greffes allogéniques ou pour la recherche. Bien qu’inévitablement séparé du corps humain au moment de la naissance de chaque enfant, ce sang n’est pas considéré comme un déchet d’aucune valeur et un consentement doit être obtenu avant tout prélèvement et toute utilisation. Ce mémoire présente une revue empirique de la pratique de mise en banque canadienne. Cette analyse révèle que les banques s’assurent d’obtenir un consentement préalable à la collecte, à l’entreposage et à l’utilisation du sang de cordon, sans toutefois que l’origine de ce consentement soit uniforme. Elle permet également de constater que les acteurs impliqués dans la mise en banque semblent considérer le sang de cordon comme un bien susceptible d’appropriation. Ce mémoire aborde ainsi la question de savoir qui, de la mère ou de l’enfant, doit consentir à ce que le sang de cordon soit d’abord prélevé pour ensuite être mis en banque. Il traite également de la propriété de ce sang une fois séparé du corps humain et des contraintes juridiques encadrant son aliénation. Il suggère au final certains aménagements pour l’utilisation du sang de cordon en recherche de même qu’une uniformisation des règles d’entreposage privé. / The umbilical and placental cord blood is now a prized biological resource as it contains stem cells and high hemoglobin level used in therapeutic treatments. Considering the current applications and those envisaged in the future, cord blood can be secured in private banking for autologous or family use. It can also be given to a public bank for allogeneic transplants or research. Cord blood should not be considered as a human waste without value, even if it is inevitably produced at the time of birth of each child. Consent must be obtained before any withdrawal and use. This study presents an empirical review of Canadian cord blood banking practice. This analysis reveals that banks do obtain prior consent to the collection, storage and use of cord blood. However, the source of this consent differs. It also shows that the actors involved in the banking process consider cord blood as a movable property that can be transferred to one another. This study addresses the question of who, between the mother and the child, should consent to cord blood collection and storage. It deals with blood’s ownership once separated from the human body and the legal constraints applicable to its alienation and use. It also suggests modifications to the legal framework for cord blood research as well as a standardization of private storage rules.

L’importance des modificateurs de la chromatine dans la régulation de l’hématopoïèse et des hémopathies malignes est illustrée par l’histone méthyltransférase Mixed-Lineage Leukemia (MLL) qui est essentielle au maintien des cellules souches hématopoïétiques (CSH) et dont le gène correspondant, MLL, est réarrangé dans plus de 70% des leucémies du nourrisson. Les histones déméthylases (HDM), récemment découvertes, sont aussi impliquées dans le destin des CSH et des hémopathies malignes. Le but de ce projet est d’étudier l’expression des HDM dans les cellules hématopoïétiques normales et leucémiques afin d’identifier de potentiels régulateurs de leur destin. Nous avons réalisé un profil d'expression génique des HDM par qRT-PCR et par séquençage du transcriptome (RNA-seq) dans des cellules de sang de cordon (cellules CD34+ enrichies en CSH et cellules différenciées) et des cellules de leucémie aiguë myéloïde (LAM) avec réarrangement MLL. Les deux techniques montrent une expression différentielle des HDM entre les populations cellulaires. KDM5B et KDM1A sont surexprimés dans les cellules CD34+ par rapport aux cellules différenciées. De plus, KDM4A et PADI2 sont surexprimés dans les cellules leucémiques par rapport aux cellules normales. Des études fonctionnelles permettront de déterminer si la modulation de ces candidats peut être utilisée dans des stratégies d’expansion des CSH, ou comme cible thérapeutique anti-leucémique. Nous avons aussi développé et validé un nouveau test diagnostique pour détecter les mutations de GATA2 qui code pour un facteur de transcription clé de l’hématopoïèse impliqué dans les LAM. Ces travaux soulignent l’importance des facteurs nucléaires dans la régulation de l’hématopoïèse normale et leucémique. / The importance of chromatin modifiers in regulation of hematopoiesis and hematologic malignancies is illustrated by the Mixed-Lineage Leukemia (MLL) histone methyltransferase, which is essential to maintain hematopoietic stem cells (HSC) and whose corresponding gene, MLL, is rearranged in over 70% of infant leukemia. The recently discovered histone demethylases (HDM) are also involved in HSC fate and in hematologic malignancies. The purpose of this project is to study the expression of HDM in normal and leukemic hematopoietic cells to identify potential regulators of their fate. We performed a comprehensive gene expression profile of HDM by qRTPCR and transcriptome sequencing (RNA-seq) in cord blood cells (CD34+ cells enriched in HSC and differentiated cells) and in acute myeloid leukemia (AML) cells with MLL rearrangement. Both techniques revealed differential expression of HDM between these cell populations. KDM5B and KDM1A are overexpressed in CD34+ cells compared to differentiated cells. Moreover, KDM4A and PADI2 are overexpressed in leukemic cells compared to normal cells. Functional studies will determine whether modulation of these candidates can be used in HSC expansion strategies or as anti-leukemic drug target. We have also developed and validated a new diagnostic test to detect mutations of GATA2, a gene encoding a key transcription factor involved in hematopoiesis and in AML. This work highlights the importance of nuclear factors in the regulation of normal and leukemic hematopoiesis.