Glutathione S-transferases (GST, EC2.5.1.18) are a family of multifunctional, dimeric enzymes that catalyse the nucleophilic attack of the tripeptide glutathione (&amp / #947 / -L-glutamyl-L-cysteinyl-L-glycine) on lipophilic compounds with electrophilic centres. The primary function of GSTs is generally considered to be the detoxification of both endogenous and xenobiotic compounds. Cytosolic GSTs have been grouped into eleven distinct classes as: (A) / Alpha, (M) / Mu, (P) / Pi, (S) / Sigma, (T) / Theta, (Z) / Zeta, (F) / Phi, (U) / Tau, (B) / Beta, (O) / Omega and (L) / Lambda. iv In this study, the total RNAs from Pinus brutia needles were isolated, GST Zeta cDNA was prepared by RT-PCR, the length of the insert was elongated by applying 5&#039 / RACE (Rapid Amplification for cDNA ends) method and the identity of the insert was checked by sequencing. The amino acid sequence of GST-Zeta was deduced as composed of 226 amino acids. The genomic DNA was also isolated from Pinus brutia needles, amplified by PCR and sequenced, and compared to the sequence of cDNA. The expression level of GST-Zeta in individual trees of Pinus brutia were examined by Northern blot analysis, and compared to their thiol contents. The mRNA levels varied up to three-fold, whereas GSH amounts varied approximately 1.8 fold, and there were no correlation between the GST-Zeta expression and GSH concentration. GST enzyme with activity towards CDNB was isolated and purified from Pinus brutia needles in 1.95 % yield with a purification factor of 15.45-fold. The purification protocol included a sequential chromatography on Sephadex G-25 column, DEAE cellulose anion exchanger liquid chromatography column, and S-hexylglutathione agarose affinity columns. The purified GST showed specific activity towards CDNB as 2022 nmole/min/mg. The GST purified from needles had a molecular weight (Mr) value of about 24.000 which was confirmed by SDS-PAGE.

Submitted by ANNITA MORAIS GIRARDI null (annitamgirardi@gmail.com) on 2016-02-16T19:49:59Z No. of bitstreams: 1 Tese_Annita_Morais_Girardi.pdf: 19183057 bytes, checksum: cf7a9853bcc87aef37b3ca91a2afceea (MD5) / Approved for entry into archive by Sandra Manzano de Almeida (smanzano@marilia.unesp.br) on 2016-02-17T13:22:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 girardi_am_dr_jabo.pdf: 19183057 bytes, checksum: cf7a9853bcc87aef37b3ca91a2afceea (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-17T13:22:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 girardi_am_dr_jabo.pdf: 19183057 bytes, checksum: cf7a9853bcc87aef37b3ca91a2afceea (MD5) Previous issue date: 2016-01-26 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Este estudo avaliou o uso da termografia infravermelha e do exame radiológico digital como ferramentas de diagnóstico precoce da laminite em ovinos com acidose ruminal subaguda induzida experimentalmente e os efeitos da ingestão prolongada de alta proporção de alimento concentrado sobre as variáveis clínicas e laboratoriais. Foram utilizadas sete ovelhas adultas, com cânulas ruminais permanentes, que não tiveram prévio contato com alimento concentrado. Para a indução da acidose ruminal, incluiu-se ao volumoso, diariamente, 10% de alimento concentrado até atingir 80%, porcentagem mantida até completarem 19 semanas. A observação dos sinais de diarreia deu-se do quarto ao 22º dia e de laminite do quinto ao 24º dia. O fluido ruminal foi predominantemente líquido, de odor ácido e coloração amarelada. Observou-se elevação inicial nos valores da frequência cardíaca, tempo de sedimentação e flotação no fluido ruminal, plaquetas, neutrófilos segmentados, AST, FA, GGT, cálcio ionizado, magnésio, glicose, ureia, triglicérides e bilirrubinas indireta e total. No início do experimento, notou-se redução da frequência respiratória, linfocitopenia, monocitopenia, hipocalcemia, hipofosfatemia, hiponatremia, hipoproteinemia e hipocolesterolemia. A frequência de movimentos ruminais, o tempo de redução do azul de metileno, os níveis sanguíneos de creatinina, bilirrubina direta, lactato e CK foram reduzidos, enquanto as médias de temperatura, peso e escore corporal, eosinófilos, albumina, cloretos e potássio no sangue aumentaram durante todo o período de observação. Redução do pH ruminal ocorreu nos primeiros dias, a despeito de sua manutenção acima de 5,5 durante as 19 semanas de observação. Mecanismos compensatórios respiratórios e metabólicos, principalmente a acidificação da urina, mantiveram o pH sanguíneo dentro dos limites fisiológicos considerados para a espécie ovina. Dezesseis frações proteicas séricas foram separadas pela eletroforese, dentre elas oito proteínas identificadas pelos seus pesos moleculares, de funções desconhecidas. A maioria das proteínas de fase aguda e as imunoglobulinas identificadas no fracionamento eletroforético variaram durante o período de observação, sugerindo reação inflamatória. Nenhuma alteração macroscópica foi detectada à necropsia. A radiologia digital não permitiu a identificação de alterações podais decorrentes de laminite durante o período de avaliação. A termografia infravermelha detectou aumentos na temperatura da parede do casco mesmo sem a manifestação clínica de dor, indicando que esta técnica pode ser uma ferramenta útil para detectar laminite em ovinos numa fase precoce de evolução da doença. / This study evaluated the use of infrared termography and digital radiologic examination as early diagnostic tools for laminitis in sheep with experimentally induced subacute ruminal acidosis, and the effects of long-term ingestion of a high concentrate diet on clinical and laboratory variables. Seven adult ewes with permanent rumen cannula were used, which did not have any previous ingestion of concentrate feed. For the induction of ruminal acidosis, it was added to the roughage, 10% of concentrate feed until reach 80%, percentage held to the end of the 19-week experiment. Diarrhea signs were observed from fourth to 22nd day and laminitis from fifth to 24th day. Ruminal fluid was predominantly liquid, sour-smelling and yellowish. Initial increases of heart rate, sedimentation and flotation time, platelets, segmented neutrophils, AST, ALP, GGT, ionized calcium, magnesium, glucose, urea, triglycerides, indirect and total bilirubin were noted. At the beginning of the experiment, there was reduction of respiratory rate, lymphocytopenia, monocytopenia, hypocalcemia, hypophosphatemia, hyponatremia, hypoproteinemia, and hypocholesterolemia. Ruminal movement rate, methylene blue reduction time, creatinine, direct bilirubin, lactate and CK blood levels decreased, while body temperature, weight and score, eosinophils, albumin, chloride and potassium blood levels increase throughout the period. Ruminal pH reduction occurred within the first days, despite its maintenance above 5.5 during the 19 weeks. Respiratory and metabolic mechanisms, mainly urine acidification, remained the blood pH between physiologic limits for sheep. Sixteen protein fractions were separated by electrophoresis, among them eight proteins of unknown functions, identified by their molecular weights. Most acute phase proteins and the immunoglobulins identified in the electrophoretic fractionation varied throughout the observation period, suggesting inflammation. No macroscopic alteration was detected at necropsy. The digital radiology did not allow the identification of podal changes resulting from laminitis during the trial period. Infrared thermography has detected increases in the maximum temperature of the hoof wall, even without the clinical manifestation of pain, indicating that this technique can be an useful tool to detect laminitis in sheep at an early stage of the disease. / FAPESP: 2012/09111-7

Orientador: Wilma Aparecida Starke Buzetti / Banca: Caris Maroni Nunes / Banca: Maria Conceição Zocoller Seno / Resumo: Toxocara vitulorum é um parasita nematódeo de alta freqüência no trato intestinal de búfalos, particularmente em bezerros búfalos de um a três meses de idade. Devido à sua alta morbidade e mortalidade, causa consideráveis prejuízos a bubalinocultura. A pesquisa objetivou a obtenção de antígenos de extrato larval solúvel bruto (Ex), do material excretor-secretor (ES) de larvas infectantes e do líquido perientérico (Pe) de adultos de T. vitulorum, bem como a separação das frações protéicas na mistura pelo SDS-PAGE, seguida da análise imunológica por "Western blot" (WB), utilizando-se soros imunes e colostros de búfalos naturalmente infectados com T. vitulorum além de camundongos imunes. O acompanhamento do quadro parasitário dos bezerros búfalos também foi realizado. Pôde-se verificar que os três antígenos, Pe, Ex e ES, apresentaram mobilidades eletroforéticas pelo SDS-PAGE revelando nove (11,5, 14,2, 31, 38, 58, 76, 88, 112 e 165 KDa), onze (11,2, 13,3, 16,5, 22, 25, 32, 43, 53, 68, 82 e 96 KDa) e oito (19, 48, 56, 64, 90, 110, 150 e 190 KDa) bandas protéicas, respectivamente. A maioria dessas frações separadas pela eletroforese, foi reconhecida por todos as amostras de soros e pelo colostro, quando analisada pelo WB. No entanto, somente as bandas de alto peso molecular (68 - 190 KDa) persistiram nos grupos de bezerros búfalos que se encontravam no pico, declínio ou expulsão e na ausência ou autocura, à exceção do antígeno ES, que desapareceu durante o processo de autocura. Já os soros de bezerros búfalos com um de vida, que mamaram o colostro e os daqueles que se encontravam em fase de aparecimento ou ascensão, revelaram com as mesmas frações detectadas no soro e no colostro das búfalas. Os três antígenos reagiram de forma cruzada entre si, quando foram testados com soros homólogos e heterólogos de camundongos imunizados experimentalmente com estes antígenos de T. vitulorum / Abstract: Toxocara vitulorum is a nematode parasite of small intestine of cattle and water buffaloes particularly buffalo calves with one to three months of age, causing high morbidity and mortality. The purpose of this research was the antigen obtaintion and characterization of crude soluble larval extract (Ex), excretory-secretory (ES) of infective larvae, and perienteric fluid (Pe) from adults of T. vitulorum, as well as the separation of protein fractions from the antigenic mixture by SDS-PAGE and analysis of each band by Western blot (WB), using immune sera and colostrum of buffaloes naturally infected by T. vitulorum, and mice experimentally immunized. The parasitological status of the buffalo calves was also evaluated using sequentially coprological examinations. The results showed that three antigens, Pe, Ex and ES, revealed nine (11,5, 14,2, 31, 38, 58, 76, 88, 112, and 165 KDa), eleven (11,2, 13,3, 16,5, 22, 25, 32, 43, 53, 68, 82, and 96 KDa) and eight (19, 48, 56, 64, 90, 110, 150, and 190 KDa) protein bands by SDS-PAGE, respectively. The majority of these isolated bands were recognized by sera and colostrum of all groups of infected animals (buffalo cows one day post parturition and buffalo calves in five different periods of T. vitulorum infection) analyzed by WB. However, only the fractions of high molecular weight (68 - 190 KDa) persisted in the groups of buffalo calves at maximum peak of infection, expulsion and post-expulsion of the parasite or self-cure process, excepting ES antigen, that was not detected during the self-cure process. Sera of buffalo calves at one day of age, after suckling the colostrum and at the beginning of infection reacted with the same bands detected by serum and colostrum of the buffalo cows. The three antigens showed crossed reaction among themselves, when they were tested with homologous and heterologous sera of mice experimentally immunized with them / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:46Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-02-23Bitstream added on 2014-06-13T20:51:05Z : No. of bitstreams: 1 rocha_tg_me_jabo.pdf: 837046 bytes, checksum: f72346486eb135d1df17c2bfd41fd6ee (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O objetivo do estudo foi avaliar a transferência de imunidade passiva (TIP) de vacas Canchim aos seus bezerros. Um grupo experimental foi constituído por 13 vacas primíparas e seus bezerros, e o outro por 13 vacas pluríparas e seus bezerros. Foram coletadas amostras de sangue venoso dos bezerros e secreções lácteas das vacas até 1 hora e 1, 2, 7, 15 e 30 dias após o nascimento/parto. No hemograma, notaram-se alterações características do período neonatal, como redução na contagem de hemácias, teor de hemoglobina e volume globular após a ingestão do colostro, além de aumento na contagem de linfócitos e redução da contagem de neutrófilos segmentados. Os exames bioquímicos séricos revelaram aumento nas atividades de GGT (até 3.746 U/L) e ALP (até 1.030 U/L) e nos teores de proteína total (até 7,77 g/dL), globulinas (até 6,01 g/dL), IgA (até 322 mg/dL) e IgG (até 2.918 mg/dL) após a ingestão do colostro, seguidos por redução gradual nestes parâmetros até os 30 dias de idade. As avaliações bioquímicas das secreções lácteas revelaram alta concentração de todos os componentes colostrais analisados, com redução gradual nos seus teores no decorrer do período experimental, à exceção dos minerais, cujas concentrações oscilaram pouco entre os momentos. A TIP foi eficiente em ambos os grupos de bezerros, e a qualidade das secreções lácteas, embora diferentes entre vacas primíparas e pluríparas, não interferiu na passagem de imunoglobulinas da vaca para o bezerro. / The aim of this study was to evaluate the passive immunity transfer from Canchim cows to its calves. One experimental group comprised 13 primiparous cows and its calves and the other group, 13 multiparous cows and its calves. Samples of calves’ venous blood and cow`s lacteal secretions were collected until 1 hour and 1, 2, 7, 15 and 30 days after birth/parturition. In the hemogram, characteristic alterations of this period, such as reduction in the erytocyte count, hemoglobin concentration and corpuscular volume after colostrum intake and rise in the lymphocyte count and reduction in the neutrophil count were noticed. The serum biochemistry revealed augmentation in the GGT (up to 3,746 U/L) and ALP (up to 1,030 U/L) activities and in the total protein (up to 7.77 g/dL), globulin (up to 6.01 g/dL), IgA (up to 322 mg/dL) and IgG (up to 2,918 mg/dL) concentrations after colostrum intake, followed by a gradual reduction in these parameters until 30 days of age. The biochemical evaluation of the lacteal secretions revealed high concentrations of all the colostral components analysed, with gradual reduction in their concentrations along the experimental period, except for the minerals, which showed little oscillation between the moments. The passive immunity transfer was efficient in both groups of calves, and the quality of the lacteal secretions, although different between primiparous and multiparous cows, did not interfere in the transference of immunoglobulins from the cows to the calves.

Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2017-03-23T18:50:16Z No. of bitstreams: 1 GracianaCleciaDantas_TESE.pdf: 5111296 bytes, checksum: b36fdda3c626c34a46d304ad7884c2d2 (MD5) / Approved for entry into archive by Monica Paiva (monicalpaiva@hotmail.com) on 2017-03-23T18:58:12Z (GMT) No. of bitstreams: 1 GracianaCleciaDantas_TESE.pdf: 5111296 bytes, checksum: b36fdda3c626c34a46d304ad7884c2d2 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-23T18:58:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 GracianaCleciaDantas_TESE.pdf: 5111296 bytes, checksum: b36fdda3c626c34a46d304ad7884c2d2 (MD5) Previous issue date: 2015-05-29 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior (CAPES) / O uso de agrot?xicos em cultivo agr?cola ? cada vez maior. Os inseticidas qu?micos usados na agroind?stria causam grandes preocupa??es como a contamina??o ambiental e a falta de seletividade aos organismos. Uma alternativa para esse problema ? a utiliza??o de bioinseticidas. Os bioinseticidas s?o mais seguros que os agrot?xicos comuns e apresentam vantagens como menor toxicidade e alta especificidade. Ademais, podem ser utilizados em menor quantidade, decomp?em-se mais r?pido e sua utiliza??o associada com os inseticidas sint?ticos faz com que o uso de agrot?xicos seja menor, causando baixo impacto ambiental. Em particular, bioinseticidas do tipo baculov?rus t?m sido apontados como uma op??o de substitui??o a estes inseticidas qu?micos na agricultura. Neste trabalho, foi realizada a produ??o in vitro do baculov?rus Spodoptera frugiperda nucleopolyhedrovirus e o estudo do seu perfil eletrofor?tico com base nas prote?nas virais presentes nos v?rus extracelulares deste baculov?rus. As part?culas de v?rus extracelulares obtidas durante a passagem seriada do baculov?rus foram analisadas por eletroforese em gel desnaturante e, como esperado, a poliedrina - prote?na respons?vel pela forma??o do corpo de oclus?o - com aproximadamente 30 kDa foi destaque em todas as passagens analisadas. Prote?nas na regi?o entre 14,4 e 97 kDa tamb?m foram detectadas. A an?lise do efeito da adi??o do horm?nio ?-ecdisona extra?do do Ginseng brasileiro e do horm?nio ecdisona sint?tico na produ??o do baculov?rus Spodoptera foi realizada na terceira e quarta passagens em c?lulas Sf21, momento em que a forma??o dos corpos de oclus?o foi reduzida. Os resultados mostraram que o horm?nio ecdisona n?o influenciou na produ??o dos corpos de oclus?o na terceira passagem. Por?m, na quarta passagem ao se adicionar o horm?nio ecdisona, tanto o sint?tico como o extra?do do Ginseng brasileiro, houve um aumento aproximado de duas vezes na forma??o dos corpos de oclus?o quando comparados ? produ??o sem adi??o de ecdisona. Utilizando este processo de infec??o, foi realizada uma modelagem e simula??o matem?tica que representasse o mecanismo de produ??o do bioinseticida. / O uso de agrot?xicos em cultivo agr?cola ? cada vez maior. Os inseticidas qu?micos usados na agroind?stria causam grandes preocupa??es como a contamina??o ambiental e a falta de seletividade aos organismos. Uma alternativa para esse problema ? a utiliza??o de bioinseticidas. Os bioinseticidas s?o mais seguros que os agrot?xicos comuns e apresentam vantagens como menor toxicidade e alta especificidade. Ademais, podem ser utilizados em menor quantidade, decomp?em-se mais r?pido e sua utiliza??o associada com os inseticidas sint?ticos faz com que o uso de agrot?xicos seja menor, causando baixo impacto ambiental. Em particular, bioinseticidas do tipo baculov?rus t?m sido apontados como uma op??o de substitui??o a estes inseticidas qu?micos na agricultura. Neste trabalho, foi realizada a produ??o in vitro do baculov?rus Spodoptera frugiperda nucleopolyhedrovirus e o estudo do seu perfil eletrofor?tico com base nas prote?nas virais presentes nos v?rus extracelulares deste baculov?rus. As part?culas de v?rus extracelulares obtidas durante a passagem seriada do baculov?rus foram analisadas por eletroforese em gel desnaturante e, como esperado, a poliedrina - prote?na respons?vel pela forma??o do corpo de oclus?o - com aproximadamente 30 kDa foi destaque em todas as passagens analisadas. Prote?nas na regi?o entre 14,4 e 97 kDa tamb?m foram detectadas. A an?lise do efeito da adi??o do horm?nio ?-ecdisona extra?do do Ginseng brasileiro e do horm?nio ecdisona sint?tico na produ??o do baculov?rus Spodoptera foi realizada na terceira e quarta passagens em c?lulas Sf21, momento em que a forma??o dos corpos de oclus?o foi reduzida. Os resultados mostraram que o horm?nio ecdisona n?o influenciou na produ??o dos corpos de oclus?o na terceira passagem. Por?m, na quarta passagem ao se adicionar o horm?nio ecdisona, tanto o sint?tico como o extra?do do Ginseng brasileiro, houve um aumento aproximado de duas vezes na forma??o dos corpos de oclus?o quando comparados ? produ??o sem adi??o de ecdisona. Utilizando este processo de infec??o, foi realizada uma modelagem e simula??o matem?tica que representasse o mecanismo de produ??o do bioinseticida.

Le travail de recherche propose et développe un cadre de système des systèmes (SdS) pour l’analyse de risques des installations industrielles et des infrastructures critiques. Les méthodes pour la représentation, la modélisation et la simulation d’un système sont développées pour identifier les particularités du SdS quant à leur vulnérabilité et leur résilience physique à des défaillances aléatoires et risques naturels. Plusieurs techniques de représentation, telles que l’arbre de défaillances, le Muir Web, la modélisation hiérarchique, le Goal Tree Success Tree – Dynamic Master Logic Diagram, sont étudiées et approfondies depuis l’origine pour s’adapter aux objectifs de l’analyse de SdS. Une méthode de représentation est développée ex novo, à savoir, le graphe hiérarchique. Dans ces cadres de représentation, des états binaires et multiples sont utilisés pour modéliser les performances des SdS à analyser. La simulation Monte Carlo et l’analyse d’intervalle sont combinées pour évaluer quantitativement des modèles de SdS en présence d’incertitude (due à la variabilité naturelle d’un phénomène ou au manque d’information). La mise en oeuvre de ces approches est illustrée dans deux domaines d’application : l’évaluation du risque d’événements externes et la vulnérabilité d’infrastructures critiques. / This thesis propounds and develops a system-of-systems (SoS) framework for the risk analysis of industrial installations and critical infrastructures. System representation, modeling and simulation methods are developed to capture the peculiar features of SoS, with respect to their vulnerability and physical resilience to random failures and natural hazards. Several representation techniques of literature, i.e., Fault Tree, Muir Web, Hierarchical Modeling, Goal Tree Success Tree – Dynamic Master Logic Diagram, are explored and originally extended/tailored to fit the purpose of SoS analysis. One representation method is developed ex-novo, namely the Hierarchical Graph. Within these representation frameworks, binary and multiple states are used to model the performances of the SoS under analysis. Monte Carlo simulation and interval analysis are combined for the quantitative evaluation of the SoS models in presence of uncertainty (due to both randomness and lack of knowledge). Examples of analyses are carried out within two application areas: external event risk assessment and vulnerability of critical infrastructures.

Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2017-04-06T21:03:10Z No. of bitstreams: 2 Tese - Leonardo Guimarães de Oliveira - 2016.pdf: 2541166 bytes, checksum: 5b0501be9f076d03111ca00fcf4980a7 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-04-07T11:18:45Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Leonardo Guimarães de Oliveira - 2016.pdf: 2541166 bytes, checksum: 5b0501be9f076d03111ca00fcf4980a7 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-07T11:18:45Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Leonardo Guimarães de Oliveira - 2016.pdf: 2541166 bytes, checksum: 5b0501be9f076d03111ca00fcf4980a7 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-03-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The protein profile of hornless Nellore cattle from a segregating population for meat tenderness of extremes shear force, low extreme group (M) and extreme high (D) group, showed differentially expressed proteins. They had greater relative abundance of proteins of the glycolytic process in group M and proteins of the oxidative metabolism evidenced more expressed in group D, fact that probably is correlated to the final tenderness of the meat. Only identified in group D, the cytochrome c protein indicates induction of the apoptotic process in this group of animals. Structural proteins were identified in group M, indicating a possible greater proteolysis. Calpastatin was only identified in group D, this protein is highly related to the final meat tenderness because it is a natural inhibitor of the calpain. Separation of calpastatin by ion exchange column chromatography of two different muscles described two peaks of calpain inhibitory activity: peak 1 (CAST1) and peak 2 (CAST2). CAST 1 activity increased during the post-mortem period in Triceps brachii and showed no difference between days in Longissimus dorsi and on the other hand, total activity of calpastatin and CAST 2 decreased during post-mortem aging. The 115 kDa band of calpastatin decreased its intensity during post-mortem aging in both muscles with more than 70% of the change occurring on the first day. The mitochondrial ATP synthase beta subunit proteins increased and Succinyl CoA ligase decreased after aging and Adenylate kinase isoenzyme decreased on day 7. Calpastatin peaks had weak phosphorylated bands and had different IP and MW patches than 2D-SDS -PAGE. During the purification process of the calpastatin peaks the activity per mg of protein increased but lost half of the total activity presented during the first purification step. For peak 2 of calpastatin the specific activity increased 139.8 times and at the end of this process 36% of the total activity remained. Purified calpastatin was identified on the second-size gel having a molecular weight similar to the western blot. Spots from calpastatin peak 1 and two from calpastatin peak 2 were identified as peptides belonging to the calpastatin molecule. Sequence of peptides identified in Spot from purified peak 1 as part of the inhibitory domain III and IV and of the C-terminus and from the purified peak 2 a sequence of peptides identified as part of the inhibitory domain I, II and III. These results lead us to believe that both peaks, in this case, are degradation products of the intact molecule, and probably the small peptides are broken down during the process. The results of the present study show that purification of distinct forms of active calpastatin is possible, however, the intact form of calpastatin was not present in this purification. The presence of peptides was not conclusive to determine the origin and composition of each active peak. / O perfil protéico de animais da raça nelore mocho de uma população segregante para a maciez da carne de extremos valores de força de cisalhamento, grupo extremo baixo (M) e grupo extremo alto (D), apresentou proteínas diferentemente expressas as quais houve maior abundância relativa de proteínas do processo glicolítico no grupo M e proteínas do metabolismo oxidativo evidenciadas mais expressas no grupo D, fato que provavelmente está correlacionado à maciez final da carne. Apenas identificada no grupo D, a proteína citocromo c indica indução do processo apoptótico neste grupo de animais. Proteínas estruturais foram identificadas no grupo M, indicando uma possível maior proteólise. A calpastatina foi somente identificada no grupo D, esta proteína está altamente relacionada com a maciez final da carne por ser inibidora natural das calpaínas. A separação de calpastatina por cromatografia em coluna de troca iônica de dois músculos diferentes descreveu dois picos de actividade inibitória de calpaínas: pico 1 (CAST1) e pico 2 (CAST2). Atividade de CAST 1 aumentada durante o período post mortem no Triceps brachii e não apresentou diferença entre os dias em Longissimus dorsi e por outro lado, a atividade total de calpastatina e CAST 2 diminuiu durante o envelhecimento post mortem. A banda de 115 kDa da calpastatina diminuiu sua intensidade durante o envelhecimento post mortem em ambos os músculos com mais de 70% da alteração ocorrendo no primeiro dia. As proteínas mitocondriais da subunidade ATP sintase beta aumentaram e a Succinil-CoA ligase diminuiu após o envelhecimento e a Adenilato quinase isoenzima diminuiu no dia 7. Os picos de calpastatina apresentavam faixas fosforiladas fracas e apresentavam manchas em IP e MW diferentes do que 2D-SDS-PAGE. Durante o processo de purificação dos picos de calpastatina a actividade por mg de proteína aumentou mas perdeu metade da atividade total apresentada durante a primeira etapa de purificação. Para o pico 2 de calpastatina a actividade específica aumentou 139,8 vezes e no final deste processo permaneceu 36% da atividade total. A calpastatina purificada foi identificada no gel de segunda dimensão com um peso molecular semelhante ao western blot. Spots do pico 1 da calpastatina e dois do pico 2 da calpastatina foram identificados como peptídeos pertencentes à molécula da calpastatina. Sequêcia de peptídeos identificados em Spot a partir do pico 1 purificado como parte do domínio inibidor III e IV e do terminal C e do pico 2 purificado uma sequêcia de peptideos identificados como parte do domínio inibidor I, II e III. Estes resultados levam-nos a crer que ambos os picos, neste caso, são produtos de degradação da molécula intacta e, provavelmente, os pequenos peptideos são quebrados durante o processo. Os resultados do presente estudo mostram que é possível a purificação de formas distintas de calpastatina activa, contudo a forma intacta de calpastatina não estava presente nesta purificação. A presença de peptídeos não foi conclusiva para determinar a origem ea composição de cada pico ativo.

Free-living marine nematodes are the most ubiquitous, abundant and diverse meiofaunal component of benthic communities. These are excellent model organisms, due to its short life span, wide availability and feasibility to cultivate with minimum laboratory facilities. In this study, a population of Diplolaimella dievengatensis Jacobs 1991 (Nematoda, Monhysteridae) from the relatively Pristine estuary of the Guaratuba River in São Paulo, Brazil was isolated and cultivated. The goals were; i- to apply an integrative taxonomic approach in order to compare this population from Brazil with another from the species type-locality in the Belgian Coast, with regard to morphological, life-cycle and the 18S gene of the rDNA molecular data; and ii- to compare, at the light of life history theory, the responses of life history parameters such as; fecundity, growth and survivorship of D. dievengatensis (here as a slower species) and Litoditis marina (Bastian, 1865) (Nematoda, Rhabditidae) (as a faster species) under sublethal exposition to the sodium dodecyl sulfate (SDS) surfactant. The population from Brazil was similar to that from Belgium coast in all parameters. Although morphometric analyses considered the Brazilian D. dievengatensis isometrically larger than the Belgian population regarding some characters, the presence of all diagnostic characters confirmed the similarity of both species. The life-cycle, hatching time, final body length, and biomass parameters were similar in both populations, in which females were larger than males. The population growth, measured as intrinsic rate of natural increase was slightly higher for the D. dievengatensis from Brazil (rm=0.41), than the European population (rm =0.348). Molecular comparison on Genbank showed 99.4% of similarity between both populations, indicating therefore, that D. dievengatensis from Brazil is similar to those from Belgium. In the chapter ii, both species responded differently to SDS exposition. Growth and reproduction rate of D. dievengatensis surprisingly were enhanced at low and intermediate concentrations of SDS (0.001 and 0.003%), while for L. marina these parameters were reduced in all SDS concentrations tested (0.001, 0.003 and 0.006%). The SDS did not affect the survivorship of adults of the slower specie. On the other hand, survivorship of adults of the fast species was significantly affected by SDS and this effect was dependent on adult gender, with reduced rates of males exposed to 0.006% SDS. Although both species are located nearby along the fast-slow continuum, they responded distinctly to of the toxic SDS effect. Effects over L. marina met the trend of faster species in allocating fewer investments in defenses against physiological injuries and on their own somatic maintenance. We propose that the apparent lower resistance of this faster species under stress at the individual level is balanced by their higher reproductive rates, conferring higher resilience to this species at the population level. Finally, it was demonstrated that the marine nematode D. dievengatensis is an important native model organism which can be used in a wide range of studies and experimental tests. Identifying and understanding differential effects of stress in the context of life-history theory is an important aspect which enhanced our understanding about the threats posed by anthropogenic activities on natural communities / Nematodas marinhos de vida livre são o mais onipresentes, abundantes e diversos componentes da meiofauna em comunidades bênticas. São excelentes organismos modelo devido a seu curto ciclo de vida, ampla disponibilidade e viabilidade de cultivo com mínima estrutura laboratorial. Neste estudo, uma população de Diplolaimella dievengatensis Jacobs 1991 (Nematoda, Monhysteridae) do estuário relativamente prístino do rio Guaratuba, São Paulo, Brasil foi isolada e cultivada. Os objetivos foram: ii- aplicar uma abordagem taxonômica integrativa a fim de comparar esta população do Brasil com outra da localidade tipo dessa espécie, da costa da Bélgica, com relação à dados morfológicos, do ciclo de vida e molecular do gene 18S do rDNA; e ii-comparar, à luz da teoria da historia de vida, repostas de parâmetros do ciclo de vida tais como: fecundidade, crescimento e sobrevivência de D. dievengatensis (aqui como espécies mais lenta) e Litoditis marina (Bastian, 1865) (Nematoda, Rhabditidae) (como espécie rápida) sob exposição subletal ao surfactante dodecil sulfato de sódio (DSS) . A população do Brasil foi similar a da costa da Bélgica em todos os parâmetros. Embora analises morfométricas consideraram D. dievengatensis do Brasil isometricamente maior que a população belga em relação em algumas características, a presença de todos os caracteres diagnósticos confirmaram a similaridade de ambas as espécies. Os parâmetros de ciclo de vida, tempo de eclosão, comprimento corporal final e biomassa foram similares em ambas as populações, nas quais fêmeas foram maiores que machos. Crescimento populacional, mensurado como taxa intrínseca de crescimento natural foi ligeiramente mais alta para D. dievengatensisdo Brasil (rm=0.41), que para a população europeia (rm=0.348). Comparações moleculares no Genbank mostraram 99.4% de similaridade entre ambas populações, indicando portanto que a população do Brasil é similar a D. dievengatensis belga. No capítulo ii, ambas as espécies responderam distintamente a exposição ao SDS. Supreendentemente as taxas de crescimento e de reprodução de D. dievengatensis foram incrementadas sob concentrações mais baixas e intermediárias (0.001 e 0.003%), enquanto para L. marina esses parâmetros foram reduzidos em todas as concentrações de DSS testadas (0.001, 0.003 e 0.006%). O DSS não afetou a sobrevivência de adultos da espécie mais lenta. Por outro lado, a sobrevivência de adultos da espécie mais rápida foi significativamente afetada pelo SDS e esse efeito foi dependente do sexo, com taxas reduzidas em machos expostos a 0.006 % de DSS. Embora ambas as espécies estejam proximamente dispostas ao longo do gradiente \"rápido-lento\", elas responderam diferentemente ao efeito tóxico do DSS. Efeitos sobre L marina se enquadram no padrão de espécies mais rápidas ao alocar menores investimentos para as defesas contra danos fisiológicos e para sua própria manutenção somática. Nós propomos que a aparente menor resistência desta espécie rápida sob estresse ao nível individual é balanceada por suas altas taxas reprodutivas, conferindo mais alta resiliência a essa espécie ao nível populacional. Por fim, foi demonstrado que D. dievengatensis é um importante organismo modelo nativo que pode ser usado em uma ampla diversidade estudos e testes experimentais. Identificar e compreender diferentes efeitos do estresse dentro do contexto da teoria da história de vida é um aspecto importante, o qual tem aumentado nosso conhecimento sobre as ameaças de atividades antropogênicas sobre comunidades naturais

The diploma thesis deals with the preparation and characterization of catanionic complexes and their possible application to pharmaceutics and medicine. The catanionic complexes were prepared by mixing two oppositely charged surfactants with the concentration of 20 mmol·dm­3 in various volume ratios. Two systems were analyzed – CTAB + SDS and Septonex + SDS. Both systems were prepared in an aqueous and physiological environment. The turbidimetric analyses provided results of the intensity of turbidity of the prepared mixtures. The size and stability of the prepared particles were determined by DLS and ELS measurements. CTAB-rich samples showed significant viscosity changes and they were therefore characterized by rheological measurements. The results of this work show that the asymmetry of alkyl chains, surfactant selection, temperature, and ionic strength have a significant influence on the properties and self-assembly of surfactants in catanionic complexes.

The aim of this work is to study the possibility of microbial production of polyhydroxyalkanoates (PHA). PHA can be used as biodegradable materials. Bacterial strain Cupriavidus necator was used for laboratory production of PHA. This bacterium was cultivated in medium with various precursors to produce copolymers of 3HB with 3HV or 4HB. Another part of the work was aimed at cultivation of C. necator on different waste substrates, especially oils, with the aim to achieve the highest production of polymer. Another large part of the thesis is dedicated to isolation strategies of PHA using enzymes. Commercially used proteases – alcalase and pancreatin – can be used with advantages for digestion of bacterial cells. A number of optimization experiments showed that application of proteases leads to enhancement of PHA purity to about 13%. Purity increase up to 90 % was achieved by adding a surfactant, which promotes the solubility of non-PHA forming polymer. This surfactant increases the purity of 20 % when compared to control. The last part of presented work deals with the use of enzyme solution isolated from Bacillus subtilis medium. Its application to C. necator culture led to the yield of polymer at a purity exceeding 95 %. These results could represent the basis for new isolation strategies, which can lead to more efficient yield of PHA.