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Female reproductive performance is a critical component of sustainable pig production systems. There is abundant evidence of genetic variation in these traits among pig breeds. The aims of this study were to identify quantitative trait loci (QTL) affecting reproductive traits and to identify and characterise positional candidate gene(s) underlying the QTL. A Large White - Meishan F2 population was scanned for QTL with effects on reproductive traits. This analysis revealed 13 putative QTLs on seven different chromosomes with effects on five different traits: ovulation rate (OR), teat number (TN), prenatal survival (PS), total born alive (TBA) and litter size (LS). QTL for PS and LS on chromosome 8 were fine mapped and Secreted Phosphoprotein 1 (SPP1) confirmed as a candidate gene. A genome-wide association study was performed on a diverse population of different breeds and crosses lines, for reproductive traits including LS, TBA, number of stillborn piglets, and number of mummified piglets. Fourteen SNPs were found significantly associated with reproductive traits. The functional study of SPP1 examined the hypothesis that differences in foetal growth may be associated with the effectiveness of conceptus attachment, as measured by SPP1 expression. Patterns of SPP1 mRNA and protein expression in placental and uterine tissues supplying the smallest and a normal-sized foetus from the same uterus were examined in Large White-Landrace (LW-LR), Large White (LW) and Meishan (MS) females 40 and 45 of pregnancy. The smallest LW-LR foetuses tended to have a higher level of SPP1 mRNA in endometrium tissue compared to the normal-sized foetuses. However, placenta expression was higher in the normal-sized foetuses compared to the smallest ones. SPP1 protein levels in normal sized foetuses were significantly higher than in the smallest litter mates for all the tissues. Significantly higher levels of SPP1 mRNA and protein were found in MS compared to LW. In both breeds, significant differences between sizes were found in some tissues, with similar expression patterns in respect to size, for both mRNA and protein in endometrial tissues when compared to contemporary LW. In placenta, the direction of the expression differed between breeds, with a higher expression of mRNA and protein in the normal-sized MS foetuses and in the smallest sized LW foetuses. The comparison of SPP1 expression between different foetal sizes and different breeds revealed associations between breed, foetal size, and SPP1 protein, factors implicated in PS and LS. These results together with the genetic evidence indicate that the potential role of SPP1 in placental and foetal development merits further investigation.

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Parasitas da família trypanosomatidae como dos generos Crithidia, Blastocrithidia, Leptomonas, Hepertomonas e Rhynchoidomona infectam insetos e Phytomonas parasitam plantas. O T. cruzi e L. (L.) chagasi, agentes etiológicos respectivamente da doença de Chagas e da leishmaniose visceral (LV) também fazem parte desta família. Pela similaridade entre estes parasitos alguns estudos tem utilizado os tripanosomatídeos não patogênicos como fonte alternativa de antígenos para o imunodiagnóstico da doença de Chagas e da leishmaniose. Com o objetivo de identificar moléculas em tripanosomatídeos não patogênicos que reagem com anticorpos anti T. cruzi e anti- Leishmania sp, foram utilizados dois preparados antigênicos: a fração excretada-secretada (ES) e o extrato total obtido por digestão química (ET) de L. seymouri, C. deanei, C. fasciculata e C. luciliae, sempre comparados com o T. cruzi e a L. (L.) chagasi. A reatividade diferencial entre anticorpos anti T. cruzi e anti L. (L.) chagasi levou à escolha da L. seymouri, único parasito no qual a fração ES mostrou significativas diferenças de reatividade, a C. deanei apresentou dados semelhantes. Anticorpos presentes em casos de LV reagem, por ELISA, tanto com ES como com ET de L. seymouri, no entanto casos de leishmaniose tegumentar e a maioria dos chagásicos não apresentaram reação com a fração ES deste parasito, apesar de reagirem com o antígeno ET. O ELISA mostrou que os anticorpos anti L. (L.) chagasi reagem mais com proteínas contidas no ES e menos com carboidrato, ao contrário a baixa reatividade dos anticorpos anti T. cruzi para o ES são preferencialmente contra carboidratos. Quando as frações de ES e ET foram analisados por Immunobloting o anti- L. (L.) chagasi não reagiu com nenhuma banda por esta metodologia, ao contrário anticorpos anti- T. cruzi apresentaram intensa reação com bandas na região de 29-36kDa do ET de L. seymouri, que foram identificadas como sendo moléculas de proteínas e de carboidratos (66-97kDa) para o ES. A utilização de soros policlonais monoespecíficos mostra que ES e ET possuem epítopos compartilhados e a quantificação deste compartilhando foi calculado utilizando anticorpos monoespecíficos eluídos de ES ou ET. Estes resultados mostraram que a identificação de moléculas reativas de L. seymouri por anticorpos presentes em chagásicos e leishmanióticos sp depende da metodologia empregada versus preparado antigênico. A superioridade das moléculas contidas no parasito de L. seymouri foi adicionalmente evidenciada quando 25,5% das amostras de soros de VL que apresentavam baixa reatividade para o ET de L. chagasi, Abs 492nm menores que 0.99 e média e SD de 0,56 ? 0,18 apresentavam alta reatividade para o ET de L. seymouri (p<0,01) com média e SD de 1,51 ? 0,35. Estes dados nos indicam que uma caracterização mais profunda das moléculas presentes na L. seymouri é de vital importância se for empregada no imunodiagnóstico das doenças de Chagas e leishmaniose. / Parasites of Trypanosomatidae family as Crithidia, Blastocrithidia, Leptomonas, Hepertomonas and Rhynchoidomonas infect insects and Phytomonas parasitize plants. T. cruzi and L. (L.) chagasi the etiological agents of Chagas disease and Leishmaniasis (VL) respectively, belong to this family. The similarity between these parasites led few studies to use non-pathogenic trypanosomatids as an alternative source of antigens for Chagas\' disease and leishmaniasis immunodiagnosis. With the aim of identifying molecules in nonpathogenic trypanosomatids that react with anti T. cruzi and anti-Leishmania antibodies, two antigenic preparations were employed: the excreted-secreted molecules (ES) and total extract obtained by chemical digestion (ET) of L. seymouri, C. deanei, C. fasciculata and C. luciliae, and compared with T. cruzi and a L. (L.) chagasi. ES fraction of L. seymouri was the unique that showed differences in reactivity when tested with anti T. cruzi and anti L. (L.) chagasi antibodies, evaluation with C. deanei showed similar data. ELISA performed with L. seymouri ES and ET antigens reacted with all VL cases, however tegumentar leishmaniasis and Chagas disease cases showed no reaction with the ES fraction, although they react with ET antigen. The ELISA revealed that anti L. (L.) chagasi antibodies react with proteins contained in ES and less with carbohydrate, unlike the low reactivity of anti T. cruzi with ES were mainly against carbohydrates. When ES and ET were analyzed by immunoblotting the anti L. (L.) chagasi antibodies did not react with any bands, unlike antibodies to T. cruzi showed intense reaction with 29-36kDa protein bands of L. seymouri ET and carbohydrate bands ES (66-97kDa). The use of monospecific polyclonal sera showed that ES and ET share epitopes and these data was calculated using monospecific antibodies eluted from ES or ET antigens. These results show that the identification of L. seymouri molecules reactive by chagasic and leishmaniotic sp cases depends on the methodology employed versus antigenic preparation. The superiority of L. seymouri reactivity was further evidenced when 25.5% of VL sera that showed low reactivity to L. chagasi ET (Abs 492nm < 0.99 and smaller than average and SD of 0.56 +/- 0.18) showed high reactivity to ET L. seymouri (p <0.01) with mean and SD of 1.51 +/- 0.35. These data indicate that a more thorough characterization of molecules present in L. seymouri is of vital importance if used in Chagas disease and leishmaniasis immunodiagnosis.

Carrapatos são parasitas hematófagos transmissores de doenças para humanos e animais, e responsáveis por prejuízos econômicos de bilhões de dólares para os sistemas pecuários mundiais. A emergência de carrapatos multirresistentes a acaricidas torna urgente o desenvolvimento de vacinas efetivas contra este parasita. Neste trabalho, nós utilizamos dados de sialotranscriptomas de carrapatos R. microplus para selecionar antígenos secretados pelo parasita para serem testados como uma vacina multicomponente. Os antígenos produzidos de forma recombinante em E. coli foram utilizados como imunógenos em animais suscetíveis à carrapatos para testes de proteção vacinal contra infestações por R. microplus em bovinos e por R. sanguineus em cães. No primeiro ensaio, bovinos imunizados com oito antígenos recombinantes adjuvantados com um polímero sintético apresentaram indução de IgG sérica específica para cinco antígenos, e redução de 22% na infestação por carrapatos R. microplus. No segundo ensaio, a imunização de bovinos com nove antígenos adjuvantados com sais de alumínio gerou IgG específica para todos os antígenos inoculados, e proteção vacinal crescente de 70% e 75% em duas infestações sucessivas com carrapatos R. microplus, sem revacinação, indicando boost natural pela infestação. No terceiro ensaio, a imunização de cães com nove antígenos recombinantes associados à hidróxido de alumínio induziu a soroconversão de IgG dos animais para todos os antígenos, e proteção vacinal de 36% contra a infestação por carrapatos R. sanguineus. Todas as formulações afetaram principalmente o número de fêmeas ingurgitadas após a infestação. O efeito protetor de antígenos derivados de carrapatos R. microplus sobre carrapatos R. sanguineus (proteção cruzada) indica ser possível o desenvolvimento de uma vacina multicomponente efetiva contra os dois parasitas. / Ticks are hematophagous parasites which transmit diseases to humans and animals, and are responsible for billions of dollars of damage to the world\'s livestock systems. The emergence of ticks resistant to multiple acaricides makes urgent the development of effective vaccines against this parasite. In this work, we used data from the R. microplus tick sialotranscriptome to select antigens secreted by the parasite to be tested as a multicomponent vaccine. Recombinant antigens expressed in E. coli were used as antigens in tick\'s susceptible hosts to evaluate it efficacy in protect animals against R. microplus and R. sanguineus infestations. In the first assay, bovines immunized with eight recombinant antigens adjuvanted with a synthetic polymer presented the induction of serum IgG reactive for five antigens, and reduction of R. microplus infestation in 22%. In the second trial, immunization of cattle with nine antigens adjuvanted with aluminum salts generated serum IgG against all antigens, and vaccine protection against R. microplus parasitism was calculated in 70% and 75% for each infestation. In the third trial, the immunization of dogs with recombinant antigens adjuvanted with aluminum hydroxide induced IgG seroconversion against all antigens, and a 36% of protection against infestation by R. sanguineus ticks in immunized animals. All formulations reduced mainly the number of engorged females recovered from infestation. The cross reactive protection induced by R. microplus derived antigens R. sanguineus tick infestation indicate that it is possible to develop a unique multicomponent vaccine against the two parasites.

Os efeitos da MT-I, uma fosfolipase A2 isolada do veneno de Bothrops asper (VBa), foram avaliados em mastócitos (MC) em cultura, quanto à: i) desgranulação e liberação de prostaglandina E2 (PGE2); ii) papel da atividade catalítica na desgranulação; iii) papel da PLD, PLC, cPLA2, iPLA2, PI3K, MAPK, PKC, PTK, ERK1/2, Junk, G&alpha;i, G&alpha;q e do cálcio na desgranulação; iv) expressão gênica de citocinas Th1 e Th2, e v) alterações ultraestruturais em MC. Os resultados mostraram que a MT-I, em concentrações não citotóxicas, causou a desgranulação de MC. Este efeito foi parcialmente dependente da atividade catalítica e dependente da cPLA2, PLC, PLD e PI3K, mas não da iPLA2, ERK1/2, p38MAPK, PKC, MEK, Junk, G&alpha;i e G&alpha;q. O cálcio intra e extracelular (CRAC e LTCC) estão envolvidos neste efeito da MT-I. Ainda, a MT-I induziu a síntese e liberação da PGE2, expressão de genes de citocinas Th1 e Th2, aumento do número de vesículas citoplasmáticas e de endocitose dependente de clatrina. O VBa também causou a desgranulação de MC sugerindo que a MT-I é relevante para este efeito. / The effects of Myotoxin-I (MT-I), a phospholipase A2 (PLA2) from Bothrops asper venom (BaV) in cultured mast cells (MC) were evaluated focusing: i) degranulation and prostaglandin E2 (PGE2) release; ii) role of PLA2 catalytic activity in degranulation; iii) role of PLD and PLC, cPLA2 and iPLA2, PI3K, MAPK, PKC, PTK, ERK1/2, Junk, G&alpha;i and G&alpha;q protein and calcium in degranulation; iv) gene expression of Th1 and Th2 cytokines, and v) MC ultrastructural alterations. Results showed that MT-I, at non-cytotoxic concentrations, caused MC degranulation. This effect was partially dependent on its catalytic activity and dependent on cPLA2, PLC, PLD and PI3K, but not iPLA2, ERK1/2, p38MAPK, PKC, MEK, Junk, G&alpha;i nor G&alpha;q. Both intra and extracellular calcium (CRAC and LTCC) are involved in MT-I-induced degranulation. Furthermore, MT-I induced synthesis and release of PGE2, gene expression of Th1 and Th2 cytokines, increased numbers of cytoplasmic vesicles and clathrin-dependent endocytosis. BaV also caused MC degranulation suggesting that MT-I is relevant for this effect.

Carrapatos são parasitas hematófagos transmissores de doenças para humanos e animais, e responsáveis por prejuízos econômicos de bilhões de dólares para os sistemas pecuários mundiais. A emergência de carrapatos multirresistentes a acaricidas torna urgente o desenvolvimento de vacinas efetivas contra este parasita. Neste trabalho, nós utilizamos dados de sialotranscriptomas de carrapatos R. microplus para selecionar antígenos secretados pelo parasita para serem testados como uma vacina multicomponente. Os antígenos produzidos de forma recombinante em E. coli foram utilizados como imunógenos em animais suscetíveis à carrapatos para testes de proteção vacinal contra infestações por R. microplus em bovinos e por R. sanguineus em cães. No primeiro ensaio, bovinos imunizados com oito antígenos recombinantes adjuvantados com um polímero sintético apresentaram indução de IgG sérica específica para cinco antígenos, e redução de 22% na infestação por carrapatos R. microplus. No segundo ensaio, a imunização de bovinos com nove antígenos adjuvantados com sais de alumínio gerou IgG específica para todos os antígenos inoculados, e proteção vacinal crescente de 70% e 75% em duas infestações sucessivas com carrapatos R. microplus, sem revacinação, indicando boost natural pela infestação. No terceiro ensaio, a imunização de cães com nove antígenos recombinantes associados à hidróxido de alumínio induziu a soroconversão de IgG dos animais para todos os antígenos, e proteção vacinal de 36% contra a infestação por carrapatos R. sanguineus. Todas as formulações afetaram principalmente o número de fêmeas ingurgitadas após a infestação. O efeito protetor de antígenos derivados de carrapatos R. microplus sobre carrapatos R. sanguineus (proteção cruzada) indica ser possível o desenvolvimento de uma vacina multicomponente efetiva contra os dois parasitas. / Ticks are hematophagous parasites which transmit diseases to humans and animals, and are responsible for billions of dollars of damage to the world\'s livestock systems. The emergence of ticks resistant to multiple acaricides makes urgent the development of effective vaccines against this parasite. In this work, we used data from the R. microplus tick sialotranscriptome to select antigens secreted by the parasite to be tested as a multicomponent vaccine. Recombinant antigens expressed in E. coli were used as antigens in tick\'s susceptible hosts to evaluate it efficacy in protect animals against R. microplus and R. sanguineus infestations. In the first assay, bovines immunized with eight recombinant antigens adjuvanted with a synthetic polymer presented the induction of serum IgG reactive for five antigens, and reduction of R. microplus infestation in 22%. In the second trial, immunization of cattle with nine antigens adjuvanted with aluminum salts generated serum IgG against all antigens, and vaccine protection against R. microplus parasitism was calculated in 70% and 75% for each infestation. In the third trial, the immunization of dogs with recombinant antigens adjuvanted with aluminum hydroxide induced IgG seroconversion against all antigens, and a 36% of protection against infestation by R. sanguineus ticks in immunized animals. All formulations reduced mainly the number of engorged females recovered from infestation. The cross reactive protection induced by R. microplus derived antigens R. sanguineus tick infestation indicate that it is possible to develop a unique multicomponent vaccine against the two parasites.

O objetivo desse trabalho foi avaliar a expressão de genes envolvidos no transporte de monocarboxilatos (Mct1, Mct2, Mct3 e Mct4) e de genes específicos da oogênese (Bmp15, Gdf9 e Has2) em complexos cumulus-oócito (CCOs) selecionados pelo teste BCB. Após seleção morfológica com base no grau de compactação das células do cumulus (CCs) e no grau de homogeneidade do citoplasma, os CCOs foram corados com 26 μM BCB (azul cresil brilhante) por 90 min e divididos em dois grupos: BCB+, que apresentavam o ooplasma corado de azul, e BCB-, com ooplasma não corado. Foram utilizados dois grupos controles não expostos ao BCB: o grupo holding foi submetido às mesmas condições que os grupos corados e o outro grupo controle foi diretamente submetido à maturação in vitro (MIV), após a seleção morfológica dos CCOs. A expressão gênica relativa foi determinada por RT-PCR em CCOs coletados antes e ao final da maturação. A expressão também foi avaliada, separadamente, em oócitos desnudos (ODs) e células do cumulus (CCs) antes e após a maturação. A análise dos transcritos demonstrou que houve aumento significativo (p < 0,05) na expressão relativa de Gdf9 e Bmp15 nos grupos BCB+, BCB- e holding antes da MIV, enquanto Has2 teve aumento significativo (p < 0,01) após a MIV apenas no grupo controle. Os outros genes analisados (Mct1, Mct2 e Mct4) mantiveram-se estáveis durante a maturação. O aumento na abundância relativa de alguns transcritos durante a MIV pode ser atribuído as condições de incubações durante o teste BCB. Nossos resultados demonstraram, pela primeira vez, a expressão de Mct1, 2 e 4 em CCOs bovinos. Enquanto o mRNA de Mct1 e Mct4 estava presente em ODs e em CC, o Mct2 foi detectado somente em CCs. Não detectamos a expressão de transcritos de Mct3 em CCOs. As diferenças na expressão dessas três isoformas sugerem um papel único para esses transportadores durante a maturação. / The aim of this study was to determine the relative expression of genes involved in transport of monocarboxylates (Mct1, Mct2, Mct3 e Mct4) and oogenesis specific genes (Bmp15, Gdf9 and Has2) in immature and mature bovine cumulus-oocyte complexes (COC) after selection by BCB. Immature COCs underwent morphological selection and were stained with 26 mM BCB for 90 min. Based on ooplasm staining, oocytes were distributed in two groups BCB+ (blue color) and BCB- (non-stained). The holding control group was exposed to the same incubation conditions as stained COCs, but without BCB. Control group was submitted to in vitro maturation (IVM) immediately after morphological selection. mRNA expression was investigated by RT-PCR in COCs before and after IVM. No relationship was observed in the relative expression of Has2, Gdf9, Bmp15 or Mct1, 2 and 4 transcripts between BCB- and BCB+ COCs. Transcripts analysis showed that Gdf9 and Bmp15 in BCB+, BCB- and holding groups were upregulated (p < 0.05) before IVM, while Has2 was up-regulated (p < 0.01) after IVM in the control group. Others genes remained stable during maturation (Mct1, 2 and 4). The increase in relative abundance of some transcripts during IVM may be attributed to incubation conditions during the BCB test. Our results showed, for the first time, Mct1, 2 and 4 expression in bovine COCs. Mct1 and Mct4 transcripts were present in denuded oocytes and cumulus cell, while Mct2 was detected only in cumulus cells. These differences between the three isoforms in localization suggest unique roles for each in monocarboxylate transport during maturation.

[Truncated abstract] Glucocorticoids are critical for the maturation of the fetus late in pregnancy. Indeed, clinical administration of glucocorticoids is used to accelerate fetal lung maturation in mothers at risk of pre-term delivery. Increased glucocorticoid exposure, however, can have detrimental effects on fetal and placental growth and increase the risk of disease in later life. Many studies have focused on the effect of an increase in the transplacental passage of glucocorticoids on both fetal growth and subsequent postnatal development. But there is a growing body of evidence to suggest that the impact of glucocorticoids on fetal growth is mediated, in part, via their direct effects on the placenta . . . Overall, these studies quantify the labyrinth zone-specific increases in placental expression of PPARG and VEGF in association with a marked increase in vascularisation observed near term. Furthermore, this study demonstrates for the first time that these increases in gene expression are prevented by maternal dexamethasone treatment which also inhibits growth of the fetal capillary network. Elevated expression of SFRP4 in the regressing basal zone late in gestation and in both placental zones after dexamethasone-induced placental growth restriction is consistent with a role for SFRP4 in glucocorticoid-mediated inhibition of wnt signalling. Collectively, the data presented in this thesis show that glucocorticoid inhibition of fetal growth is mediated in large part via effects on the placenta, specifically through inhibition of signals that promote proliferation and vascularisation.

Resumo: O cancro cítrico está entre as principais doenças que afetam a produção de laranjas no Brasil e é causado pela bactéria fitopatogênica gram-negativa Xanthomonas citri subsp. citri (Xac). O presente trabalho teve por objetivo analisar a expressão diferencial de proteínas secretadas pela bactéria selvagem e por um mutante (02H02) assintomático, que teve a proteína HrpB4, que participa de seu sistema de secreção tipo III (SSTT) inativada, em condição de cultivo em meio rico CN e em meio XAM1 indutor de hipersensibilidade e patogenicidade (genes hrp). As proteínas secretadas em meio de cultura foram extraídas pela ação do ácido tricloroacético (TCA) e identificadas através de espectrometria de massas. Tais análises identificaram 55 proteínas diferentes secretadas em ambos os meios de cultura, tanto para Xac quanto para 02H02, de modo que 13 destas proteínas são comuns entre a Xac e seu mutante cultivados em XAM1 e 14 são exclusivas para Xac cultivada em XAM1, as quais deixaram de ser secretadas no 02H02. Proteínas relacionadas aos genes reguladores do SSTT foram detectadas em condição infectante para ambas as bactérias, demonstrando a eficácia do meio de cultura XAM1 em induzir Hrp. Foi observado que diversas proteínas secretadas pelo sistema de secreção tipo II (SSTD) em condição infectante para Xac e seu mutante possuem um papel ativo na degradação das paredes celulares do hospedeiro e podem ser reguladas por proteínas controladoras do SSTT. Fatores de sinalização difusíveis produzidos por Xac aparentemente sofreram alteração em sua secreção no mutante devido à inativação do pilus do SSTT, demonstrando a relação dessa molécula com o SSTT. A não detecção de proteínas secretadas diretamente pelo SSTT denota que as mesmas podem estar sendo secretadas no interior de vesículas lipídicas de membrana externa, assim como ocorre em Xanthomonas campestris / Abstract: Citrus canker is among the major diseases which affect citrus production in Brazil and is caused by the gram-negative phytopathogenic bacterium Xanthomonas citri subsp. citri (Xac). This work aimed to analyze the differential expression of secreted proteins by the wild bacterium and by an asymptomatic mutant (02H02), lacking the type III secretion system (TTSS) protein HrpB4, in rich cultivation medium NB and in the hrp inducing medium XAM1. The proteins secreted in all culture media have been extracted by trichloroacetic acid based protocols (TCA) and identified using mass spectrometry. The analysis identified 55 different proteins secreted in both culture medium for Xac and 02H02, of which 13 are common among Xac and its mutant cultivated in XAM1 and 14 proteins are exclusively secreted by Xac cultivated in XAM1. Proteins related to the TTSS regulatory genes have been detected in infecting condition in both bacteria, showing the effectiveness of XAM1 hrp inducing medium. It has been observed that several type II secretion system's secreted proteins showed an active role in host cell wall degradation and may be regulated by type III secretion system's proteins in Xac and 02H02 in infecting condition. Diffusible signal factors produced by wild Xac apparently suffered an altered secretion in the mutant due the inactivation of the type three secretion system's pilus, showing the relationship of this molecule with this secretion system. The lack of detection of proteins secreted by the TTSS denote that these proteins may be secreted in the interior of outer membrane lipid vesicles, just like it was verified in Xanthomonas campestris / Orientador: Jesus Aparecido Ferro / Coorientador: Julio Cezar Franco de Oliveira / Banca: Maria Teresa Marques Novo / Banca: Leandro Márcio Moreira / Mestre