Submitted by Claudinei Pracidelli (cpracide@ipen.br) on 2014-11-10T10:50:23Z No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-11-10T10:50:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Dissertação (Mestrado em Tecnologia Nuclear) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

O folículo ovariano é composto pelo oócito (gameta feminino) e por várias camadas de células foliculares somáticas, sendo que destas, as mais intimamente associadas com o oócito são as células do cumulus oophorus (CCs), as quais estão em contato direto com o gameta feminino e formam o complexo cumulus-oócito (CCO), e as células murais da granulosa (CGs), que revestem a parede do folículo ovariano. Visto que estas CGs e CCs são facilmente acessadas durante tratamentos de reprodução assistida (RA), que podem ser coletadas sem comprometimento do oócito e que são descartadas após a recuperação do oócito é possível que elas sejam utilizadas em pesquisas que visam elucidar a fisiologia ovariana. No entanto, quando recuperadas, nos ciclos de reprodução assistida, estas células se encontram em um estado luteinizado, devido ao tratamento hormonal que as pacientes realizam. Sabe-se que o uso de CGs luteinizadas em cultura celular para o estudo do processo molecular ovulatório é limitado visto esta prévia exposição celular às gonadotrofinas e ao seu estado luteinizado. Porém, foi demonstrado que CGs luteinizadas podem readquirir sua capacidade de resposta à estimulação por gonadotrofinas, recuperando características semelhantes às daquelas de folículos não luteinizados nos estágios iniciais de diferenciação (early antral não luteinizado). A estimulação destas células com FSH causa aumento na expressão de genes que caracterizam CGs típicas de folículos pré-ovulatórios (pré-ovulatório não luteinizado). Ainda, outra questão importante com relação ao folículo ovariano diz respeito à ação dos androgênios nesta estrutura ovariana, sendo que já se sabe que a ativação do receptor de androgênio, localizado nas células foliculares, é capaz de modular a expressão e a atividade de genes importantes para a manutenção do desenvolvimento do folículo ovariano. Desta forma, sugere-se que o efeito reprodutivo do tratamento com dehidroepiandrosterona (DHEA) e seu sulfato (SDHEA), importantes androgênios, pode ser devido às suas ações justamente no microambiente folicular. Portanto, o objetivo deste trabalho foi analisar a exposição de células foliculares desluteinizadas (estágios early antral e pré-ovulatório) ao SDHEA. Para isto, células da granulosa e do cumulus foram obtidas de pacientes submetidas à fertilização in vitro e foram cultivas separadamente. Inicialmente, fez-se a determinação do melhor tempo de cultivo deste modelo celular proposto, dentre 6, 8 ou 10 dias de cultivo. As análises de viabilidade celular realizadas mostraram que o melhor tempo para o cultivo primário folicular, para as próximas etapas do trabalho, seria de oito dias. Após, também por análises de viabilidade celular, a melhor dose de SDHEA para exposição às células foliculares foi determinada dentre cinco doses testadas em comparação a um controle sem exposição hormonal. As análises mostraram que a dose mais adequada a ser utilizada era a dose de 0,08 μM de SDHEA. Posteriormente, tendo definido o melhor tempo de cultivo e a dose ideal de exposição das células em questão ao SDHEA, os experimentos foram realizados com dois grupos experimentais distintos: células early antral não luteinizadas e células pré-ovulatórias não luteinizadas – expostas ao FSH. Ambos os grupos foram divididos em dois subgrupos: grupo controle (sem exposição hormonal) e grupo SDHEA (com exposição ao SDHEA). Foram feitas dosagens hormonais de SDHEA, de estradiol e de progesterona nos dias 1, 4, 6 e 8 do sobrenadante do cultivo celular. A análise ao longo do tempo mostrou que os valores das dosagens de SDHEA se mantiveram constantes no grupo controle durante todo o período de cultivo celular, não havendo diferença estatística entre as quatro dosagens hormonais feitas neste grupo. Por outro lado, no grupo tratado houve diferença nos valores deste hormônio nos dias 6 e 8, em comparação aos dias 1 e 4, devido justamente ao tratamento com SDHEA realizado neste grupo experimental. Com relação ao estradiol, independente do tipo celular e do estágio de desenvolvimento, foi possível ver que a sua secreção era elevada no primeiro dia de cultivo, diminuindo nos outros dias devido às condições e ao tempo de cultivo do protocolo de desluteinização celular. Além disso, as células tratadas com SDHEA apresentaram uma secreção de estradiol superior àquelas não tratadas. Por fim, as dosagens de progesterona revelaram que o tratamento com SDHEA não alterou a secreção deste hormônio pelas células, em nenhum dos dois estágios de desenvolvimento. Ainda, as células apresentaram uma secreção aumentada de progesterona no sexto dia de cultivo celular em comparação ao primeiro e ao quarto dia; porém, esta secreção começou a diminuir quando do oitavo dia de cultivo. Tendo em vista os resultados obtidos, podemos concluir que o tratamento com SDHEA é capaz de aumentar a secreção de estradiol de células foliculares não luteinizadas, não alterando a secreção de progesterona dessas mesmas células. Mais estudos são necessários para um melhor entendimento dos efeitos do SDHEA nos processos que compõem a foliculogênese. / Ovarian follicle is formed by the oocyte (female gamete) and somatic follicular cells. Those closer to the oocyte are cumulus oophorus cells (CCs), which are in direct contact with the female gamete, and the granulosa mural cells (GCs), which form the wall of the ovarian follicle. As GCs and CCs are easily accessed during assisted reproduction procedures and are discarded after oocyte retrieval, they can be used in research aimed at elucidating ovarian physiology. However, when recovered in assisted reproduction cycles, these cells are in a luteinized state due patient hormonal treatment. It is known that the use of luteinized GCs to study the molecular ovulatory process is limited due to this prior cellular exposure to gonadotrophins and their luteinized state. However, luteinized CGs have been shown to reacquire similar characteristics to those of non-luteinized follicles in early stages of differentiation (non-luteinized early antral). Stimulation of these cells with follicle stimulating hormone (FSH) increases expression of genes that characterize CGs typical of pre ovulatory follicles (non-luteinized pre ovulatory). Another important question regarding the ovarian follicle relates to androgens action in this ovarian structure. As it is known, androgen receptor activation, located in follicular cells, is able to modulate expression and activity of important genes for the maintenance of ovarian follicle development. Thus, authors suggest that the reproductive effect of dehydroepiandrosterone (DHEA) and their sulfate (SDHEA) treatment, important androgens, may be due their actions precisely in the follicular microenvironment. Consequently, the aim of this work was to analyze the exposure to SDHEA of non-luteinized follicular cells (early antral and pre-ovulatory stages). Granulosa and cumulus cells were obtained from patients submitted to in vitro fertilization and were separately cultivated. Initially, the best culture time of this proposed cellular model was determined among 6, 8 or 10 days of culture. Cellular viability analysis showed that primary follicular culture for the next steps of the study would be of 8 days. Thereafter, cellular viability assays were used to determine the best SDHEA dose among 5 doses to follicular cells exposure in comparison to a control without hormonal exposure. The analysis showed that the best dose to use was 0,08 μM of SDHEA. Subsequently, after defined the best culture time and the ideal exposure dose of the cells to SDHEA, experiments were performed with two different experimental groups: non-luteinized early antral cells and non-luteinized pre ovulatory cells – exposed to FSH. Both groups were divided in two subgroups: control group (no hormonal exposure) and SDHEA group (with SDHEA exposure). SDHEA, estradiol and progesterone hormonal dosages of the cell culture supernatant were done on days 1, 4, 6 and 8. Over time analysis revealed that SDHEA values were constant in control group during all the cell culture period, without statistical difference between the four hormonal dosages performed in this group. However, treated group showed a difference in the values of this hormone on days 6 and 8, compared to days 1 and 4, due to treatment with SDHEA of these experimental group . Regarding estradiol, independent of cell type and stage of development, it was possible to see that its secretion was high on the first day of culture, decreasing in others due to conditions and time of culture of the non-luteinized cells protocol. In addition, the SDHEA treated cells presented higher estradiol secretion than those not treated. Finally, progesterone dosages revealed that treatment with SDHEA did not alter this hormone secretion from the cells in either of the two development stages. Besides that, the cells had an increased progesterone secretion on the sixth cell culture day compared to first and fourth day; however, this secretion began to decrease on the eight day of culture. In conclusion, SDHEA treatment is able to increases the non-luteinized follicular cells secretion of estradiol, but it is not able to modify the progesterone secretion of the same cells. More studies are needed to better understand the effects of SDHEA on the process that make part of folliculogenesis.

O objetivo geral deste trabalho foi caracterizar o perfil protéico da secreção uterina pura, através da eletroforese bi-dimensional, de éguas em diferentes fases do ciclo estral, com diferentes graus de alterações inflamatórias e degenerativas, e com diferente capacidade de resposta à cobertura. Para tanto se realizaram cinco experimentos. O primeiro objetivou caracterizar o perfil protéico da secreção endometrial de éguas e determinar se essas proteínas estão associadas ao ciclo estral. A hipótese a ser testada é que o perfil protéico das secreções endometriais varia entre o estro e o diestro. Conclui-se que a composição protéica da secreção uterina da égua em estro é diferente daquela de éguas em diestro, podendo as diferenças protéicas estarem associadas tanto ao processo de manutenção e desenvolvimento embrionário, como a uma necessidade de eventual resposta inflamatória. O segundo experimento objetivou comparar as taxas de prenhez e morte embrionária em éguas não lactantes cobertas no primeiro, ou em outros ciclos durante a temporada reprodutiva. Foi concluído que: (a) durante a temporada reprodutiva, a fertilidade de éguas solteiras é menor no 1° ciclo que nos ciclos subseqüentes; (b) que uma taxa de morte embrionária maior pode ser esperada em éguas falhadas cobertas no 1° ciclo do que nos demais e (c) que a menor fertilidade observada no 1° ciclo não está relacionada à incidência de endometrite persistente pós-cobertura. O terceiro experimento objetivou comparar o perfil protéico da secreção endometrial e a expressão de receptores para esteróides ovarianos no endométrio de éguas em diestro após a 1ª ovulação e após a 2ª ovulação da temporada. Conclui-se que o ambiente uterino é diferente no primeiro diestro da temporada reprodutiva, comparado aos ciclos subseqüentes. O quarto experimento objetivou comparar o perfil protéico da secreção endometrial de éguas resistentes e susceptíveis à endometrite persistente pós-cobertura, durante o estro.Ahipótese a ser testada é que o ambiente uterino da égua susceptível encontra-se alterado no estro prévio à cobertura. Conclui-se que a composição da secreção endometrial das éguas susceptíveis, antes da cobertura, é diferente daquela observada nas éguas resistentes, estando as proteinas observadas relacionadas ao processo inflamatório e à contratilidade uterina. O quinto experimento objetivou (a) comparar a composição protéica da secreção endometrial de éguas em estro com e sem fibrose e (b) avaliar o efeito da inflamação endometrial sobre o perfil protéico da secreção uterina de éguas em estro e em diestro. A hipótese é que a fibrose e a inflamação alteram a composição protéica do fluído uterino, podendo prejudicar o desempenho reprodutivo da égua. Conclui-se que nas éguas em estro a inflamação e a fibrose endometrial alteram apenas a quantidade de poucas proteínas no ambiente uterino. Durante o diestro, a presença da inflamação alterou o ambiente uterino, havendo maior quantidade de proteínas inflamatórias. Os resultados apresentados neste trabalho requerem a confirmação da identidade das proteínas, através de seqüeciamento ou imuno identificação. No entanto, várias informações puderam ser obtidas e muitas novas perguntas podem ser geradas, em especial a partir dos resultados com as éguas susceptíveis. / The main objective from this study was the characterization of the protein profile by SDS-PAGE, from mares during the estrous cycle and mares with uterine inflammation, fibrosis and susceptibility to persistent post-mating endometritis. Five experiments were performed. The first aimed to evaluate the protein profile of endometrial secretions of mares and to determine if any of these proteins was associated with estrous cycle. It was concluded that protein profile from estrous mares is different from the profile from diestrous mares. This difference can be explained by requirements to support and develop the embryo or to an eventually inflammatory response. The second experiment aimed to compare pregnancy and embryo loss rates in non-lactating mares bred either in the first, or in other estrus cycles during the breeding season. It was concluded that: (a) during the breeding the fertility of non-lactating mares is lower in the 1st than in other estrus cycles season; (b) that a higher embryo loss rate may be expected in barren mares bred in the 1st than in other estrus cycles of the breeding season and (c) that the lower fertility rate observed during the 1st estrus cycle is not related to the incidence of post-breeding endometritis. The third experiment aimed to compare the protein profile of endometrial secretions and the steroid hormone receptor expression of the uterus from diestrous mares in the first, or in other estrous cycles during the breeding season. It was concluded that the uterine environment in the first diestrus of the breeding season is different in relation of the other diestrus. The fourth experiment aimed to compare the protein profile of endometrial secretions from estrous mares resistant or susceptible to persistent post-mating endometritis (PPME). The tested hypothesis was that before the insemination in susceptible mares the uterine environment is disturbed. It was concluded that there is a difference in the uterine environmentbetween resistant and susceptible mares to PPME, probably resulting from the inflammatory response and affecting the uterine contractility. The fifth experiment aimed (a) to compare the protein profile of endometrial secretions from estrous mares with and without fibrosis and (b) to estimate the effect of inflammation in the protein profile of endometrial secretion from mares in estrous and in diestrous. The tested hypothesis was that fibrosis and inflammation disturb the uterine environment modifying the protein profile of the endometrial secretion impairing the reproductive performance. It was concluded that inflammation and fibrosis in estrous influenced the protein profile in a low number of spots. During diestrous, the inflammation affect uterine environment with an expressive number of inflammatory proteins. The protein profile observed in the experiments must be confirmed by sequencing or immunoidentification. However, much information could be obtained but many others must be investigated, principally by the susceptible mare.

O sorotipo O125ac:H6 compreende amostras de Escherichia coli enteropatogênica atípicas que apresentam o padrão de adesão agregativa (AA) em células HEp-2. A construção de um banco de mutantes da amostra protótipo Ec292/84 com o transposon TnphoA gerou quatro mutantes não aderentes. O objetivo deste estudo foi a caracterização genotípica e fenotípica desses mutantes. As regiões adjacentes à inserção do TnphoA no mutante Ec2921/84::01 foram amplificadas, clonadas e seqüenciadas, revelando que a inserção do TnphoA ocorreu no gene secD, parte do sistema de secreção de proteínas do tipo 2 (SST2). O perfil de proteínas de membrana externa (OMP) dos mutantes, em comparação com a amostra selvagem, revelou a ausência de proteínas de 21 e 30 kDa nos mutantes. Um antissoro obtido contra o extrato de OMP da amostra protótipo inibiu o padrão AA e reconheceu a proteína de 30 kDa em immunoblottings com extratos de OMP. Esses dados indicam que esta proteína está envolvida no estabelecimento do padrão AA de E. coli O125ac:H6 e que essa proteína é transportada através do SST2. / The serotype O125ac:H6 comprises atypical Enteropathogenic Escherichia coli strains that express the aggregative adherence (AA) pattern to HEp-2 cells. We obtained four nonadherent mutants using TnphoA insertion in the Ec292/84 strain. The aim of this study was the genetic and phenotypic characterization of these mutants. The genetic analysis of the mutants revealed that the insertion of TnphoA ocurred in the secD gene, part of the bacterial type 2 secretion system (T2SS). The mutant outer membrane proteins (OMP) profile, in comparison to the prototype strain, demonstrated the lack of expression of proteins of 21 and 30 kDa in the mutant profile. An antiserum raised against the OMP extract of the prototype strain, in addition to inhibit the AA pattern, recognized the 30 kDa protein in immunoblotting assays with OMP extract. These data indicate this OMP is involved in the establishment of the AA pattern presented by the atypical EPEC strains of the O125ac:H6 serotype, and that this protein is transported via the T2SS.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O Mycobacterium leprae, agente etiolÃgico da hansenÃase, nÃo à cultivÃvel em meio axÃnico. A quantificaÃÃo do bacilo realizada pelo exame baciloscÃpico e histopatolÃgico à Ãtil para a classificaÃÃo da hansenÃase na escolha e monitoramento do tratamento. No entanto, esta metodologia produz resultados de especificidade e sensibilidade limitada. A PCR em tempo real (qPCR) à um ensaio sensÃvel e especÃfico que permite a quantificaÃÃo a partir de diversas amostras e pode ser utilizada no diagnÃstico diferencial de muitos patÃgenos. Atà o momento, nenhum estudo avaliou a sensibilidade e especificidade da qPCR para o diagnÃstico da hansenÃase utilizando amostras de secreÃÃo nasal. Portanto, este estudo teve como objetivo detectar e quantificar o DNA de M. leprae por qPCR em amostras de secreÃÃo nasal e biÃpsias de pacientes com hansenÃase, correlacionando com a avaliaÃÃo clÃnica e o Ãndice baciloscÃpico. Foram analisadas 61 amostras de muco nasal e 19 amostras de biÃpsia de lesÃo de pele (pareadas) de casos confirmados de hansenÃase atendidos no Centro de ReferÃncia Nacional em Dermatologia SanitÃria Dona LibÃnia. Todas as amostras foram submetidas à extraÃÃo e amplificaÃÃo de DNA por nested PCR da regiÃo de 238 pb da sequÃncia RLEP2. Posteriormente as amostras foram submetidas à quantificaÃÃo da regiÃo 16S rRNA do genoma de M. leprae pela qPCR, cuja especificidade foi verificada atravÃs da curva de dissociaÃÃo (Tm=79,5ÂC). O mÃtodo foi suficientemente sensÃvel para detectar 20 fg de DNA de M. leprae, o equivalente a quatro bacilos. Na anÃlise da secreÃÃo nasal, o ensaio foi capaz de confirmar o diagnÃstico em 89,7% dos casos multibacilares (MB), e 73,3% dos casos paucibacilares (PB). A sensibilidade foi de 100% na analise de biÃpsias de pacientes MB. O nÃmero de bacilos detectados nas amostras de secreÃÃo nasal de pacientes com hansenÃase se manteve no intervalo de 1,39 x 103 a 8,02 x 105 bacilos, enquanto a detecÃÃo em biÃpsia de pacientes MB variou de 1,87 x103 a 1,50 x 106. A PCR em tempo real à mais sensÃvel do que a PCR convencional e pode ser utilizada como uma ferramenta complementar para o diagnÃstico clÃnico e histopatolÃgico da hansenÃase. / Mycobacterium leprae, the etiologic agent of leprosy, is not cultivable in axenic medium. The quantification of bacilli performed by skin bacilloscopy and histopathology is useful for the clinical classification of leprosy and treatment monitoring. However, this methodology yields low results regards to sensitivity and specificity. On the other way, the real-time quantitative PCR (qPCR) is a sensitive and specific assay that allows quantification of a varied of samples and also can be used for differential diagnosis of many pathogens. To this date, no studies have evaluated the sensitivity and specificity of qPCR for the diagnosis of leprosy from nasal secretion samples. Therefore, this study aimed at detecting and quantifying DNA from M. leprae by qPCR from nasal secretion and biopsy samples from leprosy cases, correlating with clinical and bacteriological index. We analyzed 61 samples of nasal secretion and 19 biopsy specimens of skin lesion (paired) from confirmed leprosy cases seen at the National Reference Center for Sanitary Dermatology Dona LibÃnia. All samples were subjected to DNA extraction followed by amplification by nested PCR of a region of 238 bp which targets a RLEP2 repetitive sequence. The samples were subjected to quantification of 16S rRNA region of the genome of M. leprae by qPCR, which specificity was verified by amplicon melting temperature (Tm = 79.5  C). The method was able to detect amounts over to 20 fg of M. leprae DNA, equivalent to four bacilli units. Nasal secretion assay was able to confirm the diagnosis in 89.7% of the multibacillary cases (MB) and 73.3% of the paucibacillary cases (PB). In addition, MB patient biopsies sensitivity was 100%. The number of bacilli detected in nasal secretion samples from leprosy patients ranged from 1.39 x 10 to 8.02 x 105 bacilli, while detection in MB patient biopsy ranged from 1,87 x 103 to 1,50 x 106. The real-time PCR is more sensitive than conventional PCR and can be used as a complementary tool for the clinical and histopathological diagnosis of leprosy.

Sistemas de Secreção Tipo IV (T4SSs), normalmente compostos por 12 proteínas (VirB1-VirB11 e VirD4) são tipicamente associados às funções de conjugação bacteriana e transferência de fatores de patogenicidade para células hospedeiras. Mas também, muitas espécies da ordem Xanthomonadales possuem um T4SS associado a matar bactérias. O modelo atual de morte de uma célula-alvo mediada pelo T4SS é baseado na secreção de toxinas denominadas XVIPs (\"Xanthomonas VirD4 interacting proteins\") ou X-Tfe (Xanthomonadaceae-T4SS effector) no qual cada XVIP/X-Tfe apresenta uma proteína de imunidade cognata denominada X-Tfi (Xanthomonadaceae-T4SS immunity protein). Demonstramos que um XVIP, XAC2609, é secretado através do T4SS de modo que depende de contato célula-célula e do seu domínio XVIPCD (\"XVIP conserved domains\"). A porção N-terminal de XAC2609 codifica um domínio GH19 que cliva a peptideoglicana de E. coli, mas perde a sua atividade na presença do seu inibidor cognato, o X-Tfi XAC2610. Portanto, XAC2609/XAC2610 formam um par de proteínas efetora/imunidade associado ao T4SS de X. citri. Através de diferentes técnicas de microscopias utilizando a cepa Δxac2610, foi observado que XAC2610 protege o envelope celular de X. citri contra efeitos de autólise celular promovidos pela atividade de XAC2609. Ensaios funcionais baseados nas observações de fenótipos de colônias e de formação de biofilme mostraram que XAC2610 confere imunidade para X. citri contra uma atividade 7 intrínseca de XAC2609. A proteína com o papel de reconhecer os substratos através da interação com os sinais de secreção do T4SS é VirD4. No T4SS de X. citri, existe a hipótese de que o domínio XVIPCD seja o sinal de secreção presente nas XVIPs. Logo, os aspectos bioquímicos e biofísicos da interação VirD4-XVIPCD foram investigados através de experimentos de co-purificação por cromatografia de afinidade e exclusão molecular, RMN e SAXS. Demonstramos que o domínio AAD de VirD4 (VirD4AAD) está associado a interagir especificamente com o domínio XVIPCD de XAC2609 (XAC2609XVIPCD), formando um heterodímero em solução. VirD4AAD é um domínio globular e monomérico e XAC2609XVIPCD é desenovelado mas se enovela concomitante à interação com VirD4AAD. Construções de XAC2609 contendo mutações pontuais no domínio XVIPCD foram utilizadas em ensaios in vivo de secreção pela X. citri e ensaios in vitro de interação com VirD4AAD por titulação monitorada por calorimetria isotérmica (ITC). Através desses experimentos, observamos que uma forte interação entre VirD4AAD-XAC2609XVIPCD é essencial para secreção de XAC2609 via o T4SS. Esses resultados permitem concluir que o domínio XVIPCD é o sinal de secreção dos substratos do T4SS de X. citri e que o AAD confere especificidade à VirD4 por interagir com o XVIPCD. Finalmente, através de ensaios de competições bacterianas entre E. coli e X. citri, foram observados diferentes fenótipos associados à função do T4SS: i) nocautes gênicos das subunidades estruturais VirB5, VirB11 abolem a função do T4SS em X. citri.; ii) nocautes de xac2611, apresentaram uma maior vantagem adaptativa do que a cepa selvagem de X. citri em competições e a expressão epissomal de XAC2611 inibe fortemente a função do T4SS e iii) a atividade ATPásica de VirD4 é essencial para a função do sistema e a expressão de mutantes 8 de VirD4 exerce um fenótipo de dominância negativa sobre a função do T4SS em X. citri. / The Type IV secretion System (T4SS) is typically associated with the function of bacterial conjugation and as a pathogenicity factor. T4SSs are normally composed of 12 proteins, VirB1-VirB11 and VirD4. Many species of the order Xanthomonadales possess a T4SS associated with killing bacteria. The current model of the T4SS killing is based on the secretion of toxins denominated XVIPs/X-Tfes (Xanthomonas VirD4 interacting proteins) /(Xanthomonadaceae-T4SS effector) in which each XVIP/X-Tfe has a cognate immunity protein denominated X-Tfi (Xanthomonadaceae-T4SS immunity protein). We demonstrate that an XVIP, XAC2609, is secreted through the T4SS so that it depends on cell-cell contact and its XVIPCD domain (\"XVIP conserved domains\"). The N-terminal portion of XAC2609 encodes a GH19 domain which cleaves the E. coli peptidoglycan but loses its activity in the presence of its cognate inhibitor, X-Tfi XAC2610. Therefore, XAC2609 /XAC2610 form a pair of effector/immunity proteins associated with X. citri T4SS. By using the X. citri Δxac2610 strain, has been shown through different microscopic techniques that XAC2610 protects the cell envelope of X. citri against the effects of cellular autolysis promoted by XAC2609 activity. Functional assays based on observations of colony phenotypes and biofilm formation has shown that XAC2610 confers immunity to X. citri against an intrinsic activity of XAC2609. VirD4 is the protein that recognizes the substrates through the interaction with the T4SS secretion signals. In the T4SS of X. citri, is hypothesized that the XVIPCD domain is the secretion signal present in the XVIPs. Here, the biochemical and biophysical aspects of the VirD4-XVIPCD interaction were investigated through Pull- Down, Molecular Exclusion Chromatography, NMR and SAXS assays. It has been shown the AAD domain of VirD4 (VirD4AAD) is associated with specifically interacting with the XAC2609XVIPCD domain (XAC2609XVIPCD), forming a heterodimer in solution. VirD4AAD is a globular and monomeric domain while XAC2609XVIPCD is elongated, but upon interaction with VirD4AAD goes through structural compaction process. Constructs of XAC2609 containing point mutations in the XVIPCD domain were used to perform secretion experiments in X. citri and Isothermal titration calorimetry against VirD4AAD. Through these assays, it has been characterized that a strong interaction between VirD4AAD-XAC2609XVIPCD is essential for secretion of XAC2609 via T4SS. Consequently, these results allow concluding that the XVIPCD domain is the secretion signal of X. citri T4SS substrate and the AAD confer specificity to VirD4 by interact with the XVIPCD domains. Finally, bacterial competitions between E. coli and X. citri showed different phenotypes associated with T4SS function: i) virB5, virB11 knockouts abolish the function of T4SS in X. citri.; ii) knockouts of xac2611 exhibited a higher adaptive efficiency than the wild-type X. citri strain in competitions, but the expression of XAC2611 abolishes the function of T4SS in the wild strain of X. citri; iii) The ATPase activity of VirD4 is essential and exerts a negative dominance over the T4SS function in X.citri.

Foram avaliadas as características hematológicas, mais especificamente a resposta dos elementos de proteção do sangue, de juvenis de pacu, espécie endêmica e neotropical, mantidos em condições adversas e alimentados com dietas contendo colostro bovino liofilizado. Esta primeira secreção láctea, rica fonte de proteínas, moléculas biologicamente ativas e elementos antioxidantes, pode atuar positivamente no sistema de proteção dos animais. No experimento de estresse crônico, juvenis de pacu foram alocados em elevada densidade (50 kg peixe/m3) por 30 dias. No experimento de estresse agudo, os juvenis permaneceram por 15 dias em gaiolas de alimentação, sendo submetidos à baixa concentração de oxigênio (0,75 mg/L). Durante o período experimental, quatro dietas contendo 0, 10, 20 e 30% de colostro bovino liofilizado (CBL) (com 32% de proteína bruta), foram fornecidas duas vezes diariamente (considerando-se quadruplicatas para cada dieta). Antes do início e ao final de cada experimento, analisou-se para cada lote os parâmetros biométricos de biomassa e comprimento para obtenção de análises de desempenho. Oito juvenis para a situação experimental de adensamento, e dez juvenis para a de hipóxia, de cada tratamento, foram anestesiados com benzocaína e amostras de sangue foram coletadas do vaso caudal para análises hematológicas. Foram realizadas análises de eritrograma, leucograma (contagem total e diferencial de leucócitos), hematócrito e calculados os índices hematimétricos. As imunoglobulinas séricas dos juvenis de pacu foram quantificadas através do método de Turvação por Sulfato de Zinco (ZST), que foi padronizado para peixes no presente trabalho. Os juvenis de pacu foram distribuídos em um delineamento experimental inteiramente casualizado no experimento de estresse crônico, e para o de estresse agudo, em blocos, ambos com quatro tratamentos. Os dados foram submetidos à análise de variância, através do procedimento \"General Linear Model\" (PROC GLM) do programa estatístico SAS (1989). Para a avaliação de diferenças entre médias foram efetuados contrastes entre pares de médias utilizando-se o método de Tukey, onde foi considerada a probabilidade de 5% (P<0,05). Não foi observada influência do colostro bovino no desempenho e nas variáveis hematológicas analisadas em ambas situações experimentais, estresse crônico e agudo. Entretanto, para o experimento de estresse agudo, a inclusão de CBL na dieta dos pacus influenciou o número de células granulocíticas especiais, sendo que o grupo que recebeu 0% de CBL apresentou menor número de células que o grupo que recebeu 10% de CBL, assim como o número de monócitos, sendo que o grupo que recebeu 20% de CBL apresentou menor número de células que o grupo que recebeu 30% de CBL na dieta (P<0,05). Embora o colostro bovino não tenha influenciado as variáveis hematológicas analisadas, não houve efeito negativo à esta fonte de proteína heteróloga fornecida aos peixes, uma vez que o desempenho dos animais que receberam o composto na dieta foi semelhante aos animais que receberam dieta sem esta secreção láctea. Considerando os presentes resultados, o colostro bovino liofilizado, uma fonte rica de moléculas bioativas, não contribuiu para a proteção de juvenis de pacu sujeitos à alta densidade de estocagem e baixa oxigenação. / Hematological characteristics were evaluated, specifically the response of blood protection elements of juvenile pacu, endemic and neotropical species, kept under adverse conditions and fed diets containing lyophilized bovine colostrum. This first milk secretion, a rich protein source, biologically active molecules and antioxidant elements, can act positively in the animal protection system. In the chronic stress experiment, juvenile pacu were allocated at high density (50 kg fish/m3) for 30 days. In the acute stress experiment, the juveniles remained for 15 days in feed cages and were submitted to low oxygen concentration (0.75 mg/L). During the experimental period, four diets containing 0, 10, 20 and 30% of lyophilized bovine colostrum (CBL) (with 32% crude protein) were given twice daily (considering quadruplicates for each diet). Before the beginning and the end of each experiment, the biometric parameters of biomass and length were analyzed in each batch for performance analyses. Eight juveniles for the experimental situation of densification and ten juveniles for hypoxia of each treatment were anesthetized with benzocaine and blood samples were collected from the caudal vein for the hematological analysis. Erythrogram, leukogram (total and differential counts of leukocytes), hematocrit and hematimetric indexes were performed. The serum immunoglobulins of the pacu juveniles were quantified by the Zinc Sulfate Turbid (ZST) method, which was standardized for fish in this study. Juveniles pacu were distributed in a completely randomized experimental design for cronic stress experiment, and for acute stress in randomized blocks, both with four treatments. Data were submitted to the \"General Linear Model\"procedure (PROC GLM) of the statistical program SAS (1989). For a mean-to-average assessment, contrasts were performed between pairs of means using the Tukey method, where a probability of 5% (P <0.05) was considered No influence of bovine colostrum was observed on performance and hematological variables analyzed in both experimental situations, chronic and acute stress. However, for the experimental situation of acute stress, the addition of CBL to the diet of pacu influenced the number of special granulocytic cells, and the group that received 0% CBL presented lower number of cells than the group that received 10% CBL, as well as the number of monocytes. The group that received 20% of CBL presented lower number of monocytes than the group that received 30% of CBL in the diet (P <0.05). Although bovine colostrum did not influence the hematological variables analyzed, there was no negative effect on this source of heterologous protein supplied to the fish, since the performance of the animals that received the compound in the diet was similar to the animals that received diet without this milk secretion. Considering theresults, lyophilized bovine colostrum, a rich source of bioactive molecules, does not contribute to the protection of juvenile pacu subjected to high stocking density and low oxygenation.

O objetivo geral deste trabalho foi caracterizar o perfil protéico da secreção uterina pura, através da eletroforese bi-dimensional, de éguas em diferentes fases do ciclo estral, com diferentes graus de alterações inflamatórias e degenerativas, e com diferente capacidade de resposta à cobertura. Para tanto se realizaram cinco experimentos. O primeiro objetivou caracterizar o perfil protéico da secreção endometrial de éguas e determinar se essas proteínas estão associadas ao ciclo estral. A hipótese a ser testada é que o perfil protéico das secreções endometriais varia entre o estro e o diestro. Conclui-se que a composição protéica da secreção uterina da égua em estro é diferente daquela de éguas em diestro, podendo as diferenças protéicas estarem associadas tanto ao processo de manutenção e desenvolvimento embrionário, como a uma necessidade de eventual resposta inflamatória. O segundo experimento objetivou comparar as taxas de prenhez e morte embrionária em éguas não lactantes cobertas no primeiro, ou em outros ciclos durante a temporada reprodutiva. Foi concluído que: (a) durante a temporada reprodutiva, a fertilidade de éguas solteiras é menor no 1° ciclo que nos ciclos subseqüentes; (b) que uma taxa de morte embrionária maior pode ser esperada em éguas falhadas cobertas no 1° ciclo do que nos demais e (c) que a menor fertilidade observada no 1° ciclo não está relacionada à incidência de endometrite persistente pós-cobertura. O terceiro experimento objetivou comparar o perfil protéico da secreção endometrial e a expressão de receptores para esteróides ovarianos no endométrio de éguas em diestro após a 1ª ovulação e após a 2ª ovulação da temporada. Conclui-se que o ambiente uterino é diferente no primeiro diestro da temporada reprodutiva, comparado aos ciclos subseqüentes. O quarto experimento objetivou comparar o perfil protéico da secreção endometrial de éguas resistentes e susceptíveis à endometrite persistente pós-cobertura, durante o estro.Ahipótese a ser testada é que o ambiente uterino da égua susceptível encontra-se alterado no estro prévio à cobertura. Conclui-se que a composição da secreção endometrial das éguas susceptíveis, antes da cobertura, é diferente daquela observada nas éguas resistentes, estando as proteinas observadas relacionadas ao processo inflamatório e à contratilidade uterina. O quinto experimento objetivou (a) comparar a composição protéica da secreção endometrial de éguas em estro com e sem fibrose e (b) avaliar o efeito da inflamação endometrial sobre o perfil protéico da secreção uterina de éguas em estro e em diestro. A hipótese é que a fibrose e a inflamação alteram a composição protéica do fluído uterino, podendo prejudicar o desempenho reprodutivo da égua. Conclui-se que nas éguas em estro a inflamação e a fibrose endometrial alteram apenas a quantidade de poucas proteínas no ambiente uterino. Durante o diestro, a presença da inflamação alterou o ambiente uterino, havendo maior quantidade de proteínas inflamatórias. Os resultados apresentados neste trabalho requerem a confirmação da identidade das proteínas, através de seqüeciamento ou imuno identificação. No entanto, várias informações puderam ser obtidas e muitas novas perguntas podem ser geradas, em especial a partir dos resultados com as éguas susceptíveis. / The main objective from this study was the characterization of the protein profile by SDS-PAGE, from mares during the estrous cycle and mares with uterine inflammation, fibrosis and susceptibility to persistent post-mating endometritis. Five experiments were performed. The first aimed to evaluate the protein profile of endometrial secretions of mares and to determine if any of these proteins was associated with estrous cycle. It was concluded that protein profile from estrous mares is different from the profile from diestrous mares. This difference can be explained by requirements to support and develop the embryo or to an eventually inflammatory response. The second experiment aimed to compare pregnancy and embryo loss rates in non-lactating mares bred either in the first, or in other estrus cycles during the breeding season. It was concluded that: (a) during the breeding the fertility of non-lactating mares is lower in the 1st than in other estrus cycles season; (b) that a higher embryo loss rate may be expected in barren mares bred in the 1st than in other estrus cycles of the breeding season and (c) that the lower fertility rate observed during the 1st estrus cycle is not related to the incidence of post-breeding endometritis. The third experiment aimed to compare the protein profile of endometrial secretions and the steroid hormone receptor expression of the uterus from diestrous mares in the first, or in other estrous cycles during the breeding season. It was concluded that the uterine environment in the first diestrus of the breeding season is different in relation of the other diestrus. The fourth experiment aimed to compare the protein profile of endometrial secretions from estrous mares resistant or susceptible to persistent post-mating endometritis (PPME). The tested hypothesis was that before the insemination in susceptible mares the uterine environment is disturbed. It was concluded that there is a difference in the uterine environmentbetween resistant and susceptible mares to PPME, probably resulting from the inflammatory response and affecting the uterine contractility. The fifth experiment aimed (a) to compare the protein profile of endometrial secretions from estrous mares with and without fibrosis and (b) to estimate the effect of inflammation in the protein profile of endometrial secretion from mares in estrous and in diestrous. The tested hypothesis was that fibrosis and inflammation disturb the uterine environment modifying the protein profile of the endometrial secretion impairing the reproductive performance. It was concluded that inflammation and fibrosis in estrous influenced the protein profile in a low number of spots. During diestrous, the inflammation affect uterine environment with an expressive number of inflammatory proteins. The protein profile observed in the experiments must be confirmed by sequencing or immunoidentification. However, much information could be obtained but many others must be investigated, principally by the susceptible mare.

Orientadores: Ljubica Tasic, Marco Aurelio Zezzi Arruda / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-17T19:46:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Martins_AdrianaMartini_M.pdf: 8608342 bytes, checksum: fca9bf20d004eaa7ecfd1a0213382c0b (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A expressão protéica da bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) foi avaliada aplicando técnicas de espectrometria de massas (MS) na tentativa de identificar a presença de 40 proteínas classificadas como possíveis chaperonas de secreção dos Sistemas Secretórios do Tipo III e IV. Embora o processo de virulência da Xac ainda não seja bem elucidado, acredita-se que as proteínas alvo desempenhem papel importante em caminhos secretórios. Estas proteínas participam no encaminhamento dos fatores de virulência para a secreção, proporcionando-lhes estrutura específica e compatível aos caminhos secretórios, previnem sua aglomeração e interações inapropriadas. Para alcançar os objetivos, a Xac foi cultivada em três condições distintas: meio de cultura LB, considerado como controle, e meios enriquecidos com extratos provenientes de folhas e cascas de laranja, que mimetizam a presença da planta hospedeira por conterem nutrientes específicos. A separação das proteínas da Xac foi realizada por eletroforese em uma e duas dimensões, que permitiu verificar a presença das proteínas alvo na região de 8-23 kDa com pI na faixa 4-7. Após lise tríptica, as análises de espectrometria de massas (MS) foram realizadas utilizando-se exclusivamente as técnicas de ionização suave MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization) e ESI (Electro Spray Ionization). Foram identificadas 12 proteínas da Xac até então consideradas hipotéticas, sendo uma delas, potencial chaperona secretória dessa bactéria. Aplicando técnica de cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS) foi avaliado o consumo preferencial da Xac em relação aos extratos de casca e folha de laranja, como, também, a produção de metabólitos. O estudo de metalômica qualitativa possibilitou a identificação de espécies metálicas ligadas às proteínas da Xac por ICP-MS em frações obtidas por cromatografia líquida / Abstract: The proteome of the bacterium Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) was studied with the aim to identify 40 hypothetical proteins and possible secretion chaperones from the Type III and Type IV Secretion Systems. It is believed that the target proteins can interact in a conserved manner with virulence factors providing them specific and appropriate structures to travel through the secretion pathways, prevent their improper interactions and agregation. For this purpose, Xac was cultived in three distinct conditions: rich medium (LB), used as the control condition, and in media enriched with orange¿s leaves and peels extracts, which simulate the presence of the host plant cell by containing specific nutrients. After protein separation by electrophoresis (1D and 2D), and detection of proteins in the region of 8-23 kDa and pI range from 4-7, characteristic of the target proteins, tryptic lysis was executed. Mass Spectrometry (MS) analyses applying soft ionization sources, MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization) or ESI (Electro Spray Ionization), enabled the identification of 12 proteins, one of them possible secretion chaperone, that were considered hypothetical. Gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) was used as a tool for monitoring the consumption of specific nutrients present in the extracts by Xac and the production of its metabolites. Also, ICP-MS was applied in a qualitative Xac's metalomics that enabled the discrimination of important metallic species in protein fractions obtained by HPLC / Mestrado / Quimica Organica / Mestre em Química

Orientadores: Wanderley Dias da Silveira, Eliana Guedes Stehling / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T23:32:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pace_Fernandade_D.pdf: 4667016 bytes, checksum: c841e6b899f0efc5569c9c6c6ce46935 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Linhagens de Escherichia coli patogênica para aves (APEC) causam infecções extraintestinais e são responsáveis por significativas perdas econômicas na indústria avícola mundial. Recentemente, foram descritos isolados de APEC geneticamente relacionados a diversas outras E.coli extraintestinais (ExPEC) de origem humana, indicando a possibilidade das mesmas constituírem risco zoonótico para humanos. Alguns dos conhecidos fatores de virulência de APEC incluem adesinas, sistema de aquisição de ferro, citotoxinas, entre outros. Nesse trabalho, demonstramos que a linhagem de APEC SEPT 362, isolada do fígado de uma ave apresentando sinais clínicos de septicemia, expressa o Sistema de Secreção Tipo VI (SST6), causa rearranjo do citoesqueleto de células epiteliais cultivadas in vitro, é capaz de aderir e invadir células HeLa e é viável dentro de macrófagos. Para estudar o envolvimento do SST6 na patogênese da linhagem SEPT362, foram deletados três genes desse sistema: hcp, que codifica para uma proteína estrutural e secretada, clpV, que codifica para uma ATPase e icmF (intracellular multiplication factor), gerando três mutantes, respectivamente. Todos os mutantes demonstraram uma diminuição nos processos de adesão e invasão a células HeLa, formação de biofilme e virulência in vivo. Estudos de transcriptoma mostraram que a expressão da fímbria tipo 1 encontra-se diminuída nesses mutantes, o que poderia ser responsável pela diminuição do processo de adesão e invasão às células epiteliais. Nesse trabalho, demonstramos que o SST6 é importante para o processo de patogenicidade, visto que todos os mutantes tiveram sua virulência atenuada em experimentos realizados in vivo com uma significativa diminuição de características relacionadas à patogenicidade in vitro. Esses resultados demonstram que os genes estudados do SST6 influenciam a expressão da fímbria tipo 1 e contribuem para a patogênese desta linhagem APEC / Abstract: Avian pathogenic Escherichia coli (APEC) strains frequently cause extraintestinal infections and are responsible for significant economic losses in the poultry industry worldwide. APEC isolates are closely related to human extraintestinal pathogenic E. coli (ExPEC) strains and may also act as pathogens for humans. Known APEC virulence factors include adhesins such as type 1 fimbriae and curli, iron acquisition systems, and cytotoxins, among others. Here we demonstrated that APEC strain SEPT362, isolated from a septicemic hen, expresses a type VI secretion system (T6SS), causes cytoskeleton rearrangements, invades epithelial cells, replicates within macrophages, and causes lethal disease in chicks. To assess the contribution of the T6SS to SEPT362 pathogenesis, we generated three mutants, ?hcp (which encodes a protein suggessed to be both secreted and a structural component of the T6SS), ?clpV (encoding the T6SS ATPase) and ?icmF (intracellular multiplication factor). All mutants showed decreased adherence and invasion to HeLa cells and decrease in several other pathogenicity related characteristics. Transcriptome studies showed that the level of expression of type 1 fimbriae was decreased in these mutants, which may account for the diminished adhesion and invasion of epithelial cells. The T6SS seems to be important for the disease process, given that both mutants (?hcp and ?clpV) were attenuated in an infection model in chicks. These results suggest that the T6SS influences the expression of type 1 fimbriae and contributes to the pathogenesis of this APEC strain pathogenesis / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular