Thesis (M. Tech. (Agriculture)) - Central University of Technology, Free state, 2013 / The objectives of the study were to find the relationship between live performance and testis traits of South African indigenous cockerels on Naked Neck, Ovambo and Potchefstroom Koekoek (Trial 1). Characterise Naked Neck, Ovambo and Potchefstroom Koekoek cockerels’ semen macroscopically and microscopically (Trial 2). To investigate the relationship between phenotypic and sperm traits of the South African indigenous cockerels Naked Neck, Ovambo and Potchefstroom Koekoek. (Trial 3). Quantification of indigenous cockerels sperm traits measured by Computer Assisted Sperm Analysis (CASA) technology and the relationship to fertility (Trial 4). The cockerels shank, comb and wattle length were recorded with a vernier calliper. A total of 198 ejaculates were collected from 33 cockerels; Ovambo (n=11), Potchefstroom Koekoek (n=11) and Naked Neck (n=11) by means of an abdominal massage technique. Following analysis, 0.25 ml undiluted semen dose from Naked Neck (NN, 11), Ovambo (OV, 11) and Potchefstroom Koekoek (PK, 11) cockerels were inseminated NN (30), OV (30) and PK (30) hens once per week for 6 weeks. Semen was analysed macroscopically and microscopically. The sperm motility rate was evaluated with the aid of the Computer Assisted Sperm Analysis (CASA) called Sperm Class Analyser (SCA) system. Breed significantly (P< 0.05) affected the body weight of Ovambo (2.5±0.4kg), Naked Neck (2.0±0.3kg) and Potchefstroom Koekoek (2.3±0.3kg) cockerels, OV was statistically heavier than NN and PK. The semen volume of Naked Neck (0.5±0.2ml) breed was significantly higher, when compared to Ovambo (0.4±0.2ml), but similar to Potchefstroom Koekoek (0.3±0.2ml) breed. The overall sperm motility rate of Ovambo (95.0±7.2%), Potchefstroom Koekoek (86.0±13.7%) Naked Neck (76.4±22.2%) group was significantly different. The normal sperm morphology in the Naked Neck (76.4±22.2%) was significantly lower when compared to Potchefstroom Koekoek (86.0±13.7%) and Ovambo (95.0±7.2%) cockerels. A positive correlation existed between body weight and semen volume for Potchefstroom Koekoek (r=0.1477) cockerels only. Moreover, there was a positive correlation between the body weight and total sperm motility for Naked Neck (r=0.3848), Ovambo (r=0.4871) and Potchefstroom Koekoek (r=0.2230) cockerels. However, a negative correlation existed between body weight and semen volume for Naked Neck (r=-0.4502) and Ovambo (r=-0.1244). There was no significant differences (P>0.05) on the shank length (SL), comb length (CL) and wattle length WL) of Naked Neck (8.4, 5.4 and 5.6 cm), Ovambo (8.3, 5.8 and 6.0 cm) and Potchefstroom Koekoek (7.7, 5.9 and 5.6). There was a positive correlation between shank length and wattle length, comb length, semen volume, sperm concentration, semen pH and live normal sperm, inversely, a negative correlation of body weight and total sperm motility was observed. Introspective a negative correlation existed between body weight and total motility. Ovambo (11.45±0.9 g) had the highest live weight of testis, it was significantly different from Naked Neck (9.2±0.8g) and Potchefstroom Koekoek (8.9±0.8 g). For average length of the testis there was a significant difference amongst all breeds, Ovambo (4.0±0.5 cm), Naked Neck (3.4±0.3 cm) and Potchefstroom Koekoek (3.7±0.4 cm). Following Al, significant differences were recorded in Potchefstroom Koekoek and produced eggs that had highest average egg weight (55.5 g), fertility (68.2 %), hatchability (78.6 %), percentage of normal chicks (80.1%) and chick weight (37.9 g) compared to Ovambo (40.4 g, 5 2.1 % , 70.2 %, 71.5 %, 32.8 g and Naked Neck (37.1 g, 50.6 %, 71.1 %, 75.8 % and 23.5 g). In order to achieve the highest level of fertility and hatched of fertile eggs, an adequate number of active males that are producing high quality semen should be maintained in the breeder house at all times. In conclusion, body weight positively affected semen volume and sperm motility rate but this was breed dependent. The Sperm of Potchefstroom Koekoek and Ovambo resulted in a better motility and morphology rate. The Sperm Class Analyser or CASA provided more precise, repeatable and objective information. Evaluation of the sperm motility rate of South African indigenous cockerels holds potential for future use in semen evaluation. Body weight of all three indigenous breeds was positively correlated with sperm concentration, semen pH, and total sperm motility. Shank and wattle length of all three indigenous breeds were positively correlated with semen volume, sperm concentration, and semen pH but not with total sperm motility. However, comb length was positively correlated with semen volume and pH, sperm concentration, and total motility. In conclusion, there is no correlation between live performance and testis traits. Though the study suggests that body weight and testicular length are good indicators of sperm production. Simple and indirect method of estimation is still needed to predict the fertility of the breeding cockerels. In order to achieve the highest level of fertility and hatch of fertile eggs, an adequate number of active males that are producing high quality semen should be maintained in the breeder house at all times. The Potchefstroom Koekoek, Ovambo and Naked Neck donated quality semen as well as in improving the fertility and hatchability traits of the indigenous chicken breeds. Chicken hatched from larger eggs had higher body weight, hatchability and fertility therefore breeders should select bigger egg sizes probably of 50-55g for breeding programmes. Consequently, the local cockerels have higher potential for use in natural mating and Al programmes since seminal traits could be a viable index for selection of breeding cockerels.

Endozoochory is an important part of plant-animal relationship. In model area of the Doupov Mountains large herbivore mammals, such as red deer, sika deer and wild boar, act as effective seed dispersers. Out of 282 dung samples 29 719 seedlings of 91 species emerged. The most common species was Urtica dioica (80 % of all seedlings). The amount of seeds in dung as well as species composition were highly dependent on dispersing animal, both showed strong seasonality and differences between two studied localities. Frequency of species in dung did not correspond to their frequency in vegetation suggesting strong preferences of herbivores as predators. However more research is needed to test this hypothesis. Given very high time demands for samples processing beforehand the emergence experiment, the influence of concentration by washing through on seedling emergence and species composition was tested. According to preliminary results more seedlings and species emerge from concentrated samples. However, concentration has no effect on emergence of U. dioica as the most common species. Concentration of samples by running water is recommended for faster emergence in greenhouse conditions. Preliminary results also suggest that the approximation of number of seedlings/species on weight of dry mass is not...

Root system development in the early phases of plant ontogeny Seed germination and subsequential developement of the root system is a critical stage of life of a newly rising plant. The plant must recognise and suitably and quickly find an answer to the environmental conditions in which it finds itself. However, the way in which the root system develops and its final architecture depends not only on the environmental conditions but also on the plant itself. In addition, responses to different conditions may vary among different plant species. This work examines the developement of a root system in the first four weeks of a plant's life. It observes the dependence on the amount of available nutrients in the substrate and on the amount of available nutrients the seed is given by the mother plant. It also briefly touches on the relations between seed germination, seed size and the amount of available nutrients. No differences relating to the amount of available nutrients were found in seed germination. However, differences in germination speeds were found between plant species. Plant biomass increases with the increasing amount of available nutrients in the substrate. This increase is relatively greater for plant species with a small seed size. Plant species with a big seed size invest relatively more...

Orientador: Maria Denise Lopes / Banca: Frederico Ozanan Papa / Banca: Jussara Tebet / Resumo: A análise dos efeitos da refrigeração sobre a congelabilidade da célula espermática da cauda do epidídimo de gatos domésticos foram avaliados nesse experimento. Após prévia refrigeração a 5O C por 24 horas alíquotas de sêmen foram submetidas a criopreservação e posteriormente descongeladas para análise morfofuncional. 15 animais foram submetidos a orquiectomia de conveniência e seus epidídimos foram manipulados para obtenção de amostras que foram suspensas em meio TE (TRIS/Equex/Gema de Ovo), analisadas, refrigeradas e congeladas. Amostras referentes ao grupo controle foram congeladas imediatamente após a colheita. A analise morfofuncional consistiu em motilidade, vigor, morfologia espermática e Integridade de membrana. Após a descongelação os resultados dos grupos controle e trabalho foram analisados estatisticamente e observou-se que não existe diferença estatística para nenhuma das variáveis analisadas. Embora tenha sido observada diferença estatística entre os momentos pós-colheita e pós-refrigeração por 24 horas para as variáveis motilidade, vigor, integridade de membrana e defeitos primários, nenhuma variável diferiu entre as amostras congeladas pós-colheita e as amostras congeladas pós-refrigeração prolongada. Tais resultados demonstram que um transporte refrigerado a 5O C por 24 horas não interfere sobre a congelabilidade de sêmen do epidídimo de gatos domésticos. Do ponto de vista da conservação tais resultados abrem portas para um melhor fluxo de gametas de espécies selvagens para centrais de biotecnologia permitindo um melhor aproveitamento e conservação deste material. / Abstract: The present study analyzed the effect of cooling on sperm cells obtained from the epididymis tail from domestic cats in respect to their capability for freezing. The treatment group had their samples submitted to freezing after being cooled at 5° C during 24 hours, and th~ control group samples were frozen immediately after collection, Samples from both groups were then thawed and submitted to mo rphofunctiona I analysis. Fifteen animais were submitted to a convenient routine orchiectomy and their epididymis were processed to obtain a semen samples which were suspended in TE medium (TRIS/Equexl egg yolk). The samples were then analyzed, coo,led and frozen. The morphofunctional analysis consisted of sperm motility, vigor, morphology and membrane integrity. After thawing, the semen samples from treatment and control groups were analyzed and no statistic difference was found among ali variables described above. / Mestre

A necessidade de criopreservação seminal vem aumentando cada vez mais, concomitantemente à evolução das biotecnologias aplicadas à reprodução animal. Sabe-se que a principal causa da diminuição do desempenho reprodutivo de um touro, criado em clima tropical, é o estresse térmico. Raças de origem européia (Bos taurus taurus) são consideravelmente mais sensíveis à essas condições climáticas quando comparadas aos animais de origem indiana (Bos taurus indicus). Esses animais não adaptados podem apresentar decréscimo na qualidade espermática, como alterações estruturais, funcionais e maior suscetibilidade ao estresse oxidativo, após a descongelação do sêmen. Para avaliar essa hipótese, foram utilizadas amostras criopreservadas de 40 touros, sendo 20 da raça Nelore (Bos taurus indicus) e 20 da raça Simental (Bos taurus taurus), criados em clima tropical, dessas, 10 amostras seminais de cada raça foram coletadas durante inverno e 10 durante o verão. Após a descongelação das amostras, foram realizados os testes espermáticos convencionais como motilidade progressiva, vigor e índice de motilidade espermática, e os testes funcionais tais como integridade de membrana plasmática (Eosina/Nigrosina), integridade acrossomal (POPE), integridade de DNA (Ensaio Cometa) e atividade citoquímica mitocondrial (3\'3 diaminobenzidina DAB). Também foi avaliada a suscetibilidade das células espermáticas à peroxidação lipídica induzida, através da mensuração da concentração de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). Os dados foram analisados levando em conta as classes: raça (Nelore e Simental) ou estação do ano (verão e inverno), através do programa SPSS 13.0 para Windows. A variável DAB I foi maior (p=0,04) nas amostras dos touros Nelore em comparação com Simentais (17,85 &plusmn; 2,38 vs 11,4 &plusmn; 1,84). Observou-se o efeito das estações do ano sobre as variáveis motilidade progressiva (26,50% inverno e 13,30% verão; p=0,02), DAB I (22,32% inverno e 13,30% verão; p=0,04) e DAB III (13,88% inverno e 22,10% verão; p=0,01), somente no sêmen dos touros Nelore, e o efeito das raças (p=0,03) sobre as variáveis DAB I (22,34% Nelore e 11,60% Simental) e DAB III (13,88% Nelore e 21,19% Simental), apenas durante o inverno, quanto ao nível de TBARS, não foi verificado diferença entre nenhum grupo. Houve correlação entre alguns testes funcionais e convencionais, porém a variável integridade de DNA não correlacionou com nenhum teste convencional. Esses resultados podem indicar que a peroxidação lipídica sofrida, espontaneamente, pelos touros Europeus, devido ao estresse térmico, selecionou espermatozóides mais resistentes à criopreservação. / Seminal cryopreservation technique has been increasing concomitant reproductive biotechnologies. It is known that heat stress is the main cause that affects bulls reproductive performance under tropical environment. European breeds (Bos taurus taurus) are much more sensible to these conditions than Indian breeds (Bos taurus indicus). These non-adapted animals present a fast decrease in sperm quality as structural and functional parameters and higher oxidative stress susceptibility. In order to test this hypothesis, cryoprotected semen samples of twenty Nelore (Bos taurus indicus) and twenty Simmental (Bos taurus taurus) bulls, raised under tropical conditions, were analyzed; ten samples of each breed were collected during summer and ten during winter. After thawing, semen samples were submitted to following conventional tests: progressive motility, vigor and sperm motility index (IME), and following functional tests: plasmatic membrane integrity (eosin-nigrosin), acrosomal membrane integrity (POPE), DNA fragmentation (Comet Assay) and mitochondrial activity (3\'3 diaminobenzidine - DAB). The spermatozoa susceptibility to the induced lipid peroxidation followed by measurement of thiobarbituric acid reactive substances concentration (TBARS), was used as an oxidative stress index. Statistical analysis were performed for breed (Nelore and Simmental) and season (summer and winter), using SPSS 13.0 for Windows. Comparing Nelore and Simmental, DAB I was higher (p=0,04) in the first group (17,85 &plusmn; 2,38 and 11,4 &plusmn; 1,84, respectively). Season effect was observed only in Nelore samples on: progressive motility (26,50% winter and 13,30% summer; p=0,02), DAB I (22,32% winter and 13,30% sumer; p=0,04) and DAB III (13,88% winter and 22,10% summer; p=0,01); and breed effect (p=0,03) was observed only during winter on: DAB I (22,34% Nelore and 11,60% Simmental) and DAB III (13,88% Nelore and 21,19% Simmental). TBARS index, did not differ in breed or season. Correlations were observed between some of functional and conventional tests, however, the DNA integrity did not correlate with any conventional test. These results may indicate that probably, the spontaneous peroxidation that European bulls suffer due to the heat stress may have selected sperm more resistant to the cryopreservation.

Os bichos-preguiça são animais extremamente sensíveis e sofrem com a destruição e a fragmentação das matas. Apresentam baixa taxa de crescimento populacional e necessitam serem mais estudados para que se possa pensar na preservação da espécie. Este estudo teve como objetivo captar informações sobre o sêmen deste animal. Para tanto 18 machos foram capturados em Manaus (AM), Valença (RJ) e Santos (SP), quinze da espécie Bradypus trydactilus e três B. variegatus. Após a captura, os animais foram anestesiados com cloridrato de quetamina (Vetaset&reg; ? Fort Dodge) na dosagem de 10mg/kg associada com cloridrato de xilazina (Kensol&reg; ? König), na dosagem de 1mg/kg, administrado por via intra-muscular. Os eletrochoques foram aplicados em seqüências de três intensidades progressivas de choques, com dez repetições para cada intensidade e variação de 10 mA entre elas. Iniciou-se com 20 mA, atingindo o máximo de 60 mA. A cada série de 3 intensidades de choque realizou-se um intervalo de aproximadamente 3 minutos, após o qual se reiniciou a seqüência com 10 mA acima da mA inicial da seqüência anterior. Cada estímulo durou aproximadamente 3 segundos. O sêmen colhido foi processado conforme as técnicas utilizadas para animais domésticos, realizou-se também preparação para microscopia eletrônica de varredura. Todos os animais ejacularam uma pequena quantidade de sêmen, porém em alguns o volume ejaculado foi insuficiente para a realização do espermiograma completo. Os espermatozóides apresentaram grande variedade de defeitos e as características observadas nas colheitas do primeiro semestre eram distintas das observadas no segundo semestre, porém os dados ainda não foram suficientes para a padronização do sêmen ou para definições mais precisas da existência de sazonalidade. Embora maiores estudos sejam necessários, este estudo foi pioneiro e mostrou a possibilidade de colheita de sêmen através da eletroejaculação nesta espécie. / Sloths are extremely sensitive animals that suffer with the destruction and fragmentation of forests. They present a low population growth rate and need to be further studied for the preservation of the species. This study intended to contribute with information about their semen. In order to do that, 18 male individuals were captured in Manaus (AM), Valença (RJ), and Santos (SP), fifteen of them belonging to the Bradypus tridactylus, and three to the B. Variegatus spieces. After being captured, animals were anesthetized with an intramuscular injection of a combination of 10mg/kg ketamine hydrochloride (Vetaset&reg; ? Fort Dodge) and 1mg/kg of xylazine hydrochloride (Kensol&reg; ? König). Electroshocks were givem in sequences of three progressive intensities, with ten repetitions for each intensity and variation of 10 mA between them. They started with 20 mA and peaked at 60 mA. For each series of 3 shock intensities, there was an interval of approximately 3 minutes, after which they received a new sequence 10 mA above the initial mA of the previous sequence. Each stimulus lasted about 3 seconds. The semen collected was processed according to the techniques used for domestic animals. Spermatozoa were also analyzed by electron scanning microscopy. All animals ejaculated small quantities of semen, and in some of them the volume ejaculated was not enough for a complete spermiogram. Spermatozoa presented a wide variety of defects and the features seen in the collections of the first half of the year were different from those seen in the specimen collected in the second half of the year. Nevertheless, the data were not sufficient to standardize semen, neither to define seasonality more precisely. Although further studies are necessary, this study has shown the possibility of collecting semen through electroejaculation in this species.

A grande demanda por proteína animal e a importância que a criação bovina exerce sobre a economia nacional, vêm exigindo eficientes sistemas de produção. A preservação e disseminação da genética do rebanho bovino dependem de biotecnologias como a criopreservação espermática, inseminação artificial e fertilização in vitro. No entanto, atualmente muito tem sido discutido sobre o uso da gema de ovo nos diluidores seminais. Pois apresentam variabilidade em sua composição e risco de contaminação microbiológica. Em contrapartida, apesar dos diluidores sintetizados com lecitina de soja não fornecerem esses riscos, seus resultados não são muito satisfatórios na criopreservação espermática bovina. Com base na hipótese de que a suplementação do diluidor seminal à base de lecitina de soja com antioxidantes, preserve as características das células espermáticas de maneira tão eficiente quanto à gema de ovo, o objetivo do presente experimento foi comparar o efeito do diluidor à base de gema de ovo com o diluidor à base de lecitina de soja (com e sem antioxidantes), sobre a manutenção da funcionalidade e fertilidade de amostras espermáticas bovinas criopreservadas. Para tal, foram utilizadas amostras seminais de 20 touros Brangus, cujas colheitas foram realizadas pelo método de eletroejaculação e as amostras foram diluídas em 4 grupos de diluidores: LElecitina de soja (sem a adição de antioxidantes); LAlecitina de soja suplementada com ácido ascórbico (AA, 4,5mM); LS lecitina de soja suplementada com superóxido dismutase (SOD, 60UI/mL) e GOgema de ovo (sem adição de antioxidantes). O sêmen foi então, criopreservado de maneira automatizada. As amostras foram descongeladas e analisadas quanto aos testes laboratoriais de motilidade computadorizada do espermatozóide (CASA); integridade de membrana plasmática (eosina/nigrosina); integridade de membrana acrossomal (fast Green/ rosa bengala); atividade citoquímica mitocondrial (DAB); susceptibilidade do DNA à desnaturação (SCSA); índice de estresse oxidativo induzido (TBARS). Além disso, foram realizados testes para verificar o potencial de fertilidade das amostras espermáticas criopreservadas. A fertilidade in vivo foi realizada pela técnica de inseminação artificial em tempo fixo (IATF), utilizando 450 fêmeas bovinas, seguido de exame ultrassonográfico para avaliação de prenhez. Teste de fertilidade in vitro, foi realizado pela técnica de produção in vitro de embriões (PIV) com o uso de ovários de frigoríficos, a classificação do desenvolvimento embrionário e a avaliação da motilidade espermática foram promovidas no decorrer do processo. Os resultados demonstraram que o diluidor LE apresentou efeito na proteção espermática de maneira semelhante ao diluidor GO. No entanto a suplementação desse primeiro com antioxidantes é uma alternativa para melhorar ainda mais esse processo, já que a taxa de prenhez obtida nos grupos LA e LS é satisfatória em um programa de IATF. Ainda o grupo LS foi o que apresentou melhores resultados no processo de PIV. Concluindo que o diluidor à base de lecitina de soja suplementado com o antioxidante superóxido dismutase seria uma opção para a substituição definitiva dos diluidores sintetizados com gema de ovo. / Due to the great demand for animal protein and the importance that bovine breeding exert on national economy, efficient production systems have been required. Cattle genetics preservation and dissemination depend on reproductive biotechnologies such as sperm cryopreservation, artificial insemination and in vitro fertilization. However, the use of egg yolk-based extender is under discussion nowadays, once there is great variability in its composition and risks of bacteriological contamination. On the other hand, despite soybean lecithin-based extenders do not present these risks, satisfactory results, after bovine sperm cryopreservation, have not been reached yet. Based on the hypothesis that soybean lecithinbased extender supplemented with antioxidants, preserve the sperm cell characteristics so efficient as egg yolk does, the aim of the present experiment was to compare the effects of egg yolk-based extender and soybean lecithin-based extender (with and without antioxidants), on functionality and fertility maintenance of bovine cryopreserved sperm samples. For this, seminal samples from 20 Brangus bulls were used, collects were realized by eletroejaculation method and samples were diluted in 4 extenders group: LE-soybean lecithin-based extender (without antioxidant supplementation); LA- soybean lecithin supplemented with ascorbic acid (AA, 4,5mM); LS- soybean lecithin supplemented with superoxide dismutase (SOD, 60UI/mL) and GO-egg yolk-based extender (without antioxidant supplementation). Then, semen was cryopreserved by automatic method. Samples were thawed and analyzed by laboratorial tests such as computer assisted semen analysis (CASA); plasma membrane integrity (eosin/nigrosin); acrosome membrane integrity (fast green/ rose bengal); mitochondrial cytochemical activity (DAB); susceptibility of chromatin denaturation (SCSA); induced oxidative stress index (TBARS). Furthermore, tests for fertility potential of cryopreserved semen samples were performed. In vivo fertility was accessed by timed artificial insemination (TAI), 450 bovine females were inseminated, and ultrasonographical exam was realized for pregnancy detection. In vitro fertility test was accessed by embryo in vitro production (IVP), ovaries from slaughterhouses were used, embryo development classification and sperm motility were promoted during the process. Results indicate that sperm protection is similar between LE and GO extenders. However the antioxidant supplementation of soybean lecithin-based extender is a great alternative to improve the process of sperm protection, since pregnancy rate of LA and LS groups was satisfactory for a TAI program. Besides, LS group presented the best results on IVP process. In conclusion, soybean lecithin-based extender supplemented with superoxide dismutase would be a better option for a definite replacement of egg yolk-based extender for sperm bovine cryopreservation.

A criopreservação dos espermatozóides eqüinos gera alterações nas membranas semelhantes às que ocorrem durante o processo de capacitação (criocapacitação). Sabe-se que o plasma seminal possui fatores decapacitantes. Além disso, é citado na literatura a possibilidade melhorar a preservação dos espermatozóides com membrana plasmática íntegra e motilidade, após refrigeração ou criopreservação, quando adicionado plasma seminal de animais que apresentam boa resposta à congelação ao sêmen de animais que apresentam espermatozóides com baixa capacidade de congelação. Assim, o presente experimento verificou se a criopreservação gera modificações semelhantes à capacitação e se a adição ao sêmen pós-descongelação de plasma seminal autólogo ou adquirido de um animal com boa resposta à congelação (homólogo) diminuía estes efeitos. Para isso, foram realizadas 5 colheitas de sêmen de 4 garanhões. O sêmen in natura foi avaliado e então, processado e submetido à congelação. Após a descongelação o sêmen foi novamente avaliado e então dividido em três tratamentos: adicionado de diluidor de criopreservação sem crioprotetor (DIL), deste com 20 % (v/v) de plasma seminal homólogo (PH) ou com 20 % (v/v) de plasma seminal autólogo (PA). Em seguida, o sêmen foi incubado em banho-Maria (37°C) e submetido as avaliações nos três diferentes períodos de amostragem (0, 60 e 120 minutos de incubação). As avaliações do sêmen consistiram na análise computadorizada das características da motilidade (CASA) e nas análises por citometria de fluxo da reação acrossomal, do potencial de membrana mitocondrial, da estabilidade da membrana plasmática, da peroxidação lipídica e na detecção da fosforilação do aminoácido tirosina presente na superfície da célula espermática. As variáveis foram submetidas à análise de variância e ao teste LSD para comparação das médias, ao nível de 5 % de significância. A criopreservação não aumentou a população de células viáveis com membrana acrossômica reagida, nem a população de células viáveis com aumento na desordem da membrana plasmática (capacitadas). Entretanto, a criopreservação levou a uma redução na quantidade de células com potencial de membrana mitocondrial e aumentou a peroxidação das membranas, além de induzir o aumento na fosforilação de proteínas presentes na superfície da célula. A criopreservação ocasionou uma redução de todas as variáveis analisadas pelo CASA, incluindo a população identificada como hiperativada. A adição do plasma seminal, indiferentemente da origem, melhorou a integridade da membrana plasmática, reduziu a população com aumento na desordem da membrana plasmática (capacitados), além de reduzir a quantidade de proteínas fosforiladas na superfície do espermatozóide. Porém esta melhora só foi encontrada nas análises iniciais (tempo 0), com o tempo o plasma seminal mostrou não ser um meio adequado para se manter o sêmen armazenado levando a um prejuízo na maioria das variáveis estudadas. Baseado nos resultados, pode-se sugerir a adição de plasma seminal com o intuito de reduzir os efeitos da criocapacitação. Contudo, ao adicionar o plasma seminal ao sêmen, este deve ser depositado no trato reprodutivo da fêmea o mais breve possível. / Cryopreservation of equine spermatozoa leads to capacitation-like changes (cryocapacitation). Seminal plasma contains decapacitating factors. Moreover, it has been known that addition of seminal plasma from stallions with good post-thaw semen quality to semen of stallions with low post-thaw semen quality preserve progressive motility and membrane integrity better. Therefore, this study was intended to find out whether the cryopreservation process induces capacitation-like changes and if addition of autologous seminal plasma or seminal plasma from stallion with good post-thaw semen quality (homologous) reduces cryocapacitation effects. For this, five ejaculates were obtained from each of four mature stallions. Samples of in natura semen were analyzed, and submited to cryopreservation. Post-thawed semen was analyzed again so divided in three treatments: only cryopreservation media without cryoprotectants, cryopreservation media without cryoprotectants added 20 % (v/v) of seminal plasma homologous, and cryopreservation media without cryoprotectants added 20 % (v/v) of seminal plasma autologous. All samples were maintained in water bath (37°C) for 120 minutes, while semen analyzes were assessed at time 0, 60 and 120 min. The assessment of each sample was determined by computer-assisted sperm analyses of motility (CASA) and flow cytometry analyzes of acrosome reaction, mitochondrial potential, increased membrane fluidity, lipid peroxidation and degree of protein tyrosine phosphorylation in sperm surface. The variables were submitted to analysis of variance and LSD test at 5% level of significance. Cryopreservation did not increase viable cells with acrosome reaction, neither viable cells with increased membrane fluidity (capacitated). However, cryopreservation led an decrease of cell with mitochondrial potential and an increased in lipid peroxidation, besides increase tyrosine phosphorylation of the equine sperm surface proteins. The cryopreservation caused a reduction of all variables assessed by CASA, including hyperactivated cells. Seminal plasma addition, regardless of origin, improved integrity of plasma membrane, reduced number of viable cells with increased membrane fluidity, besides decrease phosphorylation of sperm surface proteins. Nevertheless, the improved created only was found in the initial analysis (time 0), seminal plasma shown a harmful effect in maintenance of sperm during incubation. Incubation of sperm in seminal plasma damaged majority of variables assessed. Based on results, seminal plasma could be added to post-thawed semen to decrease the cryocapacitation effects. However, post-thawed semen has to be deposited as soon as possible in female reproductive tract when the seminal plasma is added.

Uma abordagem mais moderna sobre o binômio estresse térmico-degeneração foi realizada, visando monitorar a integridade de acrossomo, mitocôndrias e cromatina. Raros são os trabalhos sobre os efeitos da somatotropina bovina exógena (bST) sobre a qualidade seminal de touros que tenham passado por períodos de estresse térmico e conseqüente degeneração testicular. Foram objetivos do trabalho: 1) Comparar as características seminais e espermáticas de touros normais e touros submetidos a estresse térmico testicular (tratados ou não com bST); 2) Avaliar a integridade da membrana plasmática e acrossomal, função mitocondrial e defeitos cromossômicos de espermatozóides de touros normais e touros submetidos a estresse térmico testicular (tratados ou não com bST). Para tanto, o experimento foi dividido em 4 fases: Fase Pré-Insulação: período do dia 1 ao dia 35 (dia 1 = dia do início do experimento), Fase Pré-Tratamento: período do dia 36 ao dia 63 (colocação da bolsa insuladora no dia 36 por 96 horas), Fase Tratamento: período do dia 64 ao dia 119 (aplicações de bST), Fase Pós-tratamento: período do dia 120 ao dia 154. O sêmen de dezesseis touros Simental (Bos taurus taurus) foi coletado semanalmente ao longo de 22 semanas (154 dias). Os touros foram divididos em quatro grupos: o Grupo CONT foi o controle, não foi submetido a qualquer tratamento; o Grupo INSUL sofreu insulação testicular; o Grupo bST recebeu aplicações de somatotropina bovina (Lactotropin® 1 mg/kg PV) a cada quatorze dias a partir do dia 64; o Grupo IbST sofreu insulação e recebeu aplicações de somatotropina. Os animais foram avaliados quanto às características físicas e seminais. O estresse térmico testicular influenciou negativamente o perímetro escrotal, a motilidade espermática, o vigor, o movimento de massa, mas aumentou o total de defeitos espermáticos. A somatotropina bovina influenciou a quantidade de cabeças piriformes nos ejaculados. Os defeitos de cromatina foram influenciados pelo estresse térmico testicular. A população de espermatozóides com membrana plasmática íntegra, acrossomo intacto e potencial mitocondrial foi reduzida em função do estresse térmico testicular / Modern approach concerning binomial thermal stress-testicular degeneration was done in order to study chromatin, acrosomal and mitochondrial integrity. Furthermore, there are few relates about effects of exogenous bovine somatotropine (bST) on seminal quality of bulls which were submitted to thermal stress and consequent testicular degeneration. The objectives of this study were: 1) Comparing seminal and spermatic features of bulls which were submitted to testicular thermal stress (treated or not with bST); 2) Evaluating of the plasmatic and acrosomal membrane integrity, mitochondrial function, and chromosomal defects from the spermatozoa of these bulls. The experiment was divided in 4 phases. Pre-insulation phase: from day 1 to 35 (day 1 = first day of experiment), Pre-treatment phase: from day 36 to 63, Treatment phase: from day 64 to 119 (treatment with bST) and Post-treatment phase: from day 120 to 154. Semen of sixteen Simmental bulls (Bos taurus taurus) was collected once a week, during 22 weeks (154 days). Bulls were split in four groups: Group CONT was the control, and it was not treated or insulated; Group INSUL was insulated; Group bST was treated with bovine somatotropine (Lactotropin® 1.2 mg/kg BW) each 14 days since day 64. Group IbST was insulated and treated with bST. Physical and seminal features of bulls were evaluated. Thermal stress decreased scrotal circumference, sperm motility, vigour and gross motility, and increased total sperm defects. The bST increased pyriform heads in ejaculated. Testicular thermal stress increased chromatin defects. Sperm population with intact plasmatic membranes, intact acrosome and mitochondrial function were reduced by testicular thermal stress

Durante a injeção intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) seleciona-se um espermatozoide móvel e morfologicamente normal para injeção em ovócito maduro. Evidências recentes indicam que mesmo espermatozoides aparentemente normais podem ocultar defeitos em nível molecular. O principal objetivo deste trabalho foi a descrição de um novo método capaz de selecionar espermatozoides maduros a partir de amostras não processadas em procedimento de ICSI. Em um estudo comparativo e prospectivo testou-se uma gota estendida modificada. A \"gota estendida com mecanismo contracorrente\" - GEMC foi montada em uma placa de ICSI padrão a partir de seis gotas de meio de cultivo (10 ?L). O posicionamento e união precisa das gotas deram origem a dois reservatórios e um canal, resultando em um fluxo de líquido através do canal. A adição de uma solução de PVP (polivinilpirrolidona) gerou um gradiente de viscosidade no final do circuito. Amostras seminais foram obtidas de 40 pacientes inférteis. Cada amostra seminal foi dividida em 4 alíquotas: uma alíquota para o processamento por centrifugação em gradiente de densidade (CGD), uma alíquota para a GEMC utilizando amostras não processadas, uma alíquota para a GEMC utilizando amostras processadas e uma alíquota para controle. Nos grupos GEMC uma média de 200 espermatozoides foram consecutivamente coletados, sem seleção, no reservatório de captura utilizando-se uma micropipeta de injeção como no procedimento convencional de ICSI. A morfologia espermática foi avaliada e demonstrou melhora, comparando-se com os controles, em todos os tratamentos utilizados. A imaturidade da cromatina foi avaliada utilizando-se o teste do azul de anilina. Em relação à imaturidade, 100% dos homens obtiveram melhores resultados tanto após o preparo por CGD quanto utilizando o método GEMC. Isto se refletiu em uma redução das formas imaturas de 28.65 ± 8.97% no sêmen fresco para 17.29 ± 7.72% após processamento por CGD (P < 0.01). Uma redução ainda maior nas formas imaturas foi obtida após o método GEMC quando comparado com o processamento por CGD: 0.89 ± 1.31% (P < 0.01) utilizando-se sêmen fresco e 1.05 ± 1.63% (P < 0.01) utilizando-se amostras processadas. Um novo método unindo seleção e captura de espermatozoides em um mesmo procedimento de ICSI foi descrito e testado. O método GEMC seleciona espermatozoides de forma fácil e permite o uso direto de amostras não processadas em procedimentos de ICSI. Este método seleciona espermatozoides maduros com mais eficiência do que o processamento por CGD. Novos estudos são necessários para se analisar o impacto do método nas taxas de fertilização, desenvolvimento embrionário, gravidez, implantação e abortamento / During intracytoplasmic sperm injection (ICSI) a motile spermatozoon with normal morphology is visually selected for insemination of an oocyte. Recent evidence indicates that even though the sperm appears morphologically normal, a possibility of defects at the molecular level still exists. The main objective of this work was to describe a novel approach capable of selecting mature spermatozoa from unprocessed semen sample in a one-step ICSI procedure. A modified extended drop was tested in a prospective comparative study. The \"Gota Estendida com Mecanismo Contracorrente - GEMC\" (Positive Rheotaxis Extended Drop - PRED) was assembled on a standard ICSI dish and consisted of six culture medium droplets (10 ?L). The precise merging of the drops created two reservoirs and a channel therefore the fluid flew through the channel. The addition of a PVP solution created a viscosity gradient in the final sector of the circuit. Semen samples were taken from 40 subfertile men. Each semen sample was divided into four aliquots: one aliquot for density gradient centrifugation (DGC), one aliquot for GEMC using fresh semen, one aliquot for GEMC using processed semen and one aliquot for the control. In GEMC a mean of 200 spermatozoa were collected consecutively, without selection, from the outlet reservoir with an injecting pipette as for conventional ICSI procedure. Sperm morphology was assessed and resulted in improvement compared to controls in all treatments. Chromatin immaturity was assessed using aniline blue assay. Regarding to chromatin immaturity, 100% of men had better results after DGC preparation and GEMC approach. This was reflected in a mean reduction from 28.65 ± 8.97% uncondensed chromatin in the native ejaculates to 17.29 ± 7.72% in DGC processed semen (P < 0.01). An even greater reduction was achieved after GEMC approach showing a mean of 0.89 ± 1.31% uncondensed chromatin compared to DGC processed sample (P < 0.01). A novel one-step ICSI approach joining sperm selection and recovery was developed and tested. This GEMC approach can select sperm easily and permits the direct use of native semen in ICSI. This approach can select sperm with lower chromatin immaturity than DGC method. Further studies need to access its relation to fertilization, embryo development, pregnancy, implantation and miscarriage rates