Les Escherichia coli enterohémorragiques (EHEC) sont responsables de maladies graves comme la colitehémorragique (CH), le syndrome hémolytique et urémique (SHU) ou le purpura thrombotiquethrombocytopénique (PTT). Les infections humaines sont principalement dues à la consommationd’aliments contaminés, en particulier la viande d’origine bovine, le lait ou les légumes. Le principalréservoir naturel des EHEC est le tractus gastro-intestinal (TGI) des bovins. Les fèces de bovins sont, parconséquent, responsables de la contamination de plusieurs types d’aliments mais également de ladissémination environnementale de ces bactéries pathogènes. En relation avec cette problématique, lesdeux objectifs de ce projet étaient (i) de développer une nouvelle méthode d’immuno-capture pouraméliorer l’isolement des principaux sérogroupes de EHEC impliqués dans les infections humaines; et (ii)de développer un nouveau DFM (direct fed microbial) utilisable chez les bovins pour diminuer laprévalence des EHEC chez les animaux. Cette thèse a permis le développement d’une méthoded’immuno-capture basée sur l’utilisation d’une microplaque à 96 puits, coatée avec des anticorpsspécifiquement dirigés contre E. coli O157 ou d’autres sérogroupes. Cette méthode, appelée immunomicroplatecapture (IMC) est efficace et facile d’utilisation pour l’isolement de souches d’E. coli O157 ;O26 ; O103 et O111 dans les produits alimentaires. L’IMC pourrait être une alternative à l’utilisation desbilles immuno-magnétiques qui sont classiquement utilisées pour la détection des EHEC dans lesproduits alimentaires, mais qui représentent une technique longue et fastidieuse lors de l’analysesimultanée de nombreux échantillons. La seconde partie de cette thèse a permis de sélectionner 5souches de bactéries lactiques qui présentent une activité antagoniste vis-à-vis d’E.coli O157 et d’autressérogroupes in vitro. La résistance de ces souches aux conditions du tractus gastro-intestinal (conditionsacides, présence de sels biliaires, présence de jus de rumen) a été évaluée in vitro. Leur innocuité a étévérifiée chez des souris Balb-C par l’administration de chacune des souches incorporées à la nourriture(109 cfu/g). Enfin, la lyophilisation des souches n’a pas affecté leur activité antagoniste in vitro. Lesrésultats obtenus dans les différents tests in vitro suggèrent que les 5 souches pourraientpotentiellement être utilisées comme DFM chez les bovins pour diminuer la colonisation de leur TGI parles EHEC et par conséquent diminuer le risque de contamination des aliments et le risque dedissémination environnementale. / Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) are responsible for important diseases such as hemorrhagic colitis,hemolytic and uremic syndrome or thrombotic thrombocytopenic purpura. Human infections occurprincipally by consumption of contaminated food particularly beef meat, milk or vegetables. The mainnaturally reservoir of EHEC is the gastro-intestinal tract of cattle. Cattle feces are therefore responsiblefor contamination of various types of food but also environment dissemination of the pathogenicbacteria. Related to this problematic, the two objectives of this project were (i) to develop a newimmuno-capture method to improve the isolation of the main serogroups of EHEC involved in humaninfections in food; and (ii) to develop a new direct fed microbial usable in cattle to decrease prevalenceof EHEC in animals. This thesis allowed the development of an immuno-capture method based on theuse of 96-well microplates coated with specific antibody directed against E. coli O157 and otherserogroups. This method, called immuno-microplate capture (IMC) was efficient and user-friendly forthe isolation of E. coli O157; O26; O103 and O111 in foods. This could be an alternative to the use ofimmuno-magnetic beads which are currently used for the detection of EHEC in foods, but are timeconsumingand labor intensive when large number of samples is analyzed simultaneously. The secondpart of this thesis allowed the selection of 5 lactic acid bacteria strains which presented highantagonistic activity against E. coli O157 and other serogroups in vitro. Resistance of these strains togastro-intestinal conditions (acidic conditions, presence of bile salts and rumen fluid) was evaluated invitro. The safety of the 5 strains was checked in Balb-C mice by administration of each strain mixed infeed at 109 cfu/g. Finally, freeze-drying did not affect the antagonistic activity of the 5 strains, suggesteda possible large scale use of these strains. According to the various results obtained in vitro, the 5 strainscould potentially be used as DFM in cattle to decrease colonization of their gastro-intestinal tract byEHEC and consequently decrease the risk of food and environment contaminations.

Master of Science / Food Science Institute / Randall K. Phebus / The USDA declared seven STEC serotypes to be adulterants in raw, non-intact beef products due to their severe health implications. STEC contamination of carcasses is most likely to occur during hide removal. This study evaluated the efficiency of a mixed STEC-7 inoculum to attach to raw beef carcasses (predominantly lean muscle and adipose tissue), and compared the efficacy of 4.5% lactic acid (LA) to a water (W) spray to reduce STEC populations. Four carcass contamination scenarios, representing potential points whereby STEC could come into contact with raw beef surfaces during slaughter operations, were evaluated: (A) pre-rigor surface STEC inoculated (ca. 7 log cfu/cm[superscript]2), 30-min ambient temperature attachment, spray with LA or W; (B) pre-rigor inoculated, 24-h chilled attachment, spray; (C) tissue chilled 24 h, inoculated, 30-min attachment, spray; and (D) tissue chilled 24 h, rewarmed to 30°C, inoculated, 30-min attachment, spray. Predominantly lean muscle and adipose tissue were collected from four fed cattle immediately after harvest and assigned to the four scenarios for STEC inoculation, followed by a post-inoculation water (control) or LA spray. Tissue excision samples were collected pre- and post-treatment and analyzed to enumerate STEC-7 populations. Data were collected in a completely randomized design and analyzed using a mixed-model ANOVA. Pairwise comparisons of treatment means were made at α = 0.05 with p-values adjusted using Tukey-Kramer. Initial STEC attachment levels to predominantly lean muscle and adipose tissues were not significantly different across all scenarios. Scenarios C and D showed greater STEC attachment compared to scenarios B and A. The LA spray reduced STEC levels more effectively than water across all scenarios. A significant treatment by tissue type interaction was observed for STEC reductions. A greater STEC reduction was observed for adipose tissue than for predominantly lean muscle when lactic acid spray was applied. A significant treatment by scenario interaction was observed for STEC reductions. Scenarios A and B presented greater log reductions (1.77 ± 0.27 and 1.85 ± 0.25 log CFU/cm[superscript]2, respectively) than scenario C (1.04 ± 0.10 Log CFU/cm[superscript]2). LA spray presented the same level of effectiveness when applied to pre-rigor warm tissues and chilled tissues for reducing STEC. Greater post-LA spray reductions were observed when STECs were inoculated onto pre-rigor meat surfaces and submitted to a 24 h chill cycle, suggesting that cold storage temperatures (~2 °C) may stress or injure the STEC cells prior to subsequent antimicrobial spray applications to chilled surfaces. For laboratory studies, consideration must be given to when inocula are applied to tissue surfaces to accurately determine and/or compare the effectiveness of antimicrobial treatments. These findings provide insight to beef processors and researchers regarding inoculation protocols for comparative validation studies, and potential impacts on microbiological results from application of antimicrobial interventions at different points during raw beef processing.

Une des principales limites de la chimiothérapie du cancer est le manque de sélectivité des agents cytotoxiques vis-à-vis des cellules tumorales, entrainant de nombreux effets secondaires. L’intérêt de la vectorisation est d’administrer l’agent cytotoxique sélectivement aux cellules cancéreuses et ainsi d’éviter de faire subir l’action du médicament aux cellules saines. Cette thèse a pour but de synthétiser des prodrogues multivalentes qui utilisent la sous unité B de la toxine de Shiga (STxB) comme agent de vectorisation, ciblant préférentiellement les cellules cancéreuses Gb3-positives. Les deux agents cytotoxiques choisis, un dérivé de la camptothécine et de l’auristatine, ont été liés de façon covalente auvecteur via un espaceur bifonctionnel clivable par le glutathion. L’espaceur a également été remplacé par un répartiteur multivalent susceptible de délivrer une quantité plus importante d’agent cytotoxique à l’intérieur des cellules tumorales.Parallèlement à ce projet de vectorisation d’un agent thérapeutique, des sondes IRM capables de marquer in vivo les tumeurs possédant à leur surface le récepteur Gb3 ont été synthétisées. L’IRM a une très bonne définition spatiale, mais souffre d’un manque de sensibilité. Pour augmenter le contraste, nous avons utilisé une stratégie reposant sur lamultivalence des espaceurs liés à des molécules de DOTA-Gd, un agent de contraste classiquement utilisé en IRM. Ces dernières ont été fixées à STxB via un répartiteur multivalent (des nano-bâtonnets d’or). Le signal IRM est plus intense et donc plus facile à détecter. Enfin, nous avons développé une nouvelle méthode chimique basée sur la ligationoxime pour optimiser la création de conjugués entre STxB et des antigènes comme outils de vaccination. Le conjugué STxB-ovalbumine a permis une meilleure présentation de l’antigène par les cellules dendritiques, conduisant chez la souris à une induction efficace de lymphocytes T. / Pas de résumé en anglais

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Master of Science / Food Science Institute, Animal Science and Industry / Daniel Y.C. Fung / Within the United States, it has been estimated that 60 deaths and 73,000 illnesses are caused by Escherichia coli O157:H7 infection annually (Gavin et al., 2004). Multiple effects have been known to occur with the onset of infection from E. coli O157:H7 in which some of these can become life-threatening. Escherichia coli O157:H7 is defined as a Shiga-toxin-producing E. coli strain (STEC). This microbial pathogen is a gram-negative bacillus organism that is motile, non-sorbitol fermenting, and β-glucuronidase negative. The infectious dose of E. coli O157:H7 can be as low as ten cells (Food and Drug Administration, 2009). Consumption of contaminated food, mainly undercooked ground beef and non or incorrectly pasteurized milk, are the primary sources of E. coli O157:H7 infection in human. Cattle, in particular, are considered chief asymptomatic reservoirs for this pathogen. Carried in their gut, feces, and milk, cattle carry this Shiga toxin-producing E. coli in ranges from 10[superscript]2 to 10[superscript]5 CFU/g. Although colonized with E. coli O157:H7, cattle and other ruminants show no adverse side effects from the pathogenic bacteria. There is also a difference in the prevalence of this pathogen between human and cattle. There has been a low incidence of illness caused by E. coli O157:H7 in humans when compared to the high prevalence of E. coli 057:H7 found in cattle and their environment. It has been discovered, through population genetic analysis, that E. coli O157:H7 and other O157:H- isolates make up a clone complex. In spite of the clonal nature of E. coli O157:H7 and other O157:H[superscript]- isolates, there are significant characteristics showing variability between the clone complex. These variability aspects can possibly account for the rapid divergence of E. coli strains including the recently discovered divergence of E. coli O157:H7 in to two separate lineages. Other possible reasons for a non-linear relationship between cattle prevalence and human infection include diversity of the Shiga Toxin-Encoding bacteriophage and receptors in cattle verses human, and finally the difference between the production of Locus of Enterocyte Effacement (LEE) in both human and cattle lineages.

Le cancer est la seconde cause de mortalité dans le monde et les cancers de localisation muqueuse (poumon, estomac, colorectal, du col de l’utérus, …) représentent la première cause de mortalité due au cancer dans le monde. La majorité des vaccins contre les cancers muqueux n’ont à ce jour, pas montré de résultats cliniques significatifs. Au cours de ce travail, nous avons développé une immunothérapie efficace basée sur la sous-unité B non toxique de la toxine de Shiga et montré pour la première fois dans le domaine de la cancérologie que la localisation de l’immunisation était cruciale pour induire des réponses immunitaires anti-tumorales. En effet, dans un modèle préclinique, une immunisation systémique intramusculaire n’a pas permis d’induire de protection thérapeutique efficace contre le développement de tumeurs muqueuses de la langue, alors que la voie d’immunisation intranasale a induit une réponse clinique complète. Nous avons identifié les lymphocytes T CD8+ comme les cellules nécessaires à cette protection et plus précisément la population de lymphocytes T résidents mémoires (Trm). Ces Trm présentent le phénotype classique CD103+ mais expriment également l’intégrine CD49a qui joue un rôle dans la migration/rétention au sein des tumeurs mais également dans la survie à long terme des Trm. Par ailleurs nous avons montré que les cellules dendritiques muqueuses pulmonaires permettaient d’induire ce phénotype CD49a sur les lymphocytes T CD8+ alors que les cellules dendritiques de la rate non. Notre travail montre que l’aspect quantitatif de ces Trm joue un rôle dans la protection anti-tumorale, en effet nous avons pu pour la première fois moduler in vivo le nombre de Trm en traitant les souris par un anticorps anti-TGF-β. La diminution du nombre des Trm est corrélée à la diminution de la protection anti-tumorale. Les patients atteints de cancers des voies aérodigestives supérieures sont majoritairement traités par radiothérapie. Dans l’optique d’essais cliniques à court terme, nous avons montré que la radiothérapie localisée associée à notre immunothérapie permet une protection plus efficace que le traitement seul de l’un ou de l’autre notamment en provoquant un remodelage du microenvironnement tumoral associé à une normalisation vasculaire. Nos résultats ouvrent de nouvelles perspectives dans le développement d’immunothérapies thérapeutiques efficaces contre les cancers muqueux et pourront mener rapidement à des essais cliniques. / Cancer is the second mortality cause worldwide while mucosal cancers (lung, stomac, …) is the first mortality cause from. The majority of cancer vaccines against mucosal tumors have not given rise yet to significant clinical results. In this work we developed a strong immunotherapy based on the nontoxic subunit B from shiga toxin and showed for the first time that the localization of the immunization is crucial to induce potent and effective anti-tumoral responses. In a preclinical model a systemic immunization failed to induce a therapeutical protection against mucosal tumor challenge while intranasal immunization completely succeed. We identified a CD8 T lymphocyte population as a required cells in this protection and more precisely the T resident memory (Trm) cells. This Trm showed the classical CD103 phenotype as well as the CD49a which can play a specific role in the retention or the migration of this cells in the tumor tissue and might play a role in the survival. We also demonstrate that dendritic cells from the mucosal parenchyma was required to induce the CD49a expression on CD8 T cells while dendritic cells from the spleen was not. Our work shows that the Trm number as an impact in the anti-tumoral protection. We were able to reduce the Trm number in vivo using an anti-TGF-β antibody. This number diminution was correlated with a less efficient anti-tumoral protection. Patients with head and neck cancers are treated with radiotherapy. In this situation we showed that the combination of radiotherapy and our immunotherapy was associated with a better protection than radiotherapy alone or immunotherapy alone thanks to a vascular normalization. These results might rapidly lead to clinical trials and might open new ways to work with immunotherapies.

Le cancer est la seconde cause de mortalité dans le monde et les cancers de localisation muqueuse (poumon, estomac, colorectal, du col de l’utérus, …) représentent la première cause de mortalité due au cancer dans le monde. La majorité des vaccins contre les cancers muqueux n’ont à ce jour, pas montré de résultats cliniques significatifs. Au cours de ce travail, nous avons développé une immunothérapie efficace basée sur la sous-unité B non toxique de la toxine de Shiga et montré pour la première fois dans le domaine de la cancérologie que la localisation de l’immunisation était cruciale pour induire des réponses immunitaires anti-tumorales. En effet, dans un modèle préclinique, une immunisation systémique intramusculaire n’a pas permis d’induire de protection thérapeutique efficace contre le développement de tumeurs muqueuses de la langue, alors que la voie d’immunisation intranasale a induit une réponse clinique complète. Nous avons identifié les lymphocytes T CD8+ comme les cellules nécessaires à cette protection et plus précisément la population de lymphocytes T résidents mémoires (Trm). Ces Trm présentent le phénotype classique CD103+ mais expriment également l’intégrine CD49a qui joue un rôle dans la migration/rétention au sein des tumeurs mais également dans la survie à long terme des Trm. Par ailleurs nous avons montré que les cellules dendritiques muqueuses pulmonaires permettaient d’induire ce phénotype CD49a sur les lymphocytes T CD8+ alors que les cellules dendritiques de la rate non. Notre travail montre que l’aspect quantitatif de ces Trm joue un rôle dans la protection anti-tumorale, en effet nous avons pu pour la première fois moduler in vivo le nombre de Trm en traitant les souris par un anticorps anti-TGF-β. La diminution du nombre des Trm est corrélée à la diminution de la protection anti-tumorale. Les patients atteints de cancers des voies aérodigestives supérieures sont majoritairement traités par radiothérapie. Dans l’optique d’essais cliniques à court terme, nous avons montré que la radiothérapie localisée associée à notre immunothérapie permet une protection plus efficace que le traitement seul de l’un ou de l’autre notamment en provoquant un remodelage du microenvironnement tumoral associé à une normalisation vasculaire. Nos résultats ouvrent de nouvelles perspectives dans le développement d’immunothérapies thérapeutiques efficaces contre les cancers muqueux et pourront mener rapidement à des essais cliniques. / Cancer is the second mortality cause worldwide while mucosal cancers (lung, stomac, …) is the first mortality cause from. The majority of cancer vaccines against mucosal tumors have not given rise yet to significant clinical results. In this work we developed a strong immunotherapy based on the nontoxic subunit B from shiga toxin and showed for the first time that the localization of the immunization is crucial to induce potent and effective anti-tumoral responses. In a preclinical model a systemic immunization failed to induce a therapeutical protection against mucosal tumor challenge while intranasal immunization completely succeed. We identified a CD8 T lymphocyte population as a required cells in this protection and more precisely the T resident memory (Trm) cells. This Trm showed the classical CD103 phenotype as well as the CD49a which can play a specific role in the retention or the migration of this cells in the tumor tissue and might play a role in the survival. We also demonstrate that dendritic cells from the mucosal parenchyma was required to induce the CD49a expression on CD8 T cells while dendritic cells from the spleen was not. Our work shows that the Trm number as an impact in the anti-tumoral protection. We were able to reduce the Trm number in vivo using an anti-TGF-β antibody. This number diminution was correlated with a less efficient anti-tumoral protection. Patients with head and neck cancers are treated with radiotherapy. In this situation we showed that the combination of radiotherapy and our immunotherapy was associated with a better protection than radiotherapy alone or immunotherapy alone thanks to a vascular normalization. These results might rapidly lead to clinical trials and might open new ways to work with immunotherapies.

Le cancer est la seconde cause de mortalité dans le monde et les cancers de localisation muqueuse (poumon, estomac, colorectal, du col de l’utérus, …) représentent la première cause de mortalité due au cancer dans le monde. La majorité des vaccins contre les cancers muqueux n’ont à ce jour, pas montré de résultats cliniques significatifs. Au cours de ce travail, nous avons développé une immunothérapie efficace basée sur la sous-unité B non toxique de la toxine de Shiga et montré pour la première fois dans le domaine de la cancérologie que la localisation de l’immunisation était cruciale pour induire des réponses immunitaires anti-tumorales. En effet, dans un modèle préclinique, une immunisation systémique intramusculaire n’a pas permis d’induire de protection thérapeutique efficace contre le développement de tumeurs muqueuses de la langue, alors que la voie d’immunisation intranasale a induit une réponse clinique complète. Nous avons identifié les lymphocytes T CD8+ comme les cellules nécessaires à cette protection et plus précisément la population de lymphocytes T résidents mémoires (Trm). Ces Trm présentent le phénotype classique CD103+ mais expriment également l’intégrine CD49a qui joue un rôle dans la migration/rétention au sein des tumeurs mais également dans la survie à long terme des Trm. Par ailleurs nous avons montré que les cellules dendritiques muqueuses pulmonaires permettaient d’induire ce phénotype CD49a sur les lymphocytes T CD8+ alors que les cellules dendritiques de la rate non. Notre travail montre que l’aspect quantitatif de ces Trm joue un rôle dans la protection anti-tumorale, en effet nous avons pu pour la première fois moduler in vivo le nombre de Trm en traitant les souris par un anticorps anti-TGF-β. La diminution du nombre des Trm est corrélée à la diminution de la protection anti-tumorale. Les patients atteints de cancers des voies aérodigestives supérieures sont majoritairement traités par radiothérapie. Dans l’optique d’essais cliniques à court terme, nous avons montré que la radiothérapie localisée associée à notre immunothérapie permet une protection plus efficace que le traitement seul de l’un ou de l’autre notamment en provoquant un remodelage du microenvironnement tumoral associé à une normalisation vasculaire. Nos résultats ouvrent de nouvelles perspectives dans le développement d’immunothérapies thérapeutiques efficaces contre les cancers muqueux et pourront mener rapidement à des essais cliniques. / Cancer is the second mortality cause worldwide while mucosal cancers (lung, stomac, …) is the first mortality cause from. The majority of cancer vaccines against mucosal tumors have not given rise yet to significant clinical results. In this work we developed a strong immunotherapy based on the nontoxic subunit B from shiga toxin and showed for the first time that the localization of the immunization is crucial to induce potent and effective anti-tumoral responses. In a preclinical model a systemic immunization failed to induce a therapeutical protection against mucosal tumor challenge while intranasal immunization completely succeed. We identified a CD8 T lymphocyte population as a required cells in this protection and more precisely the T resident memory (Trm) cells. This Trm showed the classical CD103 phenotype as well as the CD49a which can play a specific role in the retention or the migration of this cells in the tumor tissue and might play a role in the survival. We also demonstrate that dendritic cells from the mucosal parenchyma was required to induce the CD49a expression on CD8 T cells while dendritic cells from the spleen was not. Our work shows that the Trm number as an impact in the anti-tumoral protection. We were able to reduce the Trm number in vivo using an anti-TGF-β antibody. This number diminution was correlated with a less efficient anti-tumoral protection. Patients with head and neck cancers are treated with radiotherapy. In this situation we showed that the combination of radiotherapy and our immunotherapy was associated with a better protection than radiotherapy alone or immunotherapy alone thanks to a vascular normalization. These results might rapidly lead to clinical trials and might open new ways to work with immunotherapies.

Pas de résumé / Recently targeted therapies appeared as attractive alternatives to classical antitumoral treatments. The approach, developed on the concept of targeting drug to cancer cells, aims to spear normal tissues and decrease the side effects. This doctoral dissertation focuses on developing new anticancer targeted treatments in the field of chemotherapy and cancer immunotherapy by exploiting an original targeting moiety, the B subunit of Shiga toxin (STxB). Its specific properties, such as, recognition with its receptor Gb3 overexpressed in cancer cells or in antigen-presenting cells, its unconventional intracellular trafficking, guided the choice of this protein as targeting carrier. This project is based in the use of copper-free Huisgen [3+2] cycloaddition as a coupling method, which led to successful preparation of various conjugates for their respective applications. The concept was first validated by STxB-biotin conjugate. The high yield of the reaction and the compatibility between the targeting carrier and the chemical ligation promoted the design of conjugates for chemotherapy and immunotherapy. Two therapeutical optimizations of previously developed strategy in STxB drug targeting delivery were investigated: synthesis of multivalent drug-conjugates and synthesis of conjugates containing a highly potent anticancer agent. Both approaches exploited three anticancer agents: SN38, Doxorubicin and Monomethyl auristatin F. The disulfide spacer, combined with various self-immolative systems, insured drug release. Two cytotoxic conjugates STxB–doxorubicin (STxB-Doxo) and STxB-monomethyl auristatin F (STxB-MMAF) were obtained in very high yield and demonstrated strong tumor inhibition activity in the nanomolar range on Gb3-positive cells. Based on the results the STxB-MMAF conjugate was investigated on a mouse model. The project aimed also to develop STxB bioconjugates for vaccine applications. Previous studies used B subunit as a targeting carrier coupled to an antigenic protein in order to induce a more potent immune response against cancer. The conjugates were prepared using a commercial linker, requiring modifying the antigen at first place, or by oxime ligation, where slightly acidic conditions promoted the coupling. Thus, the work presented herein proposed an alternative ligation via copper-free click chemistry especially for more sensitive antigenic proteins. Various types of conjugates were synthesised and investigated for their immune stimulation properties. The STxB targeting strategy was also applied to the development of a new vaccine based on coupling the targeting carrier to alpha-GalCer, one of the most potent immune stimulating agents known. The work focused on the synthesis of functionalised alpha-Galcer with an azide handle.