Cyclin-Dependent Kinase 9 (CDK9) as part of the PTEFb complex promotes transcriptional elongation by promoting RNAPII pause release. We now report that, paradoxically, CDK9 is also essential for maintaining gene silencing at heterochromatic loci. Through a live cell screen, we discovered that CDK9 inhibition reactivates epigenetically silenced genes in cancer, leading to restored tumor suppressor gene expression and cell differentiation, along with activation of endogenous retrovirus (ERV) genes. CDK9 inhibition results in dephorphorylation of the SWI/SNF protein SMARCA4 and represses HP1α expression, both of which contribute to gene reactivation. Based on gene activation, we developed the highly selective and potent CDK9 inhibitor MC180295 (IC50 =5nM) that has broad anti-cancer activity in-vitro and is effective in in-vivo cancer models. Additionally, CDK9 inhibition sensitizes with the immune checkpoint inhibitor α-PD-1 in vivo, making it an excellent target for epigenetic therapy of cancer. / Molecular Biology and Genetics

Universities are regarded as critical institutions that shape society, which on the one hand have a great influence on (successful) social processes, but on the other, are traditionally very privileged and exclusive places of education. Despite various demands to open up to plural perspectives, they are still strongly characterized by powerful, meritocratic, and discriminatory structures, cultures, and orders. (Social) inclusion efforts are always linked to the need to analyze processes of exclusion. This article therefore examines the question: Which ableist practices and culture of silence are revealed in the context of higher education and how can these be linked to the findings of postcolonial studies on the topic of silence? On the one hand, established perspectives (lecturers and students), but above all the perspectives of marginalized and unheard (groups of) people (lecturers with (learning) disabilities) are involved. The results from two group discussions (N = 9) with perspectives from these three different positions are presented to work out implicit and explicit processes of silence. The (power) theoretical reference is the concept of ableism, which is linked with (postcolonial) perspectives on the ideas of “silence” according to Brunner (2017a). This article emphasizes that, in addition to formal access restrictions to university education, there are also implicit barriers oriented towards non‐transparent ableist expectations of ability, which in turn (re‐)produce processes of silence. The case study concerns one German university and shows that formal access to higher education is only one aspect of reducing ableism; above all, it is the creation of transparent structures with regard to set ability expectations, critical‐reflective spaces, and a culture of “unlearning” biographically characterized ableist notions of normality. This article therefore focuses on the connection between ableist experiences and the findings of postcolonial discourses of silencing.

Tesis por compendio / Los viroides, los agentes infecciosos más simples de la escala biológica, están constituidos por una molécula circular de RNA monocatenario de aproximadamente 250-400 nucleótios (nt) que no codifica proteína alguna. A pesar de esta simplicidad estructural, los viroides son capaces de replicarse autónomamente, moverse sistémicamente y en muchos casos causar enfermedades en sus plantas huéspedes. Las infecciones producidas por viroides representativos generan la acumulación de pequeños RNAs viroidales (vd-sRNAs) de 21-24 nt con características similares a los pequeños RNA interferentes (siRNAs), la huella dactilar del silenciamiento mediado por RNA. La identificación de los vd-sRNAs implica que los viroides son diana de la primera barrera de silenciamiento mediado por RNA, formada por las RNasas ‘Dicer-like’ (DCLs). Para examinar si los vd-sRNAs se unen a las proteínas AGOs —el componente clave del complejo RISC (‘RNAinduced silencing complex’) que constituye la segunda barrera del silenciamiento mediado por RNA— hojas de Nicotiana benthamiana infectadas por el viroide del tubérculo fusiforme de la patata (PSTVd) se agroinfiltraron con nueve de las diez proteínas AGOs de Arabidopsis thaliana. Inmunoprecipitaciones a partir de los halos agroinfiltrados y análisis ‘Western-’ y ‘Northern-blot’ han mostrado que todas las AGOs se expresaron y, a excepción de AGO6, AGO7 y AGO10, unieron vd-sRNAs: AGO1, AGO2 y AGO3 los de 21 y 22 nt, mientras que AGO4, AGO5 y AGO9 también mostraron afinidad por los de 24 nt. La secuenciación masiva mostró que las AGO1, AGO2, AGO4 y AGO5 agroexpresadas unen los PSTVd-sRNAs en función de su tamaño y nucleótido 5’-terminal, y que los perfiles de los correspondientes vd-sRNAs cargados en las AGOs adoptan una distribución específica a lo largo del genoma viroidal. La agroexpresión de AGO1, AGO2, AGO4 y AGO5 en hojas de N. benthamiana infectadas con PSTVd atenuó la acumulación de los RNAs genómico viroidales, indicando que éstos, o sus precursores, también son diana de RISC. En contraste con los ribovirus, la infección de PSTVd en N. benthamiana no afectó de forma significativa la regulación mediada por miR168 de la AGO1 endógena, que carga vd-sRNAs con especificidad similar a su homóloga de A. thaliana. Mientras se conoce bien la biogénesis de los RNA viroidales, su degradación está restringida a algunos datos que implican al silenciamiento mediado por RNA. En el curso de nuestros estudios sobre el PSTVd, hemos observado consistentemente un patrón de 6-7 RNAs subgénomicos (sgRNAs) de polaridad (+) que aparecen junto con los RNAs monoméricos circulares y lineares en berenjena, un huésped experimental de este viroide. Hibridaciones ‘Northern-blot’ con sondas de tamaño parcial y completo, mostraron que los sgRNAs (+) de PSTVd derivan de diferentes regiones del RNA genómico y que algunos son parcialmente solapantes. Parte de los sgRNAs (+) de PSTVd se observaron también en N. benthamiana y tomate, donde han pasado desapercibidos a causa de su menor acumulación. El análisis por extensión de cebador de sgRNAs (+) de PSTVd representativos excluye que sean productos de terminaciones prematuras de la transcripción, pues carecen del extremo 5’ común que cabría esperar si ésta empezara en una posición específica. Ulteriores análisis mediante 5’- y 3’-RACE indican que los sgRNAs (+) de PSTVd tienen extremos 5’-OH y 3’-P, que probablemente resultan de cortes endonucleolíticos de precursores más largos catalizados por RNasas típicas que generan este tipo de extremos. Análisis de sgRNA (-) de PSTVd, que también se acumulan en berenjena infectada, mostraron que presentan características estructurales muy similares a los sgRNA (+). Nuestros resultados proporcionan una nueva visión de cómo ocurre la degradación in vivo de los RNAs viroidales, posiblemente durante su replicación, y sugieren que síntesis y degradación de las cadenas de PSTVd están conectadas, como se ha observado en los mRNAs. / Minoia, S. (2015). Degradación in vivo de un viroide de replicación nuclear: rutas catalizadas por proteínas Argonauta cargadas con pequeños RNAs viroidales y por otras ribonucleasas que generan RNAs subgenómicos [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/48553 / Compendio

No / The hair follicle is a cyclic biological system that progresses through stages of growth, regression, and quiescence, which involves dynamic changes in a program of gene regulation. Micro-RNAs (miRNAs) are critically important for the control of gene expression and silencing. Here, we show that global miRNA expression in the skin markedly changes during distinct stages of the hair cycle in mice. Furthermore, we show that expression of miR-31 markedly increases during anagen and decreases during catagen and telogen. Administration of antisense miR-31 inhibitor into mouse skin during the early- and midanagen phases of the hair cycle results in accelerated anagen development, and altered differentiation of hair matrix keratinocytes and hair shaft formation. Microarray, qRT-PCR and Western blot analyses revealed that miR-31 negatively regulates expression of Fgf10, the components of Wnt and BMP signaling pathways Sclerostin and BAMBI, and Dlx3 transcription factor, as well as selected keratin genes, both in vitro and in vivo. Using luciferase reporter assay, we show that Krt16, Krt17, Dlx3, and Fgf10 serve as direct miR-31 targets. Thus, by targeting a number of growth regulatory molecules and cytoskeletal proteins, miR-31 is involved in establishing an optimal balance of gene expression in the hair follicle required for its proper growth and hair fiber formation.

No / Skin development, postnatal growth and regeneration are governed by complex and well-balanced programs of gene activation and silencing. The crosstalk between small non-coding microRNAs (miRNAs) and mRNAs is highly important for steadiness of signal transduction and transcriptional activities as well as for maintenance of homeostasis in many organs, including the skin. Recent data demonstrated that the expression of many genes, including cell type-specific master transcription regulators implicated in the control of skin development and homeostasis, is regulated by miRNAs. In addition, individual miRNAs could mediate the effects of these signaling pathways through being their downstream components. In turn, the expression of a major constituent of the miRNA processing machinery, Dicer, can be controlled by cell type-specific transcription factors, which form negative feedback loop mechanisms essential for the proper execution of cell differentiation- associated gene expression programs and cell-cell communications during normal skin development and regeneration. This review summarizes the available data on how miRNA/mRNA regulatory networks are involved in the control of skin development, epidermal homeostasis, hair cycle-associated tissue remodeling and pigmentation. Understanding of the fundamental mechanisms that govern skin development and regeneration will contribute to the development of new therapeutic approaches for many pathological skin conditions by using miRNA-based interventions.

No / Eczema is widely considered to be an exacerbation of alkaline stress to the skin. Epidermal barrier dysfunction is a feature of eczema pathology, which predisposes affected individuals to distressing morbid symptoms. At least two serine proteases, stratum corneum chymotryptic enzyme (kallikrein 7 [KLK7]) and stratum corneum tryptic enzyme (kallikrien 5 [KLK5]), have increased activity levels in eczematous lesions and both have been implicated in the destruction of corneodesomosomes, which are crucial to epidermal integrity. The present in vitro study investigated whether transcriptional gene silencing after siRNA transfection could influence the activity of these signature enzymes in an in vitro model of eczema induced by alkaline shock. HaCaT epithelial cells were subjected to alkaline stress by the addition of 1,1,3,3-tetramethyl guanidine “superbase” (TMG) to the culture media. The culture media were subsequently tested for chymotryspin, trypsin, plasmin, and urokinase activity using colorimetric peptide assays and for reactive oxygen species using WST1 cell viability reagent. Cells that had been transfected with small interfering ribonucleic acid (siRNA) against KLK5 and KLK7 for 24 h before alkaline shock did not exhibit the increase in serine protease levels observed in untreated controls. Moreover, an endpoint MTT assay (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) confirmed that detachment of cells from the culture substrate observed in alkaline-stressed cells did not occur in siRNA-treated cells. This in vitro study has established the proof-of-principle that siRNA therapy appears to mitigate the consequences of alkaline shock to the serine protease-associated fragility of epithelial cells that is characteristic of eczema.

Vorhersagen von miRNA-Bindestellen enthalten oft einen hohen Prozentsatz an falsch positiven Ergebnissen (24-70%). Gleichzeitig ist es schwierig die biologischen Interaktionen von miRNAs und ihren Zieltranskripten auf experimentellem Wege und Genom weit zu messen. Daher wurde in der vorliegenden Arbeit die Frage beantwortet, ob ChIP-Sequenzierungsdaten, von denen es immer mehr gibt, verwendet werden können, um Vorhersagen von miRNA-Bindestellen zu filtern. Dabei wurde von einem Netzwerk aus miRNAs und Transkriptionsfaktoren gebraucht gemacht, die Zieltranskripte gemeinsam regulieren. Zunächst wurden verschiedene Methoden getestet, mit denen „Peaks“ aus der ChIP-Sequenzierung Zielgenen zugeordnet werden können. Zielgenlisten des transkriptionalen Repressors RE1-silencing transcription factor (REST/NRSF) wurden mithilfe von ChIP-Sequenzierungsdaten erzeugt. Ein Algorithmus zur Suche nach überrepräsentierten miRNA-Zielgenen in REST-Genlisten basierend auf Vorhersagen von TargetScanHuman wurde entwickelt und angewandt. Die detektierten „enrichment“-miRNAs waren Teil eines vielfältig regulierten REST-miRNA-Netzwerks. Mögliche Funktionen von miRNAs wurden vorgeschlagen und ihre Rolle im gemeinsamen Netzwerk mit REST und im damit gebildeten Netzwerkmotiv (Inkoherente Schleife zur Vorwärtskopplung Typ 2) wurde analysiert. Es stellte sich heraus, dass ein Filtern der Vorhersagen tatsächlich möglich ist, da Gene, die sowohl von REST als auch von einer oder mehreren „enrichment“-miRNAs reguliert werden, einen höheren Anteil an wahren miRNA-Transkript-Interaktionen haben. / Predictions of miRNA binding sites suffer from high false positive rates (24-70%) and measuring biological interactions of miRNAs and target transcripts on a genome wide scale remains challenging. In the thesis at hand the question was answered if the ever growing body of ChIP-sequencing data can be applied to filter miRNA target predictions by making use of the underlying regulatory network of miRNAs and transcription factors. First different methods for association of ChIP-sequencing peaks to target genes were tested. Target gene lists of the transcriptional repressor RE1-silencing transcription factor (REST/NRSF) were generated by means of ChIP-sequencing data. An enrichment analysis tool based on predictions from TargetScanHuman was developed and applied to find ‘enrichment’-miRNAs with over-represented targets in the REST gene lists. The detected miRNAs were shown to be part of a highly regulated REST-miRNA network. Possible functions could be assigned to them and their role in the regulatory network and special network motifs (incoherent feedforward loop of type 2) was analyzed. It turned out that miRNA target predictions of genes shared by enrichment-miRNAs and REST had a higher proportion of true positive associations than the TargetScanHuman background, thus the procedure made a filtering possible.

A chaque instant notre organisme est confronté à des agents pathogènes de nature très variable. Pourtant, malgré toutes les agressions rencontrées, il maintient une certaine intégrité. Cette dernière résulte de la mise en place d’un système de défense perfectionné, fruit de la collaboration étroite de diverses cellules :le système immunitaire. Parmi toutes les cellules qui le composent, les cellules dendritiques jouent un rôle prépondérant. Disséminées dans la plupart de nos organes et tissus, elles surveillent, en alerte du moindre danger. Elles orchestrent la réponse immune :elles sont capables d'initier et polariser une réponse immune ou d'instaurer la tolérance. De nombreux traitements thérapeutiques tentent d’exploiter leurs capacités intrinsèques. Ces cellules présentent en effet un grand potentiel dans la vaccination anti-tumorale et antivirale, dans l’acceptation de greffes et le contrôle de maladies auto-immunes. Toutefois, de nombreux éclaircissements restent encore à apporter que ce soit sur l’ontogénie des cellules dendritiques, leur rôle ou leur propre biologie. <p><p>Aussi, le dessein de ce travail était d’approfondir nos connaissances fondamentales sur les propriétés moléculaires et la biologie des cellules dendritiques afin de mieux appréhender la nature et l’amplitude des réponses qu’elles induisent. A cette fin, nous avons identifié deux nouveaux gènes qu’elles expriment préférentiellement et nous avons essayé de caractériser leur fonction. L’avènement de l’utilisation de la technique d’ARN interférence dans les systèmes de mammifères et le développement des vecteurs lentiviraux nous sont apparus comme des outils présentant un réel potentiel pour répondre à nos questions. Nous avons donc généré des souris qui sur- ou sous- expriment le gène d’intérêt, par infection lentivirale d’embryons, pour tenter de cerner son rôle in vivo. Cette méthode de transgénèse était très prometteuse car rapide, efficace, peu onéreuse et sollicitait peu de compétences pour la manipulation des embryons. Cependant, l’approche s’est révélée plus laborieuse que prévu. Nous avons en effet rencontré de nombreux phénomènes de variégation et de « silencing » qui a rendu plus ardue l’utilisation des souris transgéniques. Néanmoins, nous pensons aujourd’hui être à même d’élaborer une stratégie de sélection des souris générées par transgénèse lentivirale qui ne développeraient probablement pas les problèmes rencontrés. Au cours de l’étude, nous avons également observé une fluctuation de l’activité du promoteur CAG pendant le développement thymique, pointant l’importance du choix d’un promoteur optimal en fonction du projet de recherche. Enfin, l’analyse des souris, bien que préliminaire, suggère un rôle potentiel d’un des gènes examinés dans la différenciation, la mobilisation ou la survie des cellules dendritiques, des macrophages et des lymphocytes B.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Chez les eucaryotes, plusieurs protéines liant l'ARN ou RBPs agissent sur l'ARNm à différents niveaux, de l'épissage à la traduction. Récemment, un grand nombre d’ARN non-codant des protéines (npcRNAs) ont été identifiés chez les eucaryotes et ont été montré comme interagissant avec une variété de ribonucléoprotéines (RNP) pour contrôler l'expression des gènes au niveau post-transcriptionnel. Nous avons identifié une Nuclear-Speckle RBP (ou NSR) qui interagit avec le npcRNA, ENOD40, un lncARN qui s'accumule au cours de la formation des racines latérales et des nodules chez les légumineuses. Durant cette thèse nous avons analysé le rôle des NSR d’Arabidopsis thaliana ainsi que leur lien avec les npcARN.Deux gènes AtNSRs homologues existent chez Arabidopsis nommés NSRa et NSRb, ces gènes codent des protéines localisées dans des speckles nucléaires avec certaines protéines apparentées à l’épissage. Fait intéressant, les fusions AtNSR-GFP sont relocalisées dans des granules cytoplasmiques dans certaines cellules des racines différenciées ainsi que lors d’une co-expression éctopique de ENOD40. Le gène AtNSRb est régulé par l'auxine alors AtNSRa est constitutif. Les simples mutants Atnsr ne montrent pas de phénotype, mais la croissance des racines des doubles mutants est partiellement insensible à l'auxine, ce qui suggère une fonction redondante de ces protéines dans les racines. La localisation observée pour ces protéines nous a mené à explorer un rôle des NSRs dans l’épissage, nous avons donc analysé le profil d'épissage de 288 gènes en réponse à l'auxine chez Arabidopsis et comparé ces profils entre le WT et les mutants nsra/nsrb. Tout d’abord nous avons remarqué que l’épissage général ne variait pas, en revanche, l’analyse de 288 gènes alternativement épissés montre que le profil d'épissage de 77 gènes semble être modifié durant la réponse à l'auxine et 51 gènes nécessitent les protéines AtNSR pour ce changement. Afin de vérifier l’interaction des NSRs avec les cibles d’AS et avec les npcARN nous avons co-immunoprécipité les NSRs et nous avons identifié au moins 5 cible d’AS et 2 npcARN. L’expression de l’ARN ENOD40 ainsi que du partenaire npcARN module L’AS chez Arabidopsis. Dans un deuxième chapitre, nous avons exploré le rôle des NSRs dans le PTGS déclenché par un transgène contenant un intron ce qui nous a permis de lier l’épissage alternatif et le silencing. Nous proposons donc que les NSRs pourraient lier l’épissage alternatif et l’action des ARN non codants, notamment lors de la croissance de la racine. / In eukaryotes, several RNA binding proteins (RBPs) act on mRNA at various levels from splicing to translation. Recently a large number of non-protein coding RNAs (npcRNAs) have been identified in eukaryotes and shown to integrate into a variety of ribonucleoproteins (RNP) to control posttranscriptional gene expression. Our laboratory has identified a plant Nuclear-Speckle RBP (or NSR) that interacts with an npcRNA, ENOD40 that accumulates during lateral root and nodule formation in legumes. NSR is relocalised into a cytoplasmic RNP in the ENOD40-expressing cells. During this PhD, we have analysed the role of NSRs in Arabidopsis thaliana and its link with npcRNAs. Two AtNSR homologs from Arabidopsis thaliana, named AtNSRa and AtNSRb, code for proteins also localised in nuclear speckles together with certain splicing-related proteins. Interestingly, AtNSR-GFP fusions are relocalised into cytoplasmic granules in certain differentiated root cells and by ectopic expression of the ENOD40 RNA. The AtNSRb gene is regulated by auxin whereas AtNSRa is constitutive. Root growth and lateral root formation of double nsra/nsrb mutants is partially insensitive to auxin. The localisation of these proteins prompted us to explore roles in splicing. No defects in general splicing were observed however analysis of 288 alternatively spliced genes in WT and nsra/nsrb roots in response to auxin revealed 77 changes in splicing profiles in response to auxin from which 51 required AtNSRs. In order to validate the interaction of NSRs with alternatively spliced mRNAs and npcRNAs, we have co-immunoprecipitated NSRs and identified at least 5 interacting alternatively spliced mRNAs and 2 npcRNAs. Expression of the ENOD40 RNA or one interacting ncRNA modulate alternatively splicing in Arabidopsis. In a second chapter, we explored the role of NSRs in the modulation of PTGS triggered by intron-containing transgenes allowing us to link alternatively splicing and silencing. We propose that NSRs may link alternative splicing and the action of non-coding RNA, notably during root growth and development.

La symbiose mycorhizienne à arbuscules (MA) est une association bénéfique établie entre les membres d'un ancien sous-phylum de champignons, les Gloméromycètes, et les racines de la majorité des plantes terrestres. Les champignons MA procurent de l'eau et des minéraux (azote et phosphore principalement) à leur plante hôte et obtiennent de cette dernière des molécules carbonées sous forme d'hexoses et de lipides. Des études récentes ont montré que certaines protéines sécrétées par les champignons MA peuvent être des régulateurs importants de l'association (Kloppholz et al., 2011 ; Tsuzuki et al., 2016). Notre objectif était d'identifier de nouvelles protéines fongiques contribuant à la mise en place de la symbiose. Des protéines prédites pour être préférentiellement sécrétées par le champignon MA Rhizophagus irregularis dans les racines ont été identifiées au début de ma thèse (Kamel et al., 2017). Certaines d'entre-elles présentaient une structure ressemblant aux précurseurs de phéromones sexuelles d'Ascomycètes. Ces protéines sont connues pour être maturées dans les voies de sécrétion en petits peptides qui sont ensuite sécrétés. Leur reconnaissance par un récepteur couplé à la protéine G (GPCR) aboutit à la fusion cellulaire de deux types sexuels opposés. Dans le cas de R. irregularis, seule la reproduction clonale a été décrite, mais des données génomiques récentes remettent en question son statut d'organisme asexué (Ropars et al., 2016). Une grande partie de ma thèse a été dédiée à la caractérisation fonctionnelle de ce type de peptides chez R. irregularis. Nous avons montré que deux peptides étaient effectivement produits et sécrétés par R. irregularis. L'utilisation de peptides synthétiques nous a permis de mettre en évidence que l'un d'eux stimulait la colonisation de M. truncatula mais était également perçu par le champignon lui-même, induisant la transcription de son propre gène précurseur et d'un GPCR. Ce peptide stimulateur de la symbiose est composé de seulement trois acides aminés et il peut être produit à partir de trois précurseurs protéiques. Par des approches de génétique inverse (HIGS et VIGS), nous avons confirmé l'importance de ces précurseurs dans l'établissement de la symbiose.[...] / Arbuscular Mycorrhizal (AM) symbiosis is a beneficial association established between members of an ancient subphylum of fungi, the Glomeromycotina, and the roots of the majority of terrestrial plants. AM fungi provide water and minerals (mainly nitrogen and phosphorus) to their host plant in exchange for organic carbon in the form of hexoses and lipids. Recent studies have shown that certain proteins secreted by AM fungi are important symbiosis regulators (Kloppholz et al., 2011, Tsuzuki et al., 2016). Our aim was to identify new fungal proteins involved in the establishment of symbiosis. Proteins predicted to be preferentially secreted by the AM fungus Rhizophagus irregularis in the roots were identified at the beginning of my thesis (Kamel et al., 2017). We noticed that some of them had a structure resembling the sex pheromone precursors of Ascomycota. These proteins are known to be processed in the secretory pathway into small peptides which are then secreted. Their recognition by a G protein-coupled receptor (GPCR) leads to cell fusion of two opposite sex types. In the case of R. irregularis, only clonal reproduction has been described. However, recent genomic data question its status as an asexual organism (Ropars et al., 2016). A large part of my thesis was dedicated to the functional characterization of this type of processed peptides in R. irregularis. We show that two of them are actually produced and secreted by R. irregularis. Treatments with synthetic forms of these peptides revealed that one of them stimulated the colonization of M. truncatula but was also perceived by the fungus itself, inducing the transcription of its own precursor gene and of a GPCR gene. This symbiosis-stimulating peptide is composed of only three amino acids and can be produced from three different protein precursors. Using reverse genetics (HIGS and VIGS), we confirmed the importance of these precursors in the symbiosis establishment. [...]