Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Las Metaloproteinasas (MMPs) son una familia de endopeptidasas involucradas tanto en los procesos de remodelación tisular, como en la degradación de los componentes de la matriz extracelular. Las MMP-2 y MMP–9, conocidas también como gelatinasas, son capaces de degradar elementos de la matriz extracelular. Estas enzimas están asociadas a procesos degradativos como el que ocurre en la enfermedad degenerativa articular (EDA). Las MMPs son secretadas en forma zimógenas, expresadas como proMMPs. Este trabajo tiene como objetivo determinar la actividad gelatinolítica de MMP-2 y MMP-9 en el líquido sinovial (LS) de articulación del carpo y en suero sanguíneo (S) de equinos Fina Sangre de Carrera (FSC), con procesos articulares agudos y crónicos reagudizados. Se detecta y cuantifica la actividad mediante zimografía, y se comparan las actividades detectadas en ambos grupos de estudio. Se utilizó LS proveniente de la articulación del carpo y S de equinos FSC del Hipódromo Chile de dos grupos de animales. El primer grupo correspondió a equinos con inflamación aguda (grupo A, n = 10). El segundo grupo correspondió a aquellos con patología articular crónica re-agudizada (grupo C, n = 15). Además se obtuvieron 5 muestras de S desde ejemplares sin patología articular, a modo de referencia, y no para consideraciones estadísticas. Se midió la concentración de proteínas totales (PT) de cada muestra. Se determinó la actividad gelatinolítica de cada muestra mediante zimografía en gel de poliacrilamida al 8% con gelatina 0,1%. Estos geles fueron digitalizados y densitometrados, cuantificando el número de pixeles asociados a cada banda con actividad gelatinolítica. La actividad gelatinásica se expresó en unidades relativas a la muestra control cargada en cada gel (u.r.), y a las u.r. en relación a los mg de PT. Los resultados se presentaron como promedio de u.r.  desviación estándar, comparándose los distintos grupos mediante análisis de varianza (andeva). No se detectaron diferencias significativas entre el grupo A y C, tanto en LS como en S. Se detectó actividad de proMMP-2 en todas las muestras, y la actividad de la proMMP-9 fue detectada en todas las muestras de S pero sólo en un 80,8% de las muestras de LS. Respecto a la proMMP-2, no se detectó diferencia significativa en su actividad sérica entre los grupoa A y C, incluso al dividir por las PT. En los grupos A y C no se evidenció diferencia para la actividad proMMP-2 entre S y LS, pero al considerar las PT como denominador, se encontró que en el grupo A la actividad de la proMMP-2 es significativamente mayor en el LS que en el S. Tanto en el grupo A como en el C, la actividad de la proMMP-2 en el LS fue significativamente mayor que la de MMP-9. Dentro de las muestras en las que se detectó la proMMP-9, no se encontraron diferencias significativas entre la actividad de la proMMP-9 del LS entre los grupos A y C. La forma dímera de la MMP-9 en LS se detectó sólo en S, en 16 de sus muestras (61.5% del total de muestras de S estudiadas) En las muestras de S del grupo de ejemplares normales, ambas enzimas presentaron valores de actividad significativamente menores al compararlos con la de los grupos A y C. Las gelatinasas no cambian de manera importante su actividad gelatinolítica al comparar grupos con patologías articulares agudas, con ejemplares con patologías crónicas reagudizadas, tanto en el LS como en el S. Así también podemos concluir que las gelatinasas no se comportan igual en los distintos medios, teniendo mayor actividad la MMP-9 en S y la MMP-2 en LS. Al tener el S de ejemplares normales una menor actividad gelatinolítica, queda como posibilidad el uso de gelatinasas en S como marcadores de daño articular

A atividade física, dependendo da intensidade e duração, provoca uma resposta inflamatória nos tecidos articulares dos eqüinos. Como ocorre nos cavalos de pólo que percorrem grandes distâncias em alta velocidade com paradas bruscas do movimento, submetendo suas articulações a esforços intensos e constantes. A finalidade deste trabalho foi avaliar os efeitos da atividade esportiva no metabolismo articular, por meio de exame físico, das dosagens de mediador inflamatório (PGE2) e citocinas (IL-1 e TNF-&alpha;), da concentração de glicose, proteína total e da análise quantitativa e qualitativa das células presentes no líquido sinovial de 20 eqüinos atletas em três estágios diferentes de treinamento, a cada 30 dias, durante o período de 360 dias: animais sem treinamento (grupo controle), animais em início de treinamento (G1) e animais com mais de 5 anos de treinamento (G2). Além disso, estabelecer uma relação entre os resultados laboratoriais com os exames radiográficos e ultra-sonográficos articulares. Numa segunda fase do experimento foi avaliado o líquido sinovial de oito eqüinos atletas antes do exercício e 3, 6 e 24 horas após o término deste. As principais alterações foram encontradas nos animais do G2, ou seja, aumento da circunferência articular (P<0,05), mudança da coloração do líquido sinovial (P<0,05), maior volume de líquido sinovial obtido das articulações metacarpofalangeanas (P<0,05), aumento nas concentrações de proteína (P<0,05), glicose (P<0,05) e PGE2 (P<0,05). Concomitantemente, estes animais apresentaram aumento de volume dos tecidos moles periarticulares, osteófitos, esclerose óssea e diminuição da flexão articular (P<0,05) nos exames radiográficos; além de maior espessura e menor homogeneidade da cápsula articular fibrosa, e maior quantidade de líquido articular visualizado nos exames ultra-sonográficos (P<0,05). Já a expressão dos receptores de TNF do tipo II foi maior nas células do líquido sinovial dos animais do G1. Os animais dos grupos 1 e 2 apresentaram maior porcentagem de macrófagos e sinoviócitos (P<0,05), do que os animais do grupo controle. Na segunda fase do experimento, foram observadas às 3 e 6 horas mudanças na coloração do líquido sinovial (P<0,05), diminuição no volume obtido (P<0,05), diminuição da concentração de glicose (P<0,05), aumento na concentração de proteína total (P<0,05), aumento na concentração de PGE2 (P<0,05). As células do líquido sinovial apresentaram intensidade acentuada de marcação para os receptores de TNF do tipo II também após 3 horas do término do exercício. Conclui-se que um processo inflamatório articular é desencadeado após o exercício intenso, e a resposta dos tecidos articulares frente a este insulto mecânico, com maior intensidade 3 horas após o término da atividade esportiva, e retornando aos valores basais 24 horas após, revela a excelente adaptação articular ao estresse físico. Esta adaptação também foi observada a longo prazo, em cavalos com maior tempo de carreira esportiva, ou seja, estes animais podem apresentar alterações articulares sem sinais de dor e claudicação. Contudo, isto não impede que cavalos com carreira atlética longa desenvolvam osteoartrite. / Physical activity causes an inflammatory response in joints depending on intensity and duration of the exercise. Polo ponies, for example, cross large distances at high speed, with abrupt stops of movement, subjecting the joints to intense and constant effort. The purpose of this study was to evaluate the effects of the sporting activity on joint metabolism, by means of physical examination, measurements of inflammatory mediator (PGE2) and cytokines (IL-1 and TNF-&alpha;), glucose and total protein concentrations, and quantitative and qualitative analyses of synovial fluid cells of 20 athletic horses on 3 different stages of training, every 30 days, during a period of 360 days: animals without training (control group), animals in the beginning to train (G1), and animals with more than five years of training (G2). Moreover, the study aimed to establish a relationship between laboratorial results and radiographic and ultrasonographic exams. In a second phase of the trial, synovial fluid analysis was done from samples of eight athletic horses before, and 3, 6 and 24 hours after exercise. Main alterations were found in horses of group 2, which were increase in joint circumference (P<0.05), alteration of the synovial fluid color (P<0.05), greater synovial fluid volume, obtained from metacarpophalangeal joints (P<0.05), greater protein (P<0.05), glucose (P<0.05), and PGE2 (P<0.05) concentrations. Concomitantly, these animals showed an increase of the periarticular soft tissues, ostephytes, subchondral bone sclerosis, and a diminished joint flexion in radiographic exams (P<0.05), and also a thick and less homogeneous articular capsule, and an increase of the joint fluid quantity in ultrasonographic exams (P<0.05). The TNF type II receptor expression was greater in synovial fluid cells of group 1 horses. Horses of the groups 1 and 2 showed greater percentage of macrophages and synoviocytes (P<0.05) than the animals of the control group. In the second phase of the study, it was observed a change of the synovial fluid color at 3 and 6 hours post-exercise (P<0.05), reduction of the obtained volume (P<0.05) and glucose concentration (P<0.05), and an increase of total protein (P<0.05) and PGE2 (P<0.05) concentrations. Also, the synovial fluid cells showed an accentuated intensity of markers for TNF type II receptor 3 hours after sports activity was finished. An inflammatory process of the joint is triggered after intense exercise, but the response of the articular tissue facing this mechanical insult, more intense within 3 hours after the end of the sports activity, and the return to basal values after 24 hours, reveal the excellent adaptation of the articular tissue to physical stress. This adaptation can also be observed in animals with more time of sports career, which can have articular changes without signs of pain or lameness. Nevertheless, this doesn\'t prevent horses with longer sports careers to develop osteoarthritis.

A ozonioterapia consiste na aplicação de ozônio medicinal, uma mistura de ozônio e oxigênio, que através das espécies reativas de oxigênio e produtos de lipoperoxidação exercem diversos efeitos no organismo como, melhora da oxigenação e metabolismo dos tecidos, angiogênese, aumento dos mecanismos antioxidantes, melhora do sistema imune, efeito anti-inflamatório, entre outros. Esta modalidade terapêutica já é amplamente estudada na medicina humana e vem sendo aplicada na medicina esportiva equina no tratamento de osteoartrite, porém sem estudos expressivos que comprovem sua segurança e eficácia. O objetivo do presente estudo é analisar os efeitos inflamatório e oxidante do ozônio medicinal em articulações sinoviais de equinos hígidos. Para tanto foram utilizadas 24 articulações tibiotársicas distribuídas aleatoriamente em três grupos. Nos grupos tratados foram realizadas três aplicações semanais de 15 ml de ozônio medicinal na concentração de 20 (GA) e 40 &micro;g/ml (GB), no total de 10 aplicações. Já no grupo controle, as articulações receberam três aplicações semanais de 15 ml de O2 (GC), também no total de dez aplicações. Foram realizados exames físico, de claudicação e ultrassonográfico, bem como análise do líquido sinovial, incluindo contagem total de células nucleadas e quantificação de proteína total, prostaglandina E2, Substância P, interleucina-1, interleucina-6, interleucina 10, fator de necrose tumoral-&#945;, ácido hialurônico (concentração e peso molecular) e condroitim sulfato. Para avaliação antioxidante no líquido sinovial foi determinada a atividade da superóxido desmutase e o burst oxidativo. Houve aumento da temperatura em GA e GB, os animais de GB apresentaram maior claudicação comparado aos demais grupos e observou-se aumento em todos os grupos dos escores ultrassonográficos. Na análise do líquido sinovial observou-se aumento nas contagens celulares de GA e GB, acompanhado de polimorfonucleares em GB, aumento da concentração de proteína no GA e GB, da atividade da superóxido desmutase e do índice de ativação em GA e diminuição da concentração de ácido hialurônico em todos os grupos e condroitim sulfato em GB e GC. Não houve diferença nas concentrações de PGE2, substância P, IL-1, IL-6, IL-10 e TNF-&#945;. A aplicação consecutiva do ozônio medicinal intra-articular provocou alterações ultrassonográficas e no exame de claudicação, mais perceptível na dose de 40 ug/mL. Estas alterações estão mais relacionadas à distensão articular causada pela infusão de gases do que aos efeitos inflamatórios provindos do O3, uma vez que as análises de líquido sinovial não mostraram relevante inflamação. Conclui-se que a aplicação intra-articular de ozônio medicinal em equinos é segura em ambas as doses, e que experimentos devem ser realizados utilizando-se animais com diferentes doenças articulares, para que os benefícios da ozonioterapia sejam evidenciados e compreendidos. / Ozone therapy consists of the application of medicinal ozone, a mixture of ozone and oxygen, which through reactive oxygen species and products of lipoperoxidation exert various effects on the body, such as improvement of tissue oxygenation and metabolism, angiogenesis, increase of antioxidant mechanisms, improvement of the immune system, anti-inflammatory effect, among others. This therapeutic modality is already widely studied in human medicine and has been applied in equine sports medicine in the treatment of osteoarthritis, but without expressive studies that prove its safety and efficacy. The objective of the present study is to analyze the inflammatory and oxidizing effects of medicinal ozone on synovial joints of healthy horses. Twenty-four tibiotarsic joints were randomly distributed in three groups. In the treated groups three weekly applications of 15 ml of medicinal ozone in the concentration of 20 (GA) and 40&micro;g / ml (GB) were carried out for a total of 10 applications. Already in the control group, the joints received three weekly applications of 15 ml of O2 (GC), also in the total of 10 applications. Physical, lameness and ultrasound examinations were performed, as well as synovial fluid analysis, including total nucleated cell count and quantification of total protein, prostaglandin E2, Substance P, interleukin-1, interleukin-6, interleukin-10, tumor necrosis factor-&#945;, hyaluronic acid (concentration and molecular weight) and chondroitin sulfate. For the antioxidant evaluation in the synovial fluid, the activity of the superoxide dismutase and the oxidative burst was determined. There was an increase in temperature in GA and GB, GB animals presented greater lameness compared to the other groups and an increase was observed in all groups of ultrasound scores. In the synovial fluid analysis, GA and GB cell counts were observed, followed by polymorphonuclear cells in GB, increased protein concentration in GA and GB, superoxide desmutase activity and activation index in GA, and decrease in concentration of Hyaluronic acid in all groups and chondrocyte sulfate in GB and CG. There was no difference in the concentrations of PGE2, substance P, IL-1, IL-6, IL-10 and TNF-&#945;. The consecutive application of intra-articular medicinal ozone caused ultrasonography changes and lameness, more noticeable at 40 ug / mL. These changes related more to joint distension caused by gas infusion than to inflammatory effects from O3, since synovial fluid analyzes did not show relevant inflammation. It is concluded that the intra-articular application of medical ozone in horses is safe in both doses, and that experiments must be performed using animals with different joint diseases, so that the benefits of ozonotherapy are evidenced and understood.

Orientador: Maria Elvira Pizzigatti Correa / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-15T16:05:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Feio_PatriciadoSocorroQueiroz_M.pdf: 2401000 bytes, checksum: ec8461997196edfbdd60b22b52c1dc43 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A hemofilia é uma doença hemorrágica hereditária ligada ao cromossomo X, decorrente da ausência ou da baixa quantidade no plasma dos fatores de coagulação Fator VIII (hemofilia A) ou do Fator IX (hemofilia B). Clinicamente, a hemofilia se caracteriza por episódios recorrentes de sangramentos profundos, que podem ocorrer espontaneamente ou em decorrência de traumatismos. O sistema músculo-esquelético é freqüentemente afetado pelos eventos hemorrágicos nos pacientes portadores de hemofilia. Dentro desse sistema, as articulações são alvos de episódios recorrentes de sangramentos, resultando em hemartroses. Estes episódios estimulam a hiperplasia da membrana sinovial articular, caracterizando o quadro das sinovites hemofílicas. O ciclo vicioso típico de hemartrose-sinovite-hemartrose quando estabelecido, tem como conseqüência a cronificação das alterações agudas articulares. Histologicamente, na sinovite é observada a proliferação de fibroblastos sinoviais e a presença de um infiltrado de células inflamatórias. Apesar da articulação temporomandibular (ATM) ser uma articulação do tipo sinovial são poucos os relatos sobre o seu envolvimento na sinovite hemofílica. Portanto, o objetivo deste estudo foi o de avaliar as características morfológicas da ATM de camundongos deficientes de fator VIII. Além disso, avaliar a indução de sinovite por hiper-extensão bucal. Para isso, as ATM de 30 camundongos deficientes de Fator VIII foram avaliadas. Cinco desses animais fizeram parte do grupo controle. E os outros 25 fizeram parte do grupo experimental para indução de sinovite pelo método de hiper-extensão bucal. Os animais do grupo controle foram sacrificados e as ATMs foram preparadas para avaliação histológica através da microscopia óptica. Os animais do grupo de estudo foram sacrificados após 2 e 5 dias e 2,4 e 6 semanas do procedimento. A seguir, as ATM foram preparadas para análise em microscopia e a membrana sinovial anterior inferior foi avaliada segundo os critérios descritos por Muto et al (1998b). Como resultado, as ATMs do grupo controle não apresentaram nenhuma alteração anatômica e a membrana sinovial anterior inferior apresentou entre 2-5 camadas de células sinoviais. No grupo de estudo o número de camadas de células sinoviais foram semelhantes ao grupo controle. Não foi observada dilatação capilar, adesão sinovial nem a presença de sangue na cavidade articular. Portanto, nossos resultados caracterizaram histologicamente a membrana sinovial anterior inferior de camundongos deficientes de Fator VIII e a metodologia empregada de hiper-extensão bucal não foi capaz de provocar sinovite na membrana sinovial avaliada / Abstract: Hemophilia is a hereditary hemorrhagic disease linked to chromosome X due to the deficiency of the activity of coagulation Factor VIII in hemophilia A, or Factor IX in hemophilia B. Clinically, hemophilia is characterized by recurrent severe bleedings, mostly in the musculoskeletal system. When the hemorrhage occurs inside the joint, it is called hemarthosis. Hemarthosis can stimulate the synovial membrane which results in synovial hyperplasia that can characterize the hemophilic synovitis. The typical vicious cycle haemartrosis-synovitis-haemarthrosis when established produces as a consequence, the chronification of joint acute changes. Histologically, synovitis is characterized by proliferation of the sinovial cells surrounded by an inflammatory infiltrate. Despite the fact that temporomandibular joint (TMJ) is a synovial joint there are few clinical reports in the literature regarding its involvement in hemophilic synovitis. Therefore, the goal of this study was to evaluate the morphological characteristics of TMJ in Factor VIII deficient mice. In addition, the second goal was to induce a TMJ synovitis using a forced jaw opening model. For this purpose, 30 Factor VIII deficient mice were enrolled in this study. Five of these animals were included in the control group and their TMJ was evaluated using light microscopy to establish the regular morphology of this joint. The other 25 were submitted to a forced jaw opening, for 5 minutes per day, during 10 days. These animals were sacrificed after 2 and 5 days and 2, 4 and 6 weeks of the procedure. TMJ was prepared for optical microscopy analysis and the anterior inferior synovial membrane was studied using Muto et al (1998) criteria. As a result, the anatomic characteristic of the TMJ was similar with other mice and the anterior inferior synovial membrane of this group presented 2-5 cell layers. In the study group, no anatomic changes were observed. No difference was observed regarding the thickness of sinovial cell layer of the studied group and the control group. Capillaries dilatation, synovial adhesion and blood in the joint chambers were not observed. Therefore, our results have histologically characterized the anterior inferior synovial membrane of TJM in Factor VIII deficient mice. The methodology used for inducing sinovites was not capable of inducing sinovites in the TMJ of Factor VIII deficient mice / Mestrado / Estomatologia / Mestre em Estomatopatologia

A atividade física, dependendo da intensidade e duração, provoca uma resposta inflamatória nos tecidos articulares dos eqüinos. Como ocorre nos cavalos de pólo que percorrem grandes distâncias em alta velocidade com paradas bruscas do movimento, submetendo suas articulações a esforços intensos e constantes. A finalidade deste trabalho foi avaliar os efeitos da atividade esportiva no metabolismo articular, por meio de exame físico, das dosagens de mediador inflamatório (PGE2) e citocinas (IL-1 e TNF-&alpha;), da concentração de glicose, proteína total e da análise quantitativa e qualitativa das células presentes no líquido sinovial de 20 eqüinos atletas em três estágios diferentes de treinamento, a cada 30 dias, durante o período de 360 dias: animais sem treinamento (grupo controle), animais em início de treinamento (G1) e animais com mais de 5 anos de treinamento (G2). Além disso, estabelecer uma relação entre os resultados laboratoriais com os exames radiográficos e ultra-sonográficos articulares. Numa segunda fase do experimento foi avaliado o líquido sinovial de oito eqüinos atletas antes do exercício e 3, 6 e 24 horas após o término deste. As principais alterações foram encontradas nos animais do G2, ou seja, aumento da circunferência articular (P<0,05), mudança da coloração do líquido sinovial (P<0,05), maior volume de líquido sinovial obtido das articulações metacarpofalangeanas (P<0,05), aumento nas concentrações de proteína (P<0,05), glicose (P<0,05) e PGE2 (P<0,05). Concomitantemente, estes animais apresentaram aumento de volume dos tecidos moles periarticulares, osteófitos, esclerose óssea e diminuição da flexão articular (P<0,05) nos exames radiográficos; além de maior espessura e menor homogeneidade da cápsula articular fibrosa, e maior quantidade de líquido articular visualizado nos exames ultra-sonográficos (P<0,05). Já a expressão dos receptores de TNF do tipo II foi maior nas células do líquido sinovial dos animais do G1. Os animais dos grupos 1 e 2 apresentaram maior porcentagem de macrófagos e sinoviócitos (P<0,05), do que os animais do grupo controle. Na segunda fase do experimento, foram observadas às 3 e 6 horas mudanças na coloração do líquido sinovial (P<0,05), diminuição no volume obtido (P<0,05), diminuição da concentração de glicose (P<0,05), aumento na concentração de proteína total (P<0,05), aumento na concentração de PGE2 (P<0,05). As células do líquido sinovial apresentaram intensidade acentuada de marcação para os receptores de TNF do tipo II também após 3 horas do término do exercício. Conclui-se que um processo inflamatório articular é desencadeado após o exercício intenso, e a resposta dos tecidos articulares frente a este insulto mecânico, com maior intensidade 3 horas após o término da atividade esportiva, e retornando aos valores basais 24 horas após, revela a excelente adaptação articular ao estresse físico. Esta adaptação também foi observada a longo prazo, em cavalos com maior tempo de carreira esportiva, ou seja, estes animais podem apresentar alterações articulares sem sinais de dor e claudicação. Contudo, isto não impede que cavalos com carreira atlética longa desenvolvam osteoartrite. / Physical activity causes an inflammatory response in joints depending on intensity and duration of the exercise. Polo ponies, for example, cross large distances at high speed, with abrupt stops of movement, subjecting the joints to intense and constant effort. The purpose of this study was to evaluate the effects of the sporting activity on joint metabolism, by means of physical examination, measurements of inflammatory mediator (PGE2) and cytokines (IL-1 and TNF-&alpha;), glucose and total protein concentrations, and quantitative and qualitative analyses of synovial fluid cells of 20 athletic horses on 3 different stages of training, every 30 days, during a period of 360 days: animals without training (control group), animals in the beginning to train (G1), and animals with more than five years of training (G2). Moreover, the study aimed to establish a relationship between laboratorial results and radiographic and ultrasonographic exams. In a second phase of the trial, synovial fluid analysis was done from samples of eight athletic horses before, and 3, 6 and 24 hours after exercise. Main alterations were found in horses of group 2, which were increase in joint circumference (P<0.05), alteration of the synovial fluid color (P<0.05), greater synovial fluid volume, obtained from metacarpophalangeal joints (P<0.05), greater protein (P<0.05), glucose (P<0.05), and PGE2 (P<0.05) concentrations. Concomitantly, these animals showed an increase of the periarticular soft tissues, ostephytes, subchondral bone sclerosis, and a diminished joint flexion in radiographic exams (P<0.05), and also a thick and less homogeneous articular capsule, and an increase of the joint fluid quantity in ultrasonographic exams (P<0.05). The TNF type II receptor expression was greater in synovial fluid cells of group 1 horses. Horses of the groups 1 and 2 showed greater percentage of macrophages and synoviocytes (P<0.05) than the animals of the control group. In the second phase of the study, it was observed a change of the synovial fluid color at 3 and 6 hours post-exercise (P<0.05), reduction of the obtained volume (P<0.05) and glucose concentration (P<0.05), and an increase of total protein (P<0.05) and PGE2 (P<0.05) concentrations. Also, the synovial fluid cells showed an accentuated intensity of markers for TNF type II receptor 3 hours after sports activity was finished. An inflammatory process of the joint is triggered after intense exercise, but the response of the articular tissue facing this mechanical insult, more intense within 3 hours after the end of the sports activity, and the return to basal values after 24 hours, reveal the excellent adaptation of the articular tissue to physical stress. This adaptation can also be observed in animals with more time of sports career, which can have articular changes without signs of pain or lameness. Nevertheless, this doesn\'t prevent horses with longer sports careers to develop osteoarthritis.

A ozonioterapia consiste na aplicação de ozônio medicinal, uma mistura de ozônio e oxigênio, que através das espécies reativas de oxigênio e produtos de lipoperoxidação exercem diversos efeitos no organismo como, melhora da oxigenação e metabolismo dos tecidos, angiogênese, aumento dos mecanismos antioxidantes, melhora do sistema imune, efeito anti-inflamatório, entre outros. Esta modalidade terapêutica já é amplamente estudada na medicina humana e vem sendo aplicada na medicina esportiva equina no tratamento de osteoartrite, porém sem estudos expressivos que comprovem sua segurança e eficácia. O objetivo do presente estudo é analisar os efeitos inflamatório e oxidante do ozônio medicinal em articulações sinoviais de equinos hígidos. Para tanto foram utilizadas 24 articulações tibiotársicas distribuídas aleatoriamente em três grupos. Nos grupos tratados foram realizadas três aplicações semanais de 15 ml de ozônio medicinal na concentração de 20 (GA) e 40 &micro;g/ml (GB), no total de 10 aplicações. Já no grupo controle, as articulações receberam três aplicações semanais de 15 ml de O2 (GC), também no total de dez aplicações. Foram realizados exames físico, de claudicação e ultrassonográfico, bem como análise do líquido sinovial, incluindo contagem total de células nucleadas e quantificação de proteína total, prostaglandina E2, Substância P, interleucina-1, interleucina-6, interleucina 10, fator de necrose tumoral-&#945;, ácido hialurônico (concentração e peso molecular) e condroitim sulfato. Para avaliação antioxidante no líquido sinovial foi determinada a atividade da superóxido desmutase e o burst oxidativo. Houve aumento da temperatura em GA e GB, os animais de GB apresentaram maior claudicação comparado aos demais grupos e observou-se aumento em todos os grupos dos escores ultrassonográficos. Na análise do líquido sinovial observou-se aumento nas contagens celulares de GA e GB, acompanhado de polimorfonucleares em GB, aumento da concentração de proteína no GA e GB, da atividade da superóxido desmutase e do índice de ativação em GA e diminuição da concentração de ácido hialurônico em todos os grupos e condroitim sulfato em GB e GC. Não houve diferença nas concentrações de PGE2, substância P, IL-1, IL-6, IL-10 e TNF-&#945;. A aplicação consecutiva do ozônio medicinal intra-articular provocou alterações ultrassonográficas e no exame de claudicação, mais perceptível na dose de 40 ug/mL. Estas alterações estão mais relacionadas à distensão articular causada pela infusão de gases do que aos efeitos inflamatórios provindos do O3, uma vez que as análises de líquido sinovial não mostraram relevante inflamação. Conclui-se que a aplicação intra-articular de ozônio medicinal em equinos é segura em ambas as doses, e que experimentos devem ser realizados utilizando-se animais com diferentes doenças articulares, para que os benefícios da ozonioterapia sejam evidenciados e compreendidos. / Ozone therapy consists of the application of medicinal ozone, a mixture of ozone and oxygen, which through reactive oxygen species and products of lipoperoxidation exert various effects on the body, such as improvement of tissue oxygenation and metabolism, angiogenesis, increase of antioxidant mechanisms, improvement of the immune system, anti-inflammatory effect, among others. This therapeutic modality is already widely studied in human medicine and has been applied in equine sports medicine in the treatment of osteoarthritis, but without expressive studies that prove its safety and efficacy. The objective of the present study is to analyze the inflammatory and oxidizing effects of medicinal ozone on synovial joints of healthy horses. Twenty-four tibiotarsic joints were randomly distributed in three groups. In the treated groups three weekly applications of 15 ml of medicinal ozone in the concentration of 20 (GA) and 40&micro;g / ml (GB) were carried out for a total of 10 applications. Already in the control group, the joints received three weekly applications of 15 ml of O2 (GC), also in the total of 10 applications. Physical, lameness and ultrasound examinations were performed, as well as synovial fluid analysis, including total nucleated cell count and quantification of total protein, prostaglandin E2, Substance P, interleukin-1, interleukin-6, interleukin-10, tumor necrosis factor-&#945;, hyaluronic acid (concentration and molecular weight) and chondroitin sulfate. For the antioxidant evaluation in the synovial fluid, the activity of the superoxide dismutase and the oxidative burst was determined. There was an increase in temperature in GA and GB, GB animals presented greater lameness compared to the other groups and an increase was observed in all groups of ultrasound scores. In the synovial fluid analysis, GA and GB cell counts were observed, followed by polymorphonuclear cells in GB, increased protein concentration in GA and GB, superoxide desmutase activity and activation index in GA, and decrease in concentration of Hyaluronic acid in all groups and chondrocyte sulfate in GB and CG. There was no difference in the concentrations of PGE2, substance P, IL-1, IL-6, IL-10 and TNF-&#945;. The consecutive application of intra-articular medicinal ozone caused ultrasonography changes and lameness, more noticeable at 40 ug / mL. These changes related more to joint distension caused by gas infusion than to inflammatory effects from O3, since synovial fluid analyzes did not show relevant inflammation. It is concluded that the intra-articular application of medical ozone in horses is safe in both doses, and that experiments must be performed using animals with different joint diseases, so that the benefits of ozonotherapy are evidenced and understood.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La molécula del ácido hialurónico (AH) tiene un gran valor económico por su uso en la industria cosmética, la medicina humana y veterinaria. En este trabajo se plantea como objetivo el separar esta molécula mediante filtración de líquido sinovial (LS) obtenido desde articulación sinovial equina que se destinan a la fabricación de harina de hueso. Se seleccionaron articulaciones metacarpo-falángicas macroscópicamente normales, cuyos LS se agruparon en un pool de alto (entre 1000-3000 células/L) y otro de bajo recuento celular (< 500 células/L), con el fin de separar y comparar la concentración de AH. Se determinó la viscosidad de ambos pools con el fin de estimar el contenido de AH. Ambos pools se sometieron a filtración en vacío, utilizando papel filtro previamente pesado. La diferencia de peso entre los papeles pre y post filtración fue prácticamente igual, encontrándose valores de AH de 2,92 y 2,85 mg/mL en los pools con alto y bajo recuento celular, respectivamente, a pesar de la mayor viscosidad detectada en el pool de alto recuento celular que se asocia con una mayor cantidad de AH. Posiblemente, el incremento de estrés oxidativo asociado al mayor recuento celular, produciría una mayor degradación de moléculas de AH de alta masa molecular, generando fragmentos más pequeños (<300 kDa) que atraviesan el papel filtro. Estos fragmentos podrían explicar la mayor viscosidad detectada en el pool de mayor recuento celular. En consecuencia esta técnica permite la separación de AH de masa molecular mayor a 300 kDa sin encontrar diferencia entre LS de alto y bajo recuento celular. / The hyaluronic acid (HA) molecule has a great economic value because of its use in the cosmetic industry as well as human and veterinary medicine. The aim of the study was to separate the molecule from the synovial fluid (SF) by filtration, obtained from equine synovial joints that are used for bone meal. Macroscopically normal metacarpo-phalangeal joints were selected, and were grouped into two pools, one of high cell count (between 1000-3000 cells/L) and one low cell count (< 500 cells/L), to compare the concentration of HA. The viscosity was determined in both pools to estimate the HA content. Afterword’s they were subjected to a vacuum filtration using pre-weighed filter paper. The paper weight difference between pre and post filtration procedure was basically the same, finding HA values of 2,92 mg/mL and 2,85 mg/mL in the pools of high cell count and low cell count respectively, despite the higher viscosity detected in the pool of high cell count which is associated to a higher amount of HA. Possibly, the increase of oxidative stress associated with the higher cell count, would produce a greater degradation of HA molecules of high molecular mass, generating smaller fragments (<300 kDa) that penetrated the filter paper. These fragments could explain the higher viscosity detected in the pool of higher cell count. Consequently this technique allows the separation of HA of molecular mass higher than 300 kDa without finding differences between SFs of high and low cell counts.

Na espécie equina, as enfermidades osteoarticulares causam prejuízo econômico e impacto negativo no desempenho atlético, devido aos danos causados na cartilagem articular. A regeneração da cartilagem hialina e a manutenção da integridade das estruturas que a compõe norteiam a busca do tratamento ideal. Neste contexto, este estudo foi delineado com o objetivo de investigar a presença de células-tronco mesenquimais (CTMs) no líquido sinovial (LS) e na membrana sinovial (MS) de equinos com articulações hígidas, com osteocondrite dissecante (OCD) e com osteoartrite (OA) e compará-las, visando estabelecer qual fonte celular possui melhor característica fenotípica e capacidade de diferenciação celular, mais especificamente, aquela que seja superior em relação à capacidade condrogênica. Foram utilizados equinos machos e fêmeas de diferentes idades, totalizando 97 articulações. O LS e MS foram coletados durante artroscopia e as células foram cultivadas, e avaliadas por citometria de fluxo com os anticorpos CD44, CD90, CD105, CD34; e por imunocitoquímica com os anticorpos nanog, oct4, PGP 9.5, lisozima, vimentina e citoqueratina. Adicionalmente, o potencial de diferenciação das células foi avaliado para as linhagens condrogênica, osteogênica e adipogênica. Foi realizado teste de tumorigenicidade em camundongos Balb-Cnu/nu, para comprovar aplicabilidade clínica, e posteriormente, as CTMs provenientes de LS de articulações hígidas foram aplicadas em articulações de equinos. A identidade das células foi comprovada durante o cultivo demonstrando características de adesão ao plástico e morfologia fibroblastóide. A média percentual das populações positivas para CD90 foi de 64,9% (LS-H), 48,3% (LS-OCD), 48,1% (LS-OA), 66,6% (MS-H), 40,2% (MS-OCD) e 40,3% (MS-OA). A porcentagem de células positivas para CD44 foi de 1,18% (LS-H), 3,98% (LS-OCD), 14,2% (LS-OA), 1,9% (MS-H), 2,17% (MS-OCD) 8,56% (MS-OA). Não foi observada expressão dos anticorpos CD34 e CD105. Na análise imunocitoquímica foi detectada expressão positiva para os anticorpos: lisozima, PGP 9.5, PCNA e vimentina, e negativa para nanog, oct4 e citoqueratina. A multipotência (osteogênica, condrogênica e adipogênica) das células foi confirmada através da coloração Alizarin Red para detecção de matriz de cálcio, Oil Red O para detecção de gotículas de gordura e azul de toluidina, alcian blue e hematoxilina eosina para detecção de matriz de proteoglicanos. Com relação aos resultados do teste tumorigênico, nenhum órgão dos camundongos foi afetado, assegurando a aplicabilidade das células estudadas. Ainda, as articulações de equinos tratadas, não apresentaram quaisquer sinais de reação inflamatória após aplicação de células alogênicas. Por fim, concluímos que, a fenotipagem positiva de CD44 e CD90 somada à capacidade de diferenciação nas linhagens osteogênica e condrogênica confirma a presença de CTMs nas populações celulares obtidas de LS e MS de equinos. Também foi observado que as células de LS provenientes de articulações hígidas, são as de melhor utilização clínica, uma vez que apresentaram maior expressão de CD90 e demonstraram melhor capacidade de diferenciação celular em relação às células derivadas de articulações enfermas. Além disso, possuem método mais fácil de colheita em relação à colheita de MS, visando futura terapia celular na rotina clínica / In the equine species, osteoarticular diseases cause significant economic losses and negative impact on equine athletic performance. The hyaline cartilage regeneration and the maintenance of integrity of its components guide the search for the ideal treatment. In this scenario, this study aimed to investigate the presence of mesenchymal stem cell (MSCs) in the synovial fluid (SF) and in the synovial membrane (SM) of healthy equine joints, osteoarthritic (OA) and osteochondritic joints (OCD), comparing their potential as cellular sources, according to their differentiation ability, in particular with superior chondrogenic potential and the phenotypic characteristics of the MSCs. Ninety-seven equine joints from males and females of different ages were used to harvest cells. SF and SM were obtained during arthroscopy and the cells SF and SM were cultured and assessed for CD90, CD44, CD105 and CD34 markers by flow cytometry, and nanog, oct4, PGP 9.5, lyzozyme, vimentin and cytokeratin were assessed by immunocytochemistry. Additionally, cells were evaluated in vitro for their osteogenic, adipogenic and chondrogenic differentiation potential. The tumorigenicity test was carried in Balb-C nu/nu mice, to verify the safety of cell sources and, later, mesenchymal stem cells harvested from healthy equine joints were injected into equine joints. The identity of these cells was confirmed during cell growth, through properties of plastic adhesion and fibroblastoid morphology. The mean percentage of CD90 positive cells was 64.9% (SF-H), 48.3% (SF-OCD), 48.1% (SF-OA), 66.6% (SM-H), 40.2% (SM- OCD) and 40.3% (SM-OA). The percentage of CD44 positive cells was 1.18 % (SF-H), 3.98% (SF-OCD), 14.2% (SF-OA), 1.9% (SM-H), 2.17% (SM-OCD) and 8.56% (SM-OA). The expression of CD34 and CD105 antibodies was not observed. Through immunocytochemical analysis, expression for lysozyme, PGP9.5, PCNA e vimentin antibodies was detected and negative expression for nanog, oct4 e cytokeratin was observed. The multipotent capacity of mesenchymal stromal cells for lineage differentiation (osteogenic, chondrogenoic and adipogenic) was confirmed with different staining techniques: Alizarin Red enabled detection of the calcium matrix, Oil Red O enabled the detection of fat droplets and Toluidin Blue, Alcian Blue and haematoxylin eosin enabled detection of proteoglycan matrix. Results of tumorigenic tests in mice showed no compromise of any internal organ, assuring applicability of the studied cells. Furthermore, equine joints treated with MSC harvested from healthy joints did not show any signs of an inflammatory reaction after injection of the allogeneic cells. The presence of cells with positive CD44 and CD90 phenotypes and with the ability to differentiate into osteogenic and chondrogenic lineages confirms the presence of MSCs in equine SF and SM. Cells obtained from healthy SF were more suitable for clinical application, for they presented higher CD90 expression and demonstrated greater differentiation capabilities, when compared to that of cells retrieved from compromised joints. In addition to that, SF derived cells are easier to obtain when compared to SM cells, aiming their future application clinical

Na espécie equina, as enfermidades osteoarticulares causam prejuízo econômico e impacto negativo no desempenho atlético, devido aos danos causados na cartilagem articular. A regeneração da cartilagem hialina e a manutenção da integridade das estruturas que a compõe norteiam a busca do tratamento ideal. Neste contexto, este estudo foi delineado com o objetivo de investigar a presença de células-tronco mesenquimais (CTMs) no líquido sinovial (LS) e na membrana sinovial (MS) de equinos com articulações hígidas, com osteocondrite dissecante (OCD) e com osteoartrite (OA) e compará-las, visando estabelecer qual fonte celular possui melhor característica fenotípica e capacidade de diferenciação celular, mais especificamente, aquela que seja superior em relação à capacidade condrogênica. Foram utilizados equinos machos e fêmeas de diferentes idades, totalizando 97 articulações. O LS e MS foram coletados durante artroscopia e as células foram cultivadas, e avaliadas por citometria de fluxo com os anticorpos CD44, CD90, CD105, CD34; e por imunocitoquímica com os anticorpos nanog, oct4, PGP 9.5, lisozima, vimentina e citoqueratina. Adicionalmente, o potencial de diferenciação das células foi avaliado para as linhagens condrogênica, osteogênica e adipogênica. Foi realizado teste de tumorigenicidade em camundongos Balb-Cnu/nu, para comprovar aplicabilidade clínica, e posteriormente, as CTMs provenientes de LS de articulações hígidas foram aplicadas em articulações de equinos. A identidade das células foi comprovada durante o cultivo demonstrando características de adesão ao plástico e morfologia fibroblastóide. A média percentual das populações positivas para CD90 foi de 64,9% (LS-H), 48,3% (LS-OCD), 48,1% (LS-OA), 66,6% (MS-H), 40,2% (MS-OCD) e 40,3% (MS-OA). A porcentagem de células positivas para CD44 foi de 1,18% (LS-H), 3,98% (LS-OCD), 14,2% (LS-OA), 1,9% (MS-H), 2,17% (MS-OCD) 8,56% (MS-OA). Não foi observada expressão dos anticorpos CD34 e CD105. Na análise imunocitoquímica foi detectada expressão positiva para os anticorpos: lisozima, PGP 9.5, PCNA e vimentina, e negativa para nanog, oct4 e citoqueratina. A multipotência (osteogênica, condrogênica e adipogênica) das células foi confirmada através da coloração Alizarin Red para detecção de matriz de cálcio, Oil Red O para detecção de gotículas de gordura e azul de toluidina, alcian blue e hematoxilina eosina para detecção de matriz de proteoglicanos. Com relação aos resultados do teste tumorigênico, nenhum órgão dos camundongos foi afetado, assegurando a aplicabilidade das células estudadas. Ainda, as articulações de equinos tratadas, não apresentaram quaisquer sinais de reação inflamatória após aplicação de células alogênicas. Por fim, concluímos que, a fenotipagem positiva de CD44 e CD90 somada à capacidade de diferenciação nas linhagens osteogênica e condrogênica confirma a presença de CTMs nas populações celulares obtidas de LS e MS de equinos. Também foi observado que as células de LS provenientes de articulações hígidas, são as de melhor utilização clínica, uma vez que apresentaram maior expressão de CD90 e demonstraram melhor capacidade de diferenciação celular em relação às células derivadas de articulações enfermas. Além disso, possuem método mais fácil de colheita em relação à colheita de MS, visando futura terapia celular na rotina clínica / In the equine species, osteoarticular diseases cause significant economic losses and negative impact on equine athletic performance. The hyaline cartilage regeneration and the maintenance of integrity of its components guide the search for the ideal treatment. In this scenario, this study aimed to investigate the presence of mesenchymal stem cell (MSCs) in the synovial fluid (SF) and in the synovial membrane (SM) of healthy equine joints, osteoarthritic (OA) and osteochondritic joints (OCD), comparing their potential as cellular sources, according to their differentiation ability, in particular with superior chondrogenic potential and the phenotypic characteristics of the MSCs. Ninety-seven equine joints from males and females of different ages were used to harvest cells. SF and SM were obtained during arthroscopy and the cells SF and SM were cultured and assessed for CD90, CD44, CD105 and CD34 markers by flow cytometry, and nanog, oct4, PGP 9.5, lyzozyme, vimentin and cytokeratin were assessed by immunocytochemistry. Additionally, cells were evaluated in vitro for their osteogenic, adipogenic and chondrogenic differentiation potential. The tumorigenicity test was carried in Balb-C nu/nu mice, to verify the safety of cell sources and, later, mesenchymal stem cells harvested from healthy equine joints were injected into equine joints. The identity of these cells was confirmed during cell growth, through properties of plastic adhesion and fibroblastoid morphology. The mean percentage of CD90 positive cells was 64.9% (SF-H), 48.3% (SF-OCD), 48.1% (SF-OA), 66.6% (SM-H), 40.2% (SM- OCD) and 40.3% (SM-OA). The percentage of CD44 positive cells was 1.18 % (SF-H), 3.98% (SF-OCD), 14.2% (SF-OA), 1.9% (SM-H), 2.17% (SM-OCD) and 8.56% (SM-OA). The expression of CD34 and CD105 antibodies was not observed. Through immunocytochemical analysis, expression for lysozyme, PGP9.5, PCNA e vimentin antibodies was detected and negative expression for nanog, oct4 e cytokeratin was observed. The multipotent capacity of mesenchymal stromal cells for lineage differentiation (osteogenic, chondrogenoic and adipogenic) was confirmed with different staining techniques: Alizarin Red enabled detection of the calcium matrix, Oil Red O enabled the detection of fat droplets and Toluidin Blue, Alcian Blue and haematoxylin eosin enabled detection of proteoglycan matrix. Results of tumorigenic tests in mice showed no compromise of any internal organ, assuring applicability of the studied cells. Furthermore, equine joints treated with MSC harvested from healthy joints did not show any signs of an inflammatory reaction after injection of the allogeneic cells. The presence of cells with positive CD44 and CD90 phenotypes and with the ability to differentiate into osteogenic and chondrogenic lineages confirms the presence of MSCs in equine SF and SM. Cells obtained from healthy SF were more suitable for clinical application, for they presented higher CD90 expression and demonstrated greater differentiation capabilities, when compared to that of cells retrieved from compromised joints. In addition to that, SF derived cells are easier to obtain when compared to SM cells, aiming their future application clinical

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / La fisiopatología/etiología de la enfermedad degenerativa articular ha demostrado que esta es una patología asociada a estrés oxidativo. No existen antecedentes concluyentes acerca de la capacidad antioxidante del líquido sinovial (LS). Es por ello, que en este trabajo se evaluó el efecto antioxidante de Acido Hialurónico (AH), Condroitín-Sulfato (CS) y LS proveniente de la articulación metacarpo falángica equina normal, con daño crónico y con membrana sinovial congestiva. Este efecto se evaluó en un sistema biológico constituido por una fracción enriquecida en retículo endoplásmico de hígado de rata (microsomas) sometida a estrés oxidativo por Fe+3/ascorbato, que es un sistema generador de especies radicalarias del oxígeno. Los LS de articulación normal y con daño crónico inhibieron significativamente la lipoperoxidación microsómica inducida por Fe+3/ascorbato (40%) (p<0,05), efecto que no fue dependiente de la concentración, aunque los volúmenes ensayados de LS fluctuaron entre 10 y 100 L. El LS de la articulación con membrana sinovial congestiva, produjo un efecto significativamente menor (16%), el que fue observado sólo con el volumen de 100 L. El AH y CS no inhibieron la lipoperoxidación microsómica. Por otro lado, todos LS ensayados presentaron actividad Glutatión transferasa (GSH-T) equivalente aproximadamente al 10% de la actividad total microsómica en los LS provenientes de articulación normal y con daño crónico y al 12%, en el LS de articulación con membrana sinovial congestiva. Más aún, la presencia en los LS, de AH y CS previno el daño oxidativo sobre la GSH-T microsómica inducido por Fe+3/ascorbato. Por otra parte, los LS de articulación normal y con daño crónico no afectaron la disminución de los tioles microsómicos inducida por Fe+3/ascorbato; sin embargo, el LS proveniente de la articulaciones con membrana sinovial congestiva, AH y CS la inhibieron significativamente (p<0,05). Estos resultados indicarían que en los LS existirían diferentes mecanismos antioxidantes, los que estarían asociados a cada condición articular. Así el LS de articulación con membrana sinovial congestiva protegió los grupos tioles y la actividad GSH-T, mientras que los LS de articulación normal y con daño crónico ejercen una mayor acción protectora frente a la lipoperoxidación / Proyecto FIV 2007 Nº 12100101 4602018