A class of linear diamidines was synthesized for the evaluation as a treatment of Human African Trypanosomiasis. These fused heterocyclic compounds are thiazole[5,4-d]thiazoles and are of interest because the parent compound, 2,5-Bis(4-amidinophenyl)-thiazolo[5,4-d]thiazole HCl salt, which is also called DB 1929, has exhibited a low nanomolar IC50 value against Trypanosoma brucei rhodesiense and has shown selectivity for binding to the human telomere G-quadruplex over that of DNA duplex. A fluoro and a methoxy derivative have been synthesized and are currently undergoing testing for activity and binding affinity. In addition, fluorescence studies of selected diamidines were done to study the effect of structural variation on fluorescence. This data is useful since it can determine what types of moieties are needed to yield a compound that will fluoresce in the higher wavelengths (500 nm and above) of the visible spectrum, which would be advantageous in determining the uptake of the drug in the trypanosome within the endemic areas of Africa with a simple microscope.

>Magister Scientiae - MSc / Tsetse flies (Glossina spp) are vectors of African trypanosome (Trypanosoma spp) parasites, causative agents of Human African trypanosomiasis (sleeping sickness) and Nagana in livestock. Research suggests that tsetse fly immunity factors are key determinants in the success and failure of infection and the maturation process of parasites. An analysis of tsetse fly immunity factors is limited by the paucity of genomic data for Glossina spp. Nevertheless, completely sequenced and assembled genomes of Drosophila melanogaster, Anopheles gambiae and Aedes aegypti provide an opportunity to characterize protein families in species such as Glossina by using a comparative genomics approach. In this study we characterize thioester-containing proteins (TEPs), a sub-family of immunity-related proteins, in Glossina by leveraging the EST data for G.morsitans and the genomic resources of D. melanogaster, A. gambiae as well as A.aegypti.A total of 17 TEPs corresponding to Drosophila (four TEPs), Anopheles (eleven TEPs) and Aedes aegypti (two TEPs) were collected from published data supplemented with Genbank searches. In the absence of genome data for G. morsitans, 124 000 G.morsitans ESTs were clustered and assembled into 18 413 transcripts (contigs and singletons). Five Glossina contigs (Gmcn1115, Gmcn1116, Gmcn2398, Gmcn2281 and Gmcn4297) were identified as putative TEPs by BLAST searches. Phylogenetic analyses were conducted to determine the relationship of collected TEP proteins.Gmcn1115 clustered with DmtepI and DmtepII while Gmcn2398 is placed in a separate branch, suggesting that it is specific to G. morsitans.The TEPs are highly conserved within D. melanogaster as reflected in the conservation of the thioester domain, while only two and one TEPs in A. gambiae and A. aegypti thioester domain show conservation of the thioester domain suggesting that these proteins are subjected to high levels of selection. Despite the absence of a sequenced genome for G. morsitans, at least two putative TEPs where identified from EST data.

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RESUME<p>La Trypanosomiase Humaine Africaine (THA) appelée également « maladie du sommeil» est une maladie parasitaire provoquée par un protozoaire du genre Trypanosoma dont deux sous-espèces (T. brucei gambiense et T. brucei rhodesiense) sont pathogènes à l’homme. La stratégie de lutte contre cette maladie est essentiellement basée sur le dépistage précoce et le traitement des malades, complété avec le contrôle du vecteur. Cependant, l’utilisation du service de dépistage de la THA par les communautés exposées représente un défi majeur. L’adhésion aux campagnes de dépistage actif avec des équipes mobiles spécialisées était en-dessous de 50% dans certains villages endémiques fin des années nonante. De surcroît, l’utilisation des services de santé fixes en RDC est si faible que ceci compromet le dépistage passif dans les formations sanitaires fixes. Notre hypothèse est que cette faible utilisation des services de santé pourrait elle-même être due à un problème d’acceptabilité du dépistage et traitement de la THA par les communautés vivant dans les zones de transmission de la THA. Tout ceci compromet l’élimination de la THA comme problème de santé publique, un but que s’est fixé la communauté internationale d’ici 2020.<p>Ce travail a comme objectif d’explorer cette dimension socioculturelle de la maladie qui est souvent négligée dans le contrôle de la THA et générer une meilleure connaissance de ces aspects.<p><p>Nous avons réalisé cinq études en total pour adresser la question de la sous-utilisation des services de dépistage et traitement de la THA par les communautés et sa relation avec l’acceptabilité des services. Nous avons d’abord développé une première étude qui évalue les résultats du traitement de la THA en analysant rétrospectivement les données de routine du programme de contrôle de la THA pour l’année 2006 à 2008. Ensuite, nous avons réalisé trois études qualitatives par focus group (groupe focalisé) et entretiens individuels pour documenter la dimension socioculturelle de la lutte contre la THA. D’abord une étude qui a exploré les perceptions sur la THA dans la communauté, suivi par une étude qui explore les perceptions sur le traitement de la THA et une autre qui se concentre sur les pratiques diagnostics des professionnels de santé face à un syndrome neurologique en contexte de ressources limitées. <p><p>Une cinquième étude combine une enquête-ménage avec des focus groups et des entretiens individuels pour explorer les perceptions de la communauté sur la santé en général et les services de santé. <p>Nous avons comparé les obstacles à l’utilisation des services de dépistage et traitement de la THA identifiés dans ce travail avec les messages de sensibilisation sur la THA utilisés au programme de contrôle de la THA en RDC et nous avons développé des recommandations stratégiques.<p><p>L’évaluation des indicateurs de performances sur l’issue de traitement montre que le taux de suivi post-thérapeutique est faible dans son ensemble :25 % pour le premier suivi de six mois et moins d’un pourcent des patients revient pour la dernière visite de contrôle au mois 24. Nous avons aussi observé dans cette étude un taux d’échec au mélarsoprol et à la pentamidine respectivement de 30% et de 22 % au Kasaï Oriental qui sont cependant difficilement interprétables, car le dénominateur est incomplet. Comme très peu de patients reviennent au contrôle post-thérapeutique, cette proportion est probablement biaisée vers ceux qui sont en échec de traitement.<p><p>L’étude de perception de la THA montre que la maladie est bien connue dans les communautés vivant dans les zones à risque. Par contre, plusieurs obstacles au dépistage et traitement de la THA ont été identifiés. Les plus importants sont :la toxicité des médicaments de la THA, les obstacles financiers, l’inadéquation entre le programme de dépistage des équipes mobiles et les occupations des communautés, les interdits qui accompagnent le traitement de la THA, le manque de confidentialité et la peur de la ponction lombaire. <p>L’étude sur la perception du traitement de la THA a montré que le mélarsoprol est perçu comme un médicament toxique et est surnommé « médicament des interdits ». Par contre, le régime NECT est perçu comme un nouveau médicament moins toxique qui a rendu les interdits liés au mélarsoprol obsolètes sauf un seul, celui de ne pas avoir de rapport sexuel pendant la période de traitement et de suivi post thérapeutique qui est de 6 mois. Les interdits ont été instaurés de manière empirique par les professionnels de santé et les communautés pour mitiger les effets indésirables du mélarsoprol. Leur violation pourrait entrainer des conséquences graves et mortelles. Ces interdits sont fortement ancrés dans les croyances de la communauté et constituent aujourd’hui un obstacle au dépistage et traitement. <p><p>L’étude sur les pratiques diagnostiques des professionnels de santé en matière de syndrome neurologique en contexte de ressources limitées a montré qu’en zone rurale le diagnostic est principalement clinique. Les obstacles perçus au diagnostic de confirmation sont essentiellement d’ordre financier puisque le patient doit tout financer de sa poche. Autres obstacles évoqués sont le manque d’outils de diagnostic et la perception de la communauté qui voit le clinicien comme un devin (petit dieu) ou oracle capable de « deviner » directement la maladie sans passer par un processus diagnostique de laboratoire.<p>L’étude sur les perceptions de la santé et des services de santé a montré que les capacités de travailler (82%) et les capacités de se mouvoir (66%) sont les signes de bonne santé les plus perçus. 90% des responsables des ménages perçoivent positivement la santé de leur ménage. Les opinions sur le service de santé sont partagées.<p><p>Les études présentées dans ce travail ont généré des nouvelles connaissances sur la dimension socioculturelle de la THA. L’analyse des messages de sensibilisation sur la THA utilisés par le programme de contrôle de la THA en RDC en termes de comparaison avec les obstacles au dépistage et traitement de la THA identifiés dans ce travail montre que ces aspects socioculturels bien qu’étant des véritables goulots d’étranglements dans la dynamique de la lutte contre la THA ne sont pas bien ciblés par la communication sur la THA. <p>Les perspectives des communautés exposées au risque de la THA doivent être adressées par un dialogue continu entre professionnels de santé et communautés adapté aux réalités locales. Ainsi il sera possible d’améliorer de manière opérationnelle les stratégies d’information, éducation et communication, et de façon plus large, le dépistage et traitement de la THA en intégrant la dimension socioculturelle de la THA dans la politique de lutte contre la THA. <p><p>SUMMARY<p>Human African Trypanosomiasis (HAT), also known as “sleeping sickness” is a parasitic disease caused by protozoa of the species Trypanosoma. There are two types that infect humans, Trypanosoma brucei gambiense and Trypanosoma brucei rhodesiense. The strategy used to control sleeping sickness consists of early case detection and treatment of patients, together with vector control. Meanwhile, utilization/access to HAT screening by the affected communities remains a major challenge. Adherence to active screening programs with mobile units was below 50% in certain endemic villages end of the 90’s. Moreover, utilization of fixed health facilities in DRC is so low that it compromises passive case finding. Our hypothesis is that this low utilization of health services is caused by a problem of acceptance of case detection and treatment of HAT by the communities living in the HAT transmission zones. This compromises the target of the international community to eliminate HAT as a public health problem by 2020. This thesis wants to explore and tries to generate more knowledge on the socio-cultural aspect that is often neglected in the control of HAT. <p><p>We conducted five studies to address the lack of community participation in HAT screening and treatment activities and the relation with acceptance of these services. <p>The first study evaluated the results of HAT treatment by retrospectively analyzing data of the routine HAT control program for the period 2006-2008. <p><p>Afterwards we performed three qualitative studies consisting of focus group discussions and individual interviews to document the socio-cultural dimension of the fight against HAT. The first study explored the community perceptions regarding sleeping sickness. The second study explored the perceptions regarding HAT treatment and a third study focused on diagnostic practices of health professionals in low-resource settings facing a neurological syndrome. <p><p>The fifth study consists of a household survey, focus group discussions and individual interviews to explore community perception regarding health in general and health services. We compared the identified barriers to screening and treatment of HAT with awareness messages on sleeping sickness used by the HAT control program in DRC and we developed strategic recommendations. The evaluation of performance indicators for treatment showed that compliance with post-treatment follow-up is very poor: 25% for the first post-treatment follow-up examination at six months and less than 1% of the patients returns for the final examination at 24 months. In this study we also observed a treatment failure rate of respectively 30% and 22% for melarsoprol and pentamidine in Kasai-Oriental. However, these date are difficult to interpret because of an incomplete denominator. As only few patients return for follow-up visits, this proportion is probably biased towards those in treatment failure.<p> <p>The study on the perception of sleeping sickness shows that the disease is well known amongst the communities living in the endemic areas. However, several screening and treatment barriers were identified. The most important are: drug toxicity, financial barriers, the incompatibility between the itineraries of the mobile screening teams and the local communities’ activities, the prohibitions related to HAT treatment, lack of confidentiality and fear of lumbar punctures. The study on the perceptions regarding HAT treatment show that melarsoprol is perceived as a toxic drug and is nicknamed the ‘taboo drug’. On the other hand the NECT regime is perceived as the new drug that is less toxic and that has abolished all the taboos of melarsoprol with the important exception of sexual intercourse during the treatment period and the post-treatment follow-up period of six months. <p><p>The prohibitions have been established empirically by healthcare providers and communities to mitigate the side effects of the melarsoprol regimen. Violating these restrictions is believed to cause severe and sometimes mortal complications. Communities adhere strictly to these prohibitions and this constitutes a barrier for HAT screening and treatment.<p><p>The study focusing on diagnostic work-up of neurological syndromes in low-resource settings by health care providers has shown that in rural areas diagnosis is usually clinical. Barriers to confirmation of diagnosis are mainly related to the purchasing power of the patient. Other reported barriers are a lack of diagnostic tools and the communities’ perceptions associated with the care provider. Clinicians are perceived as diviners being able to directly identify the cause of the illness without using laboratory tests. The study regarding the perceptions on health and health services has shown that ability to work (82%) and ability to move (66%) are the most perceived signs of good health. 90% of the household responsibles positively perceive the health of their family. The opinions on the health services are divided. <p><p>The studies presented in this thesis have generated new insights on the socio-cultural dimension of HAT. The analysis of the awareness messages on HAT in DRC compared with the reported HAT screening and treatment barriers have shown that <p>although these sociocultural aspects are real bottlenecks in the dynamic of the fight against HAT, they are not targeted by the communication on HAT. <p><p>The prospects for communities at risk of HAT should be addressed through continuous dialogue between health professionals and communities adapted to local realities.<p><p>It will thus be possible to operationally improve the information strategies, education and communication, and more broadly, screening and treatment of HAT by integrating the socio-cultural dimension in the fighting policy against sleeping sickness.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Made available in DSpace on 2017-07-24T19:38:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 VivianePaula.pdf: 3188050 bytes, checksum: 1b1ca9983470b6e6a3669cfd52a8c846 (MD5) Previous issue date: 2007-03-06 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The enzymes dihydrofolate reductase-thymidylate synthase (DHFR-TS) and pteridine reductase (PTR) are involved in the pterin/folate dependent metabolism; together they represent an important target for chemotherapy of parasitic leishmanias and trypanosomes. Xray crystallography was used to elucidate accurately the structure of the PTR1 enzyme from Trypanosoma brucei in complex with inhibitors which are analogous to the substrate. The ligands assayed for crystallization were the substrate folate and the inhibitors melamine, 6-thioguanine, WSG1012, WSG1034, WSG3065, WSG3066 and WSG3067. Of these, four yielded crystals with diffraction patterns sufficient for a complete dataset. WSG3065 (later revealing the lack of the ligand), WSG3066 and WSG3067 are three of the several structures presented in this work which came from the cited crystallization assays; added to these are the refined structures complexed with triamterene and cyromazine, proceeded from two other datasets already available. The datasets were processed with the programs Mosflm / Scala and Xds / Xscale, the structures were refined using the programs CNS and Refmac5 and validated with the programs Procheck, Whatcheck, Sfcheck and ValidationPDB. All refined structures belong to the space group P21 with unit cells around a = 79, b = 90, c = 82, b = 115, 4 monomers each of 268 residues per asymmetric unit and complex active sites. Besides the inhibiting ligands (except WSG3065) present in the structure, other ligands were found either near or outside the active site: dithiothreitol, glycerol, ethylene glycol, sodium and acetate ions. Analyses on the ligand positions and corresponding interactions with the protein were carried out to understand modes of inhibition and to guide the design or the discovery of new compounds which are potent, but selective to the parasitic enzyme, inhibitors. Thereby, initial docking studies were performed aiming at identifying new molecules or lead compounds with inhibitory capabilities. / As enzimas dihidrofolato redutase-timidilato sintase (DHFR-TS) e pteridina redutase (PTR) estão envolvidas no metabolismo pterina/folato dependente; juntas, representam um importante alvo para a quimioterapia de leishmanias e tripanossomas parasitas. A Cristalografia por Raios X foi utilizada para elucidar acuradamente a estrutura da enzima PTR1 de Trypanosoma brucei complexada com inibidores que são análogos ao substrato. Os ligantes ensaiados para cristalização foram o substrato folato e os inibidores melamina, 6-tioguanina, WSG1012, WSG1034, WSG3065, WSG3066 e WSG3067. Destes, quatro forneceram cristais com padrões de difração suficientes para um conjunto de dados completo. WSG3065 (mais tarde revelando ausência do ligante), WSG3066 e WSG3067 são três das estruturas apresentadas neste trabalho derivadas dos ensaios de cristalização citados; somadas a estas estão as estruturas refinadas dos complexos com triantereno e ciromazina, provenientes de dois outros conjuntos de dados anteriormente disponíveis. Os conjuntos de dados foram processados com os programas Mosflm / Scala e Xds / Xscale, as estruturas refinadas usando-se os programas CNS e Refmac5 e validadas com os programas Procheck, Whatcheck, Sfcheck e ValidationPDB. Todas as estruturas refinadas apresentaram grupo espacial P21 com celas unitárias aproximadas a = 79 = 90, c = 82 , b = 115, 4 monômeros de 268 resíduos cada por unidade assimétrica e sítios ativos complexos. Além dos ligantes inibidores presentes nas estruturas (exceto WSG3065), outros ligantes foram encontrados próximos ou fora do sítio ativo: ditiotreitol, glicerol, etilenoglicol, íons sódio e íons acetato. Análises das posições dos ligantes inibidores e correspondentes interações com a proteína foram realizadas a fim de se entender modos de inibição e, em particular, assistir ao planejamento ou à descoberta de novos compostos que sejam inibidores potentes, mas seletivos, para a enzima parasitária. Assim, estudos iniciais de atracagem (docking) foram realizados visando identificar novas moléculas ou arcabouços com capacidades inibitórias.

Human African trypanosomiasis (sleeping sickness) is a devastating disease which is endemic in parts of sub-Saharan Africa. It is caused by the protozoan parasite T. brucei, which are transmitted by the bite of infected tsetse flies. Although the disease is fatal if left untreated, there is a lack of safe, effective and affordable drugs available; therefore new drugs are urgently needed. The aim of the work presented in this thesis is to develop novel trypanocidal compounds. It is divided into two parts to reflect the two distinct strategies employed to achieve this aim. The first part focuses on the inhibition of glycophosphoinositol (GPI) anchor synthesis by inhibiting the Zn2+-dependent enzyme, GlcNAc-PI de-N-acetylase. Trypanosomes have a variable surface glycoprotein (VSG) coat, which allows them to evade the human immune system. The GPI anchor attaches the VSG to the cell membrane; therefore inhibiting GPI synthesis should expose the parasite to the immune system. Initially, large substrate analogues were synthesized. These showed weak inhibition of the enzyme. Zinc-binding fragments were screened, and small molecule inhibitors based on salicylhydroxamic acid were then synthesized. These compounds showed modest inhibition, but the excellent ligand efficiency of salicylhydroxamic acid indicates this may be a promising starting point for further inhibitors. The second part details the P2 strategy. The P2 transporter is a nucleoside transporter unique to T. brucei, which concentrates adenosine. The transporter also binds and selectively concentrates compounds that contain benzamidine and diaminotriazine P2 motifs, which can enhance the potency and selectivity of these compounds. The sleeping sickness drugs melarsoprol and pentamidine contain P2 motifs. Compounds comprising a P2 targeting motif, a linker and a trypanocidal moiety were synthesized. Initially, a diaminotriazine P2 motif was attached to a trypanocidal tetrahydroquinoline (THQ) protein farnesyl transferase (PFT) inhibitor, with limited success. The P2 strategy was also applied to a non-selective, trypanocidal, quinol moiety. The quinol moiety was attached to diaminotriazine and benzamidine P2 motifs, and an increase in selectivity for T. brucei over MRC5 cells was observed.

RESUME La Trypanosomiase Humain Africaine (THA) demeure un problème de santé publique pour plusieurs pays en Afrique subsaharienne. Le contrôle de la THA est basé essentiellement sur la stratégie de dépistage actif suivi du traitement des personnes infectées. Le dépistage actif est réalisé par des unités mobiles spécialisées, bien que les services de santé fixes jouent un rôle important en détectant « passivement » des cas. Le dépistage reposait jadis sur la palpation ganglionnaire mais, depuis le développement du test d’agglutination sur carte (CATT), trois possibilités se sont offertes aux programmes de contrôle à savoir: i) continuer avec la palpation ganglionnaire ii) combiner la palpation ganglionnaire avec le CATT iii) recourir au CATT seul. Certains programmes comme celui de la République Démocratique du Congo (RDC) ont opté pour la combinaison en parallèle de la palpation ganglionnaire avec le CATT. Toute personne ayant une hypertrophie ganglionnaire cervicale et/ou un CATT positif est considéré comme suspecte de la THA. Elle sera soumise aux tests parasitologiques de confirmation à cause de la toxicité des médicaments anti-THA. Les tests parasitologiques classiques sont l’examen du suc ganglionnaire (PG), l’examen du sang à l’état frais (SF), la goutte épaisse colorée (GE). La sensibilité de cette séquence a été estimée insuffisante par plusieurs auteurs et serait à la base d’une grande perte de l’efficacité de la stratégie dépistage-traitement. D’autres techniques de concentration ont été développées comme la mini-Anion Exchange Concentration Technique (mAECT), la Centrifugation en Tube Capillaire (CTC) et le Quantitative Buffy Coat (QBC), mais ces techniques de concentration ne sont pas utilisées en routine. En RDC, une interruption des activités de contrôle en 1990 a eu comme conséquence une réémergence importante de la maladie du sommeil. Depuis 1998 les activités de contrôle ont été refinancées de manière structurée. Ce travail vise deux buts à savoir le plaidoyer pour la continuité des activités de contrôle et la rationalisation des stratégies de contrôle. Nous avons évalué l’évolution de la maladie du sommeil en rapport avec le financement, son impact sur les ménages ainsi que la communauté. L’exercice de rationalisation a porté sur les outils de dépistage et de confirmation. Nous avons d’abord évalué la validité des tests, leur faisabilité ainsi que les coûts et ensuite nous avons effectué une analyse décisionnelle formelle pour comparer les algorithmes de dépistage et pour les tests de confirmation. Pendant la période de refinancement structurel de la lutte contre la THA en RDC (1998-2003), le budget alloué aux activités a été doublé lorsqu’on le compare à la période précédente (1993-1997). Le nombre des personnes examinées a aussi doublé mais par contre le nombre des nouveaux cas de THA est passé d’un pic de 26 000 cas en 1998 à 11 000 en 2003. Le coût par personne examinée a été de 1,5 US$ et celui d’un cas détecté et sauvé à 300 US$. Pendant cette période, les activités ont été financées par l’aide extérieure à plus de 95%. Cette subvention pourrait laisser supposer que l’impact de la THA au niveau des ménages et des communautés est réduit mais lorsque nous avons abordé cet aspect, il s’est avéré que le coût de la THA au niveau des ménages équivaut à un mois de leur revenu et que la THA fait perdre 2145 DALYs dans la communauté. L’intervention par la stratégie de dépistage-traitement a permis de sauver 1408 DALYs à un coût de 17 US$ par DALYs sauvé. Ce coût classe l’intervention comme « good value for money ». Le recours au CATT seul s’est avéré comme la stratégie la plus efficiente pour le dépistage actif. Le gain marginal lorsque l’on ajoute la palpation ganglionnaire en parallèle est minime et n’est pas compensé par le coût élevé lié à un nombre important des suspects soumis aux tests parasitologiques. Les techniques de concentration ont une bonne sensibilité et leur faisabilité est acceptable. Leur ajout à l’arbre classique améliore la sensibilité de 29 % pour la CTC et de 42% pour la mAECT. Le coût de la CTC a été de 0,76 € et celui de la mAECT de 2,82 €. Le SF a été estimé très peu sensible. L’algorithme PG- GE-CTC-mAECT a été le plus efficient avec 277 € par vie sauvée et un ratio de coût-efficacité marginal de 125 € par unité de vie supplémentaire sauvée. L’algorithme PG-GE-CATT titration avec traitement des personnes avec une parasitologie négative mais un CATT positif à un seuil de 1/8 devient compétitif lorsque la prévalence de la THA est élevée. Il est donc possible dans le contexte actuel de réduire la prévalence de la THA mais à condition que les activités ne soient pas interrompues. Le recours à un algorithme recourant au CATT dans le dépistage actif et à la séquence PG-GE-CTC-mAECT est le plus efficient et une efficacité de 80%. La faisabilité et l’efficacité peut être différent d’un endroit à l’autre à cause de la focalisation de la THA. Il est donc nécessaire de réévaluer cet algorithme dans un autre foyer de THA en étude pilote avant de décider d’un changement de politique. Le recours à cet algorithme implique un financement supplémentaire et une volonté politique. SUMMARY Human African Trypanosomiasis (HAT) remains a major public health problem affecting several countries in sub-Saharan Africa. HAT control is essentially based on active case finding conducted by specialized mobile teams. In the past the population screening was based on neck gland palpation, but since the development of the Card Agglutination Test for Trypanosomiasis (CATT) three control options are available to the control program: i) neck gland palpation ii) CATT iii) neck gland palpation and CATT done in parallel . Certain programs such as the one in DRC opted for the latter, combining CATT and neck gland palpation. All persons having hypertrophy of the neck gland and/or a positive CATT test are considered to be a HAT suspect. Confirmation tests are necessary because the screening algorithms are not 100 % specific and HAT drugs are very toxic. The classic parasitological confirmation tests are lymph node puncture (LNP), fresh blood examination (FBE) and thick blood film (TBF). The sensitivity of this combination is considered insufficient by several authors and causes important losses of efficacy of the screening-treatment strategy. More sensitive concentration methods were developed such as the mini Anion Exchange Concentration Techniques (mAECT), Capillary Tube Centrifugation (CTC) and the Quantitative Buffy Coat (QBC), but they are not used on a routine basis. Main reasons put forward are low feasibility, high cost and long time of execution. In the Democratic Republic of Congo, HAT control activities were suddenly interrupted in 1990 and this led to an important re-emergence or the epidemic. Since 1998 onwards, control activities were financed again in a structured way. This works aims to be both a plea for the continuation of HAT control as well as a contribution to the rationalization of the control strategies. We analyzed the evolution of sleeping sickness in the light of its financing, and we studied its impact on the household and the community. We aimed at a rationalization of the use of the screening and confirmation tools. We first evaluated the validity of the tests, their feasibility and the cost and we did a formal decision analysis to compare screening and confirmation algorithms. The budget allocated to control activities was doubled during the period when structural aid funding was again granted (1998-2003) compared with the period before (1993-1997). The number of persons examined per year doubled as well but the number of cases found peaked at 26 000 in 1998 and dropped to 11 000 in the period afterwards. The cost per person examined was 1.5 US$ and per case detected and saved was 300 US$. The activities were financed for 95 % by external donors during this period. This subvention could give the impression that the impact of HAT on the household and the household was limited but when we took a closer look at this aspect we found that the cost at household level amounted to one month of income and that HAT caused the loss of 2145 DALYs in the community. The intervention consisting of active case finding and treatment allowed to save 1408 DALY’s at a cost of 17 US$ per DALY, putting the intervention in the class of “good value for money”. The use of CATT alone as screening test emerged as the most efficient strategy for active case finding. The marginal gain when neck gland palpation is added is minor and is not compensated by the high cost of doing the parasitological confirmation test on a high number of suspected cases. The concentration methods have a good sensitivity and acceptable feasibility. Adding them to the classical tree improves its sensitivity with 29 % for CTC and with 42 % for mAECT. The cost of CTC was 0.76 US$ and of mAECT was 2.82 US$. Sensitivity of fresh blood examination was poor. The algorithm LNP-TBF-CTC-mAECT was the most efficient costing 277 Euro per life saved and a marginal cost effectiveness ratio of 125 Euro per supplementary life saved. The algorithm LNP-TBF-CATT titration with treatment of persons with a negative parasitology but a CATT positive at a dilution of 1/8 and more becomes competitive when HAT prevalence is high. We conclude that it is possible in the current RDC context to reduce HAT prevalence on condition that control activities are not interrupted. Using an algorithm that includes CATT in active case finding and the combination LNP-TBF-CTC-mAECT is the most efficient with an efficacy of 80 %. Feasibility and efficacy may differ from one place to another because HAT is very focalized, so it is necessary to test this novel algorithm in another HAT focus on a pilot basis, before deciding on a policy change. Implementation of this algorithm will require additional financial resources and political commitment.

Το βακτήριο Wolbachia είναι ένα ενδοκυττάριο και μητρικά κληρονομούμενο συμβιωτικό βακτήριο. Ανήκει στην ομοταξία των Alphaproteobacteria και την τάξη των Rickettsiales. Αποτελεί ίσως τον πιο διαδεδομένο ενδοκυττάριο συμβιωτικό οργανισμό στον πλανήτη, καθώς έχει εντοπιστεί μέχρι στιγμής σε πληθώρα αρθροπόδων και νηματωδών της φιλαρίασης. Πρόσφατες μελέτες εκτιμούν ότι πάνω από το 40% των ειδών αρθροπόδων είναι μολυσμένα με το βακτήριο Wolbachia. Το συμβιωτικό αυτό βακτήριο επηρεάζει τις βιολογικές λειτουργίες και ιδιότητες των ξενιστών του και είναι υπεύθυνο για μια σειρά αναπαραγωγικών ανωμαλιών, όπως η κυτταροπλασματική ασυμβατότητα, η παρθενογένεση, η θανάτωση των αρσενικών εμβρύων και η θηλυκοποίηση. Τα μοναδικά αυτά βιολογικά χαρακτηριστικά του βακτηρίου Wolbachia προσελκύουν όλο και περισσότερο το ενδιαφέρον διαφόρων ερευνητών τόσο για το ρόλο του βακτηρίου σε εξελικτικές διαδικασίες (κυρίως ειδογένεση) όσο και για τη χρησιμοποίησή του σε περιβαλλοντικά φιλικές εφαρμογές καταπολέμησης οργανισμών που είναι επιβλαβείς στους τομείς του γεωργικού και δασικού περιβάλλοντος, και της υγείας. Τα είδη του γένους Glossina (Diptera: Glossinidae), γνωστά και ως μύγες τσε-τσε, αποτελούν ξενιστές του βακτηρίου Wolbachia. Η μύγα τσε-τσε είναι ο σημαντικότερος φορέας των παθογόνων τρυπανοσωμάτων στην τροπική Αφρική, τα οποία προκαλούν την ασθένεια του ύπνου (sleeping sickness) στον άνθρωπο και την αντίστοιχη τρυπανοσωμίαση, γνωστή ως nagana, στα ζώα. Η χρησιμοποίηση του βακτηρίου Wolbachia σε μεθόδους βιολογικής καταπολέμησης της μύγας τσε-τσε προαπαιτεί την πλήρη γνώση της γενετικής του ταυτότητας και των αλληλεπιδράσεων του με το ξενιστή. Προς την κατεύθυνση αυτή, και στα πλαίσια της παρούσας διατριβής, πραγματοποιήθηκε η ανίχνευση του συμβιωτικού βακτηρίου Wolbachia σε περισσότερα από 5300 άτομα από φυσικούς και εργαστηριακούς πληθυσμούς 11 διαφορετικών ειδών μύγας τσε-τσε από 13 Αφρικανικές χώρες. Τα αποτελέσματα έδειξαν τεράστια απόκλιση της παρουσίας του βακτηρίου τόσο μεταξύ ειδών όσο και μεταξύ πληθυσμών του ίδιου είδους. Επίσης, πραγματοποιήθηκε ο γενετικός χαρακτηρισμός των στελεχών Wolbachia από συνολικά 29 αντιπροσωπευτικά δείγματα διαφόρων πληθυσμών και ειδών μύγας τσε-τσε, ενώ σε αρκετά από αυτά παρατηρήθηκαν πολλαπλά στελέχη του βακτηρίου. Διαπιστώθηκε εντυπωσιακή γενετική ποικιλότητα στελεχών Wolbachia που απαντούν στα διάφορα είδη μύγας τσε-τσε καθώς και ασυμφωνία μεταξύ των φυλογενειών των στελεχών Wolbachia και των μυγών τσε-τσε ξενιστών της, γεγονός που σημαίνει οριζόντια μετακίνηση του συμβιωτικού βακτηρίου κατά την εξέλιξη. Επιπρόσθετα, εντοπίστηκαν για πρώτη φορά εκτεταμένα γεγονότα οριζόντιας μεταφοράς βακτηριακών γονιδίων στο γονιδίωμα τριών ειδών μύγας τσε-τσε: στο Glossina morsitans morsitans, Glossina pallidipes και Glossina austeni. Από εξελικτικής σκοπιάς, κρίσιμα ερωτήματα προκύπτουν από τα παραπάνω ευρήματα, και πιο συγκεκριμένα σχετικά με: την προέλευση-μηχανισμό αυτών των γεγονότων οριζόντιας μεταφοράς, τον χρονικό προσδιορισμό τους, τον πιθανό ρόλο τους σε διαδικασίες ειδογένεσης και την επιλεκτική εμφάνισή τους σε ορισμένα μόνο είδη Glossina π.χ. στo υποείδos Glossina morsitans centralis που είναι πολύ συγγενικό του Glossina morsitans morsitans δεν παρατηρήθηκε το φαινόμενο. Εξίσου σημαντική και επιβεβλημένη κρίνεται η διεξοδική διερεύνηση του ενδεχομένου τα βακτηριακά γονίδια που ενσωματώθηκαν στο ευκαρυωτικό γονιδίωμα της μύγας τσε-τσε να ευθύνονται για την έκφραση νέων λειτουργιών-ιδιοτήτων (ή να μεταβάλλουν τις ήδη υπάρχουσες), ιδίως μάλιστα εάν αυτές συνδέονται με την αποδοτικότητα μετάδοσης της νόσου της τρυπανοσωμίασης μέσω του φορέα της, δηλαδή της μύγας τσε-τσε. Τέλος, διαπιστώθηκε πιθανή αρνητική συσχέτιση της παρουσίας του βακτηρίου Wolbachia με τον παθογόνο ιό Salivary Gland hypertrophy Virus (SGHV), γεγονός που συζητείται στα πλαίσια βιολογικών εφαρμογών καταπολέμησης του εντόμου-φορέα και της τρυπανοσωμίασης. Παράλληλα, μεγάλο ενδιαφέρον παρουσιάζει η προοπτική χρησιμοποίησης του βακτηρίου Wolbachia για τη βιολογική καταπολέμηση εντόμων αγροτικής ή /και περιβαλλοντικής σημασίας, όπως είναι οι αφίδες και η καρπόκαψα καστανιάς. Το γεγονός αυτό προϋποθέτει την ανίχνευση και τη γενετική ταυτοποίηση του βακτηρίου σε φυσικούς πληθυσμούς εντόμων. Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής πραγματοποιήθηκε ανίχνευση και χαρακτηρισμός του βακτηρίου Wolbachia σε 78 συνολικά άτομα από 22 είδη αφίδων, από 26 φυσικούς πληθυσμούς από την Ελλάδα. Από αυτούς τους 26 πληθυσμούς, μόλις οι 4 βρέθηκαν να είναι μολυσμένοι με το βακτήριο Wolbachia και συγκεκριμένα πληθυσμοί των ειδών: Aphis fabae, Aphis hederae, Metopolophium dirhodum και Baizongia pistaciae. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν για πρώτη φορά ότι η παρουσία του βακτηρίου Wolbachia στις αφίδες είναι πιθανά πιο διαδεδομένη από ότι προέκυπτε από προηγούμενες μελέτες. Επίσης, μελετήθηκε η ανίχνευση και ο χαρακτηρισμός του βακτηρίου Wolbachia στα είδη Cydia splendana, Cydia fagiglandana και Pammene fasciana. Το βακτήριο Wolbachia ανιχνεύθηκε για πρώτη φορά στα συγκεκριμένα είδη και μάλιστα διαπιστώθηκε ότι η συχνότητα εμφάνισής του ποικίλει τόσο μεταξύ των δύο ειδών Cydia όσο και μεταξύ των πληθυσμών του κάθε είδους. Στο είδος Pammene fasciana, το βακτήριο ανιχνεύθηκε σε όλα τα άτομα που μελετήθηκαν. Τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής συζητούνται από τη σκοπιά τόσο της οικολογικής και εξελικτικής σημασίας τους όσο και της προοπτικής χρησιμοποίησης του συμβιωτικού βακτηρίου Wolbachia για τον πληθυσμιακό έλεγχο επιβλαβών εντόμων όπως οι μύγες τσε-τσε, οι αφίδες και η καρπόκαψα καστανιάς. / Wolbachia is an intracellular and maternally inherited symbiotic bacterium that belongs to the class of Alphaproteobacteria and the order of Rickettsiales. It is the most ubiquitous intracellular symbiotic organism of the planet, since it has been estimated that over 40% of insect species, in addition to filarial nematodes, crustaceans, and arachnids are infected with Wolbachia. In arthropods Wolbachia affects the biological functions and properties of its hosts and it is responsible for a number of reproductive abnormalities, such as cytoplasmic incompatibility (CI), thelytokous parthenogenesis, feminization of genetic males and male killing. These unique biological characteristics of Wolbachia are attracting the interest of various researchers for: (a) decyphering the role of Wolbachia in evolutionary processes (mainly speciation), and (b) for its use in environmentally friendly applications for the control of agricultural pests and disease vectors. The species of genus Glossina (Diptera: Glossinidae) known as tsetse flies, have been found to be infected with Wolbachia. Tsetse flies are the sole vectors of pathogenic trypanosomes in tropical Africa, causing the “sleeping sickness” in humans and the “nagana” in animals. The potential use of Wolbachia for the control of tsetse flies, prerequisite a thorough knowledge of its genetic identity and the interactions with the host. To further characterize the prevalence of Wolbachia in tsetse flies an extensive screen of more than 5300 specimens from natural and laboratory populations of 11 different Glossina species originating from 13 African countries was carried out. Our results indicated a huge divergence in the prevalence of Wolbachia, both among the species and among populations of the same species. Further characterization by MLST and wsp genotyping was carried out for the Wolbachia strains of 29 representative populations and species of tsetse flies. An impressive genetic diversity of Wolbachia strains in tsetse flies was revealed. Interestingly, disconcordance between the phylogeny of Wolbachia and that of the tsetse flies was observed, suggesting horizontal transmission of Wolbachia during the evolution. Moreover, extended horizontal gene transfer events were detected for first time in Glossina morsitans morsitans, Glossina pallidipes και Glossina austeni. These results raise critical questions concerning: (a) the origin/mechanism of these horizontal gene transfer events, (b) their temporal determination, (c) their potential role as agents of speciation and (d) their selective appearance in only some Glossina species e.g in the subspecies Glossina morsitans centralis which is closely related with Glossina morsitans morsitans the phenomenon was not observed. Equally important will be to examine if genes from the chromosomal insertions were potentially expressed and examine if these genes are associated with the vectorial capacity of tsetse flies for the trypanosoma transmission. Finally, a negative correlation between the presence of Wolbachia with the Salivary Gland Hypertrophy Virus (SGHV) was identified. This is further discussed in the context of biological applications for control of tsetse fly-vector and trypanosomiasis. Finally in this thesis, the detection and characterization of Wolbachia in 78 specimens of 22 aphids species, from 26 natural populations, from Greece was examined. Only 4 out of 26 populations were found to be infected with Wolbachia, and specifically the species: Aphis fabae, Aphis hederae, Metopolophium dirhodum και Baizongia pistaciae. These results indicated that the presence of Wolbachia in aphids is probably more prevalent than it was derived from previous studies. Also, detection and characterization of Wolbachia in the Cydia splendana, Cydia fagiglandana and Pammene fasciana was carried out. Wolbachia was detected for first time in these species, and it was found that the prevalence of Wolbachia varies between the two species of Cydia and among populations of each species, with the infection in Pammene fasciana being fixed. At the end the ecological and evolutionary importance of Wolbachia, together with the use of the bacterium for the population control of harmful insects like tsetse flies, aphids and moths is further discussed.

RESUME<p>La Trypanosomiase Humain Africaine (THA) demeure un problème de santé publique pour plusieurs pays en Afrique subsaharienne. Le contrôle de la THA est basé essentiellement sur la stratégie de dépistage actif suivi du traitement des personnes infectées. Le dépistage actif est réalisé par des unités mobiles spécialisées, bien que les services de santé fixes jouent un rôle important en détectant « passivement » des cas. Le dépistage reposait jadis sur la palpation ganglionnaire mais, depuis le développement du test d’agglutination sur carte (CATT), trois possibilités se sont offertes aux programmes de contrôle à savoir: i) continuer avec la palpation ganglionnaire ii) combiner la palpation ganglionnaire avec le CATT iii) recourir au CATT seul. Certains programmes comme celui de la République Démocratique du Congo (RDC) ont opté pour la combinaison en parallèle de la palpation ganglionnaire avec le CATT. Toute personne ayant une hypertrophie ganglionnaire cervicale et/ou un CATT positif est considéré comme suspecte de la THA. Elle sera soumise aux tests parasitologiques de confirmation à cause de la toxicité des médicaments anti-THA. Les tests parasitologiques classiques sont l’examen du suc ganglionnaire (PG), l’examen du sang à l’état frais (SF), la goutte épaisse colorée (GE). La sensibilité de cette séquence a été estimée insuffisante par plusieurs auteurs et serait à la base d’une grande perte de l’efficacité de la stratégie dépistage-traitement. D’autres techniques de concentration ont été développées comme la mini-Anion Exchange Concentration Technique (mAECT), la Centrifugation en Tube Capillaire (CTC) et le Quantitative Buffy Coat (QBC), mais ces techniques de concentration ne sont pas utilisées en routine. <p>En RDC, une interruption des activités de contrôle en 1990 a eu comme conséquence une réémergence importante de la maladie du sommeil. Depuis 1998 les activités de contrôle ont été refinancées de manière structurée. <p>Ce travail vise deux buts à savoir le plaidoyer pour la continuité des activités de contrôle et la rationalisation des stratégies de contrôle. Nous avons évalué l’évolution de la maladie du sommeil en rapport avec le financement, son impact sur les ménages ainsi que la communauté. L’exercice de rationalisation a porté sur les outils de dépistage et de confirmation. Nous avons d’abord évalué la validité des tests, leur faisabilité ainsi que les coûts et ensuite nous avons effectué une analyse décisionnelle formelle pour comparer les algorithmes de dépistage et pour les tests de confirmation.<p>Pendant la période de refinancement structurel de la lutte contre la THA en RDC (1998-2003), le budget alloué aux activités a été doublé lorsqu’on le compare à la période précédente (1993-1997). Le nombre des personnes examinées a aussi doublé mais par contre le nombre des nouveaux cas de THA est passé d’un pic de 26 000 cas en 1998 à 11 000 en 2003. Le coût par personne examinée a été de 1,5 US$ et celui d’un cas détecté et sauvé à 300 US$. Pendant cette période, les activités ont été financées par l’aide extérieure à plus de 95%. Cette subvention pourrait laisser supposer que l’impact de la THA au niveau des ménages et des communautés est réduit mais lorsque nous avons abordé cet aspect, il s’est avéré que le coût de la THA au niveau des ménages équivaut à un mois de leur revenu et que la THA fait perdre 2145 DALYs dans la communauté. L’intervention par la stratégie de dépistage-traitement a permis de sauver 1408 DALYs à un coût de 17 US$ par DALYs sauvé. Ce coût classe l’intervention comme « good value for money ».<p>Le recours au CATT seul s’est avéré comme la stratégie la plus efficiente pour le dépistage actif. Le gain marginal lorsque l’on ajoute la palpation ganglionnaire en parallèle est minime et n’est pas compensé par le coût élevé lié à un nombre important des suspects soumis aux tests parasitologiques. Les techniques de concentration ont une bonne sensibilité et leur faisabilité est acceptable. Leur ajout à l’arbre classique améliore la sensibilité de 29 % pour la CTC et de 42% pour la mAECT. Le coût de la CTC a été de 0,76 € et celui de la mAECT de 2,82 €. Le SF a été estimé très peu sensible. L’algorithme PG- GE-CTC-mAECT a été le plus efficient avec 277 € par vie sauvée et un ratio de coût-efficacité marginal de 125 € par unité de vie supplémentaire sauvée. L’algorithme PG-GE-CATT titration avec traitement des personnes avec une parasitologie négative mais un CATT positif à un seuil de 1/8 devient compétitif lorsque la prévalence de la THA est élevée.<p>Il est donc possible dans le contexte actuel de réduire la prévalence de la THA mais à condition que les activités ne soient pas interrompues. Le recours à un algorithme recourant au CATT dans le dépistage actif et à la séquence PG-GE-CTC-mAECT est le plus efficient et une efficacité de 80%. La faisabilité et l’efficacité peut être différent d’un endroit à l’autre à cause de la focalisation de la THA. Il est donc nécessaire de réévaluer cet algorithme dans un autre foyer de THA en étude pilote avant de décider d’un changement de politique. Le recours à cet algorithme implique un financement supplémentaire et une volonté politique. <p><p><p>SUMMARY<p>Human African Trypanosomiasis (HAT) remains a major public health problem affecting several countries in sub-Saharan Africa. HAT control is essentially based on active case finding conducted by specialized mobile teams. In the past the population screening was based on neck gland palpation, but since the development of the Card Agglutination Test for Trypanosomiasis (CATT) three control options are available to the control program: i) neck gland palpation ii) CATT iii) neck gland palpation and CATT done in parallel .Certain programs such as the one in DRC opted for the latter, combining CATT and neck gland palpation. All persons having hypertrophy of the neck gland and/or a positive CATT test are considered to be a HAT suspect. Confirmation tests are necessary because the screening algorithms are not 100 % specific and HAT drugs are very toxic. The classic parasitological confirmation tests are lymph node puncture (LNP), fresh blood examination (FBE) and thick blood film (TBF). The sensitivity of this combination is considered insufficient by several authors and causes important losses of efficacy of the screening-treatment strategy. More sensitive concentration methods were developed such as the mini Anion Exchange Concentration Techniques (mAECT), Capillary Tube Centrifugation (CTC) and the Quantitative Buffy Coat (QBC), but they are not used on a routine basis. Main reasons put forward are low feasibility, high cost and long time of execution. <p>In the Democratic Republic of Congo, HAT control activities were suddenly interrupted in 1990 and this led to an important re-emergence or the epidemic. Since 1998 onwards, control activities were financed again in a structured way.<p>This works aims to be both a plea for the continuation of HAT control as well as a contribution to the rationalization of the control strategies. We analyzed the evolution of sleeping sickness in the light of its financing, and we studied its impact on the household and the community. We aimed at a rationalization of the use of the screening and confirmation tools. We first evaluated the validity of the tests, their feasibility and the cost and we did a formal decision analysis to compare screening and confirmation algorithms. <p>The budget allocated to control activities was doubled during the period when structural aid funding was again granted (1998-2003) compared with the period before (1993-1997). The number of persons examined per year doubled as well but the number of cases found peaked at 26 000 in 1998 and dropped to 11 000 in the period afterwards. The cost per person examined was 1.5 US$ and per case detected and saved was 300 US$. The activities were financed for 95 % by external donors during this period. This subvention could give the impression that the impact of HAT on the household and the household was limited but when we took a closer look at this aspect we found that the cost at household level amounted to one month of income and that HAT caused the loss of 2145 DALYs in the community. The intervention consisting of active case finding and treatment allowed to save 1408 DALY’s at a cost of 17 US$ per DALY, putting the intervention in the class of “good value for money”. <p>The use of CATT alone as screening test emerged as the most efficient strategy for active case finding. The marginal gain when neck gland palpation is added is minor and is not compensated by the high cost of doing the parasitological confirmation test on a high number of suspected cases. The concentration methods have a good sensitivity and acceptable feasibility. Adding them to the classical tree improves its sensitivity with 29 % for CTC and with 42 % for mAECT. The cost of CTC was 0.76 US$ and of mAECT was 2.82 US$. Sensitivity of fresh blood examination was poor. The algorithm LNP-TBF-CTC-mAECT was the most efficient costing 277 Euro per life saved and a marginal cost effectiveness ratio of 125 Euro per supplementary life saved. The algorithm LNP-TBF-CATT titration with treatment of persons with a negative parasitology but a CATT positive at a dilution of 1/8 and more becomes competitive when HAT prevalence is high. <p>We conclude that it is possible in the current RDC context to reduce HAT prevalence on condition that control activities are not interrupted. Using an algorithm that includes CATT in active case finding and the combination LNP-TBF-CTC-mAECT is the most efficient with an efficacy of 80 %. Feasibility and efficacy may differ from one place to another because HAT is very focalized, so it is necessary to test this novel algorithm in another HAT focus on a pilot basis, before deciding on a policy change. Implementation of this algorithm will require additional financial resources and political commitment.<p><p> / Doctorat en Sciences de la santé publique / info:eu-repo/semantics/nonPublished