CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Foram investigados os efeitos do veneno da serpente Bothrops insularis e de suas fraÃÃes, lectina, L-aminoÃcido oxidase, trombina sÃmile e fosfolipase A2, no rim isolado e sistema vascular de rato. As fraÃÃes foram purificadas a partir de uma combinaÃÃo de procedimentos cromatogrÃficos, usando colunas de HPLC de exclusÃo molecular, troca iÃnica, fase reversa e colunas de baixa pressÃo de afinidade. Foi utilizada a perfusÃo de rim isolado de rato e a soluÃÃo de Krebs-Henseleit modificada (Bowman, 1970; Fonteles et al. 1998). ParÃmetros selecionados da funÃÃo renal foram avaliados durante as condiÃÃes experimentais, com a infusÃo do veneno e suas fraÃÃes, aos 60, 90, e 120 minutos. Os primeiros 30 minutos serviram de controle interno. No leito arterial sistÃmico de rato (Ferreira, 1965) a pressÃo arterial foi avaliada por manÃmetro conectado por cÃnula à artÃria carÃtida comum, e o veneno injetado na veia jugular. Os registros foram realizados a cada 10 minutos apÃs a administraÃÃo de doses crescentes do veneno, atà a infusÃo da dose de 300mcg, aos 60 minutos. Na PerfusÃo do leito arterial mesentÃrico isolado de rato (McGregor, 1965), utilizou-se a soluÃÃo de Krebs-Henseleit em fluxo constante de 4mL/minuto. A pressÃo de perfusÃo foi registrada manometricamente. A avaliaÃÃo estatÃstica foi determinada por anÃlise de variÃncia (ANOVA) e teste de Bonferroni, com nÃvel de significÃncia menor de 5%. No rim, o grupo tratado com o veneno apresentou reduÃÃo em todos os parÃmetros avaliados, com exceÃÃo da absorÃÃo de potÃssio. Com a lectina a pressÃo de perfusÃo aumentou inicialmente e caiu em seguida, juntamente com o fluxo urinÃrio e o ritmo de filtraÃÃo glomerular. Houve aumento na reabsorÃÃo de sÃdio e potÃssio, com reduÃÃo no clearance osmÃtico. Com a trombina-sÃmile, ocorreu aumento inicial seguido de queda no final em quase todos os parÃmetros, com exceÃÃo da resistÃncia vascular renal. A reabsorÃÃo tubular do sÃdio e do cloro caiu; houve elevaÃÃo inicial do transporte de potÃssio; com aumento seguido de queda do clearance osmÃtico. Com a L-aminoacido oxidase houve queda em todos os parÃmetros avaliados. Com a fosfolipase A2 houve elevaÃÃo nos parÃmetros fisiolÃgicos e vasculares; no transporte tubular de potÃssio e no clearance osmÃtico; com queda na reabsorÃÃo de sÃdio e cloro. Todos os rins mostraram, no final, sinais de necrose tubular aguda, com exceÃÃo dos perfundidos com a trombina-sÃmile. Excetuando os tratados com veneno, todos os rins apresentaram, ao final, extravasamento protÃico para o espaÃo de Bowman. No leito arterial sistÃmico o veneno produziu reduÃÃo na pressÃo arterial sistÃmica diretamente proporcional à quantidade de veneno administrada, excetuando a dose de 10mcg, alÃm de intensa hemorragia pulmonar com proliferaÃÃo de neutrÃfilos e linfÃcitos nos alvÃolos, hemorragia no rim e congestÃo generalizada. No leito arterial mesentÃrico se observou uma reduÃÃo na presÃo quando o veneno foi administrado em leito arterial prÃ-contraÃdo com fenilefrina, como tambÃm isoladamente, na ausÃncia de fenilefrina. O veneno da Bothrops insularis mostrou potencial hemorrÃgico e vasodilatador semelhante aos outros venenos de serpentes do gÃnero, com atividade necrotizante superior nos rins, onde provocou necrose tubular aguda, ao contrario do observado com outros venenos do mesmo gÃnero, em experimentos no rim isolado de rato. / We investigated the biochemical and biological effects of the whole venom from Bothrops insularis (popularly known as âgolden lancetâ), and four of its fractions, a thrombin-like enzyme, a lectin-like substance, an L-amino acid oxidase and a phospholipase A2, in perfused rat kidneys and vascular sistem. The fractions were purified by a combination of Sephadex gel filtration in HPLC columns, and ion-exchange chromatography on DEAE-Sephadex in reverse phase, low-pressure affinity columns. We used a modified isolated perfused rat kidney assay, with Krebs-Henseleit solution as the perfusion fluid (Bowman, 1970; Fonteles et al., 1998). Selected parameters of renal function during stable experimental conditions were evaluated before and at 60, 90, and 120 minutes after infusion of venom and its fractions, with the first 30 minutes interval constituting the paired control. In the systemic vascular bed (Ferreira, 1965), the arterial pressure was evaluated by a manometer connected through a canule to carotid common artery and the venom was injected into the jugular vein, with registers made at every 10 minutes after administration in increasing doses, until an infusion of 300mcg was reached at 60 minutes. In the isolated rat mesenteric blood vessels method (McGregor, 1965), the perfusions were done with Krebs-Henseleit solution, at a constant flow rate of 4mL/minute. The perfusion pressure was measured manometrically. Statistical evaluations were performed by analysis of variance (ANOVA) and Bonferroni test, at the 5% significance level. In perfused kidney studies, the group treated with the whole venom showed a fall in all physiological parameters, except in potassium transport. With the lectin-like fraction, the perfusion pressure rose initially, followed by a fall, along with urinary flow and glomerular filtration rate. Sodium and potassium tubular reabsorption increased, with a fall in the osmotic clearance. The thrombin-like fraction promoted an initial rise followed by a fall in the end, in almost all parameters except in the renal vascular resistance. The sodium and chloride tubular reabsorption fell. There was an initial rise in the potassium transport, and an initial rise followed by a fall in the osmotic clearance. With the L-amino acid oxidase fraction, there was a fall in all the parameters studied. The Phospholipase A2 fraction induced a rise in the physiological and vascular parameters, as also in the potassium transport and osmotic clearance; accompanied by a fall in sodium and chloride reabsorption. With the exception of the thrombin-like fraction, all the substances tested induced acute tubular necrosis in perfused kidneys in the end. Protein extravasation into the Bowman space was evidenced in all perfused kidneys except in those treated with the whole venom; but was more intense with the thrombin-like fraction. In the systemic arterial bed, the whole venom raised arterial pressure in a dose-dependant manner, except at the concentration of 10mcg; in addition to causing intense pulmonary hemorrhage with neutrophils and alveolar lymphocyte proliferation, renal hemorrhage, and generalized vascular dilatation and congestion. In the isolated mesenteric artery, there was a marked fall in perfusion pressure when the whole venom was infused into the vessel pre-contracted with phenillephrine, as also in the isolated vessel without phenillephrine. We conclude that Bothrops insularis venom shows vasodilatation and hemorrhagic potential, like other venoms of the genus; but, different from other Bothrops venoms, it also reveals a significant necrotic activity when perfused into isolated rat kidney, causing acute tubular necrosis,

Os envenenamentos ofídicos constituem um problema relevante de saúde pública em diversas regiões do mundo, particularmente em países da zona tropical e neotropical. A fisiopatologia do acidente ofídico é constituída por uma série de eventos complexos tanto a nível local quanto sistêmico, e o soro antiofídico é o único tratamento utilizado. No entanto, os efeitos tóxicos locais induzidos durante o envenenamento por serpentes, principalmente do gênero Bothrops, não são eficientemente neutralizados pela soroterapia tradicional. Por esta razão, procuram-se alternativas complementares, como as plantas medicinais antiofídicas que são usadas por comunidades que não têm acesso a soroterapia. A flora brasileira possui uma ampla variedade de plantas medicinais com potencial antiofídico, as quais têm sido pouco estudadas cientificamente. Neste estudo foram realizados ensaios in vitro e in vivo de neutralização de peçonhas ofídicas com o extrato aquoso das entrecascas de Anacardium humile (EAAh), e, o isolamento e a caracterização fitoquímica de um inibidor de miotoxinas, o ácido gálico (AG). Para os ensaios de inibição, foram utilizadas soluções contendo peçonha bruta ou toxina isolada misturadas com diferentes quantidades de extrato vegetal que foram previamente incubadas por 30 min a 37°C. Também foi realizada administração do extrato após o envenenamento em diferentes intervalos de tempo para os testes de inibição da miotoxicidade. Observou-se que EAAh tem atividade inibitória sobre os efeitos tóxicos (letalidade, miotoxicidade, e hemorragia) e farmacológicos/enzimáticos (edema, atividade fosfolipásica e coagulante) induzidos pelas peçonhas de serpentes dos gêneros Bothrops, Crotalus, Lachesis e das toxinas isoladas. O extrato vegetal inibiu 100% a letalidade induzida pela peçonha de C. d. terrificus e sua principal neurotoxina, a crotoxina. O EAAh foi submetido a fracionamento cromatográfico analítico, e em condições polares foi possível identificar e isolar o ácido gálico, o qual demonstrou tempo de retenção e espectros de ressonância magnética nucleares similares ao padrão comercial e a dados de literatura deste mesmo composto, respectivamente. O ácido gálico isolado foi capaz de inibir a atividade miotóxica induzida pela peçonha bruta de B. jararacussu e sua principal miotoxina, a bothropstoxina-I, uma PLA2-símile Lys49. A análise dos espectros de dicroísmo circular e os estudos de interação por modelagem molecular sugerem que o ácido gálico forma um complexo com a BthTX-I de B. jararacussu em seu sítio ativo, inibindo sua atividade tóxica. A ligação do ácido gálico com as miotoxinas não modificou nem a forma e nem a intensidade dos espectros de dicroísmo circular, não induzindo alterações significativas na porcentagem dos diversos domínios que constituem a estrutura secundária destas proteínas. O ácido gálico assim como outros taninos, tem revelado-se um bom inibidor das ações tóxicas de peçonhas de serpentes e está relacionado com a ação inibitória do extrato de Anacardium humile. / Ophidian envenomations are a significant problem of public health in several regions of the world, particularly in tropical and neotropical countries. The pathophysiology of snakebite accidents is constituted by a complex series of events both locally and systemically, and the antivenom serum is the only treatment used. However, local toxic effects induced during envenomation by snakes, especially from the genus Bothrops, are not effectively neutralized by the traditional serum therapy. For this reason, additional alternatives are made necessary, such as the use of medicinal plants that are used by communities with no access to serum therapy. The Brazilian flora possesses a wide variety of medicinal plants with antiophidian potential, which have been little-studied scientifically. In the present study, we performed in vitro and in vivo neutralization of snake venoms with the aqueous extract of inner bark of Anacardium humile (EAAh), and the isolation and phytochemical characterization of an inhibitor of myotoxins, the gallic acid (GA). For the inhibition assays, we used solutions containing crude venom or isolated toxin mixed with different amounts of plant extracts that were previously incubated for 30 min at 37°C. Administration of the extract after envenomation was also performed at different time intervals for myotoxicity inhibition assays. It was observed that EAAh has inhibitory activity against the toxic (lethality, myotoxicity and hemorrhage) and pharmacological/enzymatic effects (edema-inducing, coagulant and phospholipase activities) induced by snake venoms of the genera Bothrops, Crotalus, Lachesis and isolated toxins. The plant extract inhibited 100% of the lethality induced by C. d. terrificus venom and its major neurotoxin, crotoxin. The EAAh was subjected to analytical chromatographic separation, and in polar conditions, it was possible to identify and isolate the gallic acid, which showed retention time and nuclear magnetic resonance spectra similar to the commercial standard and to literature data of this same compound, respectively. Gallic acid alone was able to inhibit the myotoxic activity induced by crude venom of B. jararacussu and its main myotoxin, BthTX-I, a Lys49 PLA2-like enzyme. The analysis of circular dichroism spectra and interaction studies by molecular modeling suggest that gallic acid forms a complex with BthTX-I in its active site, which inhibits its toxic activity. The binding of gallic acid to myotoxins did not change neither the form nor the intensity of circular dichroism spectra, not inducing significant changes in the percentage of the various domains that form the secondary structure of these proteins. The gallic acid and other tannins have been showed to be good inhibitors of the toxic effects of snake venoms, and our study showed that this acid is related to the inhibitory action of the Anacardium humile extract.

Orientadores: Sergio Marangoni, Luís Alberto Ponce Soto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-19T22:23:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ValerianoZapana_JoseAntonio_M.pdf: 9614816 bytes, checksum: f7fe976f2fbaf3eab37af937d9930859 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: No presente trabalho, uma nova serinoprotease com atividade trombina "like" do veneno de Bothrops andianus (TLBan), serpente dos Andes do Perú, foi isolada mediante duas etapas: cromatografia de exclusão molecular G-75 e cromatografia líquida em HPLC de fase reversa; com um alto grau de pureza e homogeneidade molecular. Através da eletroforese em SDS-PAGE a TLBan mostrou ter uma massa relativa de 29 kDa sob condições redutoras e 26 kDa em condições não redutoras que foi confirmada com exatidão pela espectrometria de massa MALDI-TOF com uma massa molecular de 25 835,65 Da, após de ser submetida à glicosilação com a PNGase F e a neuraminidase, a massa relativa de TLBan diminuiu a 22 kDa e 25 kDa, respectivamente. Os estudos da atividade cinética mostraram que a serinoprotease com atividade trombina "like" possui um comportamento michaeliano frente ao substrato DL-BApNA, registrando as constantes cinéticas de Vmax = 5.4 x 10-1 nmoles p-NA/min e Km = 7.9 x 10-1 mM apresentou ser estável entre 25 ºC e 60 ºC e na faixa de pH entre 4 e 10. Na presença de diferentes íons (Mg2+, Ca2+, Mn2+, Cd2+ e Zn2+) e inibidores (PMSF, EDTA e SBTI), sua atividade proteolítica e fibrinogenolítica foi mantida, com exceção para os íons Cd2+, Zn2+ e inibidor PMSF. TLBan foi capaz de evidenciar sua atividade fibrinogenolítica frente ao fibrinogênio bovino, hidrolisado a cadeia alfa ('alfa') e beta ('beta'), comportando-se como uma trombina "like" de tipo venobim AB, apresentou um IC de 144,93 s-1, uma dose mínima coagulante (DMC) de 1,33 ± 0,25 ?g/mL e induz á agregação plaquetária. A caracterização estrutural de TLBan foi determinada por sua massa molecular via espectrometria de massa. A análise estrutural da sequência foi deduzida utilizando a base de dados: http://www.expasy.ch/sprot/, com a ajuda da sequência dos peptídeos trípticos, mostrando uma alta homologia seqüêncial dos aminoácidos com outras serinoproteases de veneno de serpente. Sua cadeia polipeptídica da TLBan mostrou a presença da tríade catalítica nas posições de His (44), Asp (90) e Ser (185). A reprodutibilidade da atividade biológica por meio dos efeitos farmacológicos só é possível com a utilização de frações quimicamente homogêneas para manter a integridade da molécula. Essas frações são obtidas com metodologias de alta eficiência: HPLC e espectrometria de massa. Os resultados podem ser associados com sua atividade biológica, eliminando a subjetividade causada pelo veneno ou frações impuras. Este tipo de abordagem será aplicado para pautar os estudos bioquímicos, estrutura-função, fisiológico e farmacológico; pode ainda revelar mecanismos desconhecidos na relação estrutura-função da serinoprotease com atividade trombina "like" do veneno de serpente. No caso da serpente Bothrops andianus, são valorizados os estudos devido ao fato de não haver trabalhos realizados, provavelmente pelo fato de tratar-se de uma espécie ainda não estudada, mas que tem interesse para o campo científico no campo da venômica / Resumo: No presente trabalho, uma nova serinoprotease com atividade trombina "like" do veneno de Bothrops andianus (TLBan), serpente dos Andes do Perú, foi isolada mediante duas etapas: cromatografia de exclusão molecular G-75 e cromatografia líquida em HPLC de fase reversa; com um alto grau de pureza e homogeneidade molecular. Através da eletroforese em SDS-PAGE a TLBan mostrou ter uma massa relativa de 29 kDa sob condições redutoras e 26 kDa em condições não redutoras que foi confirmada com exatidão pela espectrometria de massa MALDI-TOF com uma massa molecular de 25 835,65 Da, após de ser submetida à glicosilação com a PNGase F e a neuraminidase, a massa relativa de TLBan diminuiu a 22 kDa e 25 kDa, respectivamente. Os estudos da atividade cinética mostraram que a serinoprotease com atividade trombina "like" possui um comportamento michaeliano frente ao substrato DL-BApNA, registrando as constantes cinéticas de Vmax = 5.4 x 10-1 nmoles p-NA/min e Km = 7.9 x 10-1 mM apresentou ser estável entre 25 ºC e 60 ºC e na faixa de pH entre 4 e 10. Na presença de diferentes íons (Mg2+, Ca2+, Mn2+, Cd2+ e Zn2+) e inibidores (PMSF, EDTA e SBTI), sua atividade proteolítica e fibrinogenolítica foi mantida, com exceção para os íons Cd2+, Zn2+ e inibidor PMSF. TLBan foi capaz de evidenciar sua atividade fibrinogenolítica frente ao fibrinogênio bovino, hidrolisado a cadeia alfa ('alfa') e beta ('beta'), comportando-se como uma trombina "like" de tipo venobim AB, apresentou um IC de 144,93 s-1, uma dose mínima coagulante (DMC) de 1,33 ± 0,25 ?g/mL e induz á agregação plaquetária. A caracterização estrutural de TLBan foi determinada por sua massa molecular via espectrometria de massa. A análise estrutural da sequência foi deduzida utilizando a base de dados: http://www.expasy.ch/sprot/, com a ajuda da sequência dos peptídeos trípticos, mostrando uma alta homologia seqüêncial dos aminoácidos com outras serinoproteases de veneno de serpente. Sua cadeia polipeptídica da TLBan mostrou a presença da tríade catalítica nas posições de His (44), Asp (90) e Ser (185). A reprodutibilidade da atividade biológica por meio dos efeitos farmacológicos só é possível com a utilização de frações quimicamente homogêneas para manter a integridade da molécula. Essas frações são obtidas com metodologias de alta eficiência: HPLC e espectrometria de massa. Os resultados podem ser associados com sua atividade biológica, eliminando a subjetividade causada pelo veneno ou frações impuras. Este tipo de abordagem será aplicado para pautar os estudos bioquímicos, estrutura-função, fisiológico e farmacológico; pode ainda revelar mecanismos desconhecidos na relação estrutura-função da serinoprotease com atividade trombina "like" do veneno de serpente. No caso da serpente Bothrops andianus, são valorizados os estudos devido ao fato de não haver trabalhos realizados, provavelmente pelo fato de tratar-se de uma espécie ainda não estudada, mas que tem interesse para o campo científico no campo da venômica / Abstract: In this word, a new serine protease with thrombin "like" activity the venom of Bothrops andianus (TLBan), snake of the Andes of Peru, was isolated by two steps: molecular exclusion chromatography G-75 and liquid chromatography in reversed-phase HPLC; with a high degree of purity and molecular homegenidade. Through of electrophoresis on SDS-PAGE shows the TLBan have a relative mass of 29 kDa under reducing conditions and 26 kDa in reducing conditions that was not confirmed for precision by mass spectrometry MALDI-TOF, with a molecular mass of 25 835.65 Da after when was sometida a desglycosilation with PNGase F and neuraminidase, The TLBan relative mass decreased 22 kDa and 25 kDa, respectively. The kinetic studies of the activity showed that the serine protease thrombin "like" activity features a opposite behavior michaeliano substrate DL-BApNA, recording the kinetic constants of Vmax = 5.4 x 10-1 nmol p-NA/min and Km = 7.9 x 10 -1 mM had to be stable between 25 ° C and 60 ° C and at pH between 4 and 10. In the presence of different ions (Mg2 +, Ca2 +, Mn2 +, Cd2 + and Zn2 +) and inhibitors (PMSF, EDTA and SBTI), its proteolytic activity and fibrinogenolítica was maintained, except for the ions Cd2 +, Zn2 + and inhibitor PMSF. TLBan was able to enhance its activity against the fibrinogen fibrinogenolítica veal, hydrolyzing the alpha cha thrombin "like" type venobim AB, presented a CI of 144.93 s-1, a minimum coagulant dose (DMC) of 1.33 ± 0.25 mg / mL and induces platelet aggregation. The structural characterization of TLBan was determined by its molecular mass via mass spectrometry. Structural analysis of the sequence was deduced using the database: http://www.expasy.ch/sprot/, with the help of the sequence of tryptic peptides, showing a high homology with other amino acid sequence of the serine protease from snake venom. Its polypeptide chain TLBan showed the presence of a catalytic triad in positions His (44), Asp (90) and Ser (185). The reproducibility of the biological activity through the pharmacological effects is only possible with the use of chemically homogeneous fractions to maintain the integrity of the molecule. These fractions are obtained with high efficiency methods: HPLC and mass spectrometry. The results may be associated with its biological activity, eliminating the subjectivity caused by poison or impure fractions. This approach will be applied to govern the biochemical studies, structure-function, physiological and pharmacological, may also reveal unknown mechanisms in the structure-function relationship of serine protease with thrombin "like" activity from snake venom. In the case of the snake Bothrops andianus, studies are valued due to the fact that there is no work done, probably because this is a species not yet studied, but that is of interest to the scientific field of venom / Abstract: In this word, a new serine protease with thrombin "like" activity the venom of Bothrops andianus (TLBan), snake of the Andes of Peru, was isolated by two steps: molecular exclusion chromatography G-75 and liquid chromatography in reversed-phase HPLC; with a high degree of purity and molecular homegenidade. Through of electrophoresis on SDS-PAGE shows the TLBan have a relative mass of 29 kDa under reducing conditions and 26 kDa in reducing conditions that was not confirmed for precision by mass spectrometry MALDI-TOF, with a molecular mass of 25 835.65 Da after when was sometida a desglycosilation with PNGase F and neuraminidase, The TLBan relative mass decreased 22 kDa and 25 kDa, respectively. The kinetic studies of the activity showed that the serine protease thrombin "like" activity features a opposite behavior michaeliano substrate DL-BApNA, recording the kinetic constants of Vmax = 5.4 x 10-1 nmol p-NA/min and Km = 7.9 x 10 -1 mM had to be stable between 25 ° C and 60 ° C and at pH between 4 and 10. In the presence of different ions (Mg2 +, Ca2 +, Mn2 +, Cd2 + and Zn2 +) and inhibitors (PMSF, EDTA and SBTI), its proteolytic activity and fibrinogenolítica was maintained, except for the ions Cd2 +, Zn2 + and inhibitor PMSF. TLBan was able to enhance its activity against the fibrinogen fibrinogenolítica veal, hydrolyzing the alpha cha thrombin "like" type venobim AB, presented a CI of 144.93 s-1, a minimum coagulant dose (DMC) of 1.33 ± 0.25 mg / mL and induces platelet aggregation. The structural characterization of TLBan was determined by its molecular mass via mass spectrometry. Structural analysis of the sequence was deduced using the database: http://www.expasy.ch/sprot/, with the help of the sequence of tryptic peptides, showing a high homology with other amino acid sequence of the serine protease from snake venom. Its polypeptide chain TLBan showed the presence of a catalytic triad in positions His (44), Asp (90) and Ser (185). The reproducibility of the biological activity through the pharmacological effects is only possible with the use of chemically homogeneous fractions to maintain the integrity of the molecule. These fractions are obtained with high efficiency methods: HPLC and mass spectrometry. The results may be associated with its biological activity, eliminating the subjectivity caused by poison or impure fractions. This approach will be applied to govern the biochemical studies, structure-function, physiological and pharmacological, may also reveal unknown mechanisms in the structure-function relationship of serine protease with thrombin "like" activity from snake venom. In the case of the snake Bothrops andianus, studies are valued due to the fact that there is no work done, probably because this is a species not yet studied, but that is of interest to the scientific field of venom / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Sergio Marangoni / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T12:45:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carregari_VictorCorasolla_D.pdf: 3134117 bytes, checksum: 3177d146a01c9214975aac2e9aebd929 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Os venenos de serpentes são uma mistura complexa de moléculas funcionais sendo em sua maior parte proteínas. Para a perpetuação da espécie, e sendo selecionadas a partir do processo de seleção natural, as serpentes apresentam uma alta variabilidade de mutações gênicas responsáveis por expressar proteínas e componentes dos venenos ocorrendo um processo denominado de microevolução, com isso criou diversas toxinas com uma alta complexidade funcional e uma alta similaridade estrutural. Essas toxinas são responsáveis por uma grande variedade de efeitos farmacológicos que geram alterações fisiológicas e com isso imobilizando a presa (neurotoxicidade e miotoxicidade) impedindo a fuga do local de ataque, tendo componentes nos venenos que também iniciam a digestão da presa facilitando a alimentação da serpente. Estas toxinas têm sido utilizadas como ferramentas moleculares para uma melhor compreensão de processos fisiológicos. Através da identificação de modificações químicas em aminoácidos específicos e sequenciamento de "de novo" através de espectrometria de massas de PLA2s isoladas a partir do veneno de serpentes, foi possível correlacionar estrutura e função destas enzimas e elucidar certos mecanismos de ações farmacológicas específicas. As modificações químicas através dos reagentes p-BPB e AA da Bbil-TX foram identificadas e confirmadas por espectrometria de massas, apresentando um alto grau de eficiência e especificidade dos reagentes por aminoácidos específicos (lisina para o AA e histidina para o p-BPB). Após três etapas de purificação de uma nova PLA2 K49 isolada do veneno de Bothriopsis taeniata, denominada Btt-TX, esta foi submetida a duas diferentes enzimas de clivagem (tripsina e Lys-C) e os peptídeos gerados aplicados a um sistema de LC MS/MS aplicando-se diferentes métodos de fragmentação dos peptídeos digeridos como CID/HCD/ETD, com isso foi possível obter uma variedade de padrões complementares dos peptídeos fragmentados, sendo feito o sequenciamento "de novo" automático através da sobreposição dos peptídeos gerados pela combinação destas diferentes metodologias, permitindo obter 100% de cobertura da sequencia de aminoácidos. Nossos estudos de relação entre estrutura e função demonstraram que a região C-terminal e a presença de resíduos de aminoácidos altamente hidrofóbicos assim como a presença das lisinas são responsáveis pela ancoragem e penetração da membrana, promovendo assim o efeito miotóxico, independendo da atividade catalítica. A perda da região consenso do N-terminal da Btt-TX comprova a importância desta região na ancoragem com as membranas celulares e aumentando a interação com aminoácidos destas PLA2s, permitindo uma aproximação das lisinas com a membrana plasmática das células musculares aumentando a eficiência da penetração dos aminoácidos hidrofóbicos presentes na região C-Terminal / Abstract: The snake venoms are a complex mixture of functional molecules and in the most part of proteins. For the preservation of the species and suffering a natural selection process, the snakes show high genic variability responsible for the protein expressions and compounds present in the venom, occurring an microevolution process, in this way several toxins with a high functional complexity and structural similarity was created. These toxins are responsible for various pharmacological effects that produces many physiological disturbs (neurotoxicity and myotoxicity) which immobilize the prey keeping near from the local of the attack and having some venom components that start the digestion of the prey. Toxins are often used as a molecular tool to get a better comprehension of physiological process. Through identification of chemical modifications in specific amino acids and make a "de novo" sequence by mass spectrometry on isolated PLA2s from snake venom correlating function and structure of these enzymes trying to elucidate some specific pharmacological actions. All the chemical modification at the Bbil-TX by the reagents p-BPB and AA was identified and proved by mass spectrometry, showing a high level of efficacy and specificity of the reagents from specific amino acids (lysine for the AA and histidine for the p-BPB). After the purification of a new PLA2 K49 isolated from the Bothriopsis taeniata snake venom, called Btt-TX, submitting it to two different cleavage enzymes (trypsin and Lyc-C) and the generated peptides injected to an LC MS/MS system. Applying different fragmentation mode, such as, CID/HCD/ETD, it was possible obtain a variety of additional and complementary patterns of fragmented peptides. With the obtained data we did the "de novo" automatic sequence through the overlapping of the generated peptides from all the fragmentation methods, allowing to have 100%. Nossos estudos de relação entre estrutura e função demonstraram que a região C-terminal e a presença de resíduos de aminoácidos altamente hidrofóbicos assim como a presença das lisinas são responsáveis pela ancoragem e penetração da membrana, promovendo assim o efeito miotóxico, independendo da atividade catalítica. A perda da região consenso do N-terminal da Btt-TX comprova a importância desta região na ancoragem com as membranas celulares e aumentando a interação com aminoácidos destas PLA2s, permitindo uma aproximação das lisinas com a membrana plasmática das células musculares aumentando a eficiência da penetração dos aminoácidos hidrofóbicos presentes na região C-Terminal. Our structure/function studies showed that the C-terminal region and the presence of the highly hydrophobic amino acid residues as well as the lisines presence are responsible for the anchorage and disrupt membrane, promoting the myotoxic effetc. The N-terminal loss in the Btt-TX, prove the importance of this region in anchoring with the cell membrane and increasing interaction with amino acids of these PLA2s, allowing a better interaction with the lisines increasing the penetration efficiency of the hydrophobic amino acids on C-terminal region / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Serpentes do gênero Bothrops são responsáveis por 90% dos acidentes ofídicos no Brasil. Seus venenos provocam efeitos locais em humanos e animais, como hemorragia, edema, dor e necrose, caracterizando uma resposta inflamatória, cujo mecanismo não está bem definido. Esses efeitos estão relacionados com a ação combinada de proteases, substâncias que induzem hemorragia e fosfolipases, bem como a liberação de mediadores endógenos gerados pelos venenos. Considerando que a ativação do sistema complemento (SC) e de funções celulares, como quimiotaxia, ativação, proliferação e citotoxicidade podem desempenhar papel importante nos processos inflamatórios e de lesão tecidual subsequentes ao envenenamento, o estudo propõe: a) investigar a capacidade dos venenos brutos de serpentes Bothrops jararacussu e Bothrops pirajai e das toxinas purificadas, serinoprotease de B. jararacussu (SPBj) e L-aminoácido oxidase de B. pirajai (LAAOBp), em modular a atividade do SC; b) avaliar a contribuição do efeito sobre o SC no recrutamento de leucócitos polimorfonucleares humanos (PMN); c) avaliar o potencial citotóxico direto dos venenos e toxinas sobre células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC); d) analisar o efeito dos venenos sobre a modulação da expressão dos marcadores de ativação CD69, CD25 e HLA-DR em células T, B e natural killer (NK). Os resultados do ensaio de citotoxicidade mostraram que o veneno bruto de B. jararacussu foi citotóxico para PBMC apenas nas concentrações maiores, de 50 e 100g/mL, não apresentando citotoxicidade nas outras concentrações testadas. A serinoprotease apresentou baixa citotoxicidade para essas células, o que sugere a necessidade de maiores investigações quanto aos mecanismos que levam a essa morte celular. O aumento da viabilidade celular encontrado nas amostras incubadas com veneno bruto e LAAO de B. pirajai sugere possível indução de proliferação celular, que necessita de maiores estudos. Os resultados obtidos sugerem que os venenos brutos de B. jararacussu e B. pirajai são capazes de ativar o SC como observado nos ensaios cinéticos da VCVL e VA e de quimiotaxia de neutrófilos, onde ficou evidenciado que a migração celular foi devida a liberação dos fatores quimiotáticos do SC, C3a e C5a. e que suas respectivas toxinas, serinoprotease e LAAO apresentam efeitos moduladores sobre o SC humano, e estimulam investigações mais aprofundadas com a finalidade de se esclarecer os mecanismos de ação e identificar os componentes responsáveis pelos efeitos observados. Houve expressão aumentada de CD69, CD25 e HLA-DR nas células T CD4+ e CD8+, especialmente quando incubadas com veneno bruto de B. jararacussu e LAAO de B. pirajai, o que reflete ativação da resposta imune celular, e pode sugerir que este tipo de resposta desempenhe papel relevante na indução e/ou controle dos processos imunopatológicos decorrentes de envenenamentos por B. jararacussu e B. pirajai. Esta investigação visa fornecer subsídios para a possível utilização das toxinas para fins terapêuticos e como ferramentas para investigação dos mecanismos envolvidos nos processos fisiopatológicos que ocorrem em decorrência de picadas e também em outras doenças de caráter inflamatório. / Snakes of the genus Bothrops are responsible for 90% of snakebites in Brazil. Their venoms cause local effects in humans and animals, such as hemorrhage, edema, pain and necrosis, characteristic of an inflammatory response. The mechanism is not well defined. These effects are related to the combined action of proteases, substances that induce bleeding and phospholipases, as well as release of endogenous mediators generated by the venoms. Considering that activation of the complement system (CS) and cellular functions such as chemotaxis, activation, proliferation and cytotoxicity, may play a role in inflammatory processes and tissue injury following envenomation, the study proposes: a) to investigate the ability of crude venom of B. jararacussu and B. pirajai and the purified toxins, serineprotease of B. jararacussu and L-amino acid oxidase (LAAO) of B pirajai in modulating the activity of the CS, b) to assess the contribution of the effect on CS in the recruitment of human polymorphonuclear leukocytes (PMN), c) to assess the direct cytotoxic potential of venoms and toxins on human peripheral blood mononuclear cells (PBMC), d) to analyse the effect of venoms on the modulation of the expression of activation markers CD69, CD25 and HLA-DR on T, B and natural killer (NK) cells. The results of cytotoxicity assay showed that the crude venom of B. jararacussu was cytotoxic to PBMC only at higher concentrations, 50 and 100g/mL, showing no cytotoxicity in the other concentrations. The serineprotease showed low cytotoxicity to the cells, suggesting the need for further investigations about the mechanisms that lead to this cell death. The increase in cell viability found in samples incubated with crude venom of B. pirajai and LAAO suggests the possibility of induction of cell proliferation, which needs further study. The results suggest that the crude venom of B. jararacussu and B. pirajai are capable of activating the CS as observed in kinetic assays of classical pathwaylectin pathway and alternative pathway and neutrophil chemotaxis assay, where it was shown that cell migration was due to release of CS chemotactic factors, C3a and C5a, and that their respective toxins, serineprotease and LAAO have modulatory effects on human CS, and stimulate further research in order to clarify the mechanisms of action and identify the components responsible for the observed effects. There was increased expression of CD69, CD25 and HLA-DR on CD4+ and CD8+, especially when incubated with crude venom of B. jararacussu and LAAO of B. pirajai. It reflects activation of cellular immune response and may suggest that this type of response play an important role in the induction and/or control of immunopathological processes arising from envenomation by B. jararacussu and B. pirajai. This research aims to provide subsidies to the possible use of the toxin for therapeutic purposes and as tools for investigating mechanisms involved in pathophysiological processes that occur as a result of snakebites and also in other diseases of inflammatory nature.

As fosfolipases A2 (PLA2s) de peçonhas de serpentes compreendem um grupo de enzimas de massas moleculares variáveis entre 14.000 e 18.000, e são responsáveis por vários efeitos tóxicos induzidos pela peçonha destes animais, tornando-se necessária a busca por inibidores naturais de PLA2¬s. O presente trabalho propôs a caracterização bioquímica, farmacológica e estrutural de duas proteínas inibitórias isoladas do plasma da serpente Bothrops jararacussu (BjussuMIPs), que neutralizam as atividades enzimáticas, tóxicas e farmacológicas de diferentes PLA2s. Estes inibidores foram isolados por cromatografia de afinidade em miotoxina-Sepharose, demonstrando que ambos são glicoproteínas com massas moleculares de 24.000 (BjussuMIP) e 23.500 (BjussuMIP) para os monômeros e de 120.000 (BjussuMIP) e 160.000 (BjussuMIP) para os oligômeros. O tratamento dos BjussuMIPs com a N-glicosidase F reduziram os seus pesos moleculares para aproximadamente 18.000, mas não afetaram suas atividades inibitórias sobre PLA2s, sugerindo que os carboidratos tem pouco ou nenhum papel na associação dos BjussuMIPs com estas enzimas. A análise do BjussuMIP por dicroísmo circular mostrou 44% de -hélice, 18% de folhas , 10% de voltas e 28% de estruturas aleatórias. O cDNA obtido por PCR a partir do fígado desta serpente revelou 432 pb (BjussuMIP) e 543 pb (BjussuMIP) que codificam para 144 e 181 resíduos de aminoácidos, respectivamente. O alinhamento da sequência de BjussuMIP com a de outros inibidores do tipo , denominados de PLIs, apresentou 73-92% de similaridade e o BjussuMIP mostrou 89-94% com inibidores do tipo PLIs. Os BjussuMIPs demonstraram ser relativamente estável a variações de pH (6-12) e temperatura, entretanto, perderam atividade inibitória quando submetido a altas temperaturas. A caracterização funcional indica que os BjussuMIPs apresentaram propriedades inibitórias sobre diferentes PLA2s isoladas de peçonhas de serpentes dos gêneros Bothrops e Crotalus. Ambos BjussuMIPs revelaram propriedades farmacológicas como a inibição das atividades fosfolipásica, anticoagulante, miotóxica, indução de edema, citotóxica, bactericida e letal. Os resultados obtidos demonstram que o BjussuMIP mostra maior afinidade sobre as PLA2s homólogas Lys49 como BthTX-I e PrTX-I, enquanto que o BjussuMIP apresenta-se mais específico para PLA2s Asp49, sugerindo uma especificidade entre os BjussuMIPs e tipos de PLA2s. Além disso, ambos os inibidores mostraram ser eficazes na suplementação do antiveneno botrópico em diferentes concentrações, resultando no aumento da capacidade do soro em neutralizar toxinas de serpentes. Os aspectos abordados neste trabalho poderão trazer informações complementares sobre possíveis mecanismos de ação, podendo resultar no melhor entendimento dos efeitos inibitórios exercidos pelos BjussuMIPs, assim como auxiliar o tratamento do envenenamento ofídico pela suplementação da soroterapia tradicional. / Phospholipases A2 (PLA2s) from snake venoms comprise a group of enzymes with molecular weights varying from 14,000 to 18,000, and are responsible for several toxic effects induced by the venom of these animals, making important the search for natural inhibitors of PLA2s. The present work proposed the biochemical, pharmacological and structural characterization of two protein inhibitors isolated from the plasma of Bothrops jararacussu snake (BjussuMIPs), which neutralize the enzymatic, toxic and pharmacological activities of different PLA2s. These inhibitors were isolated by an affinity chromatography on myotoxin-Sepharose, showing that both are glycoproteins with molecular weights of 24,000 (BjussuMIP) and 23,500 (BjussuMIP) for the monomers and 120,000 (BjussuMIP) and 160,000 (BjussuMIP) for the oligomers. The treatment of BjussuMIPs with N-glucosidase F reduced their molecular weights to about 18,000, but did not affect their inhibitory activity on PLA2s, suggesting that the carbohydrates have little or no role in the association of these BjussuMIPs with these enzymes. The analysis of BjussuMIP by circular dichroism showed 44% of -helix, 18% of sheets, 10% of turns and 28% of random structures. The cDNA obtained by PCR from the snake liver showed 432 bp for BjussuMIP and 543 bp for BjussuMIP, which encode for 144 and 181 amino acid residues, respectively. The alignment of the sequence of BjussuMIP with those from other -inhibitors (PLIs) showed 73-92% of similarity and 89-94% for the BjussuMIP compared to other PLIs. The BjussuMIPs showed to be relatively stable to changes in pH (6-12) and temperature, however lost of its activity when submitted to high temperatures. The functional characterization indicates that both BjussuMIPs presented inhibitory properties on different snake venom PLA2s from the genera Bothrops and Crotalus. Both BjussuMIPs showed pharmacological properties such as inhibition of phospholipase, anticoagulant, myotoxic, cytotoxic, bactericidal, edema-inducing and lethal activities. The results show that BjussuMIP presents higher affinity to Lys49-PLA2 homologous, such as BthTX-I and PrTX-I, while BjussuMIP is more specific to Asp49-PLA2s, suggesting specificity between BjussuMIPs and types of PLA2s. Moreover, both inhibitors proved effective in the supplementation of Bothrops antivenom at different concentrations, resulting in an increased capacity of serum in neutralizing snake toxins. The issues reported in this work could bring additional information on possible mechanisms of action and may result in better understanding of the inhibitory effects exerted by these BjussuMIPs, as well as assist the treatment of ophidian envenomations by supplementation of the traditional serum therapy.

Made available in DSpace on 2015-04-22T22:14:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Wally Victoria.pdf: 2663856 bytes, checksum: ecb49cfdc11a071bf247bc9d401b6d9d (MD5) Previous issue date: 2005-11-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / In the Amazon the accidents caused by venomous snakes represent a serious public health problem. Serotherapy neutralizes the systemic effects from the venoms, but not local effects; therefore, there is need for research on natural inhibitors of the local effects from snake envenomation. Andiroba (Carapa guianensis Aublet, 1775) is a plant from tropical and equatorial forests and its seeds produce an oil which has medicinal properties, with anti-inflammatory and antiseptic activities, and wound healing properties, besides being a fine repellent. With the objective of evaluating the activity of the andiroba oil on the local inflammation induced by Amazonian snakes, an experimental study was done on the general pharmacological effects of the andiroba oil and on the inflammatory process induced in mice by the venoms of Bothrops atrox and Crotalus durissus ruruima, two snakes species of epidemiological importance in the Amazon region. The inhibitory kinetics of the edema in mice was evaluated by measuring the paw edema diameter and by histopathological methods. There was a significant inhibition in the inflammatory infiltrate of 87,03% and 82,10% after 3 and 12 hours respectively, after treating with andiroba oil the paws induced with the venom of Bothrops atrox. With the venom of Crotalus durissus ruruima inhibition reached 89,37% and 75,60% after 3 and 6 hours respectively, after treatment with andiroba oil. There was significant reduction in the kinetics of the edema induced by the venom of Bothrops atrox (37,67%) and of Crotalus durissus ruruima (42,41%) as early as the first hour of treatment with andiroba oil. This reduction progressed to 50,64% (for Bothrops atrox) and 82,37% (Crotalus durissus ruruima) after three hours after treatment. Histologically, it was observed a reduction of the edema induced by Bothrops atrox venom by 29,18% after 3 hours. With the venom of Crotalus durissus ruruima the reduction of the edema was 30,87% after 3 hours. Neither haemorrhagy nor myonecrosis were reduced or inhibited by andiroba oil administrated intraperitoneally. It is suggested that the inhibitory activity of Carapa guianensis could be related to leucocitary migration reduction / Na Amazônia, os acidentes por serpentes peçonhentas constituem sério problema de saúde pública. A soroterapia neutraliza os efeitos sistêmicos do veneno, mas não os efeitos locais; portanto, são necessárias pesquisas sobre inibidores naturais dos efeitos locais do envenenamento. A andiroba (Carapa guianensis Aublet, 1775) é uma planta de florestas tropicais e equatoriais, cujas sementes fornecem um óleo com propriedades medicinais, com atividades antiinflamatória, cicatrizante e anti-séptica, além de ser um ótimo repelente. Com o objetivo de avaliar a atividade do óleo de andiroba na inflamação local induzida por venenos de serpentes amazônicas, foram estudados experimentalmente os efeitos farmacológicos gerais do óleo de andiroba e sua atividade sobre o processo inflamatório local, induzido em camundongos pelos venenos de serpentes Bothrops atrox ou Crotalus durissus ruruima, serpentes de importância epidemiológica na região da Amazônia. A cinética inibitória do edema em camundongos foi avaliada pela medição do diâmetro do edema das patas dos camundongos e por métodos histopatológicos. Após o tratamento com o óleo de andiroba, obteve-se uma inibição significativa no infiltrado inflamatório de 87,03% e 82,10%, às 3 e 12 horas respectivamente, nas patas experimentais induzidas com o veneno de Bothrops atrox. Com o veneno de Crotalus durissus ruruima a inibição atingiu 89,37% e 75,60%, às 3 e 6 horas, respectivamente, pós-tratamento. Quanto ao edema avaliado pela medição do diâmetro das patas dos camundongos, foi observada uma diminuição significativa em 37,67% no edema induzido pelo veneno de Bothrops atrox e em 42,41% no edema induzido pelo veneno de Crotalus durissus ruruima, a partir da primeira hora após a administração desses venenos nos grupos tratados com o óleo de andiroba. A redução dos edemas progrediu até 50,64% (para Bothrops atrox) e 82,37% (para Crotalus durissus ruruima) às 3 horas pós-tratamento. Histologicamente observou-se uma redução no edema induzido por Bothrops atrox de 29,18% às 3 horas pós-tratamento. Com o veneno de Crotalus durissus ruruima a redução do edema foi de 30,87% às 3 horas pós-tratamento. Nem a hemorragia e nem a mionecrose foram inibidas significativamente pela administração do óleo de andiroba por via intraperitoneal. Sugere-se que a atividade inibitória da Carapa guianensis poderia estar relacionada à diminuição da migração leucocitária

Trombocitopenia e diminuição da função plaquetária são achados comuns em pacientes picados por serpentes do gênero Bothrops. Sabe-se que o veneno de Bothrops jararaca (VBj) apresenta compostos com características pró e anti-agregantes plaquetárias, porém existem poucos estudos sobre a influência do veneno total assim como das principais famílias de proteínas que o compõem sobre as funções plaquetárias. A utilização de modelos experimentais é essencial para entender as desordens plaquetárias em humanos que culminam em sangramentos diversos. Portanto, o objetivo deste estudo foi (i) comparar as respostas ex vivo de plaquetas lavadas de humanos e de camundongos frente ao VBj, assim como entender a participação de serinaproteinases (SVSP) e metaloproteinases (SVMP) presentes no veneno sobre a agregação dessas plaquetas; e (ii) delimitar dentro do complexo proteico do veneno os compostos que induzem a trombocitopenia em camundongos após 3 horas do início do envenenamento botrópico. As plaquetas lavadas de humanos e camundongos BALB/c, C57BL/6 e do mutante natural pérola (Ap3b1-/-) apresentaram respostas de agregação máxima ao VBj na concentração de 24,4 ?g/mL, porém esta concentração provocou uma agregação menos intensa em plaquetas humanas quando comparada àquela observada nas linhagens BALB/c e C57BL/6. Mesmo em plaquetas de camundongos pérolas, deficientes em corpos densos plaquetários, o VBj se mostrou um potente agonista, promovendo a agregação plaquetária sem a necessidade da secreção do conteúdo granular. A ação agonista do veneno promoveu a secreção de ATP presente nos corpos densos plaquetários de humanos e das linhagens BALB/c e C57BL/6 de forma tão intensa quanto à provocada pela trombina, assim como a secreção de PF4 presente nos grânulos ? de plaquetas humanas e de camundongos BALB/c. Já em relação à secreção lisossomal, observou-se que as plaquetas humanas secretam níveis mais baixos de ?-hexosaminidase quando estimuladas com VBj do que pela trombina, enquanto que em plaquetas de camundongos BALB/c a secreção lisossomal ao VBj foi superior à constatada com a trombina. Os baixos níveis de lactato desidrogenase (LDH) no sobrenadante das plaquetas estudadas mostraram ausência de atividade direta citotóxica pelo VBj. Para verificar se as principais classes de famílias de enzimas do VBj, SVMP e SVSP, estavam envolvidas na ativação plaquetária ex vivo, elas foram inibidas com Na2EDTA (13 mM) e AEBSF (8 mM), respectivamente. Observou-se que em plaquetas humanas as serinaproteases são importantes para a agregação ex vivo, enquanto a agregação das plaquetas de camundongos BALB/c foi independente dessa classe de toxinas. Os resultados dos ensaios in vivo demonstraram que as proteínas do VBj com peso molecular inferior a 50 kDa (UF < 50 kDa) são importantes para o estabelecimento da trombocitopenia em camundongos BALB/c que receberam essa fração por via subcutânea e que esse quadro é independente de manifestações hemorrágicas e do desenvolvimento de coagulopatia durante o envenenamento botrópico. A caracterização dos compostos presentes no UF < 50 kDa foi realizada por espectrometria de massas e foi observada a presença predominante de metaloproteinases (37%) e proteínas similares às lectinas do tipo-C (33%), enquanto serinaproteases (17%), fosfolipases A2 (10%) e outros compostos (3%) somaram 30% da fração UF < 50 kDa. Em conclusão, o veneno é um potente agonista plaquetário que promove agregação, aglutinação e secreção de plaquetas humanas e de camundongos, independente da secreção de corpos densos plaquetários, e a fração do veneno responsável pela trombocitopenia em camundongos BALB/c tem peso molecular menor que 50 kDa / Thrombocytopenia and platelet dysfunction are common findings in patients bitten by Bothrops jararaca snakes. Pro- and anti-aggregating toxins have been isolated from Bothrops jararaca venom (BjV), but only few studies have been carried out about the effects of crude BjV and its main families of enzymes on platelet function ex vivo, as well as to understand their relevance to the pathophysiological events that occur during B. jararaca envenomation. Animal models have been used to understand platelet disorders in humans that culminate in bleeding manifestations. Thus, the aim of this study was to investigate (i) the effects of BjV, and snake venom serine proteinases (SVSP) and snake venom metalloproteinases (SVMP) contained therein, on aggregation and secretion in suspensions of washed human and mouse platelets, and (ii) to determine the BjV fractions, obtained by ultrafiltration, that induce thrombocytopenia in BALB/c mice after 3 h of administration of Bothrops envenomation. Washed platelets from humans and BALB/c, C57BL/6 and pearl (Ap3b1-/-) mice showed maximal aggregation responses to BjV at the concentration of 24.4 ?g/mL. However, this concentration aggregated less intensely platelets from humans than BALB/c or C57BL/6 mice. Even in pearl mouse platelets, which are deficient in dense bodies, BjV proved to be a potent agonist, promoting platelet aggregation without the requirement of granule content secretion. Nonetheless, BjV induced secretion of ATP, present in dense bodies, and PF4, present in ? granules, in the same extent as thrombin, from platelets of humans and mice. In regard to lysosomal secretion, it was observed that human platelets secreted low ?-hexosaminidase levels when stimulated by BjV than thrombin, whereas in BALB/c platelets higher secretion was induced by BjV than by thrombin. Release of lactate dehydrogenase (LDH) was similar between BjV and thrombin, evidencing the absence of cytotoxic activity by BjV on platelets. Inhibition of SVMP and SVSP, using Na2EDTA (13 mM) and AEBSF (8 mM), respectively, demonstrated that SVSP are important for ex vivo aggregation only in human platelets, whilst BALB/c platelet aggregation was independent of both of them. In in vivo studies, only BjV toxins with molecular weight less than 50 kDa (UF50) caused thrombocytopenia when administered s.c. to BALB/c mice, and it was independent of hemorrhagic manifestations and consumptive coagulopathy. Characterization by mass spectrometry of these toxins present in UF50 showed the predominant presence of SVMP (37%) and type-C lectin proteins (33%) were observed, while SVSP (17%), phospholipases A2 (10%) and other proteins (3%) accounted for the remaining toxins in UF50. In conclusion, BjV is a potent platelet activating agent that promotes aggregation, agglutination and secretion of human and mouse platelets, independent of secretion of dense platelet bodies, and the fraction of venom responsible for thrombocytopenia in BALB / c mice has a molecular weight less than 50 kDa

As fosfolipases A2 (PLA2s) de peçonhas de serpentes compreendem um grupo de enzimas de massas moleculares variáveis entre 14.000 e 18.000, e são responsáveis por vários efeitos tóxicos induzidos pela peçonha destes animais, tornando-se necessária a busca por inibidores naturais de PLA2¬s. O presente trabalho propôs a caracterização bioquímica, farmacológica e estrutural de duas proteínas inibitórias isoladas do plasma da serpente Bothrops jararacussu (BjussuMIPs), que neutralizam as atividades enzimáticas, tóxicas e farmacológicas de diferentes PLA2s. Estes inibidores foram isolados por cromatografia de afinidade em miotoxina-Sepharose, demonstrando que ambos são glicoproteínas com massas moleculares de 24.000 (BjussuMIP) e 23.500 (BjussuMIP) para os monômeros e de 120.000 (BjussuMIP) e 160.000 (BjussuMIP) para os oligômeros. O tratamento dos BjussuMIPs com a N-glicosidase F reduziram os seus pesos moleculares para aproximadamente 18.000, mas não afetaram suas atividades inibitórias sobre PLA2s, sugerindo que os carboidratos tem pouco ou nenhum papel na associação dos BjussuMIPs com estas enzimas. A análise do BjussuMIP por dicroísmo circular mostrou 44% de -hélice, 18% de folhas , 10% de voltas e 28% de estruturas aleatórias. O cDNA obtido por PCR a partir do fígado desta serpente revelou 432 pb (BjussuMIP) e 543 pb (BjussuMIP) que codificam para 144 e 181 resíduos de aminoácidos, respectivamente. O alinhamento da sequência de BjussuMIP com a de outros inibidores do tipo , denominados de PLIs, apresentou 73-92% de similaridade e o BjussuMIP mostrou 89-94% com inibidores do tipo PLIs. Os BjussuMIPs demonstraram ser relativamente estável a variações de pH (6-12) e temperatura, entretanto, perderam atividade inibitória quando submetido a altas temperaturas. A caracterização funcional indica que os BjussuMIPs apresentaram propriedades inibitórias sobre diferentes PLA2s isoladas de peçonhas de serpentes dos gêneros Bothrops e Crotalus. Ambos BjussuMIPs revelaram propriedades farmacológicas como a inibição das atividades fosfolipásica, anticoagulante, miotóxica, indução de edema, citotóxica, bactericida e letal. Os resultados obtidos demonstram que o BjussuMIP mostra maior afinidade sobre as PLA2s homólogas Lys49 como BthTX-I e PrTX-I, enquanto que o BjussuMIP apresenta-se mais específico para PLA2s Asp49, sugerindo uma especificidade entre os BjussuMIPs e tipos de PLA2s. Além disso, ambos os inibidores mostraram ser eficazes na suplementação do antiveneno botrópico em diferentes concentrações, resultando no aumento da capacidade do soro em neutralizar toxinas de serpentes. Os aspectos abordados neste trabalho poderão trazer informações complementares sobre possíveis mecanismos de ação, podendo resultar no melhor entendimento dos efeitos inibitórios exercidos pelos BjussuMIPs, assim como auxiliar o tratamento do envenenamento ofídico pela suplementação da soroterapia tradicional. / Phospholipases A2 (PLA2s) from snake venoms comprise a group of enzymes with molecular weights varying from 14,000 to 18,000, and are responsible for several toxic effects induced by the venom of these animals, making important the search for natural inhibitors of PLA2s. The present work proposed the biochemical, pharmacological and structural characterization of two protein inhibitors isolated from the plasma of Bothrops jararacussu snake (BjussuMIPs), which neutralize the enzymatic, toxic and pharmacological activities of different PLA2s. These inhibitors were isolated by an affinity chromatography on myotoxin-Sepharose, showing that both are glycoproteins with molecular weights of 24,000 (BjussuMIP) and 23,500 (BjussuMIP) for the monomers and 120,000 (BjussuMIP) and 160,000 (BjussuMIP) for the oligomers. The treatment of BjussuMIPs with N-glucosidase F reduced their molecular weights to about 18,000, but did not affect their inhibitory activity on PLA2s, suggesting that the carbohydrates have little or no role in the association of these BjussuMIPs with these enzymes. The analysis of BjussuMIP by circular dichroism showed 44% of -helix, 18% of sheets, 10% of turns and 28% of random structures. The cDNA obtained by PCR from the snake liver showed 432 bp for BjussuMIP and 543 bp for BjussuMIP, which encode for 144 and 181 amino acid residues, respectively. The alignment of the sequence of BjussuMIP with those from other -inhibitors (PLIs) showed 73-92% of similarity and 89-94% for the BjussuMIP compared to other PLIs. The BjussuMIPs showed to be relatively stable to changes in pH (6-12) and temperature, however lost of its activity when submitted to high temperatures. The functional characterization indicates that both BjussuMIPs presented inhibitory properties on different snake venom PLA2s from the genera Bothrops and Crotalus. Both BjussuMIPs showed pharmacological properties such as inhibition of phospholipase, anticoagulant, myotoxic, cytotoxic, bactericidal, edema-inducing and lethal activities. The results show that BjussuMIP presents higher affinity to Lys49-PLA2 homologous, such as BthTX-I and PrTX-I, while BjussuMIP is more specific to Asp49-PLA2s, suggesting specificity between BjussuMIPs and types of PLA2s. Moreover, both inhibitors proved effective in the supplementation of Bothrops antivenom at different concentrations, resulting in an increased capacity of serum in neutralizing snake toxins. The issues reported in this work could bring additional information on possible mechanisms of action and may result in better understanding of the inhibitory effects exerted by these BjussuMIPs, as well as assist the treatment of ophidian envenomations by supplementation of the traditional serum therapy.