Proefschrift Rijksuniversiteit Groningen. / Datum laatste controle: 15-12-1997. Met lit. opg., bibliogr. - Met samenvatting in het Nederlands.

L'intégrase (IN) est une protéine clé du cycle de réplication des rétrovirus et constitue une cible thérapeutique importante. Nous avons découvert par cristallographie aux rayons X, une nouvelle possibilité d'assemblage dimérique du domaine central catalytique de l'intégrase du Rous associated virus type I (RAV-1 IN). Dans le cadre de mon travail de thèse, un protocole de surproduction et de purification d'un mutant du domaine catalytique isolé (H103C) a été optimisé, afin de démontrer l'existence de cet assemblage en solution grâce à un pont disulfure inter-moléculaire. Différentes méthodes ont été mises au point, afin de tester la ca pacité de petites molécules d'intérêt à se lier et à stabiliser ce "nouvel" assemblage. Un protocole de surproduction et de purification de l'IN entière du RAV-1 a également été développé et mis au point. Des études structurales ont été réalisées. Un mutant H103C de la protéine entière a été produit, afin de vérifier la formation de la "nouvelle" interface sur la protéine entière. Le microorganisme Geobacillus stearothermophilus produit deux ɑ-galactosidases, AgaA et AgaB, qui appartiennent à la famille GH36 des glycosides hydrolases. Ces deux isoenzymes partagent 97 % d'identité de séquence, mais ont des activités catalytiques différentes. Les structures cristallines d'AgaA et AgaB ont été résolues ainsi que la structures du mutant AgaA et AgaB ont été résolues ainsi que la structure du mutant AgaA A355E, qui présente des caractéristiques enzymatiques similaires de AgaB. L'analyse de ces trois structures montre que la substitution A355E entraîne un déplacement significatif du tryptophane du sous-site catalytiques -1. Ce mouvement peut expliquer les spécificités catalytiques des deux isoenzymes. / Integrase (IN) is a key protein in the retrovirus life cycle and constitutes an important therapeutic target for the development of antiretroviral compounds. This enzyme is involved in the early phase of theretroviral replication cycle and catalyses the retrotranscribed viral DNA integration into the host cell genome.The teams of BioCrystallography and Retrovirology of Lyon Gerland demonstrated by X ray crystallography, the existence of a new dimeric assembly of the central catalytic domain (CCD) of Rous Associated Virus type 1integrase or RAV 1 IN. As part of my thesis work, a protocol of overproduction and purification of the H103Cisolated catalytic domain mutant was developed to demonstrate the existence of this dimeric assembly insolution stabilized by an inter molecular disulfide bond. Biochemical and biophysical methods were developed to test the ability of small molecules of interest to bind and stabilize this "new" assembly. A protocol ofoverproduction and purification of full length RAV1 integrase was developed. Crystallization trials and SAXSstudies were undertaken. The H103C mutant of the entire protein was produced to verify the formation of the"new" interface on the full length protein.The microorganism Geobacillus stearothermophilus produces two thermostable ɑ-galactosidases named AgaA and AgaB, which belong to theGH36 glycoside hydrolase family. These two isoenzymes share97% sequence identity, but have different catalytic properties. A collaborative study was initiated with theInstitute of Industrial Genetics, University of Stuttgart (Germany),to better understand the catalytic specificity of these two isoenzymes. The crystal structures of AgaA and AgaB were solved in two different crystal systems.The crystal structure of the mutant AgaA A355E, which has catalytic properties similar of those of AgaB, wasalso determined. These three structures show that the A355E substitution results in a signifiant displacement of the W336 tryptophan residue from the catalytic subsite -1. This could explain the catalytic specificities of the two isoenzymes

Introduction: The initiation factor IF2 has different functions in the initiation of protein translation. Its C-terminal domain interacts strongly with fMet-tRNA. The main objective of this study is to isolate a specific aptamer for IF2 CTD Escherichia coli and Geobacillus stearothermophilus. Methods: A protein expression system based on E. coli BL21 was used. E. coli BL21 was transformed with InfB CTD sequence. Protein induction was performed under different temperatures and IPTG concentration. His-tagged affinity chromatography was used for protein purification since a hexa-His coding sequence was added to the InfB genes. Results: IF2 CTD was purified in high yields and purity. E. coli IF2 fragment protein concentration (558.0 ng/uL) was three times larger than that of G. stearothemophilus (144.6 ng/uL). Purity of both proteins were >95%. A specific aptamer for IF2 CTD G. stearothermophilus was obtained through SELEX. Conclusion: A rapid and efficient protocol for IF2 CTD protein purification has been developed, allowing the production of thermophilic and mesophilic IF2 fragments. The obtained aptamer may serve as a novel antibiotic mechanism in further studies. / Tesis

Thesis (Ph. D.)--University of Oregon, 2003. / Typescript. Includes vita and abstract. Includes bibliographical references (leaves 101-114). Also available for download via the World Wide Web; free to University of Oregon users.

Diss. (sammanfattning) Uppsala : Sveriges lantbruksuniv., 2004. / Härtill 4 uppsatser.

Doctor en Ciencias con mención en Microbiología

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Resíduos de Serviços de Saúde (RSS), ainda que tratados e dispostos em aterros sanitários, podem ser causas de impactos ambientais por apresentarem algum indicador de periculosidade. Segundo o apêndice IV da Resolução da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa) RDC nº 306/2004, para as tecnologias de tratamento desses resíduos é necessário que se atinja pelo menos o Nível III de inativação microbiana. Perante a ausência de dados na literatura que revelassem o tempo de exposição, temperatura e pressão ideais para a inativação microbiana no tratamento de RSS por autoclavagem e se a fração ocupada dos resíduos na autoclave poderia interferir na eficiência da desinfecção definiu-se o objetivo do trabalho para otimização do processo. Para os testes foram utilizados endósporos de Geobacillus stearothermophilus como bioindicadores e instalados cinco termopares na autoclave para aferição da temperatura dentro de todo o espaço da câmara. O RSS foi sintetizado diante das caracterizações como composição gravimétrica, distribuição granulométrica, densidade específica aparente, massa específica aparente e teor de umidade. Apresentou-se uma proposta metodológica para a avaliação do tratamento de RSS frente às dificuldades encontradas. Realizou-se ensaios com 116ºC, 125ºC e 134ºC, observando a fração de inativação em seis tempos de exposição diferentes. Sabendo-se que é padronizada em estabelecimentos de saúde a temperatura ideal para esterilização de materiais de 121ºC, apesar de não terem sido encontrados trabalhos científicos que comprovem a eficiência da esterilização nessa circunstância, foram realizados testes a 50 e 60 minutos de exposição para avaliar essa condição. Inoculou-se 106 endósporos nas amostras e a recuperação foi feita com filtração após a lavagem dos resíduos, sendo realizada a técnica de pour plate para contagem das unidades formadoras de colônias (UFC). O mesmo procedimento foi feito com a amostra retirada da autoclave. A fração de inativação dos endósporos atingiu 100% no tempo de 30 minutos de exposição à temperatura máxima de 134ºC e pressão absoluta de 2,3 kgf/cm2, resultado obtido através da relação do número de micro-organismos recuperados considerados como inoculados e o número de micro-organismos sobreviventes ao tratamento. A 121ºC houve recuperação de UFC após tratamento. A fração de ocupação não foi um fator delimitante para a inativação de endósporos, pois a temperatura se manteve a mesma independentemente da quantidade de resíduo submetido à autoclavagem. Um outro objetivo era avaliar experimentalmente a reprodução dos micro-organismos frente às condições operacionais de autoclavagem e do tempo de permanência do rejeito em condições ambientais. Esse estudo comprovou que a inativação nessas condições otimizadas esteriliza o resíduo, sendo que nenhum micro-organismo voltou a se reproduzir após dias expostos em temperatura ambiente, ou seja, não haveria riscos de contaminação em aterro sanitário quando depositados os rejeitos. Ter encontrado essas condições ideais e avaliado o processo de autoclavagem pode significar um grande avanço nas próprias unidades de tratamento, que terão um parâmetro estabelecido para trabalho. / Healthcare waste, even when treated and disposed of in landfills, can be causes of environmental impacts because they present some hazard indicator. According to appendix IV of Resolution of the National Health Surveillance Agency of Brazil (Anvisa) RDC nº 306/2004, for technologies of healthcare waste treatment, it is necessary to achieve at least Level III of microbial inactivation. The purpose of this research to optimize the process was defined taking into account the absence of data in the literature that revealed the optimal exposure time, temperature and pressure for microbial inactivation through the healthcare treatment by autoclaving and whether the fraction occupied by waste in the autoclave could interfere with the effectiveness of the disinfection. For the tests, endospores of Geobacillus stearothermophilus were used as bioindicators and five thermocouples were installed in the autoclave for temperature measurement throughout the chamber space. The healthcare waste was synthesized by characterizations such as gravimetric composition, granulometric distribution, apparent specific density, apparent specific mass and moisture content. A methodological proposal for the evaluation of waste treatment was introduced taking into consideration the difficulties encountered. Tests were performed at 116ºC, 125ºC and 134ºC, observing the fraction of inactivation at six different exposure times. Since the sterilization of materials at 121ºC is standardized in health establishments, even though no scientific studies were found to prove the sterilization efficiency in these conditions, tests were performed at 50 and 60 minutes of exposure to evaluate this condition. The concentration of 106 endospores were inoculated in the samples and the recovery was done with filtration after washing the waste, and the \"pour plate\" technique was used to count the colony forming units. The same procedure was done with the sample removed from the autoclave. The inactivation fraction of the endospores reached 100% in the time of 30 minutes of exposure to the maximum temperature of 134ºC and absolute pressure of 2.3 kgf/cm2, a result obtained by the ratio of the number of recovered microorganisms considered as inoculated and the number of microorganisms surviving the treatment. At 121ºC there was recovery of colony forming units after treatment. The occupation fraction was not a limiting factor for the inactivation of endospores, since the temperature remained the same regardless of the amount of waste submitted to autoclaving. Another objective was to experimentally evaluate the reproduction of the microorganisms taking into consideration the operational conditions of autoclaving and the amount of time that the waste remains under environmental conditions. This study proved that the inactivation under these optimized conditions sterilizes the waste, and that no microorganism would reproduce again after days exposed at room temperature, therefore, there would be no risk of contamination in a landfill when the waste is deposited. Having found these ideal conditions and evaluated the autoclaving process can mean a major advance in the treatment units themselves, which will have an established parameter for work.

Resíduos de Serviços de Saúde (RSS), ainda que tratados e dispostos em aterros sanitários, podem ser causas de impactos ambientais por apresentarem algum indicador de periculosidade. Segundo o apêndice IV da Resolução da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa) RDC nº 306/2004, para as tecnologias de tratamento desses resíduos é necessário que se atinja pelo menos o Nível III de inativação microbiana. Perante a ausência de dados na literatura que revelassem o tempo de exposição, temperatura e pressão ideais para a inativação microbiana no tratamento de RSS por autoclavagem e se a fração ocupada dos resíduos na autoclave poderia interferir na eficiência da desinfecção definiu-se o objetivo do trabalho para otimização do processo. Para os testes foram utilizados endósporos de Geobacillus stearothermophilus como bioindicadores e instalados cinco termopares na autoclave para aferição da temperatura dentro de todo o espaço da câmara. O RSS foi sintetizado diante das caracterizações como composição gravimétrica, distribuição granulométrica, densidade específica aparente, massa específica aparente e teor de umidade. Apresentou-se uma proposta metodológica para a avaliação do tratamento de RSS frente às dificuldades encontradas. Realizou-se ensaios com 116ºC, 125ºC e 134ºC, observando a fração de inativação em seis tempos de exposição diferentes. Sabendo-se que é padronizada em estabelecimentos de saúde a temperatura ideal para esterilização de materiais de 121ºC, apesar de não terem sido encontrados trabalhos científicos que comprovem a eficiência da esterilização nessa circunstância, foram realizados testes a 50 e 60 minutos de exposição para avaliar essa condição. Inoculou-se 106 endósporos nas amostras e a recuperação foi feita com filtração após a lavagem dos resíduos, sendo realizada a técnica de pour plate para contagem das unidades formadoras de colônias (UFC). O mesmo procedimento foi feito com a amostra retirada da autoclave. A fração de inativação dos endósporos atingiu 100% no tempo de 30 minutos de exposição à temperatura máxima de 134ºC e pressão absoluta de 2,3 kgf/cm2, resultado obtido através da relação do número de micro-organismos recuperados considerados como inoculados e o número de micro-organismos sobreviventes ao tratamento. A 121ºC houve recuperação de UFC após tratamento. A fração de ocupação não foi um fator delimitante para a inativação de endósporos, pois a temperatura se manteve a mesma independentemente da quantidade de resíduo submetido à autoclavagem. Um outro objetivo era avaliar experimentalmente a reprodução dos micro-organismos frente às condições operacionais de autoclavagem e do tempo de permanência do rejeito em condições ambientais. Esse estudo comprovou que a inativação nessas condições otimizadas esteriliza o resíduo, sendo que nenhum micro-organismo voltou a se reproduzir após dias expostos em temperatura ambiente, ou seja, não haveria riscos de contaminação em aterro sanitário quando depositados os rejeitos. Ter encontrado essas condições ideais e avaliado o processo de autoclavagem pode significar um grande avanço nas próprias unidades de tratamento, que terão um parâmetro estabelecido para trabalho. / Healthcare waste, even when treated and disposed of in landfills, can be causes of environmental impacts because they present some hazard indicator. According to appendix IV of Resolution of the National Health Surveillance Agency of Brazil (Anvisa) RDC nº 306/2004, for technologies of healthcare waste treatment, it is necessary to achieve at least Level III of microbial inactivation. The purpose of this research to optimize the process was defined taking into account the absence of data in the literature that revealed the optimal exposure time, temperature and pressure for microbial inactivation through the healthcare treatment by autoclaving and whether the fraction occupied by waste in the autoclave could interfere with the effectiveness of the disinfection. For the tests, endospores of Geobacillus stearothermophilus were used as bioindicators and five thermocouples were installed in the autoclave for temperature measurement throughout the chamber space. The healthcare waste was synthesized by characterizations such as gravimetric composition, granulometric distribution, apparent specific density, apparent specific mass and moisture content. A methodological proposal for the evaluation of waste treatment was introduced taking into consideration the difficulties encountered. Tests were performed at 116ºC, 125ºC and 134ºC, observing the fraction of inactivation at six different exposure times. Since the sterilization of materials at 121ºC is standardized in health establishments, even though no scientific studies were found to prove the sterilization efficiency in these conditions, tests were performed at 50 and 60 minutes of exposure to evaluate this condition. The concentration of 106 endospores were inoculated in the samples and the recovery was done with filtration after washing the waste, and the \"pour plate\" technique was used to count the colony forming units. The same procedure was done with the sample removed from the autoclave. The inactivation fraction of the endospores reached 100% in the time of 30 minutes of exposure to the maximum temperature of 134ºC and absolute pressure of 2.3 kgf/cm2, a result obtained by the ratio of the number of recovered microorganisms considered as inoculated and the number of microorganisms surviving the treatment. At 121ºC there was recovery of colony forming units after treatment. The occupation fraction was not a limiting factor for the inactivation of endospores, since the temperature remained the same regardless of the amount of waste submitted to autoclaving. Another objective was to experimentally evaluate the reproduction of the microorganisms taking into consideration the operational conditions of autoclaving and the amount of time that the waste remains under environmental conditions. This study proved that the inactivation under these optimized conditions sterilizes the waste, and that no microorganism would reproduce again after days exposed at room temperature, therefore, there would be no risk of contamination in a landfill when the waste is deposited. Having found these ideal conditions and evaluated the autoclaving process can mean a major advance in the treatment units themselves, which will have an established parameter for work.

Orientador: Pilar Rodriguez de Massaguer / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-04T02:36:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 NolascoJunior_Jonas_M.pdf: 917952 bytes, checksum: 1c082a25920f5c8390a73425551d86ef (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Nesta pesquisa é proposto um processo de tratamento térmico do mosto, com máxima preservação do conteúdo em açúcares fermentescíveis (sacarose, glicose e frutose), a fim de promover a inativação térmica de seus contaminantes bacterianos e por extensão os da fermentação alcoólica. Com esse objetivo foram examinadas as cinéticas de degradação térmica da sacarose, glicose, frutose e açúcares redutores totais (ART) (110 ¿ 140ºC) e também dos esporos de B. stearothermophilus (98 ¿ 130ºC), esporulado termo-resistente contaminante típico de mosto. Todos os fatores termodegradáveis estudados apresentaram cinéticas de destruição térmicas não-lineares de forma que o índice de redução decimal (D), obtido por regressão linear, não foi representativo da velocidade de inativação térmica, e assim as cinéticas foram analisadas mediante modelos não lineares que permitiram obter as constantes de velocidade de inativação (k). Seguidamente utilizando um gráfico tipo Arrhenius a energia de ativação Ea foi determinada e o valor de z foi obtido. As curvas de sacarose remanescentes obtidas durante estudo da sua hidrólise térmica, foram ajustadas por modelos logísticos que se mostraram apropriados para descrever ombros planos e caudas finais nas curvas cinéticas. A energia de ativação e valor z obtidos foram 112,32 kJ/mol e 26,99ºC, respectivamente. Essa reação se mostrou praticamente equimolecular quanto às hexoses produzidas. As curvas de concentração de ART vs tempo remanescentes foram ajustadas por modelos logísticos bipopulacionais, apropriados em casos em que o processo global é descrito por duas frações de compostos, as hexoses glicose e frutose, que se degradam em velocidades diferentes e apresentam ombros e caudas. Os valores de energia de ativação obtidos para a frutose e glicose foram bem próximas: 140,37 kJ/mol e 140,23 kJ/mol, respectivamente. Os valores z obtidos foram 21,59ºC e 21,61ºC. Quanto às velocidades de degradação a frutose apresentou velocidade 9 vezes maior do que a da glicose. A suspensão de esporos se mostrou heterogênea em resistência. A temperatura influenciou a forma das curvas de sobreviventes, para os esporos de B. stearothermophilus ATCC1518. Nas temperaturas mais baixas, as curvas de inativação térmica apresentaram ombro plano, passando por comportamento de modelos de frações lineares consecutivas, e finalmente na temperatura mais elevada apresentou modelo linear com eliminação da fração termo-sensível. Os valores de energia de ativação e z obtidos foram 249,52 kJ/mol e 11,48ºC, respectivamente. O processo térmico para inativação dos contaminantes do mosto foi definido após o decantador, onde foram quantificados grandes grupos microbianos em amostras coletadas de Usinas situadas em regiões de clima e umidade distintas. A concentração máxima de esporos termofílicos produtores de acidez plana foi de 9x101esporos/ml de mosto em Usina localizada em região quente e úmida enquanto um valor de 4 esporos/ml de mosto foi encontrado em Usina localizada em região de clima seco e com predominância de solo com baixa capacidade de retenção de água. Foi determinada a letalidade do processo de decantação para os contaminantes do caldo de cana e mosto através da determinação da história térmica mínima detectada no ponto mais frio de dois decantadores industriais. Baseado no tempo de residência médio e na temperatura mais fria detectada foi possível estimar que a decantação produz, em média, 4,0 x 106 reduções decimais da população de Lactobacillus fermentum e apenas 0,14 reduções decimais nos esporos de B. stearothermophilus. Baseado no conhecimento da cinética dos principais fatores termodegradáveis foi definida uma região de tratamento térmico que se extende dos 114 a 140ºC e de 3000 a 4 segundos. Graficamente essa região é um triangulo delimitado, abaixo pela reta correspondente a 5 reduções decimais dos esporos de B. stearothermophilus e acima pela reta correspondente à preservação de 98,7% dos ART do mosto. O nível de preservação de 98,7% dos ART foi escolhido pela precisão das análises usadas na determinação dos mesmos (1,3%). Qualquer processo térmico dentro dessa região será capaz de satisfazer o requisito de 5 reduções decimais dos esporos de B. stearothermophilus e preservação de 98,7% dos ART do mosto. A prática desse processo térmico implica na adoção de uma estratégia preventiva no controle da contaminação da fermentação em oposição às estratégias corretivas baseadas no uso de antibióticos que se pratica nas Usinas de Açúcar e Álcool Brasileiras / Abstract: In this research is proposed a thermal treatment process for sugar cane must with maximum retention of fermentable sugar (sucrose, glucose and fructose), to promote a thermal inactivation of its bacterial contaminants and therefore, those of alcoholic fermentation. With this objective were examined the thermo degradation kinetics of sucrose, glucose, fructose, total reducing sugars (TRS) (110 ¿ 140ºC) and also B. stearothermophilus spores (98 ¿ 130ºC), a typical thermo resistant sporulated contaminant of musts. All thermo degradable factors showed non-linear thermal destruction kinetics due to this the D value, obtained for linear regression, could not be used, thus the kinetics were reported by Arrhenius model, obtaining the reaction rates (k), Activation Energy (Ea) and the z value through out Ea values. Sucrose remaining curves obtained as a function of time during its thermal hydrolysis, were fitted by logistic models which are suitable to describe flat shoulders and ending tales in the kinetic curves. Activation Energy and z value were 112,32 kJ/mol and 26,99°C, respectively. This reaction showed to be equimolecular in regard to the produced hexoses. TRS remaining curves vs time were adjusted by logistic bipopulational models, suitable when the overall process presents two fractions, the hexoses glucose and fructose, with different degradation rates with shoulders and tales. Ea and z values for fructose and glucose were quite close: 140,37 kJ/mol, z of 21,59°C and 140,23 kJ/mol, z of 21,61°C, respectively. As far as degradation rates are concerned, fructose showed to degrade 9 times faster than glucose. Spores suspension showed heterogeneity in thermal resistance. Temperature affected the shape of survival curves for B. stearothermophilus ATCC1518 spores. At lower temperatures, it showed flat shoulder, passing through consecutive linear fraction models behaviors, and finally at higher temperatures followed linear model with elimination of the thermo-sensible fraction. Ea and z values were 249,52 kJ/mol and 11,48°C respectively. A thermal process for sugar cane must contaminant inactivation was defined after the decanter, where microbiological quantification of various microbial groups was carried out on samples from sugar cane mills located in region with different climate and humidity conditions. The maximum thermophilic flat-sour spores count was of 9 x 101 spores/ml of must and was originated from a sugar cane mill located at the warmest and most humid region, while a count of 4 spores/ml of must was found in a plant with dry climate and with soil of low capability for water retention. Decanters lethality of must contaminant was determined based on the minimum detected thermal history in two industrial equipments. Applying the average residence time with this thermal history, it was estimated that the decantation results, on average, 4,02*106 log reductions of Lactobacillus fermentum and only 0,13 log reductions in the counting of B. stearothermophilus spores. Based on the kinetic knowledge of the thermo degradable major factors it was established a thermal process region from 114 to 140C and 3000 to 4 seconds. Graphically, this region is a triangle delimited by the line for 5 log reductions of B. stearothermophilus (lower limit), and the line for 98,7% retention of the must TRS. This preservation level was adopted considering the accuracy of the sugar analysis methodology (1,3%). Any thermal process within this region will be able to satisfy the requirement of 5 log reductions for B. stearothermophilus and 98,7% retention of must TRS. The implementation of this thermal process implies in the adoption of a preventive strategy in the contamination control of the fermenting process, opposite to the corrective strategies currently applied based on antibiotics, which is common practice in Brazilian Sugar Canes mills / Mestrado / Ciência de Alimentos / Mestre em Ciência de Alimentos