Submitted by Gizele Lima (gizele.lima@inpa.gov.br) on 2017-02-13T19:00:50Z No. of bitstreams: 2 Dissertação- Vanessa Siqueira ATU 2016.pdf: 1258786 bytes, checksum: 8866db4ee63bb58e42bb5ce9a292645a (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-13T19:00:50Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação- Vanessa Siqueira ATU 2016.pdf: 1258786 bytes, checksum: 8866db4ee63bb58e42bb5ce9a292645a (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-02-19 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas - FAPEAM / Fusarium decemcellulare is the main causal agent supersprouting in guarana, currently one of the major fungal diseases of culture in the State of Amazonas. Although considered free zone the disease years ago, in 2013 the disease was first detected in the State of Bahia, the main producer of guarana in Brazil. Depending the attacks area, supersprouting features three different symptoms: galls on stems, multiplication of vegetative buds or floral hypertrophy in inflorescences. Considered by many years a disease secondary and unimportant for the guarana crop, few studies have been conducted on this pathosystem the past 30 years. The analysis of distribution in MAT-1 and MAT-2 idiomorphs population is critical for the inference of the dynamics and potential of genetic variation of a pathogen and the degree of risk to the host. This work aimed to analyze the distribution of mating-type in F. decemcellulare and to estimate the effective number of the pathogen population in the main producing areas of guarana in the state of Amazonas. Of the different symptoms of supersprouting, 285 isolates were obtained and characterized. Of these, 165 presented the idiomorph MAT-1 and 120 MAT-2. Unlike other host species of F. decemcellulare, in guarana there was no occurrence of homothallic isolates and most producing cities of guarana analyzed had an effective population number over than 80%, showing a balance in the frequency of the idiomorphs MAT-1 and MAT- 2, suggesting the possibility of sexual reproduction in the field. / Fusarium decemcellulare é o agente causal de superbrotamento em guaranazeiro, atualmente uma das principais doenças fúngicas da cultura no Estado do Amazonas. Embora considerada zona sem ocorrência da doença por anos, em 2013 foi detectada pela primeira vez no Estado da Bahia, principal produtor de guaraná no Brasil. Dependendo do tecido atacado, o superbrotamento apresenta três diferentes sintomas: galhas no caule, multiplicação das gemas vegetativas e hipertrofia floral. Considerada por muitos anos uma doença secundária e sem importância para a cultura do guaranazeiro, poucos estudos foram realizados sobre este patossistema nos últimos 30 anos. A análise da distribuição na população dos idiomorfos MAT-1 e MAT-2 é fundamental para a inferência da dinâmica e do potencial de variação genética de um patógeno e o grau de risco para o hospedeiro. Este trabalho teve como objetivo analisar a distribuição de mating-type em F. decemcellulare e estimar o número efetivo da população do patógeno nas principais áreas produtoras de guaraná no estado do Amazonas. Dos diferentes sintomas de superbrotamento em guaranazeiro, foram obtidos e caracterizados 285 isolados. Destes 165 apresentaram o idiomorfo MAT-1 e 120 MAT-2. Diferente de outras espécies hospedeiras de F. decemcellulare, em guaranazeiro não houve ocorrência de isolados homotálicos e a maioria dos municípios produtores de guaraná analisados apresentaram número efetivo de população superior a 80%, mostrando um equilíbrio na frequência dos idiomorfos MAT-1 e MAT-2, sugerindo a possibilidade de reprodução sexuada no campo.

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-03-03T11:33:29Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação - Igor K. C. Lobo.pdf: 3889233 bytes, checksum: 90f8aeeb9144c0133ea8b9fbfc42611c (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-03-03T11:33:53Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação - Igor K. C. Lobo.pdf: 3889233 bytes, checksum: 90f8aeeb9144c0133ea8b9fbfc42611c (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-03-03T11:34:15Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação - Igor K. C. Lobo.pdf: 3889233 bytes, checksum: 90f8aeeb9144c0133ea8b9fbfc42611c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-03T11:34:15Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação - Igor K. C. Lobo.pdf: 3889233 bytes, checksum: 90f8aeeb9144c0133ea8b9fbfc42611c (MD5) Previous issue date: 2016-07-15 / FAPEAM - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / Guarana from Amazonia is much appreciated for its medicinal and energizing properties, and the Amazonas state is the second national contribution in production. However, this production has been affected by a major disease of culture: the overbudding, whose causal agent is the fungus Fusarium decemcellulare. The symptoms of the disease are overbudding, hyperplasia and hypertrophy floral and stem galls. In other studies, the development of symptoms similar to those overbudding’s symptoms is associated to production, or modulation, of auxin hormone by the pathogen. Thus, this study aimed identify genes from biosynthesis pathways of auxin hormone in Fusarium decemcellulare and analyze differences between transcriptomic profiles of homothallic and heterothallic individuals. Twelve libraries were sequenced referring to six biological replicates (three homothallic individuals and three heterothallic individuals) for each growth condition: BD and MS media. Quality control of reads was carried out by Trimmomatic-0.33, FastQC and SortMeRNA softwares. Mapping reads to reference genome was done with TopHat2 software and the transcriptome assembly in each condition, as well as differential expression, were performed using the Cufflinks package (Cufflinks, Cuffmerge and Cuffdiff). Functional annotation of transcripts was performed by KEGG Automatic Annotation Server (KAAS) and Blast2GO. To verify the ability to synthesize auxin, FDC200 and CML2241 were grown in MS medium, which was then analyzed by ultra performance liquid chromatography. Genes from two putative auxin biosynthesis pathway were identified at genomic and transcriptomic levels: the indole-acetaldehyde pathway, its deviation and the tryptamine pathway. The expression of these genes was detected in both individuals, heterothallic and homothallic. A gene from a putative aminocyclopropane (ACC) deaminase also has been identified at genomic and transcriptomic levels, which is responsible for degrading the precursor of hormone ethylene, ACC. Furthermore, the auxin hormone was detected in the MS medium, where FDC200 and CML2241 were grown, confirming biosynthesis of IAA (indole-3-acetic acid) by the fungus. Therefore, the data obtained suggest the use of auxin biosynthesis and blocking of plant ethylene production by Fusarium decemcellulare to evade the host defense system, and the symptoms of overbudding in guarana plant would be a consequence of hormonal imbalance caused by the fungus. / O guaraná da Amazônia é muito apreciado por suas propriedades medicinais e energéticas, sendo o Amazonas a segunda contribuição nacional na produção. Esta produção, entretanto, acaba sendo afetada por uma das principais doenças da cultura: o superbrotamento, que tem como agente causal o fungo Fusarium decemcellulare. Os sintomas da doença são: o superbrotamento de gemas, a hiperplasia e hipertrofia floral e as galhas do caule. Em diversos estudos, associa-se sintomas semelhantes aos do superbrotamento a uma produção, ou ainda modulação, do hormônio auxina por parte do patógeno. Assim, o objetivo deste trabalho foi de identificar genes de vias de síntese do hormônio auxina em Fusarium decemcellulare e analisar diferenças entre perfis transcriptômicos de isolados homotálicos e heterotálicos. Foram sequenciadas 12 bibliotecas, referentes a seis réplicas biológicas (três isolados homotálicos e três isolados heterotálicos de F. decemcellulare) para cada condição de crescimento: meios BD e MS. O controle de qualidade das reads foi realizado pelos softwares Trimmomatic-0.33, FastQC e SortMeRNA. O mapeamento de reads no genoma de referência foi realizado com o software TopHat2 e a montagem do transcriptoma final em cada condição, bem como o cálculo de expressão diferencial, foram realizados através do pacote Cufflinks (Cufflinks, Cuffmerge e Cuffdiff). A anotação funcional dos transcritos foi realizada através das ferramentas KEGG Automatic Annotation Server (KAAS) e Blast2GO. Para verificar a habilidade de F. decemcellulare em sintetizar auxina, os isolados FDC200 e CML 2241 foram crescidos em meio MS, o qual foi posteriormente analisado por meio de cromatografia líquida de ultra performance. Foram identificados, a nível genômico e transcriptômico, duas putativas vias de síntese do hormônio auxina: a via do indol-acetaldeído, mais o desvio desta via, além da via da triptamina. A expressão destes genes foi detectada tanto em indivíduos heterotálicos, quanto em homotálicos. Foi identificado ainda, também a nível genômico e transcriptômico, um gene de uma putativa aminociclopropano (ACC) deaminase, responsável por degradar o precursor do hormônio etileno, o ACC. Além disso, o hormônio auxina foi detectado no meio de cultura MS, onde foram crescidos os isolados FDC200 e CML2241, confirmando biossíntese por parte do fungo. Os dados aqui obtidos sugerem, portanto, que Fusarium decemcellulare estaria se utilizando da síntese de auxina e bloqueio da produção de etileno da planta para burlar o sistema de defesa da hospedeira, sendo os sintomas do superbrotamento em guaranazeiro uma consequência do desequilíbrio hormonal causado pelo fungo.

Entre os problemas fitossanitários da maçã (Malus spp) estão o superbrotamento e o lenho mole, doenças associadas a fitoplasma. Para o caso do lenho mole, ainda não é totalmente aceito que um fitoplasma seja o agente causal. No entanto, vários trabalhos, usando microscopia eletrônica e enxertia de tecidos, têm apontado para a natureza fitoplasmática da doença. Mais recentemente, um fitoplasma do grupo 16SrI foi detectado em plantas de maçã cultivadas no Canadá e na República Checa. No Brasil, o lenho mole ocorre em vários estados do sul do país, sendo que pesquisas conduzidas com microscopia eletrônica e testes biológicos de transmissão por enxertia também têm evidenciado um possível fitoplasma associado à doença. O objetivo do presente trabalho foi contribuir para o conhecimento da etiologia destas doenças. Para isto, três plantas de maçã com sintomas de lenho mole, cultivadas em pomar instalado na região de Vacaria/RS, foram amostradas visando a detecção de fitoplasma, bem como a sua identificação e posterior classificação. Para detecção, foi empregada a técnica de PCR duplo com os oligonucleotídeos R16mF2/mR1 e R16F2n/R2. A identificação foi através de PCR com os oligonucleotídeos R16(III) F2/R1 e da técnica de RFLP com as enzimas de restrição AluI, HhaI, KpnI, HinfI, HpaII, MseI, RsaI e Sau3AI. Os resultados mostraram a presença de fitoplasma em 29 das 54 amostras coletadas durante o ano de 2000. As amostras de ramos e raízes coletadas no período de janeiro - abril e setembro - outubro apresentaram consistentemente fitoplasma em seus tecidos. Nas amostras colhidas em junho - agosto não houve detecção do microrganismo. A identificação molecular revelou que o fitoplasma presente em plantas sintomáticas pertencia ao grupo 16SrIII, sendo os resultados de PCR confirmados pela aplicação de RFLP. As análises de RFLP permitiram também determinar que este fitoplasma é, possivelmente, um membro do sub-grupo B. A constatação de um fitoplasma de grupo 16SrIII associado ao lenho mole em plantas de maçã cultivadas no Brasil, reforça as evidências relatadas em outros trabalhos, de que um fitoplasma seja o agente causal da doença. O fato de um fitoplasma diverso do grupo 16SrI estar associado ao lenho mole no Brasil pode ser justificado pela diversidade destes molicutes, em função da região geográfica e da variedade do hospedeiro. / The proliferation and rubbery wood diseases which are associated with phytoplasma are some of the diseases that occur in apple trees (Malus spp). In the case of rubbery wood disease, phytoplasm is not totally accepted as its causal agent. However, several researches by using electron microscopy and tissue grafting, have been able to show the phytoplasma associated with that disease. Recently, a phytoplasma from group 16SrI was detected in apple plants grown in Canada and Czech Republic. In Brazil, rubbery wood occurs in several states of the south region. Results obtained through electron microscopy and transmission biological tests using grafiting have shown a possible phytoplasma associated to the disease. The purpose of the present work was to contribute for the knowledge of that disease aetiology. Thus tissue samples from three apple plants exhibiting rubbery wood symptoms, grown at an orchard installed in the region of Vacaria/RS, were obtaind for phytoplasma detection, identification and classification. Nested PCR technique with R16mF2/mR1 and R16F2n/R2 primers was emploed to detect phytoplasma. PCR with R16(III) F2/R1 primers and RFLP technique with the restriction enzymes Alu I, Hha I, Kpn I, Hinf I, Hpa II, Mse I, Rsa I and Sau 3AI were used to phytoplasma indentification. The results showed that phytoplasma occurred in 29 of the 54 samples collected in the year of 2000. Branches and root samples obtained from January to April and from September to October exhibited phytoplasma in their tissues. In tissue samples collected from June to August, the microorganism has not been detected. The molecular identification revealed that the phytoplasm from symptomatic plants belonged to the group 16SrIII and the PCR results were confirmed by RFLP technique. Based upon the RFLP analyses it can be suggested that this phyoplasma is a member of the sub-group B. The occurrence of a phytoplasm of group 16SrIII associated to rubbery wood in apple plants grown in Brazil, reinforces the evidences related in other works, that a phytoplasm is the causal agent of that disease. The fact that a phytoplasm diferent from 16SrI group is associated to rubbery wood diseases in Brazil can be justified for the diversity of these mollicutes, due to geographical area and host.

Entre os problemas fitossanitários da maçã (Malus spp) estão o superbrotamento e o lenho mole, doenças associadas a fitoplasma. Para o caso do lenho mole, ainda não é totalmente aceito que um fitoplasma seja o agente causal. No entanto, vários trabalhos, usando microscopia eletrônica e enxertia de tecidos, têm apontado para a natureza fitoplasmática da doença. Mais recentemente, um fitoplasma do grupo 16SrI foi detectado em plantas de maçã cultivadas no Canadá e na República Checa. No Brasil, o lenho mole ocorre em vários estados do sul do país, sendo que pesquisas conduzidas com microscopia eletrônica e testes biológicos de transmissão por enxertia também têm evidenciado um possível fitoplasma associado à doença. O objetivo do presente trabalho foi contribuir para o conhecimento da etiologia destas doenças. Para isto, três plantas de maçã com sintomas de lenho mole, cultivadas em pomar instalado na região de Vacaria/RS, foram amostradas visando a detecção de fitoplasma, bem como a sua identificação e posterior classificação. Para detecção, foi empregada a técnica de PCR duplo com os oligonucleotídeos R16mF2/mR1 e R16F2n/R2. A identificação foi através de PCR com os oligonucleotídeos R16(III) F2/R1 e da técnica de RFLP com as enzimas de restrição AluI, HhaI, KpnI, HinfI, HpaII, MseI, RsaI e Sau3AI. Os resultados mostraram a presença de fitoplasma em 29 das 54 amostras coletadas durante o ano de 2000. As amostras de ramos e raízes coletadas no período de janeiro – abril e setembro – outubro apresentaram consistentemente fitoplasma em seus tecidos. Nas amostras colhidas em junho – agosto não houve detecção do microrganismo. A identificação molecular revelou que o fitoplasma presente em plantas sintomáticas pertencia ao grupo 16SrIII, sendo os resultados de PCR confirmados pela aplicação de RFLP. As análises de RFLP permitiram também determinar que este fitoplasma é, possivelmente, um membro do sub-grupo B. A constatação de um fitoplasma de grupo 16SrIII associado ao lenho mole em plantas de maçã cultivadas no Brasil, reforça as evidências relatadas em outros trabalhos, de que um fitoplasma seja o agente causal da doença. O fato de um fitoplasma diverso do grupo 16SrI estar associado ao lenho mole no Brasil pode ser justificado pela diversidade destes molicutes, em função da região geográfica e da variedade do hospedeiro. / The proliferation and rubbery wood diseases which are associated with phytoplasma are some of the diseases that occur in apple trees (Malus spp). In the case of rubbery wood disease, phytoplasm is not totally accepted as its causal agent. However, several researches by using electron microscopy and tissue grafting, have been able to show the phytoplasma associated with that disease. Recently, a phytoplasma from group 16SrI was detected in apple plants grown in Canada and Czech Republic. In Brazil, rubbery wood occurs in several states of the south region. Results obtained through electron microscopy and transmission biological tests using grafiting have shown a possible phytoplasma associated to the disease. The purpose of the present work was to contribute for the knowledge of that disease aetiology. Thus tissue samples from three apple plants exhibiting rubbery wood symptoms, grown at an orchard installed in the region of Vacaria/RS, were obtaind for phytoplasma detection, identification and classification. Nested PCR technique with R16mF2/mR1 and R16F2n/R2 primers was emploed to detect phytoplasma. PCR with R16(III) F2/R1 primers and RFLP technique with the restriction enzymes Alu I, Hha I, Kpn I, Hinf I, Hpa II, Mse I, Rsa I and Sau 3AI were used to phytoplasma indentification. The results showed that phytoplasma occurred in 29 of the 54 samples collected in the year of 2000. Branches and root samples obtained from January to April and from September to October exhibited phytoplasma in their tissues. In tissue samples collected from June to August, the microorganism has not been detected. The molecular identification revealed that the phytoplasm from symptomatic plants belonged to the group 16SrIII and the PCR results were confirmed by RFLP technique. Based upon the RFLP analyses it can be suggested that this phyoplasma is a member of the sub-group B. The occurrence of a phytoplasm of group 16SrIII associated to rubbery wood in apple plants grown in Brazil, reinforces the evidences related in other works, that a phytoplasm is the causal agent of that disease. The fact that a phytoplasm diferent from 16SrI group is associated to rubbery wood diseases in Brazil can be justified for the diversity of these mollicutes, due to geographical area and host.

Fitoplasmas são procariotos sem parede celular e habitantes de floema, agentes de doenças que causam danos consideráveis em diversas culturas. O maracujazeiro é uma espécie tropical cultivada em diversas regiões brasileiras. As doenças estão entre os fatores que podem causar danos à cultura e o superbrotamento do maracujazeiro tem se revelado como sendo uma das mais importantes. Esta doença, associada com fitoplasma, foi reportada somente no Brasil, onde foi registrada nos estados do Rio de Janeiro e de Pernambuco, no início da década de oitenta. Embora alguns estudos sobre o assunto tenham sido feitos anteriormente, o presente estudo foi conduzido para: demonstrar a presença constante do agente em associação com plantas doentes; revelar a ocorrência do fitoplasma em algumas áreas pertencentes a alguns estados; identificar, classificar e estudar filogeneticamente o fitoplasma; e demonstrar a patogenicidade do fitoplasma do superbrotamento do maracujazeiro. Em 2005-2006, plantas sintomáticas suspeitas de estarem infectadas por fitoplasma foram amostradas em algumas áreas do estado de São Paulo e vários outros estados brasileiros. A detecção e identificação por PCR duplo foi conduzida com os pares de oligonucleotídeos universais para fitoplasmas R16mF2/mR1-R16 F2n/R2 e pelo par específico R16(III) F2/R1, repectivamente. Para as análises de RFLP foram usadas as enzimas de restrição AluI, HhaI, KpnI, HinfI, HpaII, MseI, RsaI e MboI. Análises filogenéticas foram baseadas nas seqüências de nucleotídeos do 16S rDNA de fitoplasmas pertencentes a grupos e subgrupos distintos. Os ensaios de patogenicidade foram feitos usando-se enxertia de tecido. Amplificações de fragmentos de DNA de 1,2kb usando-se os oligonuclotídeos universais revelaram a presença de fitoplasma nas plantas sintomáticas de todas as regiões amostradas. Amplificações de fragmentos de DNA de 0,8kb pelos oligonucleotídeos específicos indicaram que o fitoplasma detectado era afiliado ao grupo 16SrIII, enquanto as análises de RFLP confirmaram a identificação feita com base no PCR e mostraram que o fitoplasma pode ser classificado como um membro do subgrupo 16SrIII-B. Sequenciamento e análises filogenéticas revelaram que o fitoplasma do superbrotamento do maracujazeiro é um típico representante do grupo 16SRIII, quando comparado com fitoplasmas de outros grupos. A patogenicidade foi demonstrada através da observação de sintomas típicos da doença, seguida da detecção molecular do fitoplasma in plantas sadias enxertadas com ramos de plantas infectadas. Os resultados obtidos no presente estudo permitiram: confirmar a diagnose baseada na sintomatologia; revelar a associação constante entre planta doente e fitoplasma, confirmando investigações anteriores conduzidas com microscopia eletrônica; identificar o fitoplasma como um membro do grupo 16SrIII-B; demonstrar que o fitoplasma é o agente causal do superbrotamento do maracujazeiro; e mostrar a ocorrência atual do patógeno nos estados da Bahia, do Paraná, Rio de Janeiro, Sergipe e São Paulo. / Phytoplasmas are cell wall-less prokaryotes and phloem-inhabitants associated with diseases that affect several crops. Passion fruit plant is a tropical species cultivated in various Brazilian regions. Diseases are among factors that may cause damage to this crop and the passion fruit witches\' broom has been revealed as very important one. That disease, associated with phytoplasma, was reported only in Brazil, where it was registered in Rio de Janeiro and Pernambuco States in the beginning of eighty decade. Although some studies about that subject have been made previously, the present study was conducted in order to: demonstrate the constant presence of the agent in association with diseased plants; reveal the occurrence of fitoplasma in some areas belonging to some States; identify, classify and study phylogenetically the phytoplasma; and demonstrate the pathogenicity of passion fruit witches\' broom phytoplasma. In 2005-2006, symptomatic plants suspected of phytoplasma infection were sampled in some areas of São Paulo State and various other Brazilian States. The detection and identification by nested PCR were performed with the universal primer pair R16mF2/mR1-16F2n/R2 and specific pair R16(III)F2/R1, respectively. For RFLP analyses were used the restriction enzymes AluI, HhaI, KpnI, HinfI, HpaII, MseI, RsaI e MboI. Phylogenetic analyses were based on the nucleotide sequences of the 16S rDNA from phytoplasmas belonging to distinct groups and subgroups. Pathogenecity assays were made by using grafting of tissue. Amplifications of DNA fragments of 1.2kb by using universal primer pairs revealed the presence of phytoplasma in the symptomatic plants from all sampled regions. Amplifications of DNA fragments of 0,8kb by specific primer pair indicated that the detected phytoplasma is affiliated to the group 16SrIII, while RFLP analyses confirmed the identification based on PCR and showed that phytoplasma may be classify as a member of the subgroup 16SRIII-B. Sequencing and phylogenetic analysis revealed that the passion fruit witches\'broom phytoplasma is a typical representative of group 16SRIII, when compared with phytoplasmas from other groups. Pathogenicity was demonstrated through the observation of typical symptoms of the disease followed by molecular detection of the phytoplasma in healthy plants grafted with shoots from infected plants. The results obtained in the present study allowed: to confirm the diagnosis based on the symptomatology; to reveal the firm association between diseased plant and phytoplasma, confirming previous investigations conduced by electron microscopy; to identify the phytoplasma as a member of the group 16SRIII-B; to demonstrate that phytoplasma is the causal agent of passion fruit witches\' broom; and to show the present occurrence of the pathogen in the States of Bahia, Paraná, Rio de Janeiro, Sergipe, and São Paulo

Os fitoplasmas são procariotos sem parede celular pertencentes à classe Mollicutes. Um grande número de doenças de plantas cultivadas estão associadas aos fitoplasmas, incluindo tanto aquelas que afetam grandes culturas como aquelas ocorrentes em diversas espécies de ornamentais. Em cana-de-açúcar, uma doença conhecida como síndrome do amarelecimento foliar ou amarelinho causou danos expressivos à cultura e provocou a substituição de uma cultivar muito produtiva e extensivamente plantada no estado de São Paulo. A doença também foi registrada em outros países e investigações sobre a etiologia evidenciaram a ocorrência de vírus e fitoplasma como agentes. Em primavera (Bougainvillea spectabilis), uma espécie de origem brasileira bastante apreciada como ornamental, foram observados sintomas de clorose foliar, superbrotamento de ramos, deformações foliares e florais e declínio, sintomas característicos de infecção causada por fitoplasmas. O presente trabalho teve como finalidade investigar a etiologia desta nova doença encontrada em primavera, denominada de superbrotamento, e identificar molecularmente o fitoplasma envolvido com a síndrome do amarelecimento foliar da cana-de-açúcar. Para isso, amostras de plantas sintomática e assintomáticas de cana-de-açúcar e primavera foram submetidas à extração do DNA total. A partir deste DNA, a detecção molecular foi conduzida com PCR duplo usando-se os iniciadores P1/Tint na primeira reação e R16 F2n/R2 na segunda reação. Posteriormente à detecção, foi realizada a identificação através de PCR duplo com iniciadores específicos e análises de RFLP com as enzimas de restrição AluI, RsaI, KpnI, MseI, HhaI, HpaII, e MboI. Análises filogenéticas foram baseadas nas sequências nucleotídicas do 16S rDNA dos fitoplasmas detectados na cana e na primavera, bem como nas sequências de outros fitoplasmas disponíveis em banco de dados. O teste de transmissão usou plantas infectadas de primavera e plantas sadias de vinca, interligados por filamentos de cuscuta. Os resultados mostraram que fragmentos genômicos de aproximadamente 1.2kb foram amplificados em 33% e 60% das amostras de DNA extraído de plantas sintomáticas de cana-de-açúcar e de primavera, respectivamente. O uso de iniciadores específicos demonstrou a presença de fitoplasmas dos grupos 16SrI e 16SrIII associados ao superbrotamento da primavera e de um fitoplasma do grupo 16SrI associado à síndrome do amarelecimento foliar. Análises de RFLP, confirmaram a ocorrência de fitoplasmas membros dos grupos 16SrI e 16SrIII em plantas de primavera, e revelaram que estes fitoplasmas poderiam ser classificados nos subgrupos 16SrI-B e 16SrIII-B. A identificação evidenciou que o fitoplasma encontrado em cana-de-açúcar é um representante do grupo 16SrI, sub-grupo B. Análises filogenéticas e de mapas de sítios putativos de restrição, confirmaram os resultados obtidos com os testes de PCR e com as análises de RFLP para os fitoplasmas relacionados às duas doenças estudadas. A transmissão dos fitoplasmas presentes em primavera para plantas de vinca através da cuscuta demonstrou, biologicamente, que ambos são agentes causais do superbrotamento. Em quase todas as amostras de cana-de-açúcar positivas para fitoplasma também foi detectada a presença de um luteovírus, através do uso de RT-PCR, demonstrando que o amarelecimento foliar da cana-de-açúcar no estado de São Paulo está associado a um complexo formado por fitoplasma e vírus. No caso da primavera, este trabalho se constituiu no primeiro relato da ocorrência de fitoplasmas como agente de doença nessa espécie. / Phytoplasmas are wall-less prokaryote belonging to class Mollicutes. Several hundred plant species, including food crops and ornamental species have been reported as hosts of phytoplasmas, which are associated with important diseases. In sugarcane, a disease known as yellow leaf syndrome caused serious damage and led to replacement of a cultivar with high yield and widely distributed in the São Paulo State. The syndrome has also been described in other countries and studies about etiology evidenced the occurrence of virus and phytoplasmas as causal agents. In bougainvillea (Bougainvillea spectabilis), a native specie from Brazilian territory, were observed typical symptoms of phytoplasmas, characterized by leaf chorosis, proliferation of branches, deformation of leaves and flowers, decline, and death. The aim of this study was to investigate the etiology of the disease observed in bougainvillea and to identify molecularly the phytoplasma associated with sugarcane yellow leaf. Thus, DNA was extracted from samples collected of naturally symptomatic plants of sugarcane and bougainvillea. Nested PCR primed by P1/Tint-R16F2n/R2 was used for detection, while specific primers were used for identification. RFLP with restriction enzymes AluI, RsaI, KpnI, MseI, HhaI, HpaII, MboI and phylogenetic analysis based on nucleotide sequences of 16S rDNA were also used to identify the phytoplasmas detected in sugarcane and boungainvillea. Transmission of phytoplasmas from bougainvillea to periwinkle by dodder was conducted to demonstrate the pathogenecity of this agents. Results showed that genomic fragments of 1.2kb were amplified, evidencing the presence of phytoplasmas in 33% and 60% of symptomatic sugarcane and bougainvillea plants, respectively. PCR with specific primer pairs demonstrated that phytoplasmas affiliated to groups 16SrI and 16SrIII were associated with bougainvillea proliferation, while a phytoplasma belonging to group 16SrI was present in sugarcane plants exhibiting symptoms of yellow leaf. RFLP and phylogenetic analysis revealed that phytoplasmas found in bougainvillea could be classified within subgroups 16SrI-B and 16SrIII-B, and that phytoplasma detected in sugarcane is a representative of subgroup 16SrI-B. Almost the totality of symptomatic sugarcane plants showed the presence of virus, by using RT-PCR, indicating that a coinfection of virus and phytoplasma could be responsible by inducing the disease. Positive results for transmission revealed that both phytoplasmas found in boungainvillea are causal agents of the disease. This is the first report of phytoplasma as agent of disease in that species.

Fitoplasmas são agentes causais de diversas doenças em numerosas espécies botânicas cultivadas, daninhas e silvestres. São procariotos que não apresentam parede celular, parasitas intracelulares obrigatórios, habitantes do floema e da hemolinfa, sendo transmitidos naturalmente por insetos vetores do tipo cigarrinhas. Plantas de oliveira apresentando sintomas tipicamente induzidos por fitoplasmas, caracterizados por desenvolvimento lento e superbrotamento de ramos com folhas de tamanho reduzido, foram observadas na cidade de Extrema (MG). A anomalia provoca danos significativos, pois retarda o início de produção e reduz o rendimento da cultura. Sintomas semelhantes foram relatados em olivais implantados em outros países, onde a doença foi associada aos fitoplasmas. O objetivo deste trabalho foi demonstrar a associação de fitoplasma com as plantas afetadas e identificar o fitoplasma presente nas árvores doentes. Para isto foram utilizadas as técnicas moleculares de PCR e RFLP, além de análise filogenética. Os resultados revelaram a presença de fitoplasmas em 73% das árvores sintomáticas analisadas, evidenciando que os sintomas observados no campo eram induzidos por fitoplasma. A doença foi denominada de vassoura-de-bruxa da oliveira. A identificação molecular permitiu classificar o fitoplasma como um representante do grupo 16SrVII-B. Este é o primeiro relato da ocorrência de fitoplasma em plantas de oliveira no Brasil. Em termos mais amplos, é o primeiro relato da associação de um fitoplasma do grupo 16SrVII com a doença vassoura-de-bruxa da oliveira, a qual, em outros países, está associada a fitoplasmas distintos do fitoplasma identificado no presente trabalho. / Phytoplasmas are causal agents of diverse diseases occurring in numerous botanical species, among them cultivated, weeds and wild plants. They are wall-less prokaryotes, obligate intracellular parasites, inhabitants of phoem vessels and hemolymph, and naturally transmitted by insect vectors belonging to the group of the leafhoppers. Olive trees exhibiting symptoms typically induced by phytoplasmas, characterized by slow growth and shoot proliferation with small leaves, were observed in the municipality of Extrema (MG). The anomaly provokes significant damage due to the delay in the beginning of the production and yield reduction of the crop. Similar symptoms have been reported in olive orchards cultivated in other countries, where the disease was associated with phytoplasmas. The objective of the present investigation was to demonstrate the association of phytoplasma with affected plants and identify the phytoplasma present in diseased trees. PCR assays, RFLP analysis and phylogenetic analysis were used to molecular characterization of the phytoplasma. The results revealed the presence of phytoplasma in 73% of the symptomatic trees, evidencing that the symptoms observed in field were induced by phytoplasma. The disease was designated by olive witches\" broom. The molecular identification allowed classify the phytoplasma as a representative of the 16SrVII-B group. This is the first report of the occurrence of phytoplasma in olive plants in Brazil. Moreover, this is also the first report of the association of a group 16SrVII phytoplasma with olive whitches\" broom disease, which has been described in other countries in association with phytoplasmas different from the phytoplasma identified in the present study.

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For many years considered a disease with no economic importance the oversprouting caused by Fusarium decemcellulare that is becoming a serious problem for the guarana culture in the Amazon and was also recently reported in guarana crops in the Bahia state, the disease has at least three characteristic symptoms: oversprouting of vegetative buds, floral hypertrophy and stem galls. This study aimed to analyze the diversity and genetic structure of F. decemcellulare from the main producing area of guarana in the Amazonas by molecular ISSR marker and conduct phylogenetic analysis to determine the occurrence of species complex in guarana plant. We analyzed 300 isolates collected from eight districts of Amazonas state based on 10 ISSR markers that generated 167 polymorphic bands. The number of observed alleles (Na) ranged from 1.48 (Presidente Figueiredo to 1.98 (Manaus) and the effective number of alleles (Ne) was 1.54 (Urucará) and 1.41 (Presidente Figueiredo), the values for heterozygosity (H) and Shannon Index (I) were very similar among the eight populations, with minimal to Rio Preto da Eva (H = 0:29 and I = 0:43) and maximum to Manaus (M = 0:39 and I = 0:48). The analysis of molecular variance (AMOVA) showed high genetic variability within populations (77%). Population genetic analysis by PCO (Principal coodenates analysis) and genetic structure of 300 isolates identified two populations from F. decemcellulare in guarana plant in Amazon. To verify if the different populations identified represent the same phylogenetic species, partial sequencing of the EF-1α was successfully obtained for 275 isolates and based on 19 haplotypes identified in the population 34 isolates were selected to phylogenetic analysis with (rpb1, rpb2 and ITS + LSU rDNA). The concatenated data from four regions grouped isolates in three different cluters suggesting the occurrence of three putative species in guarana plant. The analysis of 34 isoltes with ISSR also revealed the occurrence of three clusters with 54% similarity, although the marker has not been able to differentiate the putative species identified in the phylogeny. In both cases isolates were not grouped by symptoms, geographical origin or mating type, indicating the occurrence of different species can be the main factor to cluster distribution of F. decemcellulare from guarana plant. / O guaranazeiro (Paullinia cupana var. sorbilis (Mart.) Ducke) é uma espécie de origem amazônica com grande potencial econômico devido as diferentes propriedades químicas de interesse farmacêutico e industrial. O Brasil é o único produtor de guaraná sendo a Bahia seguida do Amazonas os principais produtores. Entre os principais fatores responsáveis pela redução da produção no Amazonas estão as pragas e doenças causadas por fungo. Por muitos anos considerados uma doença secundária, o superbrotamento causado por Fusarium decemcellulare atualmente constitui um problema para a cultura do guaraná no Amazonas e foi recentemente também reportada na Bahia. A doença apresenta pelo menos três sintomas bem característicos como o superbrotamento de gemas vegetativas, hipertrofia floral e galhas no caule. O presente trabalho teve como objetivo analisar a diversidade e estrutura da população, bem como a filogenia de F. decemcellulare proveniente dos principais municípios produtores de guaraná no estado do Amazonas. Foram analisados 299 isolados de F. decemcellulare coletados de nove municípios do estado do Amazonas com base em 10 marcadores ISSR que geraram 167 bandas polimórficas. O número de alelos observados (Na) variou entre 1,48 para Presidente Figueiredo à 1,98 para Manaus e o número efetivo de alelos (Ne) foi de 1,55 para Maués e de 1,41 para Presidente Figueiredo, os valores para Heterozigosidade (H) e Índice de Shannon (I) foram muito similares entre as nove populações, com mínimo para Rio Preto da Eva (H=0.29 e I=0.43) e máximo para Manaus (H=0.39 e I=0.48). A análise de variância molecular (AMOVA) revelou que a maior variabilidade genética está dentro das populações de F. decemcellulare (83%) do que entre as populações. E nenhuma correção genética foi verificada entre sintomas do qual o isolado foi obtido ou por local de coleta. Nas análises de estrutura de população e relacionamento genético entre os 299 isolados das nove populações foram estruturados em dois grupos (K=2) indicando a ocorrência de duas populações do patógeno na região. Para verificar se os diferentes grupos identificados correspondem à mesma espécie filogenética sequenciamento parcial do gene EF-1α foi obtido com sucesso para 288 isolados e com base em 19 haplótipos identificados na população, 34 isolados foram selecionados para análise filogenética com mais três regiões (rpb1, rpb2 e ITS+LSU rDNA). As quatro regiões concatenadas formaram três diferentes clusters sugerindo a ocorrência de três possíveis espécies de F. decemcelluare em guaranazeiro. A análise dos 34 isolados com ISSR também indica a ocorrência de três clusters com 54% de similaridade, embora o marcador não tenha sido capaz de diferenciar as possíveis espécies identificadas na filogenia.

Fitoplasmas são agentes causais de diversas doenças em numerosas espécies botânicas cultivadas, daninhas e silvestres. São procariotos que não apresentam parede celular, parasitas intracelulares obrigatórios, habitantes do floema e da hemolinfa, sendo transmitidos naturalmente por insetos vetores do tipo cigarrinhas. Plantas de oliveira apresentando sintomas tipicamente induzidos por fitoplasmas, caracterizados por desenvolvimento lento e superbrotamento de ramos com folhas de tamanho reduzido, foram observadas na cidade de Extrema (MG). A anomalia provoca danos significativos, pois retarda o início de produção e reduz o rendimento da cultura. Sintomas semelhantes foram relatados em olivais implantados em outros países, onde a doença foi associada aos fitoplasmas. O objetivo deste trabalho foi demonstrar a associação de fitoplasma com as plantas afetadas e identificar o fitoplasma presente nas árvores doentes. Para isto foram utilizadas as técnicas moleculares de PCR e RFLP, além de análise filogenética. Os resultados revelaram a presença de fitoplasmas em 73% das árvores sintomáticas analisadas, evidenciando que os sintomas observados no campo eram induzidos por fitoplasma. A doença foi denominada de vassoura-de-bruxa da oliveira. A identificação molecular permitiu classificar o fitoplasma como um representante do grupo 16SrVII-B. Este é o primeiro relato da ocorrência de fitoplasma em plantas de oliveira no Brasil. Em termos mais amplos, é o primeiro relato da associação de um fitoplasma do grupo 16SrVII com a doença vassoura-de-bruxa da oliveira, a qual, em outros países, está associada a fitoplasmas distintos do fitoplasma identificado no presente trabalho. / Phytoplasmas are causal agents of diverse diseases occurring in numerous botanical species, among them cultivated, weeds and wild plants. They are wall-less prokaryotes, obligate intracellular parasites, inhabitants of phoem vessels and hemolymph, and naturally transmitted by insect vectors belonging to the group of the leafhoppers. Olive trees exhibiting symptoms typically induced by phytoplasmas, characterized by slow growth and shoot proliferation with small leaves, were observed in the municipality of Extrema (MG). The anomaly provokes significant damage due to the delay in the beginning of the production and yield reduction of the crop. Similar symptoms have been reported in olive orchards cultivated in other countries, where the disease was associated with phytoplasmas. The objective of the present investigation was to demonstrate the association of phytoplasma with affected plants and identify the phytoplasma present in diseased trees. PCR assays, RFLP analysis and phylogenetic analysis were used to molecular characterization of the phytoplasma. The results revealed the presence of phytoplasma in 73% of the symptomatic trees, evidencing that the symptoms observed in field were induced by phytoplasma. The disease was designated by olive witches\" broom. The molecular identification allowed classify the phytoplasma as a representative of the 16SrVII-B group. This is the first report of the occurrence of phytoplasma in olive plants in Brazil. Moreover, this is also the first report of the association of a group 16SrVII phytoplasma with olive whitches\" broom disease, which has been described in other countries in association with phytoplasmas different from the phytoplasma identified in the present study.

Fitoplasmas são procariotos sem parede celular e habitantes de floema, agentes de doenças que causam danos consideráveis em diversas culturas. O maracujazeiro é uma espécie tropical cultivada em diversas regiões brasileiras. As doenças estão entre os fatores que podem causar danos à cultura e o superbrotamento do maracujazeiro tem se revelado como sendo uma das mais importantes. Esta doença, associada com fitoplasma, foi reportada somente no Brasil, onde foi registrada nos estados do Rio de Janeiro e de Pernambuco, no início da década de oitenta. Embora alguns estudos sobre o assunto tenham sido feitos anteriormente, o presente estudo foi conduzido para: demonstrar a presença constante do agente em associação com plantas doentes; revelar a ocorrência do fitoplasma em algumas áreas pertencentes a alguns estados; identificar, classificar e estudar filogeneticamente o fitoplasma; e demonstrar a patogenicidade do fitoplasma do superbrotamento do maracujazeiro. Em 2005-2006, plantas sintomáticas suspeitas de estarem infectadas por fitoplasma foram amostradas em algumas áreas do estado de São Paulo e vários outros estados brasileiros. A detecção e identificação por PCR duplo foi conduzida com os pares de oligonucleotídeos universais para fitoplasmas R16mF2/mR1-R16 F2n/R2 e pelo par específico R16(III) F2/R1, repectivamente. Para as análises de RFLP foram usadas as enzimas de restrição AluI, HhaI, KpnI, HinfI, HpaII, MseI, RsaI e MboI. Análises filogenéticas foram baseadas nas seqüências de nucleotídeos do 16S rDNA de fitoplasmas pertencentes a grupos e subgrupos distintos. Os ensaios de patogenicidade foram feitos usando-se enxertia de tecido. Amplificações de fragmentos de DNA de 1,2kb usando-se os oligonuclotídeos universais revelaram a presença de fitoplasma nas plantas sintomáticas de todas as regiões amostradas. Amplificações de fragmentos de DNA de 0,8kb pelos oligonucleotídeos específicos indicaram que o fitoplasma detectado era afiliado ao grupo 16SrIII, enquanto as análises de RFLP confirmaram a identificação feita com base no PCR e mostraram que o fitoplasma pode ser classificado como um membro do subgrupo 16SrIII-B. Sequenciamento e análises filogenéticas revelaram que o fitoplasma do superbrotamento do maracujazeiro é um típico representante do grupo 16SRIII, quando comparado com fitoplasmas de outros grupos. A patogenicidade foi demonstrada através da observação de sintomas típicos da doença, seguida da detecção molecular do fitoplasma in plantas sadias enxertadas com ramos de plantas infectadas. Os resultados obtidos no presente estudo permitiram: confirmar a diagnose baseada na sintomatologia; revelar a associação constante entre planta doente e fitoplasma, confirmando investigações anteriores conduzidas com microscopia eletrônica; identificar o fitoplasma como um membro do grupo 16SrIII-B; demonstrar que o fitoplasma é o agente causal do superbrotamento do maracujazeiro; e mostrar a ocorrência atual do patógeno nos estados da Bahia, do Paraná, Rio de Janeiro, Sergipe e São Paulo. / Phytoplasmas are cell wall-less prokaryotes and phloem-inhabitants associated with diseases that affect several crops. Passion fruit plant is a tropical species cultivated in various Brazilian regions. Diseases are among factors that may cause damage to this crop and the passion fruit witches\' broom has been revealed as very important one. That disease, associated with phytoplasma, was reported only in Brazil, where it was registered in Rio de Janeiro and Pernambuco States in the beginning of eighty decade. Although some studies about that subject have been made previously, the present study was conducted in order to: demonstrate the constant presence of the agent in association with diseased plants; reveal the occurrence of fitoplasma in some areas belonging to some States; identify, classify and study phylogenetically the phytoplasma; and demonstrate the pathogenicity of passion fruit witches\' broom phytoplasma. In 2005-2006, symptomatic plants suspected of phytoplasma infection were sampled in some areas of São Paulo State and various other Brazilian States. The detection and identification by nested PCR were performed with the universal primer pair R16mF2/mR1-16F2n/R2 and specific pair R16(III)F2/R1, respectively. For RFLP analyses were used the restriction enzymes AluI, HhaI, KpnI, HinfI, HpaII, MseI, RsaI e MboI. Phylogenetic analyses were based on the nucleotide sequences of the 16S rDNA from phytoplasmas belonging to distinct groups and subgroups. Pathogenecity assays were made by using grafting of tissue. Amplifications of DNA fragments of 1.2kb by using universal primer pairs revealed the presence of phytoplasma in the symptomatic plants from all sampled regions. Amplifications of DNA fragments of 0,8kb by specific primer pair indicated that the detected phytoplasma is affiliated to the group 16SrIII, while RFLP analyses confirmed the identification based on PCR and showed that phytoplasma may be classify as a member of the subgroup 16SRIII-B. Sequencing and phylogenetic analysis revealed that the passion fruit witches\'broom phytoplasma is a typical representative of group 16SRIII, when compared with phytoplasmas from other groups. Pathogenicity was demonstrated through the observation of typical symptoms of the disease followed by molecular detection of the phytoplasma in healthy plants grafted with shoots from infected plants. The results obtained in the present study allowed: to confirm the diagnosis based on the symptomatology; to reveal the firm association between diseased plant and phytoplasma, confirming previous investigations conduced by electron microscopy; to identify the phytoplasma as a member of the group 16SRIII-B; to demonstrate that phytoplasma is the causal agent of passion fruit witches\' broom; and to show the present occurrence of the pathogen in the States of Bahia, Paraná, Rio de Janeiro, Sergipe, and São Paulo