Made available in DSpace on 2014-07-29T15:01:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DALESSANDRO_Emmanuel - texto - parte 1.pdf: 1095655 bytes, checksum: 244da2ff7d05e25ed83b393557a7226d (MD5) Previous issue date: 2012-07-12 / The Wastewater Treatment Plant (WWTP) of Trindade (16 ° 39'09'' S and 49 ° 31'50'' W), also known as Barro Preto WWTP, consists of preliminary treatment followed initially by three modules in parallel (A, B and C), each containing one anaerobic pond, one facultative pond and one maturation pond in series (Australian system), being the effluent released in the stream Barro Preto. The WWTP began operating in 1997 and had the final plan in 2011. This study aimed to evaluate treatment efficiency and the module based on algal community structure and physico-chemical variables during a period of six months (September, October, November, December 2010 and April and May 2011), which contains the dry and rainy periods. Were analyzed in reference to the structure and dynamics of algae: biomass, density, richness, diversity, equality, abundance and dominance; for physic-chemical analysis were: flow rate, wastewater temperature, depth, euphotic zone, HDT, pH, DO, CND, TP, PO4 -3, NH4 +, NO3, DOB5 20°C, COD, TSS, FSS, VSS and also climatic variables. The algae were collected through non-selective process (Van Dorn bottle). The samples abiotic, chlorophyll a and pheophytin were processed according to APHA, and the density algal by the Utermöhl method. Principal Component Analysis (PCA) were performed to characterize the physic-chemical processes and the spatial and temporal differentiation. It was also made a Canonical Correspondence Analysis (CCA). The facultative and maturation ponds shown to be influenced by the seasonality of the region, and presented variance in depth. In average, the module A showed an efficiency of COD removal of 45%, and optimal efficiency in removing DBO5 20°C (84%). The facultative pond showed the highest mean of PO4 -3 efficiency removal (48%), NH4 + (36%) NO3 - (44%), BOD5 20°C (74%). OD profile of type clinograde and thermal stratification was recorded in three months of collection. The maturation pond showed higher mean removal efficiency of PT (27%) and COD (19%). In just two months was recorded thermal stratification, and found clinograde profile throughout the study. The ponds presented one of the largest ever recorded phytoplankton densities in stabilization ponds and 170 taxa recorded throughout the study, being 40% of cyanobacteria are potentially toxic. The most abundant species in both ponds and throughout the study were Chlorella vulgaris, Chlorella minutissima, Closteriopsis acicularis, Merismopedia tenuissima, Synechococcus sp and Synechocysitis sp (dominant). The ponds presented according to the indices, low species diversity and low beta diversity. The beta diversity showed that the maturation pond has more flexibility in the rainy season and optional in the dry season. The canonical correspondence analysis (CCA) showed the most abundant species when best developed in seasonality. C. acicularis in the rainy season, C. minutissima in the end of the rainy season and the beginning of the dry season, M. tenuissima in late dry season, C. vulgaris and Synechococcus sp in late dry season and beginning of precipitation. This analysis showed which environmental variables can also influence the in distribution of species. / A Estação de Tratamento de Esgotos (ETE) de Trindade (16°39 09 S e 49°31 50 O), conhecida também como ETE Barro Preto, é composta por tratamento preliminar seguido, inicialmente, por três módulos em paralelo (A, B e C), contendo cada, uma lagoa anaeróbia, uma lagoa facultativa e uma lagoa de maturação em série (sistema australiano), sendo o efluente lançado no córrego Barro Preto. O presente estudo visou avaliar e eficiência de tratamento do módulo A com base na estrutura da comunidade algal e em variáveis físico-químicas, num período de seis meses (setembro, outubro, novembro, dezembro de 2010 e abril e maio de 2011), que contém períodos de estiagem e chuvosos. Foram analisados a estrutura e a dinâmica das algas: biomassa, densidade, riqueza, diversidade, equidade, abundância e a dominância; para as análises físico-químicas foram: vazão, temperatura da água residuária, profundidade, zona eufótica, TDH, pH, OD, CND, PT, PO4 -3, NH4 +, NO3, DBO5 20°C, DQO, SST, SSF, SSV e também variáveis climáticas. As algas foram coletadas através de processo não seletivo (garrafa de van Dorn). As amostras abióticas, clorofila a e feofitina foram processadas de acordo com APHA, e a densidade algal pelo método de Utermöhl. Análises de Componentes Principais (ACP) foram feitas para caracterização dos processos físico-químicos e para a diferenciação espacial e temporal. Também foi feita uma Análise de Correspondência Canônica (ACC), com o intuito de verificar como as espécies mais abundantes se comportaram em relação as variáveis abióticas. A lagoa facultativa e de maturação mostraram influência da sazonalidade da região, além de apresentar variações na profundidade. Em média, o módulo A apresentou eficiência de remoção de DQO de 45%, e eficiência na remoção de DBO5 20°C de 84%. A lagoa facultativa foi a que apresentou maior média de eficiência de remoção de PO4 -3 (48%), NH4 + (36%), NO3 (44%), DBO5 20°C (74%). Registrou-se também perfil de OD do tipo clinogrado e estratificação térmica em três meses de coleta. A lagoa de maturação apresentou maior média de eficiência de remoção de PT (27%) e DQO (19%). Em apenas dois meses foi registrada a estratificação térmica, e verificou-se perfil clinogrado durante todo o estudo. As lagoas apresentaram uma das maiores densidades fitoplanctônicas já registrada em lagoas de estabilização, com 170 táxons durante todo o estudo, e 40% das cianobactérias registradas são potencialmente tóxicas. As espécies mais abundantes em ambas as lagoas e durante todo o estudo foram Chlorella vulgaris, Chlorella minutissima, Closteriopsis acicularis, Merismopedia tenuissima, Synechococcus sp e Synechocystis sp (dominante). As lagoas apresentaram de acordo com os índices, pouca diversidade específica e pouca diversidade beta. A diversidade beta revelou que a lagoa de maturação tem maior flexibilidade no período chuvoso e a facultativa no período de seca. As Análises de correspondência canônica (ACC) mostraram quando as espécies mais abundantes melhor se desenvolveram na sazonalidade. C. acicularis no período chuvoso, C. minutissima na final da chuva e início de seca, M. tenuissima no final da seca, C. vulgaris e Synechococcus sp. em no final da seca e início de chuva. Esta análise mostrou também que variáveis ambientais também podem influenciar na distribuição das espécies.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion der beiden cyanobakteriellen Phytochrome Cph1 und Cph2 untersucht. Dafür wurde zunächst das Wachstum von Mutanten mit einem inaktivierten cph1- bzw. cph2-Gen unter verschiedenen Lichtbedingungen analysiert. Das Wachstum aller Phytochrommutanten war unter Starklicht beeinträchtigt. Dahingegen wuchs die cph1-Mutante im FRL schlechter als der Wildtyp, während das Wachstum der cph2-Mutante im RL vermindert war. Eine cph1/cph2-Doppelmutante zeigte unter allen Lichtbedingungen eine Wachstumsreduktion, die der jeweiligen Einzelmutante ähnlich war. Die genaue Ursache für die Beeinträchtigung des Wachstums der Phytochrommutanten konnte nicht ermittelt werden. Die verschiedenen Aspekte der Photosynthese, wie Pigmentzusammensetzung, maximale Netto-Sauerstofffreisetzungsrate und 77K-Fluoreszenzemission, waren in den Phytochrommutanten nicht signifikant verändert. Bei Synechocystis sp. PCC 6803 konnte eine lichtgerichtete Bewegung beobachtet werden, wobei man aufgrund von Aktionsspektren der Motilität eine Funktion der Phytochrome oder phytochromähnlichen Proteine bei der Steuerung der phototaktischen Bewegung vermutet. Dem Cph1-Protein konnte hierfür keine Rolle zugeordnet werden. Dahingegen scheint der Photorezeptor Cph2 die lichtgerichtete Bewegung der Zellen in Richtung einer Blaulichtquelle zu inhibieren. Eine Interaktion mit einem klassischen Blaulicht-Rezeptor konnte ausgeschlossen werden. / The function of the cyanobacterial phytochromes Cph1 and Cph2 was investigated. At first, the growth of mutants with an inactivated cph1 or cph2 gene was analysed under different light conditions. The growth of all phytochrome mutants was affected under high-light conditions. However, the cph1 mutant grew slower than the wild type in far-red light, whilst the cph2 mutant revealed a reduced growth under red light conditions. A decreased growth of the cph1/cph2 double mutant was observed under all light conditions with a growth rate similar to the corresponding single mutant. The exact reason for the growth impairment of the phytochrome mutants could not be ascertained. Different aspects of photosynthesis (pigment composition, maximal net-oxygen evolution and 77K fluorescence emission) were not changed significantly in the phytochrome mutants. Synechocystis sp. PCC 6803 shows a movement towards a light source. Based on action spectra of motility phytochromes and phytochrome-like proteins are supposed to have a function in regulating the phototactic movement. An influence of the Cph1 protein in the phototactic movement was not demonstrated. Whereas, the Cph2 protein seems to be involved in the inhibition of the cell movement towards blue light. An interaction with a typical blue-light receptor was excluded.

Le développement d'organismes photosynthétiques (piégeant le C02 en préservant l'eau douce et les terres cultivables sans ajout d'engrais) capables d'utiliser l'énergie solaire pour produire du dihydrogène (H2) passe par une meilleure compréhension du rôle de l'hydrogénase dans le métabolisme cyanobactérien. Le Laboratoire de Biologie et Biotechnologie des Cyanobatéries où j'ai travaillé durant ma thèse utilise une approche de "Biologie Intégrative" pour analyser le métabolisme qui conduit à la photo-production d’H2 chez la cyanobactérie modèle Synechocystis sp. PCC6803. Mon travail s'est focalisé sur l’analyse des réseaux de régulation amenant à la production d'H2 par l’hydrogénase bidirectionnelle à centre Ni-Fe (composée de 5 sous-unités) codée par l’opéron hox. Lorsque j’ai débuté ce travail, 2 activateurs de l’opéron hox avaient été identifiés: AbrB1 et LexA. Un article dont je suis co-premier auteur est paru (Dutheil et al. 2012 J Bact.), il décrit l'identification par l'utilisation de diverses approches d'un nouveau facteur de transcription de l'opéron hox: AbrB2 (homologue d'AbrB1). J'ai ainsi montré que l'expression de l’opéron hox était régulée négativement par AbrB2 en utilisant des fusions transcriptionnelles au gène rapporteur cat (introduites dans la souche sauvage ou dépourvues d'AbrB2) ainsi que des expériences de qRT-PCR. Par la technique de retard sur gel, nous avons confirmé une interaction directe entre AbrB2 et la région promotrice de l’opéron hox. En collaboration avec deux laboratoires du CEA, nous avons montré qu'un mutant dépourvu d’AbrB2 possède une activité hydrogénase augmentée, confirmant ainsi qu'AbrB2 est un régulateur négatif de la production d'H2.Dans un deuxième temps et en collaboration avec deux post-doc du laboratoire, nous avons mis en évidence le rôle de la cystéine unique d'AbrB2 dans le contrôle redox de son activité de régulation transcriptionnelle.Par la technique du retard sur gel,j’ai montré que cette cystéine n’est pas cruciale pour la fixation d'AbrB2 sur le promoteur hox, mais que par contre, la modification redox de celle-ci l’affecte de manière drastique. Dans le cadre de collaborations, nous avons identifié la modification post-traductionnelle qui peut avoir lieu sur la cysteine d'AbrB2 et il s’agit de la première fois, qu’un tel mécanisme de régulation est identifié pour cette famille de régulateur et chez les cyanobactéries. J’ai construit une souche portant l'allèle muté abrB2 Cys>Ser sur le chromosome et exprimé par le promoteur sauvage d’abrB2. J’ai montré grâce à cette construction et en utilisant diverses techniques (activité hydrogénase, qRT-PCR, Western blot et transcriptome) que la cystéine d'AbrB2 joue un rôle dans son activité de régulation qui est 60% moins bonne sur les 529 gènes cibles (directes ou indirectes) du régulateur muté. L’effet est également visible sur l’activité hydrogénase. Ce résultat a été complété par des tests de surexpression thermoinduite d’AbrB2 qui montrent que la mutation C34S affecte la stabilité de la protéine qui ne s’accumule pas autant que la sauvage dans les même conditions et dont la surexpression est létale. Un manuscrit dont je suis copremier auteur et décrivant ces résultats est en cours de finalisation et sera prochainement soumis à l’Intern. Journ. of Hydrogen Energy.L’ensemble de ces travaux permet de mieux comprendre les mécanismes biologiques liés à l’expression de l’hydrogénase bidirectionnelle et vont dans le sens d’un rôle important de celle-ci dans la détoxification des stress redox. La détermination des relations entre les différents régulateurs de l’hydrogénase et les possibles modifications post-traductionnelles de chacun de ces facteurs que j’ai mises en évidence traduisent une enzyme à la régulation complexe. Ces nouvelles connaissances permettent d’éclairer sous un angle nouveau la photoproduction d’H2 par les cyanobactéries et permettront peut-être d’élaborer des stratégies de production d’H2 efficace. / Developing photosynthetic organism (trapping CO2 while preserving fresh water and arable soils without adding fertilizers) able to use Sun light to produce dihydrogen (H2) is depending on a better understanding of the role of hydrogenase in the cyanobacterial metabolism. The Laboratoire de Biologie et Biotechnologie des Cyanobactéries (LBBC) where I worked during my thesis uses « Integrative Biology » approach to analyze the metabolism leading to H2 photoproduction by the model cyanobacterium Synechocystis sp. PCC6803. My work focused on analyzing the regulation network leading to H2 production by the bidirectionnal hydrogenase with Ni-Fe cluster (composed of 5 subunits) encoded by hox operon. When I started this work, two transcriptionnal activators were identified : AbrB1 and LexA. An article, of which I’m sharing first author position, is published (Dutheil et al. 2012 J Bact.), it describes the identification by different approachs of a new transcriptionnal factor of hox operon : AbrB2 (homologous to AbrB1). I showed that hox expression is negatively regulated by AbrB2 by using transcriptionnal fusion to cat reporter gene (introduced in the wild type background or the AbrB2-deleted one) and qRT-PCR experiments. By the electrophoretic mobility shift assay (EMSA) method, we confirmed a direct interaction between AbrB2 and the promoter region of hox operon. Collaborating with two CEA laboratories, we showed that a mutant lacking AbrB2 harbours an increased hydrogenase activity, validating that AbrB2 is a negative regulator of H2 production.In a second time of my thesis and colaborating with two post-doc of the laboratory, we evidenced the role of the unique cysteine of AbrB2 in redox-controlling the transcriptionnal regulator activity of the protein.Using the EMSA method, I showed that the cysteine is not crucial for AbrB2 fixing on hox promoter, but also that the redox modification occuring on this residue inhibits this same binding activity. Collaborating with other labs, we identified the post-translational modifications that may occur on AbrB2 cysteine and it is the first time that such a regulating mechanism is identified for this family of regulators and in cyanobacteria. I constructed a strand harbouring the abrB2C34S mutant allele on the chromosome and expressed by the abrB2 natural promoter. I showed with this construction and using diverse methods (hydrogenase activity, qRT-PCR, Western blot and transcriptome) that AbrB2 cysteine plays a role in its regulating activity : regulating activity is 60% less efficient towards the 529 target genes (either direct and indirect) of the mutated regulator. The effect is also seen on hydrogenase activity and hox genes. This result was completed by thermoinduced overexpression assays that show that C34S mutation of AbrB2 alters protein stability : the mutated protein accumulates less than wild type allele in the same conditions, which is lethal. A manuscript, of which I’m sharing first author position, and describing those results is being finalised and will be submitted soon to the IJHE (International Journal of Hydrogen Energy).Altogether, my results allow a better understanding of the biological mechanisms linked to bidirectionnal hydrogenase expression and agree with a possible role for hydrogenase in detoxifying redox stresses. The determination of the relationships between the different regulators of hydrogenase, and their possible post-translational modifications that I revealed, highlight an enzyme with complex regulation. This new knowledge brings an original outlook on hydrogen photoproduction by cyanobacteria and shall allow elaboration of efficient H2 production strategies.

Kyoto University (京都大学) / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(人間・環境学) / 甲第19069号 / 人博第722号 / 新制||人||173 / 32020 / 京都大学大学院人間・環境学研究科相関環境学専攻 / (主査)准教授 土屋 徹, 教授 宮下 英明, 教授 川本 卓男 / 学位規則第4条第1項該当

The family of Deg/HtrA proteases is present in a wide range of organisms from bacteria, archaea to eukaryota. These ATP-independent serine endopeptidases play key roles in the cellular protein quality control. The cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803, a model organism for studies on photosynthesis, metabolism and renewable energy, contains three Deg proteases known as HhoA, HhoB and HtrA. The three proteases are important for survival in stress conditions, such as high light or temperature. In my work the biochemical characteristics of each protease were revealed in vitro and in vivo. In vitro studies performed using recombinant Synechocystis Deg proteases allowed conclusions about their oligomerization states, proteolytic activities and tertiary structure. The in vivo studies addressed their sub-cellular localization, expression and physiological importance by comparing wild-type Synechocystis cells with the three single mutants lacking one of the Deg proteases. HhoA seems to be involved in the cytoplasmic protein quality control. This protease is regulated post-transcriptional and post-translational: oligomerization, pH and/or cation-binding are some of the important factors to stimulate its proteolytic activity. Instead HhoB acts on periplasmic proteins and seems to be important for the transportation/secretion of proteins. While it has low proteolytic capacity, it may act as a chaperone. The stress-induced HtrA functions in the cellular tolerance against photosynthetic stress; additionally it might act as a protease partner of HhoB, generating a protease/chaperone complex. The results presented in this thesis lay the foundation for a better understanding of the dynamic protein quality control in cyanobacteria, which is undoubtedly important for various cellular metabolic pathways.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(人間・環境学) / 甲第19069号 / 人博第722号 / 新制||人||173(附属図書館) / 26||人博||722(吉田南総合図書館) / 32020 / 京都大学大学院人間・環境学研究科相関環境学専攻 / (主査)准教授 土屋 徹, 教授 宮下 英明, 教授 川本 卓男 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Human and Environmental Studies / Kyoto University / DFAM

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Les biotechnologies sont un outil puissant permettant d’emprunter les circuits biologiques pour produire des composés aux applications multiples (médecine, alimentation, industries…). Les cyanobactéries possèdent des propriétés génétiques et trophiques précieuses pour réduire les coûts et l’empreinte environnementale de ces procédés (photosynthèse, fixation du CO₂, sources d’azote assimilables...). Elles produisent aussi naturellement certaines molécules énergétiques comme le H₂ dont pourraient émerger de nouvelles filières propres de biocarburants. Cependant, une compréhension globale et approfondie de leur physiologie est nécessaire pour concevoir un châssis biologique performant à partir de ces organismes. Elles sont aisément manipulables génétiquement mais présentent une versatilité favorisant la fixation de mutations bénéfiques mais aussi délétères pour leur exploitation à grande échelle. Au cours de ma thèse, j’ai construit et étudié des mutants d’un régulateur de l’assimilation du CO₂ dont l’activation est liée à la photosynthèse. J’ai montré que l’activité du cycle de Calvin synchronise les flux du carbone et le statut rédox de Synechocystis et que sa dérégulation se répercute de manière pléiotropique sur son métabolisme. Plus spécifiquement, je me suis intéressé au déséquilibre carbone/azote dans cette espèce et à son métabolisme de l’urée qui présente un intérêt biotechnologique considérable. J’ai démontré que ce dernier était en compétition avec l’hydrogénase pour l’insertion du nickel dans leurs centres catalytiques respectifs. L’insuffisance de ce métal a permis de sélectionner des mutants de l’uréase tolérant une exposition prolongée à l’urée et conservant une forte capacité de production de H₂ en présence de ce substrat azoté. L’ensemble de ces résultats montre que le métabolisme de Synechocystis peut être détourné au profit de certains processus cellulaires. Les approches « omiques » permettent d’identifier globalement les réponses physiologiques induites ainsi que les leviers biologiques de compensation. Ces travaux sont discutés au regard des implications biotechnologiques de l’instabilité génétique et de la nécessité de renforcer notre compréhension de la plasticité métabolique et génomique des cyanobactéries. / Biotechnology is a powerful tool allowing exploitation of biological circuits to produce compounds with multiple uses (medicine, nutrition, industrial…). Cyanobacteria have valuable genetic and trophic properties which could reduce the costs and the environmental footprint of these processes (photosynthesis, CO₂ fixation, assimilation of diverse nitrogen sources…). They also naturally produce energetic molecules such as H₂ from which new and sustainable biofuels sectors may rise. However, a global and fine understanding of their physiology is required in order to design an efficient biological chassis with these organisms. They are genetically manipulable but also exhibit a strong versatility favoring fixation of mutations that can be either beneficial or harmful to their large-scale cultivation. Over the course of my PhD, I constructed and studied mutants of a CO₂ fixation regulator whose activation is linked to photosynthesis. I showed that the Calvin cycle activity synchronizes carbon fluxes and redox status in Synechocystis and that its deregulation affects the metabolism in a pleiotropic manner. I was specifically interested into the carbon/nitrogen balance in this species and its urea metabolism which is of prime interest in biotechnology. I demonstrated that the latter was in competition with the hydrogenase for the insertion of nickel into their respective catalytic centers. Scarcity of this metal leads to selection of mutants thriving upon prolonged exposure to urea that retained a high capacity of H₂ production in presence of this nitrogenic substrate. This work shows that the metabolism of Synechocystis can be altered in favor of other cellular processes. Omics approaches allow global identification of the physiological responses induced as well as the biological compensation mechanisms. These observations are discussed with regards to biotechnological implications of genetic instability and the need to strengthen our understanding of metabolic and genetic plasticity in cyanobacteria.

This thesis describes an investigation of the molecular mechanism underlying solar conversion processes that occur in Type I photosynthetic reaction centers, in which P700 plays a central role. Static Fourier transform infrared (FTIR) difference spectroscopy (DS) was used to probe the electronic and structural organization of P700 and P700+. In combination with isotope labeling and site directed mutagenesis we have investigated how protein interactions such as histidine ligation and hydrogen bonding modulate this organization. Comparison of (P700+-P700) FTIR difference spectra (DS) obtained using wild type and mutant PS I led us to suggest that the 131 keto carbonyl group of PA is essentially free from hydrogen bonding in the ground state. Upon cation formation, this hydrogen bonding becomes stronger, probably because of a cation induced reorientation of the hydroxyl group of a nearby threonine residue. We also tentatively suggested that a difference band at 1639(-)/1660(+) cm-1 in (P700+-P700) FTIR DS might be due to a C=C mode of the imidazole side chain of the ligating histidine residues. Most of this thesis is geared towards investigating the validity of this interpretation. (P700+-P700) FTIR DS obtained using mutant PS I particles in which hydrogen bonding to P700 is altered can be reconciled within the context of our new interpretation. (P700+-P700) FTIR DS obtained using uniformly 2H, 15N, and 13C labeled PS I particles also support our new interpretation, and indicate that the difference band at 1639(-)/ 1660(+) cm-1 cannot be associated with a strongly hydrogen bonded keto carbonyl group of PA. To investigate if the imidazole side-chain of ligating histidine residues could contribute to bands in (P700+-P700) FTIR DS vibrational mode frequencies and intensities for several protonation forms of 4-methylimidazole were calculated. The calculations suggest that the 1639(-)/1660(+) cm-1 band in (P700+-P700) FTIR DS may not be due to a C=C mode of the imidazole side chain of the ligating histidine residues. Thus we have produced data that suggests neither of the proposed interpretations alone can adequately explain the origin of the 1639(-)/1660(+) cm-1 difference band in (P700+-P700) FTIR DS. The origin of the 1639(-)/1660(+) cm-1 difference band in (P700+-P700) FTIR DS is therefore still an open question.

Le développement d'organismes photosynthétiques (piégeant le C02 en préservant l'eau douce et les terres cultivables sans ajout d'engrais) capables d'utiliser l'énergie solaire pour produire du dihydrogène (H2) passe par une meilleure compréhension du rôle de l'hydrogénase dans le métabolisme cyanobactérien. Le Laboratoire de Biologie et Biotechnologie des Cyanobatéries où j'ai travaillé durant ma thèse utilise une approche de "Biologie Intégrative" pour analyser le métabolisme qui conduit à la photo-production d'H2 chez la cyanobactérie modèle Synechocystis sp. PCC6803. Mon travail s'est focalisé sur l'analyse des réseaux de régulation amenant à la production d'H2 par l'hydrogénase bidirectionnelle à centre Ni-Fe (composée de 5 sous-unités) codée par l'opéron hox. Lorsque j'ai débuté ce travail, 2 activateurs de l'opéron hox avaient été identifiés: AbrB1 et LexA. Un article dont je suis co-premier auteur est paru (Dutheil et al. 2012 J Bact.), il décrit l'identification par l'utilisation de diverses approches d'un nouveau facteur de transcription de l'opéron hox: AbrB2 (homologue d'AbrB1). J'ai ainsi montré que l'expression de l'opéron hox était régulée négativement par AbrB2 en utilisant des fusions transcriptionnelles au gène rapporteur cat (introduites dans la souche sauvage ou dépourvues d'AbrB2) ainsi que des expériences de qRT-PCR. Par la technique de retard sur gel, nous avons confirmé une interaction directe entre AbrB2 et la région promotrice de l'opéron hox. En collaboration avec deux laboratoires du CEA, nous avons montré qu'un mutant dépourvu d'AbrB2 possède une activité hydrogénase augmentée, confirmant ainsi qu'AbrB2 est un régulateur négatif de la production d'H2.Dans un deuxième temps et en collaboration avec deux post-doc du laboratoire, nous avons mis en évidence le rôle de la cystéine unique d'AbrB2 dans le contrôle redox de son activité de régulation transcriptionnelle.Par la technique du retard sur gel,j'ai montré que cette cystéine n'est pas cruciale pour la fixation d'AbrB2 sur le promoteur hox, mais que par contre, la modification redox de celle-ci l'affecte de manière drastique. Dans le cadre de collaborations, nous avons identifié la modification post-traductionnelle qui peut avoir lieu sur la cysteine d'AbrB2 et il s'agit de la première fois, qu'un tel mécanisme de régulation est identifié pour cette famille de régulateur et chez les cyanobactéries. J'ai construit une souche portant l'allèle muté abrB2 Cys>Ser sur le chromosome et exprimé par le promoteur sauvage d'abrB2. J'ai montré grâce à cette construction et en utilisant diverses techniques (activité hydrogénase, qRT-PCR, Western blot et transcriptome) que la cystéine d'AbrB2 joue un rôle dans son activité de régulation qui est 60% moins bonne sur les 529 gènes cibles (directes ou indirectes) du régulateur muté. L'effet est également visible sur l'activité hydrogénase. Ce résultat a été complété par des tests de surexpression thermoinduite d'AbrB2 qui montrent que la mutation C34S affecte la stabilité de la protéine qui ne s'accumule pas autant que la sauvage dans les même conditions et dont la surexpression est létale. Un manuscrit dont je suis copremier auteur et décrivant ces résultats est en cours de finalisation et sera prochainement soumis à l'Intern. Journ. of Hydrogen Energy.L'ensemble de ces travaux permet de mieux comprendre les mécanismes biologiques liés à l'expression de l'hydrogénase bidirectionnelle et vont dans le sens d'un rôle important de celle-ci dans la détoxification des stress redox. La détermination des relations entre les différents régulateurs de l'hydrogénase et les possibles modifications post-traductionnelles de chacun de ces facteurs que j'ai mises en évidence traduisent une enzyme à la régulation complexe. Ces nouvelles connaissances permettent d'éclairer sous un angle nouveau la photoproduction d'H2 par les cyanobactéries et permettront peut-être d'élaborer des stratégies de production d'H2 efficace.