La maladie d'Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative irréversible et progressive entraînant des troubles cognitifs et comportementaux. L'inflammation est caractéristique de la MA. L'interleukine-10 (IL-10), une cytokine anti-inflammatoire a été associée à un risque plus faible de développer la MA. Cependant le lien entre l'IL-10 et la progression de la MA n'a jamais été étudié. Le but de cette thèse a été d'étudier le rôle de l'IL-10 dans le développement ainsi que dans la progression de la MA. Pour mener à bien cette étude, 31 sujets atteints par la MA et 20 sujets contrôles cognitivement intacts ont été recrutés. En fonction de la vitesse de diminution du test de Mini-Mental State Examination et de l’évolution des troubles cognitifs sur deux ans, les patients souffrant de la MA ont été divisés en deux sous-groupes: les patients avec une progression lente (MA lent) et ceux avec une progression rapide (MA rapide). Les analyses se sont portées sur la concentration d’IL-10 en périphérie (plasma, production par les cellules mononuclées du sang périphérique (PBMCs) après stimulation par les peptides Aβ) ainsi que le polymorphisme de son promoteur en position -592, -819 et -1082. En complément, d’autres cytokines impliquées dans l’inflammation ont été étudiées : l’IL-6 (sa concentration plasmatique, sa production par les PBMCs à la suite d’une stimulation par les peptides Aβ et son polymorphisme en position -174) et les polymorphismes du TGF-β1 (-10 et - 25), de l’IFN-γ (-874) et du TNF-α (-308) ainsi que le gène de l'apolipoprotéine E (ApoE). Une étude de la longueur des télomères, liée à l’inflammation, a été aussi réalisée. Les résultats ont montré une association entre le génotype AA et l’allèle A du polymorphisme de l’IFN-γ en position -874 avec la progression rapide de la MA. Une augmentation statistiquement significative de la production d'IL-10 après stimulation par les peptides Aβ a été montrée chez les patients atteints avec une progression lente (MA lent). Une longueur significativement plus courte des télomères a été aussi associée aux patients MA lent. L’ensemble de ces travaux suggère qu’un profil de forte production de l’IL-10 ainsi qu’un profil génétique d’IFN-γ (TT -874) pourrait ralentir la progression de la MA. Il est aussi apparu que la longueur des télomères pourrait être un marqueur du déficit cognitif. Il est clair que ces résultats préliminaires ont besoin d’être confirmés par une étude de plus grande envergure, avec un nombre de patients plus élevé. / Alzheimer’s disease (AD) is an irreversible and progressive neurodegenerative disorder leading to cognitive and behavioral impairment. Inflammation is hallmark of AD although the exact mechanisms involved and the roles of the different inflammatory components are far less clear. Interleukin-10 (IL-10) is a key anti-inflammatory cytokine and IL-10 -1082 A > G polymorphism has been associated with a lower risk of developing AD although the link between IL-10 and the AD progression have never been studied. The aim of this study is to study the role of IL-10 in the risk of developing AD and its role in AD progression. In order to complete successfully this study, 31 AD patients and 20 cognitively intact controls were recruited. Depending of the rate of decrease of mini-mental state test examination (MMSE) and evolution of cognitive disorders, AD patients were divided in two subgroups: patients with slow progression (AD slow) and those with fast progression (AD fast). Analysis were focused on periphery concentration of IL-10 (plasma and and its production by peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) after Aβ peptides stimulation) as well as its promoter polymorphism in position -592, -819 and -1082. In addition, other cytokines involved in inflammation were studied: IL-6 (its plasma concentration, its production by PBMCs following stimulation with Aβ peptides and its polymorphism at position -174) and polymorphisms of TGF-β1 (-10 to - 25), IFN-γ (-874) and TNF-α (-308) as well as the gene polymorphisms of Apolipoprotein E (ApoE). A study of telomere length, link to inflammation, was also performed. Results showed IFNγ -874AA genotype and -874A allele was associated with AD fast progression. A statistically significant increase of IL-10 production by PBMCs stimulated with Aβ peptides was shown in AD slow patients. A significantly shorter telomere length was also associated with AD slow patients. All of this work suggests that a profile with high IL-10 production and high IFN-γ (-874 TT) genotype could confer a slower AD progression. It was also found that telomere length may be a marker of cognitive impairment. It is clear that these preliminary results need to be confirmed in a larger study with a larger number of patients.

Les télomères sont des complexes nucléoprotéiques localisés à l'extrémité des chromosomes des cellules<br />eucaryotes. L'ADN télomérique humain contient entre 500 et 3000 repétitions de la séquence d(T2AG3)n (brin-G) et de son brin complémentaire C3TA2 (brin-C). Le brin G est terminé par une extrémité simple brin contenant de 50 à 200 nucléotides. Les télomères jouent des rôles essentiels au niveau cellulaire en permnettant la protection des chromosomes.<br />Un modèle proposé pour expliquer le rôle protecteur des télomères est le modèle de la boucle-T (télomérique) / boucle-D (déplacement). Dans ce modèle, on observe le repliement de I'ADN télomérique double brin et I'insertion de la partie simple brin dans la partie double brin. La formation de ces boucles fait intervenir, directement ou indirectement, denombreuses protéines comme les protéines TRF1 et TRF2. Néanmoins les mécanismes moléculaires et notamment le rôle de la protéine TRF2 dans la formation de ces boucles restent spéculatifs.<br />Le travail de thèse présenté dans ce manuscrit expose l'étude par Résonance Magnétique Nucléaire du domaine<br />de fixation à I'ADN de la protéine TRF2 (domaine Myb) et de ses interactions avec-l'ADN télomérique ainsi que<br />l'étude de modèles de boucles-D.<br />Après la détermination de la structure tridimensionnelle et l'étude de la dynamique interne du domaine Myb de<br />TRF2, nous avons réalisé l'étude des interactions du domaine Myb avec I'ADN télomérique. Ainsi, deux complexes entre le domaine Myb de TRF2 et I'ADN télomérique ont été étudiés par RMN et ont permis de mieux comprendre le rôle du domaine Myb en montrant sa grande spécificité pour I'ADN télômérique double brin. Ensuite quatre modèles de boucles D différents ont été étudiés par RMN afin d'en déterminer les structures tridimensionnelles.

Le glioblastome (GBM) est une tumeur cérébrale maligne de grade IV dont le pronostic est de 14,6 mois avec le traitement standard. Le pronostic des patients est difficile à préciser et de meilleures connaissances de révolution de ce cancer nous permettraient d’identifier de nouveaux marqueurs permettant d’estimer plus précisement le stade du cancer et ainsi, la survie des patients. L’équipe du Dr Ju Yan a étudié les profils de longueurs individuelles des télomères des cellules de patients normaux et de patients atteints de leucemie myéloïde chronique (LMC) avec les techniques d’analyse des fragments terminaux de restriction des télomères (TRF) et d’hybridation in situ observée en fluorescence de façon quantitative (Q-FISH). En utilisant les mêmes protocoles sur les GBM, nous avons évalué les longueurs individuelles des télomères et leurs profils. L’analyse complète de onze spécimens de GBM humains et de la lignée cellulaire de glioblastome U-87 MG nous a permis d’observer que les télomères 12p, 16p, 22q, 17p, 17q, 19p et 22q sont maintenus plus longs dans les profils de longueurs individuelles relatives. En comparant avec les données du Dr Yan, nous avons pu déterminer que les télomères 21p et 2q sont fréquemment observés parmi les télomères les plus courts dans les GBM et dans la LMC. Les comparaisons des télomères significativement plus courts à ceux plus longs nous ont permis d’identifier l’allongement des télomères 12p, 16p et 20q de même que le raccourcissement des télomères 3q, 9p et 22q comme étant des événements potentiellement spécifiques à révolution des GBM. Les télomères 12q et 22q ont été observés parmi les télomères les plus courts et parmi les plus longs dans différents cas de GBM et de LMC, suggérant que le maintien de la longueur et le raccourcissement de ces extrémités peuvent jouer un rôle dans l'évolution du cancer. L’utilisation du FISH multicolore (M-FISH) nous a permis d’identifier les chromosomes impliques de façon récurrente parmi les anomalies de nombre et de structure. Nous avons noté les délétions des chromosomes 1, 2, et 20 ainsi que des segments des chromosomes 6, 11q , 13q, 14q et 18. Au niveau des duplications, on retrouve majoritairement le bras court du chromosome 4 et un segment du chromosome 7. Nous avons aussi observé dans nos analyses que les chromosomes 1, 6, 12, 13, 22 et 14 sont particulièrement impliqués dans les réarrangements et leurs télomères sont fréquemment retrouvés dans les plus courts (1p, 1q, 13p, 22p et 6p). Globalement, nous avons observés que les tumeurs décrites comme étant agressives sont associées avec une survie courte après diagnostic et elles présentent des télomères courts et/ou plusieurs anomalies chromosomiques. Les tumeurs décrites comme étant indolentes sont associées avec une survie longue après diagnostic et elles présentent des télomères souvent de longueur normale et un nombre inférieur d’anomalies chromosomiques comparativement aux tumeurs agressives.

Les hélicases sont des enzymes ubiquitaires catalysant la séparation de l’ADN double-brin et impliquées dans la réplication, la réparation de l’ADN et dans le maintien des télomères. Chez l’Homme, 3 hélicases présentent des mutations responsables de syndromes cliniques : WRN pour le syndrome de Werner, BLM pour le syndrome de Bloom et RECQL4 pour le syndrome de Rothmund-Thomson. Tous ces syndromes associent un vieillissement pathologique accéléré à un risque accru de développement de cancer notamment par une augmentation de l’instabilité génomique. Les connaissances sur les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans ces maladies du vieillissement sont encore très partielles, notamment en ce qui concerne le lien entre l’instabilité génomique et le vieillissement. Au cours de ce projet, l'utilisation de prélèvements sanguins et cutanés de patients atteints de ces pathologies rares a permis de générer des modèles de cellules souches pluripotentes induites (iPS). Ces cellules présentent l’avantage de s’auto-renouveler et de pouvoir théoriquement se différencier dans tous les types cellulaires d’un organisme. Parallèlement, un témoin de sénescence a été généré de la même manière avec des cellules d’un patient souffrant du syndrome de la progéria de Hutchinson-Gilford. Après caractérisation de ces cellules, nous avons identifié des ensembles de phénotypes cellulaires et moléculaires dans le but de récapituler in vitro les pathologies. Nous avons également engagé les cellules iPS dans des voies de différenciation proches des tissus atteints dans les pathologies in vivo. Enfin, nous avons étudié la stabilité génomique de ces lignées dans les différents types cellulaires cultivés. Ainsi nous avons observé que la lignée Bloom est le siège de recombinaisons particulièrement fréquentes et est caractérisée par une instabilité du génome dans tous les types cellulaires étudiés. Egalement, la lignée Werner semblerait se distinguer par une instabilité de ses télomères. Enfin, l’ensemble des lignées des pathologies du vieillissement prématuré présenterait un défaut mitochondrial. / Helicases process the double-stranded DNA dissociation. They are involved in replication, DNA repair and maintenance of telomeres. In human, 3 helicases display mutations responsible for clinical syndromes: WRN for the Werner syndrome, BLM for the Bloom syndrome and RECQL4 for the Rothmund-Thomson syndrome. All these diseases cause premature ageing and high risk of cancer. Molecular and cellular mechanisms involved in these diseases are not well defined. Particularly, little is known concerning the link between genomic instability and ageing. During this project, we used blood samples and skin biopsies of affected patients to generate models by reprogramming cells to induced pluripotent stem cells (iPSCs). These cells have the advantage of self-renewing and theoretically could be differentiated in all cell types. At the same time, an iPSC senescence control was performed from cells of a Hutchinson-Gilford Progeria syndrome patient. iPSCs were characterized for pluripotency. In the aim of recapitulate these pathologies in vitro, we identified sets of cellular and molecular phenotypes. We also engaged differentiation of iPSCs in cell pathways closed to the affected tissues in vivo. Finally, we studied the genomic stability of iPSCs and derived cells. We observed that Bloom cells are susceptible to frequent recombinations and are characterized by a genome instability through all studied cell types. Werner cells showed an instability of telomeres length. Finally, all premature ageing diseases displayed mitochondrial defects.

Abstract: By differentiating chromosomal ends from internal breaks, telomeres prevent DNA damage checkpoint activation and provide protection from inappropriate DNA repair activity that could create genomic instability. In Saccharomyces cerevisiae, a large number of genes have been identified that are implicated in telomerase and telomere structure and/or function. However, a comprehension of the mechanism of action of these genes and how they relate to other genes is lacking. The function of end protection is based on the telomeric repeats and associated proteins, but evidence is accumulating that the subtelomeric region also plays a role. This region contains binding sites for various proteins, notably Tbf1. TBF1 is an essential gene and the protein has been implicated in telomere homeostasis, chromatin remodelling, and the DNA damage response. My master’s project is based on the observation that cells harbouring a thermosensitive (tbf1-ts) allele have abnormally short telomeres. However, all four known mutant tbf1 alleles have multiple point mutations, which renders their analyses difficult. In order to be able to more precisely determine the origin of the phenotypic variations, we used site-directed mutagenesis to create single point mutation tbf1 alleles. These experiments yielded two particular mutations, tbf1-82 and tbf1-453, which were found to have growth defects at various temperatures as well as increased sensitivity to DNA damaging drugs. Although the alleles had only minor telomere length phenotypes, it was discovered that Tbf1 could have a direct role in telomere stability in special situations. For example, in the absence of telomerase, which normally maintains telomeres, cells enter replicative senescence after about 60 population doublings and stop dividing. A small subset of the cellular population is able to evade this growth arrest by maintaining telomeres via a recombination-dependent process. An introduction of the tbf1-82 or tbf1-453 mutation into strains that also lacked telomerase caused a dramatic advance in time of onset of senescence. Thus this work uncovered that Tbf1 is a previously unknown regulator of senescence. Various genetic assays with homologous recombination genes and chromatin regulators were performed to help further characterize TBF1 and its interactors. Characterization of these novel tbf1 alleles has given new insights into the multiple roles of Tbf1. / En différenciant les extrémités chromosomiques des cassures d’ADN internes, les télomères empêchent l'activation de la signalisation d’un dommage à l'ADN et fournissent une protection contre des activités inappropriées qui sont associées à une réparation de l'ADN. Une telle réparation pourrait en fait créer une instabilité génomique. Chez Saccharomyces cerevisiae, un nombre de protéines sont impliquées dans la structure du télomère et / ou la fonction de la élomérase. On pense que la protection des télomères est gérée par les répétitions télomériques et les protéines associées, mais il y a de plus en plus d’indices que la région sous-télomérique joue également un rôle. Cette région contient des sites de liaison pour plusieures protéines, notamment pour Tbf1. TBF1 est un gène essentiel et la protéine est impliquée dans l'homéostasie des télomères et dans la réponse aux dommages de l’ADN. Toutefois, les mécanismes moléculaires restent à être précisés. Mon projet de Maîtrise est basé sur l’observation que dans les cellules qui ont un allèle thermosensible (tbf1-ts), les télomères sont anormalement courts. Malheureusement, les 4 allèles mutants de tbf1 connus présentent tous des mutations ponctuelles multiples ce qui rend leur analyse difficile. Pour clarifier l'origine des variations phénotypiques de ces mutations, la mutagenèse dirigée a été utilisée pour créer des allèles tbf1 avec une seule mutation. Mes résultats montrent que deux mutations spécifiques, tbf1-82 et tbf1-453, causent des défauts de croissance cellulaires, ainsi qu'une sensibilité aux drogues qui endommageant l'ADN. Une analyse détaillée de ces nouveaux allèles de tbf1 a montré que la protéine pourrait avoir un rôle direct dans le maintien de la stabilité des télomères. Par exemple, en absence de la télomérase qui est responsable du maintien des télomères, les cellules entrent en sénescence réplicative après environ 60 générations et arrêtent de se diviser. Par contre, une petite fraction de la population est capable de contourner cet arrêt de croissance car ces cellules maintiennent les télomères par un processus dépendant de la recombinaison homologue. L'introduction de mutations tbf1 dans des souches sans télomérase provoque une accélération d’entrée en sénescence; donc Tbf1 est un régulateur précédemment inconnu de la sénescence. Divers tests génétiques avec des gènes de recombinaison homologue et des régulateurs de chromatine ont été effectués pour aider à caractériser TBF1 et ses interactions. La caractérisation de ces nouveaux allèles a permis de mieux comprendre les multiples rôles de Tbf1.

La protéine INT6/EIF3E codée par le gène mammalien correspondant au site d’intégration du rétrovirus Mouse Mammary tumor virus (MMTV) n°6 (int-6), a été impliquée dans le cancer du sein chez la souris et l’homme. Malgré qu’INT6 soit une sous-unité du facteur d’initiation de la traduction eIF3, elle n’est pas essentielle pour la traduction générale mais pour l’expression d’ARNm spécifiques tel qu’il a été montré pour la traduction d’ARNm histones. Elle a aussi été impliquée dans la réplication d’ADN en stabilisant le facteur de licence de la réplication MCM7, dans la réponse aux dommages à l’ADN (DDR) et dans la voie du “nonsense-mediated mRNA decay“ (NMD). Par rapport à cette dernière activité j’ai étudié si INT6 pouvait spécifiquement intervenir au niveau de l’homéostasie des télomères en agissant sur les transcrits TERRA. La délétion d’INT6 par une approche d’ARN interférence révèle une augmentation des niveaux des ARN télomériques TERRA qui est dépendante du chromosome et du type cellulaire. Malgré qu’INT6 soit un facteur du NMD, elle n’agit pas sur la demi-vie des TERRA. Les expériences de DNA-FISH ont montré une augmentation des dommages aux télomères (TIF) dans les cellules en absence d’INT6. Les aberrations observées correspondent à des pertes de télomères (TFE) et des signaux multi-télomériques (MTS). Par la technique de digestion de la chromatine à la nucléase micrococcale, nous avons retrouvé une plus rapide accumulation des mono-nucléosomes aux télomères en absence d’INT6, suggérant un rôle dans la conformation de la chromatine télomérique. Ces résultats mettent en évidence INT6 comme un nouveau facteur régulateur de la stabilité des télomères. / The INT6/EIF3E protein encoded by the mammalian integration site 6 (int-6) gene, has been implicated in mouse and human breast carcinogenesis. Although, INT6 is a subunit of the eIF3 translation initiation factor, it is not essential for bulk translation but for specific mRNAs expression as histone mRNA translation. It has also been implicated in DNA replication by stabilizing the DNA replication licensing factor MCM7, in DNA Damage Response (DDR) and in the Nonsense mRNA Decay (NMD) pathway. Relative to the latter activity, I investigated whether INT6 can specifically meddle in telomere homeostasis by acting on TERRA transcripts. Deletion of INT6 by RNA interference approach revealed an increase in the telomeric RNA TERRA levels which is depending on the chromosome and cellular type. Although INT6 is a NMD factor, it doesn’t change TERRA steady-state. DNA-FISH experiments showed an increase in Telomere Induced Foci (TIFs) in INT6 depleted cells. These aberrations correspond to Telomere Free Ends (TFE) and Multi-Telomeric signals (MTS) which implicate INT6 in DDR. By means of Microccocal Nuclease (MNase) mapping assay, we found a rapid accumulation of telomeric mono-nucleosomes in INT6-depleted cells, suggesting a role in telomeric chromatin structure. These findings evidenced that INT6 is a novel key player in telomere stability.

Un lien étroit existe entre l’intégrité du génome et l’architecture nucléaire. Les lamines, composants majeurs de l’enveloppe nucléaire sont impliquées dans de nombreux processus nucléaires, tels que la réplication, la transcription et le maintien de l’architecture nucléaire. Il a notamment été rapporté que les lamines de type A sont impliquées dans la réparation des cassures double brin de l’ADN et la stabilité des télomères. Toutefois, peu d’études ont été réalisées sur les lamines de type B. Fait intéressant, il a été observé que l’accumulation de la lamine B1 est retrouvée dans différentes tumeurs. Cependant, les conséquences d’une dérégulation de cette lamine sur la stabilité du génome restent peu documentées.Au cours de ma thèse, je me suis intéressée à l’impact d’une dérégulation de la lamine B1 sur le maintien de la stabilité du génome, notamment sur la réparation des cassures double brin de l’ADN et la stabilité des télomères. Nous avons pu mettre en évidence que la surexpression de lamine B1 conduit à un défaut de réparation par NHEJ, associé à une diminution de recrutement de 53BP1 aux dommages radio-induits. Nous avons également démontré que la lamine B1 interagit directement avec 53BP1, protéine impliquée dans le choix de la voie de réparation, et que cette interaction est régulée en cas de dommages à l’ADN. En effet, la liaison entre ces deux protéines est rompue après dommages en condition endogène, ce qui n’est pas le cas après surexpression de la lamine B1. Ce défaut de recrutement de 53BP1 aux dommages pourrait rendre compte de la diminution de l’efficacité du NHEJ. De plus, j’ai pu identifier les domaines protéiques impliqués dans cette interaction. Il est intéressant de noter que la surexpression du domaine de la lamine B1 impliquée dans l’interaction mime la surexpression de la lamine B1 entière. Au contraire, la lamine B1 délétée de ce domaine n’a aucun impact sur le recrutement de 53BP1 et la persistance des dommages. Ces différentes données confortent notre hypothèse quant à la séquestration de 53BP1 après surexpression de lamine B1.En parallèle, nous avons pu démontrer que la surexpression de la lamine B1 entraine l’apparition de diplochromosomes concomitants à une sénescence accrue. Ce phénomène d’endoréplication peut être induit par des défauts télomériques, tels que des télomères dysfonctionnels ou déprotégés. De façon intéressante, mes données montrent que la surexpression de la lamine B1 entrainent des dommages télomériques. Nous avons également établit que la lamine B1 interagit avec TRF2, protéine du complexe « shelterin » permettant la protection des télomères contre la signalisation des dommages à l’ADN. La rétention putative de TRF2 par la lamine B1 pourrait être à l’origine des défauts télomériques observés après la surexpression de cette dernièreCette étude démontre de nouveaux rôles de la lamine B1 dans le maintien de la stabilité du génome, notamment à travers ses interactions avec deux protéines clefs dans la réparation des cassures double brin et la stabilité des télomères. Cela nous ouvre de nouvelles pistes de recherche qui permettront une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans la tumorigenèse et en particulier sur le lien existant entre l’intégrité de l’architecture nucléaire et la stabilité du génome. / A close link exists between genome stability and nuclear architecture. Lamins, major component of the nuclear envelope, are involved in many nuclear processes, such as replication, transcription and nuclear architecture. It has been reported than lamins A/C are involved in double strand break repair and telomere stability. However, few studies have been conducted on B-type lamins. Interestingly, it was observed that the accumulation of lamin B1 is found in different tumors. Nevertheless, consequences of its deregulation on genome stability remain poorly documented.During my PhD, I analysed the impact of deregulation of lamin B1 on genome maintenance, including double-strand breaks repair and telomere stability. We were able to demonstrate that overexpression of lamin B1 leads to defect of NHEJ, associated with decrease of the 53BP1 recruitment to DNA damage. We have also shown that lamin B1 interacts directly with 53BP1, a protein involved in the choice of the repair pathway, and that this interaction is regulated upon DNA damage. Indeed, the association between these two proteins is disrupted after damage, in endogenous condition, in contrast this dissociation is not observed after lamin B1 overexpression. The defect of 53BP1 recruitment to DNA damage could account for the decrease in the NHEJ efficiency. Moreover, I have identify the protein domains involved in this interaction. It is interesting to note that overexpression of the interaction domain mimics the overexpression of the full lamin B1. Instead, lamin B1 deleted from this domain has no impact on 53BP1 recruitment and on DNA damage persistence. These data support our hypothesis about the sequestration 53BP1 after overexpression of lamin B1.In parallel, we have demonstrated that the lamin B1 overexpression causes the appearance of diplochromosomes concurrent to an increase of senescence. This phenomenon of endoreduplication can be induced by telomere defects such as dysfunctional or deprotected telomeres. Interestingly, I have observed that lamin B1 overexpression leads telomere damages. We also established that lamin B1 interacts with TRF2, a protein of "shelterin" complex involved in the protection against the DNA damage signaling at telomere. The putative retention TRF2 by lamin B1 could cause telomere defects observed after overexpression of the latter.This study identifies new roles of lamin B1 in maintaining genome stability, including through its interactions with two key proteins in the repair of double-strand breaks and stability of telomeres. This opens up new ways of research that will enable a better understanding of the molecular mechanisms involved in tumorigenesis and in particular on the relationship between the integrity of the nuclear architecture and genome stability.

Introduction : l'analyse histopathologique des pièces d'annexectomie prophylactique(pBSO) pour risque génétique (mutations BRCA) a pu révéler des anomalies cytologiques etarchitecturales interprétées comme potentiellement pré-cancéreuses et dénommées " dysplasieovarienne et tubaire ". Nous proposons d'étudier les aspects morphologiques,immunohistochimiques et moléculaires des dysplasies tubo-ovariennes.Matériels & Méthodes : l'analyse morphologique a été réalisée dans un premier grouped'annexectomies après stimulation de l'ovulation (protocole de Fécondation in vitro).L'évaluation morphologique et immunohistochimique (expression de Ki67, p53, Bcl2, PAX2et ALDH1) a par la suite concerné 111pBSO, 42 annexectomies exposées au Tamoxifène et116 témoins non cancéreux et spontanément fertiles (nBSO). Les analyses ont été réaliséespar deux pathologistes en aveugle. Les cellules épithéliales d'intérêt ovariennes et tubairesprovenant du groupe pBSO ont été microdisséquées par laser ; l'ADN extrait a été étudié parhybridation génomique comparative (CGH array). La longueur des télomères a été évaluéepar PCR quantitative en temps réel.Résultats : les scores moyens de dysplasie ovarienne et tubaire étaient significativement plusélevés dans les groupes stimulation de l'ovulation et génétique par rapport aux témoins. Seulle score de dysplasie tubaire était supérieur aux témoins pour le groupe Tamoxifène. Onretrouvait une surexpression de ALDH1 dans les groupes pBSO et tBSO alors que Ki67, p53,bcl2 et PAX2 étaient faiblement exprimés dans les groupes pBSO et tBSO. D'ailleurs,l'expression d'ALDH1 était faible dans l'épithélium non dysplasique, forte dans la dysplasieet constamment faible dans les carcinomes occultes. De subtiles altérations génomiques et desraccourcissements télomériques ont été mis en évidence au niveau des dysplasies génétiques.Conclusions : les scores élevés de dysplasie, la forte expression d'ALDH1 et les altérationsmoléculaires provenant du groupe à risque génétique pourraient supporter le conceptd'instabilité génétique. La dysplasie tubo-ovarienne pourrait être une étape importante etprécoce de la carcinogenèse ovarienne. Nos résultats suggèrent également qu'un certainnombre de cancers de l'ovaire pourrait avoir pour origine la trompe de Fallope. Le marqueurde cellules souches ALDH1 pourrait constituer une cible dans la prévention et le diagnosticprécoce des cancers de l'ovaire.

Différents rôles de l'hélicase Pif1 ont été décrit dont le plus documenté est de décrocher la télomérase des télomères en déroulant les hybrides ARN/ADN formés entre l'ARN de la télomérase et l'ADN télomérique. Plus récemment, une nouvelle voie de signalisation des dommages à l'ADN a été mise en évidence, qui inhibe l'action de la télomérase au niveau d'une cassure de l'ADN via la phosphorylation de l'hélicase Pif1. Cette phosphorylation, dépendante de la kinase ATR (Mec1), inhibe la réparation aberrante de la cassure d'ADN par la télomérase. Nous étudions au sein de l’équipe la protéine RPA (Replication Protein A), affine de l'ADN simple-brin, qui recrute à la fois la protéine de recombinaison homologue Rad52 et la protéine Mec1 impliquée dans la cascade de signalisation des dommages de l'ADN. Lors de l'étude de différentes fonctions de l'hélicase Pif1, j'ai mis en évidence une interaction robuste entre Pif1 et RPA. J'ai identifié un allèle de RFA1, rfa1-D228Y, affectant l'interaction Pif1/RPA et montré, grâce à cet allèle, que cette interaction est impliquée dans le recrutement de Pif1 au niveau d'une cassure double-brins (CDB) induite de l'ADN. Enfin, il a été récemment mis en évidence un nouveau rôle de Pif1 dans la stabilité des G-Quadruplexes durant la réplication du brin avancé. En effet, les cellules pif1&#61508; présentent un taux d'instabilité du minisatellite CEB1 inséré sur le brin avancé d'environ 56%, correspondant à des réarrangements de l'ADN de type contractions ou expansions. Lors de l'étude de l'interaction Pif1/RPA, j'ai montré que la mutation rfa1-D228Y entraîne une instabilité du minisatellite CEB1 présent sur le brin avancé, similaire à celle observée avec la délétion pif1&#8710;. Nous suggérons un modèle selon lequel RPA recruterait Pif1 au cours de différents processus cellulaires tels que la réponse des dommages à l'ADN ou la réplication des structures particulières de l'ADN telles que les G-Quadruplexes.En parallèle de cette étude, j’ai étudié le rôle de l'histone méthyltransférase Set1 spécifique de la lysine 4 de l'histone H3 dans la régulation de la taille des télomères. J’ai mis en évidence que le raccourcissement des télomères observé dans un mutant set1&#61508; est lié à l'absence de di- et tri-méthylation de H3K4 alors que la perte de monométhylation n'a aucun effet. Cependant, le défaut de la taille des télomères dans les cellules set1&#8710; n'est pas uniquement lié au défaut de méthylation de H3K4 mais semble impliquer une autre activité de Set1 qu’il reste à déterminer. Etonnamment, nous avons observé que la délétion de SET1 aggrave le raccourcissement des télomères des mutants dont les gènes sont impliqués dans la régulation positive de la taille des télomères et inversement, aggrave le rallongement des télomères de mutants dont les gènes sont impliqués dans la régulation négative des télomères. Nous postulons que l’inactivation de Set1 pourrait à la fois inhiber l’activation précoce des origines de réplication des régions subtélomériques et conduire à un sur-raccourcissement de la taille des télomères, à la fois affecter la synthèse du brin complémentaire dans un contexte où celle-ci est affectée (mutant rif1&#61508;) et conduire à un sur-allongement des télomères. Une seconde hypothèse propose que Set1 régulerait la transcription deTERRA dans des cellules ayant les télomères déprotégés (mutant rif) entraînant le sur-allongement des télomères. / Different roles of Pif1 helicase have been described, the best documented being to remove telomerase from telomeres by unwinding the RNA/DNA hybrid between telomerase RNA and telomeric DNA. Recently, it was shown that the DNA damage signaling down-regulates telomerase action at a DNA break via Pif1 phosphorylation. Pif1 phosphorylation is dependent of the checkpoint kinase ATR (Mec1) and prevents the aberrant healing of broken DNA ends by telomerase. In our laboratory, we study RPA (Replication Protein A), a single-strand DNA binding protein which recruits the proteins involved in the DNA damage response and checkpoint regulation, such as the homologous recombination protein Rad52 and Mec1 involved in the DNA damage response. I have identified an allele of RFA1, rfa1-D228Y, that affects the Pif1/RPA interaction and showed using this allele that this interaction is implicated in the Pif1 recruitment at an induced double-strand break. Recently, a new role of Pif1 in the stability of G-quadruplex DNA during the leading strand replication has been described. pif1&#61508; cells show an instability about 56% of the human minisatellite CEB1 inserted on the leading strand. During my study of the Pif1/RPA interaction, I showed that the rfa1-D228Y mutant induced a similar instability of CEB1 minisatellite on the leading strand. We suggested that RPA would recruit Pif1 for many cellular processes such as DNA damage response or replication of secondary DNA structures such as G-Quadruplexes.In parallel, I have studied the role of the Set1 Histone methyltransferase which catalyse the methylation of the lysine 4 of histone H3, in the regulation of telomere length. I showed that the telomere shortening observed in set1&#61508; mutant is due to the loss of di- and tri-methylation of H3K4 while the loss of monomethylation has no effect. However, the short telomeres in set1&#8710; cells is not only due to the methylation defect shedding light on a new Set1 activity that remains to be fully characterized.. The SET1 deletion aggravates the telomere shortening of mutants which genes are involved in positive regulation of telomere length and conversely, aggravates the lengthening of mutants which genes are involved in negative regulation of telomere length. We postulated that inactivation of Set1 could affect at once activation of early-replication origins and leads to a telomere shortening, and affect synthesis of complementary strand in a context where this one is affected (mutant rif1&#61508;) and leads to a telomere lengthening. A second hypothesis propose that Set1 would regulate TERRA transcription in cells with deprotected-telomere (rif mutant) leading to the lengthening of telomeres.

L'objectif de ces travaux était d'utiliser certains aspects de l'activité chimique et photochimique de télomères fluorés porteurs de fonctions azides, dans le but de promouvoir les synthèses de polymères thermostables et de nouveaux matériaux photoréticulés. En premier lieu, nous avons développé et caractérisé une nouvelle classe de poly(alkyl-aryl) éthers par une promotion de la compétition de la réaction de « Click » et de couplage de Hay. Par la suite, l'activité photochimique de ces composés fluorés a été étudiée et utilisée pour élaborer des matériaux photoréticulés. Les énergies libres des surfaces des films obtenus ont été calculées en utilisant le modèle d'Owens et Wendt. Les rugosités et les compositions de ces surfaces présentant des mouillabilités singulières ont été investiguées par le biais d'analyses par profilométrie, AFM et EDX. En dernier lieu, les synthèses et caractérisations de réseaux photoréticulés sont abordées. La post sulfonation de ces matériaux a conduit à la préparation de nouveaux électrolytes pour l'application pile à combustible dont les microstructures et propriétés physico-chimiques ont été étudiées. / This work aims at using both chemical and photochemical activities of fluorinated telomers bearing azido end groups, to promote the synthesis of thermostable macromolecules and original photocrosslinked networks. In a first part, we have prepared and characterized a novel class of linear poly(alkyl aryl) ethers by the promotion of competitive “Click” reaction and Hay coupling. Then, the photolysis under UV irradiation of these fluorinated polymers was studied and used to generate photocrosslinked materials. The surface free energies of the resulting films were established using the Owens-Wendt model. The roughness and composition of the surfaces were investigated by profilometry, AFM and EDX analysis. Finally, the preparation under UV irradiation of original polymer networks was performed. The post-sulfonation of these materials allowed to prepare new proton exchange membranes for fuel cells application. The microstructures, physical and chemical properties of these electrolytes were investigated.