L’immunité cellulaire T est probablement la plus affectée par le vieillissement de l’être humain avec un retentissement sur les déficiences immunitaires au niveau humoral comme au niveau cellulaire. Elle contribue à une augmentation de la susceptibilité des sujets âgés aux maladies infectieuses, à l’auto-immunité, au cancer et à la baisse de la réponse vaccinale mais son intrication avec les pathologies notamment chroniques est mal connue.Notre travail s’est intéressé aux temps précoces de l’activation cellulaire T et à la mise au point d’un modèle permettant l’évaluation de la capacité d’activation des lymphocytes T vis-à-vis de surfaces recouvertes d’anticorps activateurs (Ac antiCD3) ou non (Ac antiHLA-ABC), observés en microscopie IRM.Ce modèle nous permet de montrer que l’étalement des lymphocytes T sur les surfaces est précédé d’ondulations verticales de la membrane générant des contacts transitoires durant environ 1 minute et que la cinétique d’étalement est ensuite sept à huit fois plus rapide sur les surfaces supposées activatrices. D’autre part, avec des dilutions successives des Ac antiCD3 sur les lamelles, l’aire moyenne de la zone de contact des lymphocytes T est fortement corrélée aux réponses prolifératives mesurées avec le test de prolifération lymphocytaire standard au CFSE.Ce modèle permet également l’observation en microscopie à fluorescence de différentes protéines phosphorylées des cascades de signalisation. L’étude de la fluorescence des cellules T purifiées, fixées et marquées par l’Ac anti-phospho-Erk en fonction des dilutions d’Ac antiCD3 sur la lamelle permet d’objectiver une décroissance de la moyenne de fluorescence avec les dilutions.Notre modèle a l’avantage d’étudier les temps précoces de l’activation. Il pourrait s’appliquer à l’étude de l’immunosénescence. Ainsi l’étude du contact entre une cellule T et des surfaces activatrices pourrait s’avérer être une méthode simple et utile d’exploration précoce de l’activation de lymphocytes T en pratique clinique.L’application de notre modèle à l’étude de l’immunité du sujet âgé est en cours dans le cadre d’une étude prospective comparative de sujets âgés malades et de sujets âgés « sains » recrutés selon les critères du « senieur protocole ».En conclusion, il s’agit d’un travail d’approche mixte à la fois fondamentale et clinique permettant d’étudier les phénomènes d’immunosénescence et leur lien avec la pathologie. / Our work was focused on early events in T cell activation and has proposed a model system for the Interference reflection microscopy-based monitoring of T lymphocytes activation by antibodies coated-surfaces, either with activating anti-CD3 or control anti-HLA-ABC.Our system has allowed to observe that T cell spreading on surfaces is preceded by vertical membrane undulations, generating transient contacts with the underlying surface for approximately 1 minute, and that spreading kinetics of are seven to eight times faster when activating antibodies are involved. At increasing dilutions of antiCD3 Ab on surfaces, the contact area formed between T lymphocytes and activating surfaces is linearly correlated to proliferative responses, as measured by CFSE labelling. Our system allowed also the direct observation, by fluorescent microscopy, of signaling-dependent protein phosphorylation. T cells exposed to decreasing concentrations of antiCD3 had lower phospho-Erk levels, as shown upon fixation and anti-phospho-Erk labeling. Allowing the study early events in T cell activation, our model could be applied to the study of immunosenescence. To monitor contacts between T cells and activating surfaces could be a simple and useful method for early exploration of T lymphocytes activation in clinical practice.We are currently carrying out a comparative prospective study on old sick and healthy subjects, recruited according to " senior protocol " criteria. In conclusion, our work represents a fundamental and clinical mixed approach for the study of immunosenescence-related phenomena and their link with pathologies.

Les Leucémies Aigues Lymphoblastiques T (LAL-T) sont des hémopathies malignes causées par la prolifération de cellules immatures T bloquées à un stade donné de leur différenciation. Leur oncogenèse est multigénique. Une anomalie de type A (à l’origine du blocage de différenciation) ainsi que des anomalies de type B (gains de fonctions de type prolifération, métabolisme, résistance à l’apoptose…) sont souvent retrouvées chez le même patient. Ces leucémies reproduisent individuellement les différentes étapes de la maturation thymique humaine. En fonction de l’immunogénétique (phénotype et réarrangement des loci des TCR), 3 groupes de LAL-T sont ainsi identifiables : les LAL-T immatures (correspondant aux formes non T-restreintes), les LAL-T corticales (bloquées autour de la b-sélection) et les LAL-T matures TCR/CD3+. Mon travail de thèse a consisté à déterminer à quel point l’activation et la signalisation du TCR pouvaient être impliquées dans la biologie de cette hémopathie. Nous avons utilisé le modèle transgénique Marilyn TCR-HY et montré in vitro (lignée TLX+) et in vivo (modèle de leucémogénèse TEL-JAK2) que l’activation du TCR par la reconnaissance de son peptide spécifique (DBY, peptide présent uniquement dans les souris mâles) empêche le développement et le maintien de la leucémie. L'induction de la signalisation du TCR par des anticorps monoclonaux dirigés contre la chaîne de signalisation CD3e (anti-CD3e humain, OKT3 ; anti-CD3e murin, 145-2C11) entraîne également une mort massive des cellules leucémiques en induisant un programme d'expression génique et de phosphoproteomique ressemblant à la sélection négative thymique. In vitro dans des LAL-T primaires, la stimulation du complexe CD3/TCR par un anticorps anti-CD3 entraîne la mort cellulaire des LAL-T CD3/TCR+ et non des TCR/CD3- quelque soit leur mécanisme oncogénétique sous-jacent. Finalement, le traitement anti-CD3 in vivo empêche la leucémogenèse chez les souris transplantées avec des LAL-T murines et humaines. Ces données fournissent un fort rationnel en faveur d’une thérapie ciblée, basée sur le traitement anti-CD3 des LAL-T matures CD3/TCR+. Ce travail démontre aussi que des étapes-clés du développement (comme la sélection négative) peuvent être des cibles thérapeutiques et sont actionnables malgré l’accumulation d’altérations géniques et épigénétiques dans les cellules cancéreuses. Par ailleurs, j’ai étudié la fréquence et l’impact pronostique des anomalies de la signalisation du TCR/pré-TCR dans une grande série protocolaire de LAL-T de l’adulte (GRAALL-2003 et -2005). Les voies de prolifération RAS/MAPK et PI3K/PTEN/AKT participent à la signalisation du TCR/pré-TCR et ont été rapportées comme dérégulées dans des séries de LAL-T pédiatriques. Dans notre série, j’ai identifié des délétions/mutations perte de fonction de PTEN (12 %) ou des mutations activatrices de KRAS/N-RAS (11%) montrant que les anomalies du pré-TCR/TCR sont fréquentes dans les LAL-T puisqu’elles sont retrouvées dans 23% des cas. Les anomalies de RAS/PTEN sont associées à un pronostic défavorable. Leur impact pronostique en fonction du statut mutationnel NOTCH1/FBXW7 (N/F) a également été étudié et montre que les anomalies de RAS/PTEN abrogent le bon pronostic des mutations N/F. Ce travail permet de proposer une classification oncogénétique basée sur les anomalies de N/F et RAS/PTEN. Cette classification définit les patients de bas risque comme ceux ayant N/F muté mais sans anomalie de RAS et PTEN (51 %) et les hauts risques qui regroupent tous les autres patients (49 %). Cette classification oncogénétique est dorénavant utilisée dans le nouveau protocole GRAALL-2014 des LAL-T de l’adulte. / T-cell acute lymphoblastic leukemias (T-ALL) are rare lymphoid neoplasms characterized by the proliferation of T lymphoblasts arrested at specific stages of maturation. Leukemic transformation of maturating thymocytes is caused by a multistep pathogenesis involving numerous genetic abnormalities that drive normal T cells into uncontrolled cell growth and clonal expansion. Depending on immunogenetic, T-ALLs are classified in 3 groups: immature, cortical (blocked around b-selection) and mature (CD3/TCR+) T-ALL. My work was to determine if activation and TCR signalling are involved in the biology of this disease. We demonstrate in T-ALL that, irrespective of the complex oncogenic abnormalities underlying tumor progression, experimentally induced, persistent TCR signalling has anti-leukemic properties and enforces a molecular and phosphoproteomic program resembling thymic negative selection, a major developmental event in normal T cell development. Using mouse models of T-ALL, we show that induction of TCR signalling by high affinity self-peptide/MHC or treatment with monoclonal antibodies to the CD3e chain (anti-CD3) causes massive leukemic cell death. Importantly, anti-CD3 treatment hampered leukemogenesis in mice transplanted with either mouse or patient-derived T-ALLs. These data provide a strong rationale for targeted therapy based on anti-CD3 treatment of TCR-expressing T-ALL patients and demonstrate that endogenous developmental checkpoint pathways are amenable to therapeutic intervention in cancer cells. Besides, I studied frequency and prognostic impact of anomalies concerning pre-TCR/TCR signalling in a large cohort of adult T-ALL included in GRAALL trials. RAS/MAPK and PI3K/PTEN/AKT pathways are involved in pre-TCR/TCR signalling and are reported as deregulated in pediatric T-ALL. I identified deletion/mutation loss-of-function of PTEN (12%) and activating mutations of KRAS/N-RAS (11%) in 23% of patients. These anomalies predict poor outcome and abrogate the good prognosis of NOTCH1/FBXW7 mutations. We proposed a purely genetic stratification of patients based on N/F/RAS/PTEN status, identifying low-risk patients (51%) with N/F mutations without RAS/PTEN anomalies and high-risk patients (49%) composed by the remaining cohort. This stratification will be used for the next protocol of adult-T-ALL.

The past 10 years has seen mother to child transmission (MTCT) of HIV-1 shift from being one of the predominant forces in the global epidemic to a phenomenon that is largely preventable and envisioned as being on the path to elimination. This thesis is based on two cohorts of Kenyan infants recruited before and after the development of effective antiretroviral interventions to prevent MTCT. Two main lines of enquiry are pursued with the aim to contribute to improved health outcomes of infants affected by HIV-1. The first seeks to further our understanding of the capacity of the infant cytotoxic T lymphocyte (CTL) response to influence viral evolutionary dynamics in early infection. Chapter 3 presents a modern phylogenetic analysis of longitudinal viral sequences derived from infants following in utero or peripartum infection. The results indicate that despite high levels of viral replication, infant CTL selection pressure plays a significant role in shaping early viral evolution. The second stems from an accumulating body of evidence that suggests that infants born to HIV-1 infected mothers who themselves are free from infection, termed HIV-1 exposed uninfected (HEU) infants, nevertheless face significantly higher rates of infectious disease- associated morbidity and mortality than HIV-1 unexposed infants. This study therefore sought to characterise the immunological status of HEU infants with particular emphasis on the phenotypic and functional properties of the T cell compartment. Chapter 4 presents the immunological characterisation of a cohort of healthy Kenyan infants recruited as a control population at two time points in early life. Chapter 5 present a cross-sectional comparison of HEU and control infant cohorts. The results suggest a level of altered immunological reactivity with respect to the T helper type 1 (Th1) response to polyclonal stimulation. In addition a compromised memory Th1 response was observed following polyclonal stimulation and following stimulation with Bacillus Calmette-Guerin and tetanus toxoid vaccine antigens.

Neisseria meningitidis causes 500,000 cases of meningitis and septicaemia annually worldwide, with a mortality rate of approximately 10%. Most disease in developed countries is caused by serogroup B infection, against which there is no universal vaccine. Opa proteins are major meningococcal outer membrane proteins, and a limited number of Opa variants have been associated with hyperinvasive serogroup B meningococci, suggesting their use as a potential novel vaccine. Immunisation of mice with recombinant Opa elicited high levels of meningococcal-specific serum bactericidal antibody (SBA), demonstrating proof in principle of this approach. Opa proteins mediate bacterial adherence to host cells and modulate human cellular immunity, and there are conflicting data regarding their effects on CD4⁺ T cells. opa genes from N. meningitidis strain H44/76 were cloned into the plasmid vector pBluescript, disrupted using antibiotic resistance cassettes and transformed into H44/76 to sequentially disrupt the four opa genes. This produced a unique panel of 15 isogenic Opa-deficient strains, including an Opa-negative strain, which enabled investigation of the immunomodulatory role of surface-expressed Opa proteins. There was no consistent effect of Opa expressed on the surface of OMVs and inactivated bacteria on CD4⁺ T cells, with significant heterogeneity of responses between individuals. The rate of Opa phase variation was between 10^-3 and 10^-4, and increased 180-fold following transformation of bacteria with unrelated DNA. These data support further investigation of Opa as a potential meningococcal vaccine component, and highlight the importance of host and bacterial factors in the development of OMV vaccines.

Receptor proteins on the surfaces of cells equip them to communicate with each other and to sense and interact with their environment. One receptor family, the αβ T-cell receptors (TCRs), allow T lymphocytes to detect and respond to pathogens via interactions with antigen-presenting major histocompatibility complex (MHC) molecules on target cells. A degree of TCR cross-reactivity (e.g. through structural similarity between peptide-MHC (pMHC) complexes) is essential to account for all possible pathogens, but can also lead to the misinterpretation of self antigens as foreign, and thereby elicit an autoimmune response, resulting in diseases such as multiple sclerosis (MS). Structural studies of pMHC and TCR-pMHC complexes have been key to developing of an understanding of the molecular basis of TCR cross reactivity, and the first strand of this thesis describes attempts to express and purify a highly cross-reactive MS patient-derived TCR for structural characterisation. The formation, purification and crystallisation of a TCR-self pMHC complex including another autoreactive TCR is also described. Another family of receptors, the fibronectin leucine-rich transmembrane proteins (FLRTs), has been implicated in roles in embryonic development including cell sorting and adhesion. In the second strand of this thesis, the nature of homotypic interactions between FLRTs, which may underlie adhesion between FLRT transfected cells, is investigated. Biophysical analyses demonstrate that these interactions may be mediated by the extracellular leucine-rich repeat (LRR) domain, and crystal structures of all three FLRT LRR domains suggest how interactions between them may underlie FLRT self-association at the cell surface. Residues which contribute to these interactions are conserved across different members of the FLRT family and different species. These findings confirm that FLRTs induce homotypic cell-cell adhesion, and suggest that this behaviour is mediated by self association at the cell surface via the LRR domain.

Drak2 est un membre de la famille des protéines associées à la mort et c’est une sérine/thréonine kinase. Chez les souris mutantes nulles Drak2, les cellules T ne présentent aucune défectuosité apparente en apoptose induite par activation, après stimulation avec anti-CD3 et anti-CD28, mais ont un seuil de stimulation réduit, comparées aux cellules T de type sauvage (TS). Dans notre étude, l’analyse d’hybridation in situ a révélé que l’expression de Drak2 est ubiquiste au stade de la mi-gestation chez les embryons, suivie d’une expression plus focale dans les divers organes pendant la période périnatale et l’âge adulte, notamment dans le thymus, la rate, les ganglions lymphatiques, le cervelet, les noyaux suprachiasmatiques, la glande pituitaire, les lobes olfactifs, la médullaire surrénale, l’estomac, la peau et les testicules. Nous avons créé des souris transgéniques (Tg) Drak2 en utilisant le promoteur humain beta-actine. Ces souris Tg montraient des ratios normaux entre cellules T versus B et entre cellules CD4 versus CD8, mais leur cellularité et leur poids spléniques étaient inférieurs comparé aux souris de type sauvage. Après activation TCR, la réponse proliférative des cellules T Tg Drak2 était normale, même si leur production d’interleukine (IL)-2 et IL-4 mais non d’interféron-r était augmentée. Les cellules T Tg Drak2 activées ont démontré une apoptose significativement accrue en présence d’IL-2 exogène. Au niveau moléculaire, les cellules T Tg Drak2 ont manifesté une augmentation moins élevée des facteurs anti-apoptotiques durant l’activation; un tel changement a probablement rendu les cellules vulnérables aux attaques subséquentes d’IL-2. L’apoptose compromise dans les cellulesT Tg Drak2 a été associée à un nombre réduit de cellules T ayant le phénotype des cellules mémoires (CD62Llo) et avec des réactions secondaires réprimées des cellules T dans l’hypersensibilité de type différé. Ces résultats démontrent que Drak2 s’exprime dans le compartiment des cellules T mais n’est pas spécifique aux cellules T; et aussi qu’il joue des rôles déterminants dans l’apoptose des cellules T et dans le développement des cellules mémoires T. En outre, nous avons recherché le rôle de Drak2 dans la survie des cellules beta et le diabète. L’ARNm et la protéine Drak2 ont été rapidement induits dans les cellules beta de l’îlot après stimulation exogène par les cytokines inflammatoires ou les acides gras libres et qui est présente de façon endogène dans le diabète, qu’il soit de type 1 ou de type 2. La régulation positive de Drak2 a été accompagnée d’une apoptose accrue des cellules beta. L’apoptose des cellules beta provoquée par les stimuli en question a été inhibée par la chute de Drak2 en utilisant petit ARNi. Inversement, la surexpression de Drak2 Tg a mené à l’apoptose aggravée des cellules beta déclenchée par les stimuli. La surexpression de Drak2 dans les îlots a compromis l’augmentation des facteurs anti-apoptotiques, tels que Bcl-2, Bcl-xL et Flip, sur stimulation par la cytokine et les acides gras libres. De plus, les expériences in vivo ont démontré que les souris Tg Drak2 étaient sujettes au diabète de type 1 dans un modèle de diabète provoqué par de petites doses multiples de streptozotocine et qu’elles étaient aussi sujettes au diabète de type 2 dans un modèle d’obésité induite par la diète. Nos données montrent que Drak2 est défavorable à la survie des cellules beta. Nous avons aussi étudié la voie de transmission de Drak2. Nous avons trouvé que Drak2 purifiée pouvait phosphoryler p70S6 kinase dans une analyse kinase in vitro. Lasurexpression de Drak2 dans les cellules NIT-1 a entraîné l’augmentation de la phosphorylasation p70S6 kinase tandis que l’abaissement de Drak2 dans ces cellules a réduit la phosphorylation. Ces recherches mécanistes ont prouvé que p70S6 kinase était véritablement un substrat de Drak2 in vitro et in vivo. Cette étude a découvert les fonctions importantes de Drak2 dans l’homéostasie des cellules T et le diabète. Nous avons prouvé que p70S6 kinase était un substrat de Drak2. Nos résultats ont approfondi nos connaissances de Drak2 à l’intérieur des systèmes immunitaire et endocrinien. Certaines de nos conclusions, comme les rôles de Drak2 dans le développement des cellules mémoires T et la survie des cellules beta pourraient être explorées pour des applications cliniques dans les domaines de la transplantation et du diabète. / Drak2 is a member of the death-associated protein family, and is a serine threonine kinase. In Drak2 null mutant mice, T cells have no apparent defect in activation-induced apoptosis after stimulation with anti-CD3 and anti-CD28, but have a lowered threshold to stimulation, compared with wild type (WT) T cells. In our study, in situ hybridization analysis has revealed that Drak2 expression is ubiquitous at the mid-gestation stage in embryos, followed by more focal expression in various organs in the perinatal period and adulthood, notably in the thymus, spleen, lymph nodes, cerebellum, suprachiasmatic nuclei, pituitary, olfactory lobes, adrenal medulla, stomach, skin and testes. We generated Drak2 transgenic (Tg) mice using the human beta-actin promoter. These Tg mice showed normal T cell versus B cell and CD4 versus CD8 populations in the spleen, but their spleen weight cellularity was lower in comparison with wild type mice. After TCR activation, the proliferation response in Drak2 Tg T cells was normal, although their interleukin (IL)-2 and IL-4 but not interferon-r production was augmented. Activated Drak2 Tg T cells demonstrated significantly enhanced apoptosis in the presence of exogenous IL-2. At the molecular level, Drak2 Tg T cells manifested a lower increase of anti-apoptotic factors during activation; such a change probably rendered the cells vulnerable to subsequent IL-2 insults. The heightened apoptosis in Drak2 Tg T cells was associated with reduced numbers of T cells with the memory cell phenotype (CD62Llo) and repressed secondary T cell responses in delayed type hypersensitivity. These results demonstrate that Drak2expresses in the T cell compartment but is not T cell-specific; and it plays critical roles in T cell apoptosis and memory T cell development. Further, we investigated the role of Drak2 in beta-cell survival and diabetes. Drak2 mRNA and protein were rapidly induced in islet beta-cells after exogenous inflammatory cytokine or free fatty acid stimulation, which is present endogenously in either type 1 or type 2 diabetes. Drak2 upregulation was accompanied by increased beta-cell apoptosis. The beta-cells apoptosis caused by the said stimuli was inhibited by Drak2 knockdown using siRNA. Conversely, transgenic (Tg) Drak2 overexpression led to aggravated beta-cell apoptosis triggered by the stimuli. Drak2 overexpression in islets compromised the increase of anti-apoptotic factors, such as Bcl-2, Bcl-xL and Flip, upon the cytokine and free fatty acid stimulation. Further in vivo experiments demonstrated that Drak2 Tg mice were prone to type 1 diabetes in a multiple-low-dose streptozotocin-induced diabetes model, and they were also prone to type 2 diabetes in a diet-induced obesity model. Our data show that Drak2 is detrimental to beta-cell survival. We also investigated the signalling pathway of Drak2. We found that purified Drak2 could phosphorylate p70S6 kinase in an in vitro kinase assay. Drak2 overexpression in NIT-1 cells led to enhanced p70S6 kinase phosphorylation, while Drak2 knockdown in these cells reduced the phosphorylation. These mechanistic studies proved that p70S6 kinase was a bona fide Drak2 substrate in vitro and in vivo.This study has discovered the important functions of Drak2 in T cell homeostasis and diabetes. We proved that p70S6 kinase was a substrate of Drak2. Our findings have broadened our knowledge of Drak2 in the immune and endocrine system. Some of our findings, such as the roles of Drak2 in memory T cell development and beta cell survival could be explored for clinical application in the areas of transplantation and diabetes.

Suite à la rencontre d’un antigène (Ag) présenté à la surface des cellules présentatrice de l’Ag (CPA), les lymphocytes T naïfs, ayant un récepteur des cellules T (RCT) spécifique de l’Ag, vont proliférer et se différencier en LT effecteurs (1). Suite à l’élimination de l’Ag la majorité des LTe vont mourir par apoptose alors que les restants vont se différencier en LT mémoire (LTm) protégeant l’organisme à long terme. Les mécanismes qui permettent la différenciation des LTe en LTm sont encore inconnus. Pour comprendre comment les LTm CD8+ sont générés à partir des LTe, nous avons émis l’hypothèse que la densité de l’Ag présenté par les CPA peut avoir un impact sur la sélection des LT CD8+ répondant l’Ag à se différencier en LTm. De manière intéressante, nos résultats montrent qu’une immunisation avec des cellules dendritiques (DCs) exprimant un haut niveau de complexe CMH/peptide à sa surface permet le développement de LTm. À l’inverse, le développement des LTm est fortement réduit (10-20X) lorsque les souris sont immunisées avec des DCs exprimant un niveau faible de complexes CMH/peptide à leur surface. De plus, la quantité d’Ag n’a aucune influence ni sur l’expansion des LT CD8+ ni sur l’acquisition de leurs fonctions effectrices, mais affecte de manière critique la génération des LTm. Nos résultats suggèrent que le nombre de RCT engagé lors de la reconnaissance de l’Ag est important pour la formation des LTm. Pour cela nous avons observé par vidéo-microscopie le temps d’interaction entre des LTn et des DCs. Nos résultats montrent que le temps et la qualité de l’interaction sont dépendants de la densité d’Ag présenté par les DCs. Effectivement, nous observons une diminution dans le pourcentage de LT faisant une interaction prolongée avec les DCs quand le niveau d’Ag est faible. De plus, nous observons des variations de l’expression des facteurs de transcription clefs impliqués dans la différenciation des LTm tels qu’Eomes, Bcl-6 et Blimp-1. Par ailleurs, la densité d’Ag fait varier l’expression du Neuron-derived orphan nuclear receptor 1 (Nor-1). Nor-1 est impliqué dans la conversion de Bcl-2 en molécule pro-apoptotique et contribue à la mort par apoptose des LTe pendant la phase de contraction. Notre modèle propose que la densité de l’épitope contrôle la génération des CD8+ LTm. Une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la génération des LTm permettra le développement de meilleures stratégies pour la génération de vaccin. Dans un second temps, nous avons évalué le rôle du signal RCT dans l’homéostasie des LTm. Pour ce faire, nous avons utilisé un modèle de souris transgénique pour le RCT dont son expression peut être modulée par un traitement à la tétracycline. Ce système nous a permis d’abolir l’expression du RCT à la surface des LTm. De manière intéressante, en absence de RCT exprimé, les LTm CD8+ peuvent survivre à long terme dans l’organisme et rester fonctionnels. De plus, une sous population des LTm CD4+ a la capacité de survivre sans RCT exprimé dans un hôte lymphopénique alors que l’autre sous population nécessite l’expression du RCT. / Following antigen (Ag) encounter presented at surface of antigen presenting cell (APC), naïve T lymphocytes, which express a T cell receptor (TCR) specific for Ag, undergo massive proliferation and differentiate into effector T cells (1). After elimination of the pathogen, most effector T cells die, while the remaining differenciates into memory T cells (LTm) which are responsible for long-term protection of the organism. The mechanism that promotes the differentiation of effectors T cells into memory T cells is still largely unknown. To understand how Tm cells are generated from effectors, we hypothesized that the density of antigen on the APC could have an impact on the selection of CD8+ T cell responders differentiating into memory. Very interestingly, our results show that immunization of mice with dendritic cells (DCs) expressing high levels of peptide-MHC complexes on their surface allow a strong development of LTm. In contrast, the development of memory T cells was strongly reduced (10-20X) when mice were immunized with DCs expressing two-fold less level of peptide-MHC complexes. In agreement with the results described above, the amount of Ag does not have any influence on T cell expansion and acquisition of effector functions, but critically affects memory T cell generation. Our data suggest that the numbers of TCR engaged in MHC/peptide recognition are important for the formation of memory T cells. To do that, we evaluated by time-lapse videomicroscopy the time of interaction between LTn and DCs. Effectively, we observed a significant reduction in the percentage of cells making prolonged interaction with DCs when the level of Ag is decreased. Moreover, we observed a modification in the expression of key transcription factors involved in the differentiation of Tm cells, such as Eomes, Bcl6 and Blimp-1. Further analysis reveals that the Ag density influences the expression of Neuron-derived orphan nuclear receptor 1 (Nor1). Nor-1 is involved in the conversion of Bcl-2 into a pro-apoptotic molecule and contributes to effector death by apoptosis during contraction phase. Our model proposes that density of Ag controls the generation of LTm. A better understanding of the role of TCR signals in the generation of LTm will help to develop better vaccination strategies. Second time, we have evaluated the role of TCR signals in Tm cell homeostasis. To do that, we have used a tetracycline-inducible expression system of the TCR in mice. This system allows us to abolish TCR expression on Tm cells. Interestingly, we show that the ablation of TCR expression did not influence the survival and functionnality of Ag-specific CD8+ LTm cells. Furthermore, our results show that a subset of CD4 Tm cells can survive in the absence of TCR expression in nonlymphopenic hosts while another subset requires the TCR expression to survive.

Les modifications post-transcriptionnelles de l’ARN messager (ARNm), comme l’épissage alternatif, jouent un rôle important dans la régulation du développement embryonnaire, de la fonction cellulaire et de l’immunité. De nouvelles évidences révèlent que l’épissage alternatif serait également impliqué dans la régulation de la maturation et de l’activation des cellules du système hématopoïétique. Le facteur hnRNP L a été identifié comme étant le principal régulateur de l’épissage alternatif du gène codant pour le récepteur CD45 in vitro. Le récepteur CD45 est une tyrosine phosphatase exprimée par toutes les cellules du système hématopoïétique qui contrôle le développement et l’activation des lymphocytes T. Dans un premier temps, nous avons étudié la fonction du facteur hnRNP L dans le développement des lymphocytes T et dans l’épissage de l’ARNm de CD45 in vivo en utilisant des souris dont le gène de hnRNP L a été supprimé spécifiquement dans les cellules T. La délétion de hnRNP L dans les thymocytes résulte en une expression aberrante des différents isoformes de CD45 avec une prédominance de l'isoforme CD45RA qui est généralement absent dans le thymus. Une conséquence de la délétion de hnRNP L est une diminution de la cellularité du thymus causée par un blocage partiel du développement des cellules pré-T au stade DN4. Cette réduction du nombre de cellules dans le thymus n’est pas liée à une hausse de la mort cellulaire. Les thymocytes déficients pour hnRNP L démontrent plutôt une prolifération augmentée comparée aux thymocytes sauvages due à une hyper-activation des kinases Lck, Erk1/2 et Akt. De plus, la délétion de hnRNP L dans le thymus cause une perte des cellules T en périphérie. Les résultats des expériences in vitro suggèrent que cette perte est principalement due à un défaut de migration des thymocytes déficients pour hnRNP L du thymus vers la périphérie en réponse aux chimiokines. L’épissage alternatif de CD45 ne peut expliquer ce phénotype mais l’identification de cibles par RNA-Seq a révélé un rôle de hnRNP L dans la régulation de l’épissage alternatif de facteurs impliqués dans la polymérisation de l’actine. Dans un second temps, nous avons étudié le rôle de hnRNP L dans l’hématopoïèse en utilisant des souris dont la délétion de hnRNP L était spécifique aux cellules hématopoïétiques dans les foies fœtaux et la moelle osseuse. L’ablation de hnRNP L réduit le nombre de cellules progénitrices incluant les cellules progénitrices lymphocytaires (CLPs), myéloïdes (CMPs, GMPs) et mégakaryocytes-érythrocytaires (MEPs) et une perte des cellules hématopoïétiques matures. À l’opposé des cellules progénitrices multipotentes (MPPs) qui sont affectées en absence de hnRNP L, la population de cellules souches hématopoïétiques (HSCs) n’est pas réduite et prolifère plus que les cellules contrôles. Cependant, les HSCs n’exprimant pas hnRNP L sont positives pour l'Annexin V et expriment CD95 ce qui suggère une mort cellulaire prononcée. Comme pour les thymocytes, une analyse par RNA-Seq des foies fœtaux a révélé différents gènes cibles de hnRNP L appartenant aux catégories reliées à la mort cellulaire, la réponse aux dommages à l’ADN et à l’adhésion cellulaire qui peuvent tous expliquer le phénotype des cellules n’exprimant pas le gène hnRNP L. Ces résultats suggèrent que hnRNP L et l’épissage alternatif sont essentiels pour maintenir le potentiel de différenciation des cellules souches hématopoïétiques et leur intégrité fonctionnelle. HnRNP L est aussi crucial pour le développement des cellules T par la régulation de l’épissage de CD45 ainsi que pour leur migration. / Post-transcriptional modifications of pre-mRNA by alternative splicing are important for cellular function, development and immunity. New evidence reveals that alternative splicing is implicated in the regulation of maturation and activation of hematopoietic cells. HnRNP L has been identified as the main regulator of alternative splicing of CD45 in vitro. The receptor tyrosine phosphatase CD45, which is expressed on all hematopoietic cells, is known for its role in the development and activation of T cells. First, we have investigated the function of hnRNP L in T cell development and CD45 pre-mRNA splicing in vivo using T cell specific deletion of hnRNP L in mice. The hnRNP L deletion results in aberrant expression of CD45 isoforms, predominantly CD45RA, which is usually absent from the thymus. Ablation of hnRNP L results in a partial block in pre-T cell development at the DN4 stage. This reduction in thymic cellularity is not due to an increase in cell death. In fact, hnRNP L deficient thymocytes demonstrate accelerated proliferation compared to wild-type cells due principally to a hyper-activation of the kinases Lck, Erk1/2 and Akt. Moreover, hnRNP L deletion results in a loss of peripheral T cells. In vitro studies suggest that this loss of peripheral cells is caused by a defect in response to chemokine signals. Since CD45 pre-mRNA splicing cannot explain this phenotype, the identification of hnRNP L targets by RNA-Seq has shown that hnRNP L plays a role in the regulation of alternative splicing of factors involved in actin polymerization. Secondly, we studied the role of hnRNP L in hematopoiesis using knockout mice in which hnRNP L is conditionally deleted specifically in fetal liver and bone marrow hematopoietic cells. Ablation of hnRNP L reduces the number of cell lineage committed progenitors including the common lymphoid progenitors (CLPs), common myeloid and granulocyte progenitors (CMPs, GMPs) and the megakaryocyte-erythrocyte progenitors (MEPs) as well as the mature hematopoietic cells. In contrast to multipotent progenitors (MPPs) that are affected by the absence of hnRNP L, the hematopoietic stem cell (HSC) population is not reduced. In fact, HSCs from hnRNP L deleted mice demonstrate increased cell cycling. However, hnRNP L deficient HSCs express high levels of Annexin V and CD95, which suggests an increased cell death. As for the thymus, a RNA-Seq analysis of fetal livers revealed different targets of hnRNP L among gene categories related to cell death, DNA damage responses and cell adhesion that may explain the phenotype observed in the hnRNP L deficient HSCs. These results suggest that hnRNP L and alternative splicing are essential for the survival and maintenance of the differentiation potential of HSCs. HnRNP L is also crucial for the development of T cells by regulating both their migration and the splicing of CD45.

La voie de signalisation Notch est conservée au cours de l'évolution. Elle joue un rôle clé dans le développement, et elle est impliquée dans de nombreuses décisions de destin cellulaire, dans le maintien des cellules souches, et dans le contrôle de la prolifération et de la différenciation cellulaires. Une dérégulation de la signalisation Notch est impliquée dans diverses maladies et cancers, y compris les tumeurs solides, comme les cancers du sein et du col de l'utérus, et les leucémies, comme la Leucémie Aiguë Lymphoblastique des cellules T (LAL-T). Notch est un récepteur transmembranaire activé par des ligands transmembranaires de la famille DSL (Delta/Serrate/Lag-2). Bien que plusieurs mutations oncogéniques ont été identifiées au niveau du récepteur Notch, de nombreux cancers modulés par Notch demeurent ligand-dépendants. Étonnamment, les mécanismes moléculaires régulant l'activation du ligand sont encore relativement peu caractérisés par rapport à ceux qui régissent le récepteur Notch lui-même. Utilisant un essai de co-culture avec un rapporteur luciférase de Notch, nous avons effectué le premier crible d'ARNi pan-génomique visant spécifiquement à identifier des régulateurs des ligands de Notch dans la cellule émettrice du signal. Nous avons ainsi pu découvrir de nouvelles classes de régulateurs communs pour les ligands Delta-like1 et 4. Ces régulateurs comprennent des inhibiteurs de protéases, des facteurs de transcription, et des gènes divers à fonction inconnue, tels que Tmem128 « Transmembrane protein 128 », ou à fonction préalablement caractérisée tels que la co-chaperonne moléculaire Cdc37 « Cell division cycle 37 homolog ». Par la suite, nous avons développé des cribles secondaires fonctionnels où nous avons démontré l'importance de ces régulateurs pour des événements Notch-dépendants, comme la différenciation des cellules T normales, et la survie des cellules souches pré-leucémiques isolées à partir d'un modèle murin de LAL-T. En outre, nous avons prouvé que les régulateurs les plus forts du crible de survie sont également nécessaires pour l'activité d'auto-renouvellement des cellules souches pré-leucémiques. Finalement, nous avons entamé une caractérisation moléculaire préliminaire de deux régulateurs nouvellement identifiés; Tmem128 et Cdc37 afin d'étudier leur mécanisme d'action sur les ligands. En conclusion, cette étude nous a permis d'identifier de nouveaux régulateurs de la voie Notch qui pourraient servir de cibles thérapeutiques potentielles dans les cancers; tel qu'illustré par le modèle LAL-T. La compréhension des détails moléculaires sous-jacents aux fonctions de ces régulateurs sera essentielle afin de développer des inhibiteurs pharmacologiques pour bloquer leur action et entraver la signalisation Notch dans le cancer. / The Notch signalling pathway is evolutionarily conserved. It plays a key role in development and it is involved in multiple cell fate decisions, in the maintenance of stem cells, and in the regulation of cell proliferation and differentiation. Misregulation of Notch signalling is implicated in various diseases and cancers including solid tumours, such as breast and cervical cancers, and leukemias, such as T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia (T-ALL). Notch is a transmembrane receptor activated by transmembrane ligands of the DSL family (Delta/Serrate/Lag-2). Whereas oncogenic mutations have been identified in the Notch receptor, many Notch-mediated cancers remain ligand-dependent. Strikingly, the molecular mechanisms that regulate ligand activation are still poorly characterized as compared to those regulating the Notch receptor itself. Using a co-culture assay with a luciferase Notch reporter, we performed the first genome-wide RNAi screen aiming specifically at identifying regulators of Notch ligands in the signal-sending cell. We thereby unraveled new classes of common regulators for both Delta-like1 and 4 ligands. These regulators include protease inhibitors, transcription factors and various genes of unknown function such as Tmem128 (Transmembrane protein 128), or of previously characterized function such as the molecular co-chaperone Cdc37 (Cell division cycle 37 homolog). We next developed functional secondary screens where we demonstrated that our hits are important for Notch-mediated events, such as normal T-cell differentiation, and survival of pre-leukemic stem cells (pre-LSCs) isolated from a mouse model of T-ALL. Moreover, we showed that top hits from the pre-LSC survival screen are also required for the self-renewal activity of pre-LSCs. Finally, we performed a preliminary molecular characterization of two newly identified regulators; Tmem128 and Cdc37 in order to investigate their mechanism of action on Delta-like ligands. Altogether, this study led to the identification of novel Notch pathway regulators that could serve as potential therapeutic targets in Notch cancers, as exemplified by the T-ALL model. Elucidating the finer details that underlie the molecular functions of these regulators will be critical to develop pharmacological inhibitors to counteract their action and impede Notch signalling in cancer.

Les premières étapes d’activation des lymphocytes T sont cruciales pour déterminer leur comportement, ainsi que leur prolifération. Ces étapes dépendent fortement des conditions initiales, particulièrement de l’avidité du récepteur du lymphocyte (TCR) pour le ligand spécifique provenant de l’antigène. La reconnaissance du virus entraine une séquence des réactions biochimiques mettant en œuvre de protéines membranaires et cellulaires. Le processus peut être mesuré par cytométrie en flux. On propose ici plusieurs modèles de différents niveaux de complexité. Ces modèles décrivent une relation entre la population de lymphocytes T et leurs composants intracellulaires et extracellulaires. Ils conduisent à des systèmes d’EDO et d’EDP dont la résolution permet d’étudier la dynamique de la densité de population des lymphocytes au cours du processus d'activation. En outre, différentes hypothèses sont proposées pour le processus d'activation des cellules filles après prolifération. Les équations de bilan de population (EBPs) sont résolues par une nouvelle méthode validée par une solution analytique quand elle existe, ou par comparaison à différentes méthodes numériques disponibles dans la littérature. L’avantage de cette nouvelle méthode est d’être utilisable dans certains cas où les méthodes classiques ne le sont pas. / The early steps of activation are crucial in deciding the fate of T-cells leading to the proliferation. These steps strongly depend on the initial conditions, especially the avidity of the T-cell receptor for the specific ligand and the concentration of this ligand. The recognition induces a rapid decrease of membrane TCR-CD3 complexes inside the T-cell, then the up-regulation of CD25 and then CD25–IL2 binding which down-regulates into the T-cell. This process can be monitored by flow cytometry technique. We propose several models based on the level of complexity by using population balance modeling technique to study the dynamics of T-cells population density during the activation process. These models provide us a relation between the population of T-cells with their intracellular and extracellular components. Moreover, the hypotheses are proposed for the activation process of daughter T-cells after proliferation. The corresponding population balance equations (PBEs) include reaction term (i.e. assimilated as growth term) and activation term (i.e. assimilated as nucleation term). Further the PBEs are solved by newly developed method that is validated against analytical method wherever possible and various approximate techniques available in the literature.