Les bactéries lactiques présentent un grand intérêt économique de par leur large utilisation dans l’industrie agroalimentaire. Parmi elles, Streptococcus thermophilus (ST) est d’une importance majeure puisqu’elle est la plus utilisée après Lactococcus lactis, pour la fabrication de produits laitiers fermentés et de fromages. De plus, cette bactérie est le seul streptocoque à bénéficier du statut GRAS (Generally Recognized As Safe). Outre son intérêt en industrie laitière, ST présente des effets bénéfiques sur la santé intestinale de l’Homme. Bien que ces effets soient largement documentés, le statut probiotique de ST reste encore à conforter. C’est pourquoi des études sont actuellement menées afin de sélectionner des souches de ST à fort potentiel probiotique. Parmi les critères importants figurent leur capacité à survivre aux conditions drastiques du tube digestif (TD) et leur capacité à adhérer aux cellules intestinales. Dans cette optique, les objectifs de cette thèse étaient d’étudier, dans un premier temps, la capacité d’adhésion in vitro de la souche ST LMD-9 à différentes lignées cellulaires intestinales d’origine humaine et d’évaluer la survie de cette souche au stress biliaire. Afin de mettre en évidence un rôle potentiel de certaines protéines de surface dans ces deux processus, trois mutants issus de cette souche et inactivés dans les gènes prtS (protéase pariétale), srtA (sortase A) et mucBP (protéine de liaison aux mucines), ont été inclus dans cette étude. Dans un second temps, l’impact de l’adhésion de LMD-9 a été analysé, d’une part sur l’expression de gènes codant certaines mucines dans les cellules eucaryotes, et d’autre part sur l’expression de gènes qui seraient spécifiquement induits durant le processus d’adhésion, ceci en utilisant la technologie R-IVET (Recombinase-based In Vivo Expression Technology). Les résultats obtenus ont permis de montrer que la souche LMD-9 était capable de survivre jusqu’à une concentration de 3 mM en sels biliaires et que les protéines de surface PrtS, SrtA et MucBP seraient impliquées dans la résistance à ce stress. Nos résultats ont également montré que LMD-9 adhérait aux trois différentes lignées cellulaires, suggérant ainsi que la souche pourrait interagir avec les différentes mucines qu’elle peut rencontrer dans le TD. De plus, l’implication de certaines protéines de surface dans l’adhésion de LMD-9 s’est avérée dépendante des caractéristiques de ces lignées, qu’il s’agisse de cellules entérocytaires (Caco-2) ou productrices de mucus (HT29-MTX et HT29-CL.16E). Concernant l’impact de l’adhésion de la souche LMD-9 sur l’expression des gènes MUC2 et MUC5AC, aucun effet sur le taux de transcrits n’a été observé dans nos conditions expérimentales. Par ailleurs, nos résultats ont permis, pour la première fois, d’identifier les gènes spécifiquement induits dans la souche LMD-9 durant l’adhésion aux cellules épithéliales. Nous avons ainsi montré que l’adhésion de la souche LMD-9 ne dépend pas uniquement des protéines de surface, mais d’autres fonctions et voies métaboliques seraient également impliquées. Ce travail de thèse contribue ainsi à apporter de nouvelles connaissances liées (i) au choix du modèle cellulaire dans les études d’adhésion bactérienne in vitro, (ii) à l’aptitude de la souche LMD-9 à survivre au stress biliaire en faisant intervenir certaines protéines de surface et (iii) à la compréhension des mécanismes moléculaires de l’adhésion de LMD-9 aux cellules épithéliales intestinales / Lactic acid bacteria are of great economic interest because of their use in the food industry. Among them, Streptococcus thermophilus (ST) is of major interest since it is the most used after Lactococcus lactis, for the manufacture of fermented dairy products and cheese. In addition, this bacterium is the only streptococcus to benefit from GRAS status (Generally Recognized As Safe). Beside its interest in the dairy industry, ST has beneficial effects on human intestinal health. Although these effects are widely documented, the probiotic status of ST remains to be consolidated. Therefore, studies are currently being conducted in order to select strains of ST with a high probiotic potential. Among criteria that are important to select ST strains include their ability to survive stress the drastic conditions of the digestive tract (DT) and their ability to adhere to intestinal cells. In this context, the aim of this thesis was to investigate firstly the in vitro adhesion capacity of the ST LMD-9 strain to different human intestinal cell lines and to evaluate the survival of this strain to bile salt stress. In order to highlight the potential role of some surface proteins in these two processes, three mutants derived from this strain and inactivated in the genes prtS (parietal protease), srtA (sortase A) and mucBP (Mucin Binding-protein) were also included in this study. Secondly, the impact of LMD-9 adhesion was analyzed, on one hand on the expression of some mucin-encoding genes in eukaryotic cells, and on the other hand on the expression of genes that would be specifically induced during adhesion process using the R-IVET (Recombinase-based In Vivo Expression Technology) approach. The results obtained demonstrated the ability of LMD-9 to survive up to the concentration of 3 mM of bile salts and that the PrtS, SrtA and MucBP surface proteins would be involved in the resistance to this stress. Our results also showed that the LMD-9 strain was capable of adhering to three cell lines used suggesting that this strain could interact with different mucins that may encounter in the DT. Moreover, the involvement of some surface proteins in the adhesion of LMD-9 has been found to be dependent on the surface characteristics of these cell lines, whether they are enterocytic (Caco-2) or mucus-secreting cells (HT29-MTX and HT29-CL.16E). Regarding the impact of LMD-9 adhesion on MUC2 and MUC5AC gene expression, no effect has been observed on the transcript level under our experimental conditions. Furthermore, for the first time, our results allowed us to identify genes specifically induced in the LMD-9 strain during adhesion process to epithelial cells. We have thus shown that the LMD-9 adhesion does not depend solely on surface proteins, but other functions and metabolic pathways are also involved. This thesis work contributes thus to new knowledge related to (i) the choice of the cellular model in in vitro bacterial adhesion studies, (ii) the ability of LMD-9 to survive bile salt stress by involving some surface proteins and (iii) understanding the molecular mechanisms of LMD-9 adhesion to epithelial cells

Alterações favoráveis na composição da microbiota intestinal podem ser observadas com o consumo regular de alimentos funcionais contendo probióticos. Os probióticos são micro-organismos vivos que conferem benefícios à saúde do hospedeiro, quando administrados em quantidades adequadas. Tradicionalmente, são incorporados aos leites fermentados e a outros produtos lácteos fermentados. Atualmente, a idéia de redução dos componentes lácteos como veículos para agentes probióticos tem sido promovida, em razão da alta proporção de indivíduos que apresentam intolerância à lactose, além da busca por alternativas vegetarianas. Nesse contexto, a soja aparece como um substituto ideal para o consumo, promovendo a saúde através de características nutricionais intrínsecas. O presente trabalho visou desenvolver um produto semelhante ao queijo petit-suisse, mas à base de soja, com polpa de fruta, e adicionado de micro-organismos probióticos, bem como avaliar a aceitabilidade do produto sob o ponto de vista sensorial e suas características físico-químicas, microbiológicas e de textura instrumental durante o seu armazenamento a 4±1 °C por até 28 dias. Três formulações foram produzidas (com três repetições cada): F1- formulação de queijo petit-suisse probiótico elaborado com massa-base de queijo quark, como controle (produto lácteo); F2 - formulação com \"queijo\" de soja e com creme de leite (produto misto à base de soja e de leite); F3 - formulação com \"queijo\" de soja e com creme de soja (produto de soja). Em todas as formulações, foi empregada a cultura probiótica ABT-4, constituída dos micro-organismos comprovadamente probióticos Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bb-12, Lactobacillus acidophilus La-5 e da cultura starter Streptococcus thermophilus. Os produtos foram armazenados a 4±1 °C e avaliados sensorialmente (teste de aceitabilidade, utilizando escala hedônica estruturada), após 7, 14 e 21 dias, por 50 consumidores em cada período. Adicionalmente, foram analisados semanalmente durante o seu armazenamento por até 28 dias quanto à viabilidade dos probióticos e da cultura starter e quanto ao seu pH e o seu perfil instrumental de textura (teste de dupla compressão de amostras, em analisador de textura TA-XT2). Paralelamente, foi realizado um monitoramento microbiológico das amostras quanto à presença de contaminantes e a partir de amostras mantidas congeladas, foi determinada a composição centesimal dos produtos. A viabilidade de La-5 mostrou-se satisfatória até o 28º dia de armazenamento das formulações F1 e F2, com populações variando de 8,29 a 7,56 log ufc/g e de 8,17 a 6,49 log ufc/g, respectivamente. Entretanto, para F3, as populações de La-5 mostraram-se satisfatórias até o 21º dia (8,18 a 6,84 log ufc/g), não atingindo o mínimo recomendado na última semana. Por outro lado, a viabilidade de Bb-12 manteve-se acima de 8 log ufc/g até o 28º dia de armazenamento de F1, F2 e F3. A cultura starter apresentou populações sempre entre 9,73 e 8,86 log ufc/g. O pH manteve-se estável para todas as formulações, mas foi significativamente menor (p<0,05) para F2, em relação a F1 e F3. Nos parâmetros dureza e gomosidade, F1 apresentou comportamento antagônico em relação ao de F2 e F3. Todos os parâmetros de textura de F1 diferiram significativamente de F2 e F3 (p<0,05). Não houve diferença significativa (p>0,05) na análise sensorial de uma mesma formulação entre os períodos de armazenamento. No entanto, na comparação entre as formulações, foram observados escores médios superiores (p<0,05) para F3 aos 21 dias (6,4), quando comparada a F2 (4,6). Os alimentos à base de soja, F2 e F3, mostraram-se bons veículos para os micro-organismos probióticos, com populações adequadas para caracterizá-los como probióticos, sendo que F3 mostrou uma tendência a um melhor desempenho sensorial após 14 e 21 dias de armazenamento. / Favorable changes in the composition of the intestinal microbiota can be observed with the regular consumption of functional foods containing probiotics. Probiotics are live microorganisms which when administered in adequate amounts confer a health benefit on the host. They are traditionally incorporated into fermented milks and other fermented milk products. Currently, the idea of reducing milk components as vehicles for probiotic agents has been promoted due to the high proportion of people who have lactose intolerance, and the search for vegetarian alternatives. In this context, soy appears as an ideal replacement for consumption, promoting health through intrinsic nutritional characteristics. This work aimed to develop a product similar to petit-suisse cheese, but soy based, with fruit pulp, and with probiotic micro-organisms, as well as evaluating the acceptability of the product from the point of view of its sensory and physico-chemical characteristics, microbiological and instrumental texture profile during storage at 4 ± 1 °C for up to 28 days. Three formulations were produced (in triplicates): F1 - formulation of probiotic petit-suisse cheese prepared with quark cheese, as control (milk product) F2 - formulation with soy \"cheese\" and milk cream (mixed product with soy and milk), F3 - formulation with soy \"cheese\" and soy cream (soy product). The three formulations were produced with the probiotic ABT-4 culture, consisting of the probiotic microorganisms Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bb-12, Lactobacillus acidophilus La-5 and the starter culture Streptococcus thermophilus. The products were stored at 4 ± 1 °C and subjected to sensory evaluation (acceptability test, using an hedonic scale), after 7, 14, and 21 days, by 50 consumers in each period. Additionally, the products were monitored weekly during storage for up to 28 days regarding the viability of the probiotics and starter culture and their pH profile and the instrumental texture (double compression of samples test, using a TA-XT2 texture analyzer). Also, samples were monitored for the presence of contaminants, and, the chemical composition of the products was determined from samples kept frozen. The viability of the La-5 was satisfactory until the 28th day of storage for F1 and F2, with populations ranging from 8.29 to 7.56 log cfu/g and from 8.17 to 6.49 log cfu/g respectively. However, for F3, the population of La-5 proved to be satisfactory until the 21st day (8.18 to 6.84 log cfu/g), not reaching the minimum recommended in the last week. On the other hand, Bb-12 viability remained above 8 log cfu/g throughout the 28 days of storage for F1, F2, and F3. The starter culture populations were always between 9.73 and 8.86 log cfu/g. The pH remained stable for all formulations, but was significantly lower (p<0.05) for F2, compared to F1 and F3. As for the texture parameters hardness and gumminess, F1 showed antagonistic behavior in relation to F2 and F3. All texture parameters evaluated differed significantly for F1, F2, and F3 (p<0.05). There was no significant difference (p>0.05) in the sensory scores obtained for the same formulation, when different storage periods were compared. However, when the 3 formulations were compared, higher average scores (p<0.05) were obtained on day 21 for F3 (6.4) than for F2 (4.6). The soy-based foods, F2 and F3, proved to be good vehicles for probiotic microorganisms, with appropriate populations to characterize them as probiotics, and F3 showed a trend towards a better performance in sensory evaluation on days 14 and 21 days of storage.

Nous nous intéressons à la production de peptides bioactifs dans des laits fermentés par la bactérie lactique Streptococcus thermophilus. Pour ce faire, il est nécessaire que cette bactérie en internalise le moins possible lors de sa croissance. Il était donc important de caractériser le système protéolytique S. thermophilus. Tout d’abord, les relations phylogéniques liant 30 souches de S. thermophilus ont été recherchées par MLST. Ensuite, un système de transport de type ABC qui semble fonctionnel a été identifié chez la souche LMD-9 et appelé OTS. Une étude de la variabilité des systèmes de transport Ami et OTS des 30 souches de S. thermophilus a été réalisée. Enfin, l’hydrolyse des caséines par la protéase PrtS de S. thermophilus a été étudiée. Cette protéase habituellement ancrée à la paroi de la bactérie est retrouvée chez la souche 4F44 également sous forme libre. La séquence protéique de PrtS4F44, différente de celle de PrtS de la souche LMD 9 (PrtSLMD-9), n’est pas la cause de la libération partielle de PrtS4F44. La sortase A, acteur de l’ancrage de PrtS à la paroi de la bactérie, présente chez la souche 4F44 (srtA4F44) un allèle différent de celui de la souche LMD-9 (srtALMD-9). En effet, PrtSLMD-9 se trouve libérée lorsque srtALMD-9 est remplacée par srtA4F44 dans la souche LMD-9 montrant ainsi que SrtA4F44 est déficiente, entrainant par conséquent un défaut d’ancrage de PrtS4F44 et sa libération partielle dans le milieu extracellulaire. L’hydrolyse des caséinates bovines totales par la forme libre de PrtS4F44 a permis d’obtenir des peptides bioactifs qui pourront être utilisés pour la fonctionnalisation de produits laitiers fermentés / We are interested in the production of bioactive peptides in fermented milk by the lactic acid bacterium Streptococcus thermophilus. For this, it requires that the bacterium internalize them as few as possible during its growth. Therefore, it was important to characterize the proteolytic system of S. thermophilus. First, phylogenetic relationships linking 30 S. thermophilus strains have been searched by MLST. Secondly, an ABC-type transport system which seems to be functional was identified in the LMD-9 strain and named OTS. A study of the variability of Ami and OTS transport systems of the 30 strains of S. thermophilus was performed. Finally, the hydrolysis of caseins by proteinase PrtS of S. thermophilus was studied. This proteinase usually anchored to the wall of the bacterium was also found in a free form in strain 4F44. The protein sequence of PrtS4F44, different from the one of PrtS in the LMD-9 strain (PrtSLMD-9), is not the cause of the partial release of PrtS4F44. Sortase A, the actor of the anchoring of PrtS to the wall of the bacteria, presents different alleles between the strain 4F44 (srtA4F44) and the LMD-9 strain (srtALMD-9). Indeed, PrtSLMD-9 is released when srtALMD-9 is replaced by srtA4F44 in the strain LMD-9 showing that SrtA4F44 is deficient, causing consequently a default of PrtS4F44 anchoring and its partial release into the extracellular medium. Additionally, hydrolysis of bovine caseinates was performed using the free form PrtS4F44 and allowed the production of bioactive peptides that can be used for the functionalization of fermented dairy products

Streptococcus thermophilus est la bactérie lactique la plus utilisée après Lactococcus lactis dans l’industrie laitière pour la fabrication de yaourts et de fromages. Il s’agit du seul streptocoque à avoir le statut de bactérie GRAS (Generally Recognized As Safe). Malgré de récentes études montrant sa capacité à survivre dans le tractus digestif humain et des effets santé intéressants, le statut probiotique de S. thermophilus reste l’objet d’interrogations. Ainsi, les objectifs de cette thèse ont été (i) d’approfondir les connaissances sur la capacité de survie de S. thermophilus en conditions digestives humaines simulées, grâce, en particulier, au système dynamique multi-compartimenté TIM (TNO gastro-intestinal model) et (ii) d’identifier des gènes de S. thermophilus spécifiquement activés dans des conditions complexes comme l’environnement digestif, à l’aide de la technologie R-IVET (Recombinase-based In Vivo Expression Technology) basée sur l’excision d’un gène rapporteur. Le système R-IVET est composé d’un vecteur plasmidique portant la recombinase cre démunie de son promoteur et d’une cassette chromosomique composée d’un gène marqueur entouré de sites loxP reconnus par Cre. Ainsi, dans un premier temps, nous avons implanté la technologie R-IVET chez S. thermophilus LMD-9. Sa fonctionnalité a été testée et validée in vitro et dans le tractus digestif de la souris. Puis, l’étude de la survie de quatre souches de S. thermophilus dans le système TIM a montré que trois d’entre elles étaient plus résistantes que la quatrième, très sensible aux stress gastro-intestinaux. Ces résultats confirment donc que la survie de S. thermophilus dans l’environnement digestif est souche-dépendante. Ils montrent également que la survie de S. thermophilus est influencée par la matrice alimentaire, celle-ci étant plus importante en lait fermenté qu’en lait liquide. Enfin, dans un troisième temps, nous avons construit une première banque génomique R-IVET, en clonant en amont de cre des fragments d’ADN génomiques provenant de LMD-9. Cette banque a été testée uniquement en conditions gastriques simulées dans le TIM. Puis, après avoir optimisé notre outil chez S. thermophilus en améliorant la méthode d’identification des gènes activés, une seconde banque R-IVET a été testée dans l’ensemble du tractus gastro-intestinal (TIM) et en système batch en présence du microbiote intestinal. Ces expériences nous ont permis de mettre en évidence, pour la première fois, des gènes de S. thermophilus spécifiquement activés dans les différents compartiments digestifs de l’homme. Ce travail de thèse contribue ainsi à approfondir les connaissances sur le comportement de cette bactérie dans le tractus gastro-intestinal humain. A moyen terme, ces travaux devraient permettre d’identifier des marqueurs de survie de S. thermophilus et de mieux comprendre son activité métabolique dans l’environnement digestif, facilitant la sélection de souches dans la perspective de développement d’aliments fonctionnels. / Streptococcus thermophilus is the lactic acid bacterium most commonly used after Lactococcus lactis in the dairy industry for the production of yogurt and cheese. It is the only streptococcus strain to have the GRAS status (Generally Recognized As Safe). Despite recent studies showing its ability to survive through the human digestive tract and valuable health effects, the probiotic status of S. thermophilus remains questioned. Thus, the objectives of this pHD work were (i) to increase knowledge on the survival of S. thermophilus in human digestive environment, by using the dynamic multi-compartmental TIM system (TNO gastro-intestinal model) and (ii) to identify the genes from S. thermophilus that are specifically activated in complex digestive environment using the R-IVET technology (Recombinase-based In Vivo Expression Technology). R-IVET is based on the excision of a reporter gene and consists of a plasmid vector carrying the promoterless recombinase cre and a chromosomal cassette composed of a marker gene flanked by loxP recognized by Cre. First, we introduced the R-IVET technology in S. thermophilus LMD-9. Its functionality was tested and validated in vitro and in the mice digestive tract. Then, the survival of four S. thermophilus strains was investigated in the TIM system and we showed that 3 of these strains were more resistant than the other one, very sensitive to gastrointestinal stresses. These results strengthen the idea that the survival of S. thermophilus is strain-dependent. We also highlighted that the survival of S. thermophilus was influenced by the food matrix, being higher in fermented compared to liquid milk. Lastly, we constructed a first genomic R-IVET library, by cloning upstream of cre genomic DNA fragments from LMD-9. This library was tested only in gastric condition (TIM). After optimization of our tool in S. thermophilus (improvement of the method allowing identification of the activated genes), a second R-IVET library was tested throughout the gastrointestinal system (TIM) and in batch system including intestinal microbiota. By identifying bacterial genes specifically activated in human digestive conditions, this work contributes to extend our knowledge on the behavior of S. thermophilus in the human gastrointestinal tract. This could open up opportunities in determining survival markers for S. thermophilus and better describing its metabolic activity in the human gut, then facilitating the selection of strains that can be included in functional foods.

Orientador: Marcelo Cristianini / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-22T10:26:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_MiguelMeirellesde_M.pdf: 1688064 bytes, checksum: 7da6b05069a8467a053c06082ae009f5 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Leites fermentados probióticos são considerados alimentos funcionais, devendo conferir proteção às culturas. A alta pressão dinâmica (APD) vem sendo investigada como alternativa na produção de leite fermentado, pois altera a funcionalidade de alguns constituintes. Este trabalho objetivou avaliar o uso de leite submetido à APD na cinética de fermentação de S. thermophilus e L. acidophilus, bem como a viabilidade das culturas, as características físico-químicas e reológicas durante a estocagem refrigerada do leite fermentado probiótico.Leite (3% de gordura) foi submetido ao processo de APD (100MPa e 200MPa) e comparados com controle (15/5MPa), e avaliada a cinética de fermentação (pH), atividade proteolítica e a viabilidade durante a fermentação do L. acidophilus (Cap.2). Outro experimento foi realizado com leite (2% de gordura) submetido à APD (50/5MPa, 100/5MPa, 150/5MPa e 180/5MPa) e comparado com o controle (15/5MPa), no qual foi avaliada a cinética de fermentação de S. thermophilus em co-cultura com L. acidophilus (Cap.3), bem como o comportamento reológico (Cap.3) e as características físico-químicas (Cap.4) do leite fermentado probiótico durante a estocagem refrigerada. A cinética de fermentação de Lactobacillus acidophilus foi alterada pela APD (100MPa e 200MPa) em comparação com o controle (15/5MPa), aumentando consideravelmente o tempo de fermentação com o aumento da pressão, sendo que após 24 horas de fermentação as amostras apresentaram valores de pH 4,49 (15/5MPa), pH 4,72 (100MPa) e 4,93 (200MPa). A atividade proteolítica foi alterada, sendo que pressões elevadas reduziram a atividade, atingindo no final da fermentação uma redução de 21,39% (100MPa) e 35,89% (200MPa), quando comparadas com o controle. Além disso, as amostras submetidas à APD apresentaram menor número de células viáveis de L. acidophilus no fim da fermentação em relação ao controle (0,28 ciclos log) (p<0,05). A cinética de fermentação do Streptococcus thermophilus e Lactobacillus acidophilus não foi alterada pela APD. O comportamento reológico durante a fermentação de leite processado à 100/5MPa e 180/5MPa apresentou correlação positiva entre a pressão usada com a consistência do leite fermentado, gerando um produto com maior consistência. Além disso, o processo de APD aumentou a capacidade de retenção de água (CRA) em 9,15% e reduziu a sinérese espontânea do produto em 31%, entre o controle e a amostras processada a 180/5MPa. A viabilidade do S. thermophilus não foi (p<0,05) influenciada pela APD (50/5MPa, 100/5MPa, 50/5MPa e 180/5MPa) em comparação com a homogeneização convencional (15/5MPa) durante a estocagem refrigerada, reduzindo a contagem em aproximadamente 0,2 ciclos log em todos os tratamentos estudados. A viabilidade do L. acidophilus foi maior na amostra processada a 180/5MPa a partir do 14° dia, em comparação ao controle (15/5MPa). O pH apresentou uma pequena redução (p<0,05) somente na amostra processada a 180/5MPa no ultimo dia. A atividade proteolítica das culturas não foi influenciada pela ADP. Os resultados demonstraram que a APD pode melhorar a textura de leite fermentado, aumentar a capacidade de retenção de água, reduzir a sinérese e alterar a cinética de fermentação, dependendo da cultura utilizada. No entanto, a viabilidade das culturas, a redução do pH e a atividade proteolítica não sofreram alterações expressivas pela APD, apesar de apresentar diferenças significativas / Abstract: Probiotics fermented milk are considered functional food, should provide protection to cultures. Dynamic high pressure (DHP) is being investigated as an alternative in the production of fermented milk, because changing the functionality of some constituents. This study evaluated the use of milk submitted to DHP in fermentation kinetics of S. thermophilus and L. acidophilus, as well as the viability of the cultures, the physico-chemical and rheological during refrigerated storage of fermented milk probiotic. Milk (3% fat) was subjected to the process of DHP (100MPa and 200MPa) and compared with control (15/5MPa), and evaluated the kinetics of fermentation (pH), proteolytic activity and viability during fermentation of L. acidophilus (Cap.2). Another experiment was performed with milk (2% fat) subject to DHP (50/5MPa, 100/5MPa, and 150/5MPa 180/5MPa) and compared with the control (15/5MPa), in which was evaluated the kinetics fermentation of S. thermophilus in co-cultured with L. acidophilus (Cap.3), and rheological behavior (Cap.3) and the physico-chemical (Cap.4) of probiotic fermented milk during refrigerated storage. The fermentation kinetics of Lactobacillus acidophilus was modified by DHP (100MPa and 200MPa), comparated to control (15/5 MPa) considerably increasing the fermentation time the higher the pressure used, and that after 24 hours of fermentation samples showed pH 4.49 (15/5MPa), pH 4.72 (100MPa) 4.93 (200MPa). The proteolytic activity was changed, with elevated pressures reducing proteolytic activity at the end of the fermentation, reaching a reduction of 21.39% (100MPa) and 35.89% (200MPa) compared with the control. In addition, the samples submitted to APD had lower number of viable probiotics in the end of fermentation compared to control (0,28 log cycles) (p<0.05). The fermentation kinetics of Streptococcus thermophilus and Lactobacillus acidophilus was not altered by DHP. The rheological behavior during fermentation in milk processed by DHP (100/5 MPa and 180/5 MPa) demonstrated a positive correlation between the pressure and consistency of the fermented milk. Moreover, the process of DHP favored water-holding capacity (WHC) in 10.13% and reduced syneresis spontaneous in 31% between the control and 180/5 MPa. The viability of S. thermophilus was not influenced by DHP (50/5MPa, 100/5MPa, 150/5MPa and 180/5MPa), comparated to conventional homogenization (15/5 MPa) during refrigerated storage, reducing the count in approximately 0.2 log cycles in all treatments. The viability of L. acidophilus was higher in the processed sample 180/5MPa from day 14, compared to the control (15/5 MPa). The pH showed a small reduction in sample subject to 180/5 MPa at the final day of storage. The proteolytic activity of the culture was not influenced by DHP. The results showed that the DHP may improve the texture of fermented milk, increase water-holding capacity, reduce syneresis and alter the kinetics of the fermentation. However, viability of cultures, the decrease in pH and proteolytic activity did not change by DHP, despite showing significant differences / Mestrado / Tecnologia de Alimentos / Mestre em Tecnologia de Alimentos

Les bactéries lactiques sont largement utilisées en tant que ferments dans l'industrie laitière. Leur production s’effectue généralement dans des milieux semi-définis ou complexes dans lesquels certains nutriments peuvent être apportés par des extraits de levure (EXLs). Ce projet de thèse, qui associe deux partenaires industriels, les groupes Lesaffre et Sacco, ainsi que l’INRA, s’est focalisé sur l’effet des peptides de deux EXLs (EXL1 et EXL2) sur une souche industrielle de Streptococcus thermophilus, un levain lactique d’intérêt économique majeur. L’hypothèse sous-jacente était que ces peptides pourraient avoir un double rôle de nutrition et de régulation de fonctions cellulaires pouvant présenter un intérêt technologique. Afin d’explorer cette question, une stratégie expérimentale à deux niveaux a été élaborée : i) caractérisation et suivi cinétique de la fraction peptidique des deux EXLs par spectrométrie de masse (peptidomique) durant la fermentation de S. thermophilus en bioréacteurs, et ii) suivi cinétique parallèle du transcriptome et du protéome de la bactérie. L’objectif final était de croiser ces deux niveaux d’information afin de corréler des différences de contenu peptidique avec des différences d’activation de systèmes participant aux performances globales du levain.La caractérisation et le suivi du peptidome des EXLs en cours de fermentation a nécessité un important travail de développement méthodologique ayant abouti in fine à l’élaboration d’un outil analytique complet, combinant analyse peptidomique à haut-débit des échantillons et traitement bioinformatique et statistique des données. Cet outil a permis d’identifier environ 4000 peptides différents composant les deux EXLs. Le suivi cinétique a notamment permis de préciser la spécificité du transporteur d’oligopeptides de la bactérie (Ami). En particulier, il s’est avéré qu’une charge nette positive était le facteur prévalent pour le transport des peptides chez S. thermophilus. En complément de cette approche semi-quantitative, des analyses quantitatives ont été réalisées sur des fractions peptidiques des EXLs (dosages différentiels par HPLC des acides aminés avant et après hydrolyse). Elles ont notamment permis de révéler d’importantes différences de teneurs en oligopeptides entre les deux EXLs.En parallèle, le suivi transcriptomique et protéomique réalisé durant la croissance de la bactérie a révélé deux faits marquants. Le premier fait a trait à la surexpression dans l’EXL1 d’un locus génétique régulé par un mécanisme de quorum sensing utilisant un peptide phéromone comme signal moléculaire. Le deuxième fait marquant concerne diverses voies de biosynthèse (acides aminés et purines) différentiellement affectées par les deux EXLs. L’origine de ces dynamiques pourrait être au moins pour partie le fait de différences de contenu peptidique entre les deux substrats. Notamment, certaines voies de biosynthèse pourraient avoir été modulées différentiellement sous l’action de régulateurs centraux tels que CodY, dont l’activité est corrélée au contenu peptidique du milieu, ou encore YebC, un régulateur CodY-like dont le lien fonctionnel avec CodY reste encore inconnu chez S. thermophilus. Tous ces résultats ouvrent d’intéressantes perspectives pour mieux explorer le lien entre peptides et métabolisme bactérien. A terme, cette démarche pourrait se traduire par l’identification de biomarqueurs de performances dans les EXLs, et l’élaboration à façon de produits permettant de maximiser le potentiel technologique des ferments lactiques. / Lactic acid bacteria are widely used as starters in dairy industry. They are generally produced in complex fermentation media containing a wide array of nutrients that can be provided by yeast extracts (YEs). The main goal of this thesis project, involving two industrial partners, Lesaffre and Sacco, as well as INRA, was to investigate the effect of the peptide fraction of two YEs (YE1 and YE2) on an industrial Streptococcus thermophilus strain, a major lactic acid starter. The underlying hypothesis of this whole project was that YE peptides could have a role in nutrition but also regulate cellular functions of technological relevance. In order to explore this question, a two-step strategy was elaborated: i) mass spectrometry characterization (peptidomics) of both YE peptide fractions and time course analysis of their relative abundance during the growth in bioreactors of S. thermophilus, and ii) parallel time course analysis of the strain transcriptome and proteome. The final objective was to cross these two levels of information in order to correlate differences of peptide content with differentially activated systems related to technological performances.YE peptidome characterization and kinetic analysis first required an important methodological development. It eventually resulted in a complete analytical tool that combines high throughput peptidomic analysis as well as bioinformatic and statistical data processing. This powerful tool was able to identify around 4,000 different peptides in both YEs. Then, the time course analysis also clarified the in vivo substrate specificities of the oligopeptide transport system of the bacterium (Ami). A peptide positive net charge notably turned out to be the leading factor governing peptide transport. In addition to this semi-quantitative approach, quantitative analyses were carried out on YE peptide fractions (differential HPLC analyses of amino acids before and after sample hydrolysis). They notably revealed significant differences in oligopeptides content between both YEs.Meanwhile, genome scale transcriptomic and proteomic analyses performed during the strain growth highlighted two significant events. The first one concerns the overexpression in YE1 of a quorum sensing-based genetic locus that uses a pheromone peptide as molecular signal. The second event relates to several biosynthesis pathways (amino acids and purines) that were differentially affected by both YEs. These dynamics could result from differences in peptide content between both substrates. In particular, some pathways could have been differentially modulated by central regulators such as CodY, whose activity is correlated to the medium peptide richness, or YebC, a CodY-like regulator whose functional link with CodY is still unknown in S. thermophilus. All these results open avenues for a better understanding of the interplay between peptides and bacterial metabolism. In the future, this whole approach could lead to the identification of performance biomarkers in YEs, which in turns may eventually translate into the conception of new customized products granting high technological performances to dairy starters.

S. thermophilus est une bactérie largement employée dans la fabrication des produits laitiers. La capacité des souches de S. thermophilus à générer des peptides bioactifs à partir des caséines bovines a été étudiée. Dix souches exprimant différemment la protéase de surface, PrtS, ont été incubées en présence de la caséine [alpha]s1, [alpha]s2 ou [bêta]. Le nombre et le type de peptides libérés dépendent de la souche utilisée. Des peptides connus comme des peptides bioactifs ont été détectés : 13 peptides ont été générés à partir de la caséine [bêta], 5 peptides à partir de la caséine [alpha]s2 et 2 peptides à partir de la caséine [alpha]s1. L'utilisation de cette bactérie pour la production de tels peptides dans l'aliment requiert qu'elle en internalise le moins possible. Nous nous sommes intéressés aux systèmes de transport de peptides présents au sein de l'espèce S. thermophilus. Une collection de 22 souches de S. thermophilus a été choisie pour étudier la variabilité des systèmes de transport des peptides présents au sein de l'espèce. Toute d'abord, la proximité phylogénétique entre les souches a été évaluée par MLST, puis la variabilité génétique du système de transport des oligopeptides Ami et du transporteur de di- et tripeptides DtpT a été étudiée au sein de cette collection. Un cluster, composé de 4 gènes, annoté en tant que transporteur ABC de peptides et de nickel a été détecté au sein du génome de la souche LMD-9, et appelé Ots. Il est présent chez 9 sur 22 souches de S. thermophilus et est transcrit tout au long de la croissance en milieu M17. La caractérisation du système Ots suggère qu'il est impliqué dans l'internalisation de peptides de petites tailles / S. thermophilus is a widely used bacterium in the manufacture of dairy products. The capacity of S. thermophilus to generate bioactive peptides from bovine caseins was studied. Ten strains expressing different levels of the cell envelope protease, PrtS, were incubated with [alpha]s1-, [alpha]s2- or [beta]-casein. Number and type of peptides released were strain-dependent. Peptides known as bioactive peptides were detected: 13 peptides were generated from [beta]-casein, 5 peptides from [alpha]s2-casein and 2 peptides from [alpha]s1-casein. The use of this bacterium for the production of such peptides in the food products requires the least internalization of these peptides by this bacterium. We were interested in knowing the peptide transport system present in the species S. thermophilus. A collection of 22 strains of S. thermophilus was chosen to study the genetic variability of peptide transport systems present within the species. First of all, we evaluated the phylogenetic proximity between selected strains by MLST, and then the genetic variability of the transport system of oligopeptides Ami and di- and tripeptides transporter, DtpT were studied in this collection. A cluster consisting of four genes, annotated as ABC transporter of peptides and nickel was detected in the genome of strain LMD-9, and called Ots. It is present in 9 of 22 strains of S. thermophilus and is transcribed throughout the growth in M17 medium. The Ots system seems to be involved in the internalization of smaller sized peptides

Streptococcus thermophilus, bactérie utilisée en industrie agro-alimentaire, est soumise à de nombreuses modifications environnementales (modification de la concentration en oxygène, de la température, du pH, ...) lors de la fabrication de produits fermentés. Pour s'adapter à ces modifications, la bactérie dispose de systèmes de défense qui sont contrôlés par des réseaux de régulation impliquant notamment des régulateurs transcriptionnels. Parmi eux, se trouvent les régulateurs de la famille Rgg. Les gènes Rgg codent des régulateurs transcriptionnels très polymorphes. Plusieurs études ont montré leur implication dans la réponse aux stress. L'originalité de S. thermophilus est que de nombreuses copies Rgg différentes sont présentes sur les génomes de cette espèce bactérienne (entre 5 et 7 copie selon les souches). Cette étude a pour objectif la caractérisation de la famille Rgg et l'étude du rôle des gènes Rgg de S. thermophilus, et, notamment, l'implication de ces gènes dans l'adaptation de S. thermophilus à son environnement. Les analyses réalisées in silico ont permis de montrer que les gènes Rgg sont spécifiques de la famille des Streptocococcaceae et des genres Lactobacillus et Listeria. Les protéines appartenant à cette famille sont polymorphes et ne forment pas un groupe monophylétique. Les analyses ont néanmoins montré que ces protéines se caractérisaient par deux domaines : un « domaine HTH » en position N-terminale, très probablement impliqué dans la liaison à l'ADN et un « domaine médian » en position centrale, dont le rôle reste à déterminer. Les analyses réalisées au cours de ce travail montrent que le gène rgg0182 de S. thermophilus LMG18311 code un régulateur transcriptionnel qui participe, notamment, à la réponse adaptative de S. thermophilus exposée à une augmentation de sa température de croissance. De plus, la délétion du gène Rgg0182 confère aux cellules une capacité d'adhésion à une surface hydrophobe et induit une réduction de la taille des chaînes. L'ensemble de ces phénotypes suggère que la protéine Rgg0182 est un régulateur global de l'expression génique de S. thermophilus LMG18311. Des gènes cibles de ce régulateur ont été recherchés parmi les gènes de réponses au choc thermique et indique que la protéine Rgg0182 est impliquée dans l'homéostasie des chaperons et des protéases. / Streptococcus thermophilus, bacterium used in dairy industry, is subjected to many environmental changes (oxygen concentration modification, temperature shift, pH variation...) during manufacturing of fermented products. To adapt itself to these modifications, bacterium has defense systems which are controlled by regulation networks involving, in particular, transcriptional regulators. Among them, they are transcriptional regulators of the Rgg family. rgg genes code transcriptional regulators which are very polymorph. Several studies showed their involvement in stress response. The originality of S. thermophilus is the presence of many different rgg copies on genomes of this bacterial species (between 5 and 7 copy according to strain). Objective of this study is the characterization of the Rgg family and study of the S. thermophilus rgg gene function, and, in particular, involvement of these genes in S. thermophilus adaptation to environmental changes. In silico analyses has allowed to show that rgg genes are specific to the Streptocococcaceae family of and the Lactobacillus and the Listeria genus. Proteins belonging to this family are polymorphic and don?t form a monophyletic group. Analyses nevertheless showed that these proteins were characterized by two domains: a "HTH domain" in N-terminal position, very probably involved in the DNA interaction, and a "median domain" in central position which the role remains to determine. Analyses realized during this work show that S. thermophilus LMG18311 rgg0182 gene codes a transcriptional regulator which participates, in particular, in the adaptive response of S. thermophilus exposed to an increase of its growth temperature. Furthermore, the deletion of the rgg0182 gene confers on cells the capacity of a hydrophobic surface adhesion and leads to a reduction of cells chains size. All these phenotypes suggest that Rgg0182 protein is a global regulator of S. thermophilus LMG18311 genic expression. Target genes of this regulator were looked for among genes of thermal stress response and indicate that Rgg0182 protein is involved in the chaperons and proteases homeostasis.

Les éléments intégratifs conjugatifs (ICE) sont des éléments génétiques mobiles se transférant horizontalement d’une bactérie à une autre. Les ICE sont porteurs de gènes adaptatifs pouvant significativement améliorer le fitness de la bactérie hôte et permettre son adaptation à de nouvelles niches écologiques. Lors de ces travaux, des ICE apparentés à ICESt3 ont été retrouvés chez la bactérie commensale et pathogène opportuniste Streptococcus salivarius. Les analyses in silico réalisées ont démontré la diversité des ICE de cette famille, notamment au niveau de leurs modules de recombinaison, de régulation mais aussi de leurs gènes adaptatifs potentiellement mis à disposition de la communauté microbienne orale et digestive de l’Homme. La fonctionnalité de deux de ces ICE a été mise en évidence expérimentalement à travers l’évaluation de la capacité de ces éléments à se transférer intra- et inter-spécifiquement. Ces travaux ont également permis l’identification de facteurs d’hôte influençant la mobilité d’ICESt3, révélant ainsi l’importance, pour le transfert et l’acquisition de cet ICE, des molécules de surface telles que les lipoprotéines, les acides téichoïques et les exopolysaccharides. En conclusion, il a été démontré que les éléments de la famille ICESt3 participent à l’évolution du génome chez différentes espèces de streptocoques et aux échanges génétiques entre bactéries issues de l’alimentation et bactéries de la flore digestive humaine. Enfin, ces travaux ont contribué à une meilleure compréhension des mécanismes et des facteurs d’hôte influençant la mobilité de ces éléments génétiques mobiles / Integrative Conjugative Elements (ICEs) are mobile genetic elements that can be horizontally transferred from a bacterium to another, eventually regardless of the species or any other classification, allowing them to benefit from a broad host spectrum. ICEs can carry adaptive genes that can significantly improve the bacterial fitness and allow its adaptation to new ecological niches. In this work, ICEs related to ICESt3 were found in the commensal and opportunistic pathogen Streptococcus salivarius. In silico analysis highlighted the diversity of the ICESt3 family within this species, especially concerning their recombination and regulation modules, but also their adaptive genes likely available for the oral and digestive microbial community of the human host. The functionality of two ICEs found in S. salivarius was experimentally confirmed through their ability to transfer in intra- and interspecific manners. This work also allowed the identification of host factors affecting ICESt3 mobility, and revealed the importance, for the transfer and the acquisition of this ICE, of cell surface molecules such as lipoproteins, teichoic acids and exopolysaccharides. In conclusion, this thesis allowed expanding the knowledge regarding the mobile genetic elements of the ICESt3 family. This work demonstrated that these elements contribute to genome evolution of different streptococci species and gene exchanges between bacteria originated from food and the human gut flora. Finally, this study contributes to a better comprehension of the mechanisms and host factors influencing the mobility of these mobile genetic elements

La traduction implique l’utilisation d’aminoacyl-ARNt produits par les aminoacyl-ARNt synthétases (aaRS). Il devrait exister 20 aaRS, une spécifique de chaque acide aminé. Or, les données actuelles montrent qu’une grande majorité des organismes ne possèdent pas l’asparaginyl- (AsnRS) et/ou la glutaminyl-ARNt synthétase (GlnRS). Ils ne peuvent synthétiser l’Asn-ARNtAsn et le Gln-ARNtGln que par l’utilisation de voies impliquant la formation préalable d’aspartyl-ARNtAsn et/ou de glutamyl-ARNtGln. Ces précurseurs « mésacylés » sont synthétisés par une aspartyl-ARNt synthétase et/ou une glutamyl-ARNt synthétase non-discriminantes (AspRS-ND ou GluRS-ND). Ils sont ensuite amidés par une amidotransférase (AdT), pour fournir à la cellule l’Asn-ARNtAsn et/ou le Gln-ARNtGln nécessaires à la traduction des codons Asn et Gln.Ce travail de thèse, effectué dans le contexte biologique de deux organismes différents, Thermus thermophilus et Helicobacter pylori, a permis de montrer que les étapes enzymatiques – formation du précurseur, et amidation par l’AdT – sont réalisées au sein de complexes ribonucléoprotéiques, réunissant l’aaRS-ND, l’ARNtAsn ou l’ARNtGln, et l’AdT : l’Asn-transamidosome ou le Gln-transamidosome. Selon leur origine ou la voie à laquelle ils appartiennent (asparaginylation ou glutaminylation), ces complexes possèdent des particularités mécanistiques et structurales très différentes, mais sont tous adaptés pour éviter la libération des intermédiaires mésacylés toxiques par des stratégies spécifiques. Ce travail permet de mieux comprendre les mécanismes évolutifs qui ont conduit à l’incorporation de l’Asn et de la Gln dans le code génétique. / Protein synthesis requires the biosynthesis of aminoacyl-tRNAs by aminoacyl-tRNA synthétases (aaRS). Since 20 amino acids are présent within the genetic code, 20 aaRS should be used by a single organism. However, the vast majority of organisms found today are deprived of asparaginyl- and/or glutaminyl-tRNA synthetases (Asn- or GlnRS). They can only synthesize Asn-tRNAAsn and/or Gln-tRNAGln through biosynthesis pathways involving the preliminary formation of aspartyl-tRNAAsn and /or glutamyl-tRNAGln. Those « misacylated » precursors are synthesized by so called non-discriminating aspartyl- or glutamyl-tRNA synthetases (ND-AspRS or –GluRS). Then, they are transferred to an amidotransferase (AdT) to provide the Asn-tRNAAsn and/or Gln-tRNAGln species (necessary to fuel protein synthesis) through amidation.This work was performed in the context of two organisms – Thermus thermophilus and Helicobacter pylori. It showed that the two enzymatic steps of asparaginylation and glutaminylation – biosynthesis of the misacylated precursor and amidation by AdT – are carried out within a single ribonucleoprotein complex, namely the (Asn- or Gln-) transamidosome, gathering the ND-aaRS necessary for the misacylation, the tRNA substrate (Asn or Gln) and the AdT. According to their origin or the pathway they originate from (asparaginylation or glutaminylation), those complexes display significant mechanistical and structural peculiarities, but they are all adapted to prevent libération of the toxic misacylated species through specific strategies. This work shed new light on the évolutive mechanisms that led to the incorporation of Asn or Gln into the genetic code.