Les efforts investis pour diminuer les risques de développer un infarctus du myocarde sont nombreux. Aujourd’hui les médecins prennent connaissance des divers facteurs de risque connus prédisposant aux syndromes coronariens aigus (SCA) dans le but de prendre en charge les patients «à risque» [1]. Bien que le suivi rigoureux et le contrôle de certains facteurs de risque modifiables aient permis une meilleure gestion des cas de SCA, les cas d’infarctus persistent de manière encore trop fréquente dans le monde. Puisque d’importantes études ont démontré que les SCA pouvaient survenir sans même la présence des facteurs de risque conventionnels [2, 3], les chercheurs se sont penchés sur un autre mécanisme potentiellement responsable de l’avènement des SCA : l’inflammation. L’inflammation joue un rôle prépondérant dans l’initiation, la progression et les complications de l’athérosclérose [4, 5] mais aussi dans les situations post-infarctus [6, 7]. Au cours des dernières années, le contrôle du processus inflammatoire est devenu une cible de choix dans la prévention et le traitement des SCA. Cependant, malgré les efforts investis, aucun de ces traitements ne s’est avéré pleinement efficace dans l’atteinte du but ultime visé par une diminution de l’inflammation : la diminution de la mortalité. Le complément est un système complexe reconnu principalement pour son rôle primordial dans l’immunité [2]. Cependant, lorsqu’il est activé de manière inappropriée ou excessive, il peut être à l’origine de nombreux dommages cellulaires caractéristiques de plusieurs pathologies inflammatoires dont font partie les complications de l’athérosclérose et des événements post-infarctus. Le travail effectué dans le cadre de mon doctorat vise à établir les rôles physiopathologiques du complément dans les interactions de l’axe thrombose-inflammation caractéristiques des SCA dans le but ultime d’identifier des cibles thérapeutiques permettant le développement de nouvelles approches pour la prévention et le traitement de ces pathologies. Les principaux résultats obtenus durant mon cursus suggèrent d’abord que la voie alterne du complément peut représenter une cible thérapeutique de choix dans les maladies coronariennes aiguës puisque l’activation terminale du complément semble y être principalement causée par l’activation du cette voie. De faibles niveaux sériques de MBL (mannan-binding lectin) et une activation terminale négligeable du complément caractérisent plutôt la maladie coronarienne stable. En comparant l’activité relative de chacune des voies du complément chez des cohortes de patients traités ou non par un anticorps spécifique à la protéine C5 du complément (pexelizumab), un second volet démontre quant à lui qu’une inhibition de l’activation du C5 n’a pas d’effet bénéfique majeur sur l’inhibition de la formation du complexe sC5b-9 ou sur les événements cliniques subséquents. Par conséquent, nous avons exploré, à l’aide d’un modèle in vitro, les raisons de l’inefficacité du traitement. Les résultats révèlent que le blocage du C5 avec le pexelizumab inhibe la production de l’anaphylatoxine pro-inflammatoire C5a et du complexe terminal du complément sans toutefois avoir d’effet sur l’apoptose des cellules endothéliales produites induite par le sérum des patients atteints de STEMI. Finalement, une autre section stipule que l’atorvastatine diminue l’activation du complément induite par les plaquettes sanguines chez des patients hypercholestérolémiques, mettant en évidence l’importance du rôle de cette statine dans la réduction des effets délétères de l’activation du système du complément médié par les plaquettes. Ensemble, l’étude du rôle spécifique des différentes voies d’activation du complément dans des contextes pathologiques variés, l’analyse des effets d’une inhibition spécifique de la protéine C5 du complément dans la progression des SCA et la mise en évidence des interactions entre l’activation du complément et les plaquettes activées ont contribué au développement d’une meilleure connaissance des rôles physiopathologiques du complément dans la progression de la maladie coronarienne. / Many efforts have been made in lowering the risk of myocardial infarction in the general population. Most clinicians are knowledgeable of the several identified risk factors leading to the development of acute coronary syndromes (ACS), and in turn, insure a better follow-up for “at risk” patients [1]. Despite the fact that intensive efforts in controlling modifiable risk factors have led to a better management of new cases of ACS, myocardial infarction and its deleterious consequences are still a world plague. Because it as been shown that ACS can occur without the presence of traditional risk factors [3, 4], researchers have been interested in modifying new ACS biological pathways such as inflammation. Inflammation plays a key role in the initiation, progression, and complications of atherosclerosis [5, 6], but also in post-infarction situations [7, 8]. In the past years, inflammation markers have become important targets for the prevention and treatment of ACS. Despite intensive efforts, none of the yet tested drug was found to be effective in decreasing mortality. The complement system is mainly known for its fundamental role in innate and adaptive immunity [2]. However, excessive activation of the complement can lead to a significant number of deleterious effects such as inflammation, apoptosis, necrosis and cell lysis. Earlier findings have shown that complement is extensively activated in atherosclerotic lesions, particularly in vulnerable and ruptured plaques. The objective of my doctoral project was to establish the pathophysiological roles of complement in the axis inflammation-thrombosis of ACS with the ultimate goal of identifying new therapeutic targets leading to the development of new drugs for the prevention and treatment of these diseases. The main results obtained first suggest that the complement alternative pathway represents a potential therapeutic target in acute coronary disease since terminal complement activation occurs mainly by this specific pathway. Low MBL levels (mannan-binding lectin) in serum and negligible terminal complement activation rather characterize stable coronary artery disease. By comparing the relative activity of each pathway of the complement in patients treated or not by an antibody specific to the C5 protein of the complement (pexelizumab), other results show that an inhibition of C5 activation does not have a major beneficial effect on the inhibition of the sC5b-9 complex expression or on the subsequent clinical events. Consequently, we explored, using an in vitro model of endothelial cells, the reasons of this inefficiency. This work reveals that C5 inhibition by pexelizumab inhibits the production of the pro-inflammatory anaphylatoxin C5a and of the terminal complement complex without, however, effecting endothelial cell apoptosis induced by the serum of patients with STEMI. Finally, another section stipulates that atorvastatin decreases platelet-induced complement activation in hypercholesterolemic patients, highlighting the importance of statins in the reduction of the deleterious effects of platelets-induced complement activation. All together, the study of the specific role of the various pathways of complement activation in different pathological contexts, the analysis of the effects of a specific inhibition of the C5 complement protein in the progression of ACS and the highlighting of the interactions between complement and platelet activation contribute to the development of a better knowledge of the pathophysiological roles of the complement system in ACS.

Les Cellules Endothéliales Progénitrices ("Endothelial Progenitor Cells", EPCs) sont des précurseurs endothéliaux qui jouent un rôle émergeant en biologie vasculaire. Les EPCs ont été localisées dans le cordon ombilical, la moelle osseuse, le sang périphérique et dans certains tissus régénérateurs. Les interactions des EPCs avec les cellules sanguines et vasculaires peuvent largement influencer leurs propriétés biologiques et dicter leur fonctionnement pendant la réparation endothéliale. Plus spécifiquement, les interactions des EPCs avec les plaquettes circulantes induisent leur migration, leur recrutement et leur différentiation en cellules endothéliales aux sites de lésions vasculaires. Cependant, l’impact d’une telle interaction sur la fonction plaquettaire n’a pas été recherché. Le but de mon projet était de :1) générer des EPCs à partir des cellules mononucléaires du sang humain périphérique ("Peripheral Blood Mononuclear Cells", PBMCs); 2) étudier les interactions adhésives entre les EPCs et les plaquettes; 3) déterminer leur impact sur la fonction plaquettaire et la formation du thrombus et 4) décrire le mécanisme d’action des EPCs sur les plaquettes et le thrombus. Mises en culture sur une surface de fibronectine dans un milieu conditionné, les PBMCs fraîchement isolées possédaient une morphologie ronde et une petite taille. Après cinq jours, les PBMCs adhérentes donnaient naissance à des colonies, puis formaient une monocouche de cellules aplaties caractéristiques des EPCs après dix jours de culture. Les EPCs différenciées étaient positives pour l’Ulex-lectine et l’Acétyle des lipoprotéines de faible densité ("Acetylated Low Density Lipoprotein", Ac-LDL), exprimaient les marqueurs progéniteurs (CD34, P-sélectine, VEGFR2, vWF et VE-Cadhérine) tandis que les marqueurs leucocytaires (CD14, PSGL-1 et L-sélectine) étaient absents. Ces EPCs interagissaient avec les plaquettes activées par un mécanisme dépendant de la P-sélectine plaquettaire, inhibaient l’activation et l’agrégation plaquettaire et réduisaient significativement l’adhésion plaquettaire, principalement par l’action de prostacycline (PGI2). En fait, ceci était associé avec une augmentation de l’expression de la cyclooxygénase-2 (COX-2) et du monoxyde d’azote (NO) synthéthase inductible (iNOS). Toutefois, les effets inhibiteurs des EPCs sur la fonction plaquettaire ont été renversés par une inhibition de la COX et non pas du NO. Bien que les EPCs fussent en mesure de lier les plaquettes via la P-sélectine, leurs effets prédominants étaient médiés essentiellement par une sécrétion paracrine, impliquant la PGI2. Néanmoins, un rapprochement étroit ou un bref contact entre les EPCs et les plaquettes était requis pour que cette fonction soit complètement réalisée. D’ailleurs, cet aspect a été investigué chez des souris déficientes en P-sélectine (P-sel-/-) et chez leurs congénères de phénotype sauvage (Wild Type, WT). Chez les souris WT, les EPCs inhibaient l’agrégation plaquettaire dans le sang complet de manière concentration-dépendante alors que dans les souris P-sel-/-, l’action des EPCs n’avait pas d’effet significatif. De plus, en utilisant un modèle murin de thrombose artérielle, nous avons démontré que l’infusion systémique des EPCs altéraient la formation du thrombus et réduisaient significativement sa masse chez les souris WT, mais non pas chez les souris P-sel-/-. En outre, le nombre des EPCs incorporées au niveau du thrombus et de la paroi vasculaire était visiblement réduit chez les P-sel-/- par rapport aux souris WT. Dans cette étude, nous sommes parvenus à différentier adéquatement des EPCs à partir des PBMCs, nous avons étudié les interactions adhésives entre les EPCs et les plaquettes, et nous avons décrit leur impact sur la fonction plaquettaire et la formation du thrombus. De plus, nous avons identifié la PGI2 comme étant le principal facteur soluble sécrété par les EPCs en culture et responsable de leurs effets inhibiteurs sur l’activation, l’adhésion et l’agrégation plaquettaire in vitro. De surcroît, nous avons élucidé le mécanisme d’action des EPCs sur l’agrégation plaquettaire et la formation du thrombus, in vivo, et nous avons souligné le rôle de la P-sélectine plaquettaire dans ce processus. Ces résultats ajoutent de nouvelles connaissances sur la biologie des EPCs et définissent leur rôle potentiel dans la régulation de la fonction plaquettaire et la thrombogenèse. / Endothelial Progenitor Cells (EPCs) are believed to contribute to vascular biology and endothelial repair. EPCs have been isolated from umbilical cord, bone marrow, peripheral blood and in some regenerative tissues. Interactions of EPCs with vascular and blood cells can largely influence their functional properties and predict their destiny in the target tissues. More specifically, interactions of EPCs with circulating platelets provide the critical signal to ensure their migration and homing at the sites of vascular injury and their differentiation into endothelial cells. However, the functional consequences of such interactions on platelets remain unknown. Accordingly, this project was designed to investigate the impact of EPCs on platelet function and the specific objectives of this study were to: 1) generate EPCs from human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs); 2) characterize the adhesive interactions between EPCs and platelets; 3) determine their impact on platelet function and thrombus formation and 4) elucidate the mechanistic action of EPCs on platelets and thrombus. Cultured on fibronectin in conditioned media, PBMCs differentiated, within ten days of culture, into EPCs, which were positive for Ulex-lectin and Ac-LDL (Acetylated Low Density Lipoprotein), and expressed progenitor markers (CD34, VEGFR2, vWF, and VE-Cadherin). These EPCs bind activated platelets through P-selectin-dependent mechanism, inhibited platelet activation, aggregation and adhesion, mainly via prostacyclin (PGI2) secretion. Indeed, this was associated with up-regulation of cyclooxygenase-2 (COX-2) and inducible nitric oxide (NO) synthase (iNOS). However, the effects on platelets were reversed by COX, but not by NO inhibition. Although EPCs bound platelets via platelet P-selectin, their predominant effects occurred via a paracrine secretion, implying PGI2. Nevertheless, a transitory link or brief contact between EPCs and platelets was required for this function to be fully realized. This was further depicted using a murine arterial thrombosis model in P-selectin deficient mice (P sel-/-) and their wild-type counterparts (WT). EPCs significantly impaired, in a concentration dependent-manner, collagen-induced whole blood platelet aggregation in WT mice; whereas in P-sel-/- mice, EPCs had no significant effect. Moreover, in murin model of arterial thrombosis, infusion of EPCs altered thrombus formation and significantly reduced the mass of thrombi generated in WT, but not in P-sel-/- mice. Furthermore, the number of EPCs recruited within the thrombi and along the vascular wall was visually reduced in P-sel-/- mice as compared to WT mice. In this project, we succeeded in adequately differentiating EPCs from PBMCs, we characterized the adhesive interaction between EPCs and platelets, and we addressed the impact of EPCs on platelet function and thrombus formation. Moreover, we identified PGI2 as the principal soluble factor secreted by cultured EPCs and responsible of their inhibitory effects on platelet function in vitro. In addition, using a murine model of arterial carotid injury in WT and P-sel-/- mice, we elucidate the mechanistic action of EPCs on platelet aggregation and thrombus formation, in vivo, and we highlighted the role of platelet P-selectin in this process. These findings add new insights into the biology of EPCs and reveal a potential role for EPCs in regulating platelet function, which in turn may limit thrombogenesis and maintain hemostasis at the sites of vascular injury.

Alors que la plaquette a un rôle prépondérant dans le maintient de l'hémostase, son implication dans la formation de la thrombose est également incontestée. Il existe à présent des traitements antiplaquettaires mais ceux-ci présentent quelques failles. Le but de ma maîtrise a donc été de caractériser de nouvelles voies d'inhibition de l'activité plaquettaire. Les deux études qui ont été réalisées concernent l'inhibition de récepteurs couplés aux protéines G, soit le récepteur à l'ADP P2Y1 et le récepteur à la thrombine PAR-1. Dans un premier temps, l'étude du récepteur P2Y1 suggère que l'inhibition de celui-ci seul ou en combinaison avec l'inhibition du récepteur P2Y12 présente un potentiel thérapeutique chez des patients coronariens stables. Dans un deuxième temps, l'étude d'un nouvel antiplaquettaire qui est présentement en phase III de son développement clinique, soit le SCH 530348, a été effectuée. Étant un antagoniste du récepteur PAR-1, le SCH 530348 a des effets qui se répercutent à la fois chez la plaquette et les leucocytes qui possèdent eux aussi ce récepteur. Cette deuxième étude suggère que complémentairement à son effet chez la plaquette, cet inhibiteur diminue les marqueurs de l'inflammation systémique. / Platelets have a central role in haemostasis as well as in the pathology of atherothrombotic disease. Antiplatelet therapy is the standard treatment for patients with coronary heart disease. However, the current antiplatelet agents show some disadvantages. The aim of my studies was then to describe the effect of inhibition of platelet activation pathways that are not yet the target of clinically used therapies. The two studies that were performed are regarding the inhibition of two G coupledprotein receptors, which are the ADP P2Y1 receptor and the thrombin PAR-1 receptor. First, the study of P2Y1 receptor revealed that its inhibition alone or in combination with the inhibition of P2Y12 receptor show a therapeutic potential in patients with stable coronary disease. Second, the study of a novel antiplatelet agent, SCH 530348, which is in phase III of its clinical development, has been carried out. SCH 530348, which is a PAR-1 receptor antagonist, can therefore act on platelets as well as on leukocytes which also express this receptor. This second study showed that additionally to its effect on platelet activation inhibition, SCH 530348 also reduces the cell-surface markers of systemic inflammation.

Human platelets glycoprotein VI (GPVI) is evidenced to be a platelet receptor of major importance in the occurrence of arterial thrombosis. Thus, it can be considered to be of great interest in diagnosis and therapeutic of atheriosclerotic diseases. Antibodies are powerful molecules which can be used in both diagnostic as well as for therapeutic purposes due to their unique characteristics. Monoclonal and recombinant antibodies have antigen restricted specificity, high affinity and can be used in various assays. Moreover, the good knowledge of their structure and molecular engineering facilities now allows the antibody modulation according to desired properties.Our group has already produced several monoclonal antibodies to human GPVI by gene gun immunization against the immunoadhesin hGPVI-Fc, which differ in fine epitopespecificity, affinity and other functional properties (Lecut et al. 2003). One, 3J24, with diagnostic potential while the other, 9O12, has a therapeutic potential because it blocks the binding of GPVI to collagen. Its Fab fragment has been extensively characterized in vitro,ex vivo and in vivo for its antithrombotic properties.Here, we designed and reshaped a single-chain antibody fragment (scFv) based on 3J24variable domains for the quantification of GPVI with diagnostic potential. We were also involved in the design, production and functional evaluation of humanized anti-GPVI recombinant antibody fragments (scFvs and Fabs) with therapeutic properties.

Upper gastrointestinal bleeding episodes from variceal structures are severe complications in patients with portal hypertension. Endoscopic sclerotherapy and variceal ligation are the treatment options preferred for upper variceal bleeding owing to extrahepatic portal hypertension due to portal vein thrombosis (PVT). Recurrent duodenal variceal bleeding in non-cirrhotic patients with diffuse porto-splenic vein thrombosis and subsequent portal. cavernous transformation represent a clinical challenge if classic shunt surgery is not possible or suitable. In this study, we represent a case of recurrent bleeding of duodenal varices in a non-cirrhotic patient with cavernous transformation of the portal vein that was successfully treated with a collateral caval shunt operation.

Les cellules endothéliales progénitrices («Endothelial Progenitor Cells», EPCs) sont des précurseurs endothéliaux qui possèdent un potentiel considérable dans la réparation et la régénération vasculaire. Dans le contexte des maladies cardiovasculaires, la compréhension du rôle des EPCs dans la régulation de la thrombogenèse et la réparation endothéliale est pertinente et nécessaire pour comprendre leur potentiel thérapeutique. Nous avons rapporté que les EPCs interagissent avec les plaquettes via la P-sélectine et inhibent l’adhésion, l’activation et l’agrégation des plaquettes ainsi que la formation de thrombus. Plus récemment, nous avons démontré que les EPCs expriment le récepteur inflammatoire CD40 et il est bien connu que les plaquettes constituent la source principale de la forme soluble de son agoniste le CD40L («soluble CD40 Ligand», sCD40L). Ainsi, nous avons émis l’hypothèse principale que l’axe CD40L/CD40 dans les EPCs influence leurs fonctions anti-thrombotique et pro-angiogénique. Pour vérifier cette hypothèse, nous avons réussi à générer des «early» et «late» EPCs à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique («Peripheral Blood Mononuclear Cells», PBMCs) en culture. Nous avons mis en évidence l’existence de l’axe CD40L/CD40 dans ces EPCs en démontrant l’expression des protéines adaptatrices, nommées les facteurs associés au récepteur du facteur de nécrose tumorale («TNF Receptor Associated Factors», TRAFs). Dans une première étude, nous avons investigué l’effet du sCD40L sur la fonction des «early» EPCs dans l’agrégation plaquettaire. En effet, nous avons démontré que le sCD40L renverse leur effet inhibiteur sur l’agrégation plaquettaire, et ce sans avoir un effet significatif sur la sécrétion de prostacycline (PGI2) et d’oxyde nitrique («Nitric Oxide», NO) par ces cellules. De plus, aucun effet du sCD40L n’a été noté sur l’apoptose et la viabilité de ces cellules. Par contre, nous avons noté une augmentation importante du stress oxydatif dans les «early» EPCs suite à leur stimulation avec le sCD40L. L’inhibition du stress oxydatif renverse l’effet du sCD40L sur les «early» EPCs dans l’agrégation plaquettaire. Ces résultats pourraient expliquer, en partie, la fonction réduite des EPCs chez les individus présentant des niveaux élevés de sCD40L en circulation. Dans une deuxième étude, nous avons étudié l’effet de sCD40L dans la fonction des «early» EPCs en relation avec l’angiogenèse. Nous avons identifié, dans un premier temps,les métalloprotéinases de la matrice («Matrix Metalloproteinases», MMPs) qui sont sécrétées par ces cellules. Nous avons trouvé que les «early» EPCs relâchent principalement la MMP-9 et que cette relâche est augmentée par le sCD40L. Le sCD40L induit aussi la phosphorylation de la p38 MAPK qui contribue à augmenter la sécrétion de MMP-9. Des études fonctionnelles ont démontré que le prétraitement des «early» EPCs au sCD40L potentialise la réparation endothéliale des HUVECs. En conclusion, l’ensemble de nos travaux, dans le cadre de ce projet de doctorat, nous a permis d’élucider les mécanismes responsables de l’action du sCD40L sur les effets inhibiteur et angiogénique des «early» EPCs dans l’agrégation plaquettaire et l’angiogenèse, respectivement. Ces résultats ajoutent de nouvelles connaissances sur le rôle des EPCs et pourront constituer la base pour des études futures permettant de corréler les niveaux élevés du sCD40L circulant et l’incidence des maladies cardiovasculaires, particulièrement l’athérothrombose. / Endothelial progenitor cells (EPCs) are endothelial precursors which possess a considerable therapeutic potential in vascular repair and regeneration. In the context of cardiovascular diseases, the understanding of the role of EPCs in the regulation of thrombogenesis and endothelial repair is relevant and necessary to the understanding of their therapeutic potential. We have shown that EPCs interact with platelets via P-selectin and inhibit the adhesion, activation and aggregation of platelets as well as thrombus formation. Recently, we have shown that EPCs express the inflammatory receptor CD40 and it is well known that platelets are the main source of the soluble form of its agonist CD40L («soluble CD40 ligand», sCD40L). Hence, we have hypothesized that the CD40L/CD40 axis in EPCs influences the anti-thrombotic and pro-angiogenic functions of EPCs. To verify this hypothesis, we have successfully generated early and late EPCs from peripheral blood mononuclear cells in culture. We have demonstrated the existence of the CD40L/CD40 axis in EPCs by showing the expression of adaptor proteins, named tumor necrosis factor associated factors (TRAFs). In our first study, we investigated the effect of sCD40L on the function of early EPCs in platelet aggregation. Indeed, we have shown that sCD40L reverses their inhibitory effect on platelet aggregation without having an effect on prostacyclin (PGI2) and nitric oxide (NO) secretion by these cells. Moreover, no effect of sCD40L has been noted on the apoptosis and viability of these cells. However, we have shown a significant increase in oxidative stress in early EPCs following sCD40L stimulation. The inhibition of oxidative stress reverses the effect of sCD40L on early EPCs in platelet aggregation. These results could partially explain the decreased function of EPCs in individuals displaying higher levels of sCD40L in circulation. In our second study, we have studied the effect of sCD40L on the function of early EPCs in relation to angiogenesis. First, we have identified the matrix metalloproteinases (MMPs) which are secreted by these cells. We have found that early EPCs mainly release MMP-9 and that this release is increased by sCD40L. The sCD40L also induces the phosphorylation of p38 MAPK which contributes to increase the secretion of MMP-9. In functional studies, we have shown that pretreatment of early EPCs with sCD40L can potentialize HUVEC endothelial repair. In conclusion, our work in the context of this doctoral research project has allowed us to study the mechanisms involved in the role of sCD40L in the inhibitory and angiogenic function of early EPCs in platelet aggregation and angiogenesis, respectively. These results add new insights to the role of EPCs and could constitute the basis for future studies allowing for the correlation between high levels of sCD40L and the incidence of cardiovascular disease, particularly atherothrombosis.

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L’adhérence, l’activation et l’agrégation des plaquettes sanguines sont essentielles à l’hémostase mais peuvent également conduire à la thrombose artérielle sur plaque d’athérosclérose, aujourd’hui première cause de mortalité dans le monde. Les anti-thrombotiques actuels, dirigés contre l’activation et l’agrégation plaquettaires, ont une efficacité reconnue mais ont pour inconvénient d’augmenter le risque de saignement. L’objectif de cette thèse a été d’explorer de nouvelles stratégies réduisant la thrombose tout en préservant l’hémostase. L’utilisation de souris modifiées génétiquement a mis en évidence que l’intégrine alpha6 beta1, impliquée dans l’adhérence des plaquettes aux laminines, joue un rôle critique en thrombose expérimentale mais pas en hémostase. De plus, nous avons montré dans un système de perfusion de sang qu’une protéine préférentiellement exprimée dans les plaques d’athérosclérose, la ténascine-C, permet l’adhérence et l’activation des plaquettes. En revanche, la beta-arrestine-1, une protéine de signalisation, ne contribue que modestement aux fonctions plaquettaires et à la thrombose. En conclusion, ce travail a permis de dégager deux nouvelles pistes anti-thrombotiques potentiellement capables de préserver l’hémostase, basées sur le ciblage de l’intégrine alpha6 beta1 ou de l’interaction plaquette/ténascine-C. / Following vascular injury, blood platelet adhesion, activation and aggregation are essential for hemostasis but can also lead to arterial thrombosis, which is a leading cause of death worldwide. Current antithrombotic drugs impede platelet activation and aggregation, thereby considerably reducing cardiovascular mortality, but their use is linked to an increased bleeding risk. This thesis aimed to explore more selective strategies causing minimal perturbation of hemostasis. The use of genetically-modified mice has revealed an unsuspected important contribution of integrin alpha6 beta1, which mediates platelet adhesion to laminins, to experimental arterial thrombosis but not hemostasis. In addition, we showed that tenascin-C, an extracellular matrix protein overexpressed in atherosclerotic plaques, can support platelet adhesion and activation under flow. In contrast, the signaling protein beta-arrestin-1 does not play a major role in platelet function, hemostasis and thrombosis. In conclusion, this work provides two interesting candidates, namely integrin alpha6 beta1 and tenascin-C, to put into practice the concept of targeting thrombosis while minimally impairing hemostasis.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Uterine cancers are considered to be one of the most important malignant diseases of the female genital tract, preceded only by breast cancer. The tumor cells may produce oxidative disturbances as well as damage to the antioxidant system. Cancer may also induce alterations in blood coagulation, ranging anywhere from slight platelet activation to thrombus formation, which impair the quality of life of these patients. This study aimed to evaluate the influence of uterine cervix cancer and its treatments, such as conization and radiotherapy (RTX), on the possible development of thrombogenic processes, on the oxidative profile and on coagulation disorders. Variations in the oxidative profile were analyzed through the determination of parameters such as TBARS and protein carbonyl content and antioxidant defenses were determined from the activity of catalase and reduced glutathione (GSH). Thromboembolic disorders were evaluated by the activity of enzymes such as NTPDase, E-NPP and 5 -nucleotidase, since all of these are present in the platelet membrane, as well as the activity of ADA which has an important role in the degradation of adenosine, which in turn is known for possessing tumor promoting functions. The evaluation of oxidative and antioxidant parameters revealed that TBARS levels, protein carbonyl, GSH and the activity of catalase were enhanced in the non treated group when compared to the other groups. The increased levels of oxidants may reflect their enhanced production by tumor cells, since it is known that antioxidant levels are enhanced at the beginning of the neoplasic transformation in an attempt to neutralize the enhanced free radical production. As for the enzymes involved in the thrombogenic process, the results revealed a significant inhibition of NTPDase in groups treated for a long time ago by CNZ or RTX, when compared to the more recently treated groups and the control. The reduced ATP hydrolysis could be acting to prevent ADP formation, since this nucleotide is the main agent that promotes platelet aggregation. The reduced AMP hydrolysis in all the treated groups, may be a result of the reduced production of adenosine due to the effectiveness of the treatments. In the conization and RTX treated groups, E-NPP activity, both in serum and platelets, was reduced when compared to the control and non treated groups, which could be a reflection of reduced nucleotide degradation, due to the absence of tumor cells and, in turn, lower production of adenosine, which is a tumor promoting agent and is also the substrate for ADA. The probable absence of tumor cells due to the effectiveness of the treatments and the reduced adenosine concentration may be responsible for the reduced ADA activity found in the same groups. The inhibition of enzymes such as E-NPP, 5 -nucleotidase and ADA in all the treated groups may suggest the role of these enzymes in sequentially controlling the concentrations of nucleotides in the extracellular environment. NTPDase appears to be more sensitive to changes caused by the passing of time after the end of the treatments. We may say that the surgery itself causes greater alterations in enzymes such as E-NPP, 5 -nucleotidase and ADA from platelets, because in the groups recently treated by CNZ these activities were enhanced as compared with the group recently treated by RTX, possibly as a result of platelet alteration, which would be responsible for the enzymatic alterations observed. NTPDase is more involved in the control of platelet aggregation and the enzymes 5`-nucleotidase, E-NPP and ADA are more involved in controlling adenosine concentrations. / Os carcinomas uterinos despontam como uma das doenças malignas mais importantes do trato genital feminino, precedido apenas pelo câncer de mama. As células tumorais podem originar distúrbios oxidativos, bem como prejuízo das defesas antioxidantes desses pacientes. O câncer também pode induzir alterações na coagulação sangüínea que vão desde uma pequena ativação plaquetária até a formação de trombos na circulação, os quais prejudicam a qualidade de vida desses pacientes. Este trabalho teve como objetivo avaliar a influência do carcinoma cervical uterino e de tratamentos como a conização (CNZ) e a radioterapia (RTX) sobre o possível desenvolvimento de processos trombogênicos, sobre o perfil oxidativo e sobre os distúrbios da coagulação. As variações no perfil oxidativo foram analisadas pela determinação de parâmetros como o conteúdo de TBARS e de proteína carbonil, e as defesas antioxidantes através da atividade da enzima catalase e dos níveis de glutationa reduzida (GSH). As desordens tromboembólicas foram analisadas pela determinação da atividade de enzimas como a NTPDase, a E-NPP e a 5 -nucleotidase, enzimas presentes na membrana plaquetária, bem como através da atividade da enzima ADA a qual tem a importante função na degradação da adenosina, que reconhecidamente desempenha funções promotoras de tumor. A avaliação dos parâmetros oxidativos e antioxidantes revelou que os níveis de TBARS, de proteína carbonil, de GSH e a atividade da enzima catalase estavam aumentados no grupo de pacientes não tratados em relação aos demais grupos. O aumentado nível de oxidantes pode ser reflexo de um aumento na sua produção pela célula tumoral. Os antioxidantes podem estar aumentados possivelmente por estar no início da transformação neoplásica tumoral na tentativa de compensar o aumento da produção de espécies reativas. Com relação às enzimas envolvidas nos processos tromboembólicos, os resultados revelaram que ocorreu uma inibição significativa da enzima NTPDase nos grupos tratados há mais tempo tanto por CNZ quanto por RTX, em relação aos grupos tratados recentemente e em relação ao grupo controle. A reduzida hidrólise do ATP poderia estar atuando como forma de prevenção contra a formação do ADP, visto que este nucleotídeo é o principal agente promotor da agregação plaquetária. No caso da enzima 5 -nucleotidase observamos uma reduzida hidrólise do AMP, em todos os grupos tratados, que pode ser o resultado da reduzida produção de adenosina pela efetividade dos tratamentos. Em todos os grupos tratados por CNZ e RTX a atividade da E-NPP, tanto em soro quanto em plaquetas, estava reduzida em relação ao grupo controle e ao grupo com neoplasia não-tratada, podendo ser o reflexo da reduzida degradação de nucleotídeos, pela ausência das células tumorais, formando menos adenosina, a qual é um agente promotor de tumor e também o substrato para a ADA. A ausência de células tumorais pela efetividade dos tratamentos e a reduzida concentração de adenosina, pode ser responsável pela reduzida atividade da ADA nos mesmos grupos. A inibição da atividade das enzimas E-NPP, 5 -nucleotidase e da ADA nos grupos tratados, pode sugerir o papel dessas enzimas no controle seqüencial das concentrações de nucleotídeos no meio extracelular. A enzima NTPDase parece ser um pouco mais sensível às mudanças provocadas pelo tempo transcorrido após o término dos tratamentos. Pode-se inferir também, que a cirurgia causa maiores alterações nas enzimas E-NPP, 5 -nucleotidase e ADA de plaquetas, pelo fato de que nos grupos tratados recentemente por CNZ estas atividades encontram-se aumentadas em relação grupo tratado recentemente por RTX. Sugere-se, com esses resultados, que há uma possível alteração nas plaquetas, causada pelo processo cirúrgico, o qual seria o responsável pelas modificações enzimáticas observadas e que os tratamentos foram efetivos em combater as células tumorais uma vez que, de uma maneira geral há uma inibição das atividades das enzimas em questão, e também devido ao fato de que os testes de coagulação, possíveis indicadores de trombose associada ao câncer, não demonstraram-se alterados. Corroborando estes achados os exames citopatológicos apresentaram alterações celulares compatíveis com a normalidade. A enzima NTPDase demonstra-se estar envolvida no controle da agregação plaquetária e as enzimas 5`-nucleotidase, E-NPP e ADA parecem estar mais envolvidas no controle dos níveis de adenosina. Palavras-chave: Câncer de útero, radioterapia, conização, estresse oxidativo, plaquetas, trombose, NTPDase, E-NPP, ADA.

Les néoplasies myéloprolifératives (NMP) sont des hémopathies myéloïdes clonales, chroniques et prolifératives. Les plus fréquentes sont la polyglobulie de Vaquez et la thrombocytémie essentielle. Elles s’accompagnent de risques importants de thrombose (artérielles et veineuses) et de transformation en pathologies plus agressives (myélofibrose secondaire et leucémie aigüe). Les thromboses peuvent être la situation diagnostique de ces maladies, ou survenir au cours de la prise en charge. Le sujet de cette thèse est d’étudier la relation clinique entre NMP et thrombose. Dans un contexte de survenue de thrombose veineuse idiopathique, sans antécédent NMP, nous nous sommes intéressés à la recherche de mutation clonale chez les patients comme moyen diagnostique d’une NMP. Nous avons ainsi exploité la cohorte EDITH du CIC en prenant les patients ayant expérimentés un puis une récurrence thrombotique. A l’inverse, nous avons constitué une base de données (OBENE) des patients pris en charge pour une NMP au CHRU de Brest.Nous avons ensuite exploité cette base, en analysant la fréquence et l’impact des arythmies cardiaques auriculaires, la balance bénéfice-risque à l’utilisation des NACO, l’impact des statines sur la réduction du risque de thrombose ainsi que la fréquence et l’impact de la nonadhérence aux traitements dans les PV et TE.NMP et thromboses sont liées, il est donc nécessaire d’approfondir les connaissances de leur physiopathologie spécifique pour améliorer la prévention et le traitement des épisodes. Cette thèse amène quelques réponses àcertaines questions mais elle est surtout le point de départ de réflexion commune entre les praticiens et biologistes intéressés par ces domaines. / The myeloproliferative neoplasms (MPN) are clonal myeloid, chronic and proliferative disorders. The most frequent are polycythemia vera and essential thrombocythemia. The more frequent complications are thromboses (arterial and venous) and phenotypic evolutions (secondary myelofibrosis and acute leukemia). Thromboses can be a situation of diagnosis or observed during the followup of a MPN. This thesis is focused on the clinical link between MPN and thromboses.In a context of idiopathic venous thromboses (first event or recurrence), without medical history of MPN, we have tested patients for the most frequent MPN clonal mutations. So, we have used the informations and patients of the dedicated EDITH cohort.On the other hand, we have constituted a MPN database (OBENE) of the patients diagnosed for MPN in our Hospitalcentre. By this way, we have analysed the frequency and impact of atrial arrhythmias, the benefit-risk balance of the use of DOAC, the impact of statins to reduce the thrombotic risk and the frequency and impact of the treatment nonadherence in this population.MPN and thromboses are linked, so it is necessary to increase our knowledge of their physiopathology to improve prevention and treatment of the events. This thesis brings some answers to some questions but, she is almost the starting point of common reflexion between clinicians and biologists interested in these domains.