INTRODUÇÃO: Células-tronco mesenquimais da geleia de Wharton (GW-CTM) exibem a capacidade de modular a resposta das células T e geralmente esses efeitos imunomoduladores são anti-inflamatórios. Devido ao seu potencial imunossupressor, as CTM emergiram recentemente como uma ferramenta promissora para terapia celular. No entanto, essas células têm uma vida útil limitada in vitro, com redução progressiva da sua capacidade de autorrenovação e parada irreversível do ciclo celular. O resultado deste processo é a perda da funcionalidade das CTM, o que limita a sua utilização para fins terapêuticos. Pouco se sabe sobre a variabilidade individual das amostras de GW-CTM e como isso poderia afetar sua expansão in vitro, seu potencial imunomodulador e o processo de envelhecimento. Neste estudo, avaliamos o perfil de citocinas imunomoduladoras e a capacidade das GW-CTM inibir a proliferação de células T durante o processo de senescência replicativa para determinar se a resposta esperada é afetada. MÉTODOS: GW-CTM foram cultivadas até a senescência replicativa ser atingida; as amostras foram coletadas numa fase inicial (passagem 5), numa etapa intermediária (passagem 15) e na senescência replicativa (passagem geralmente entre 20 e 25) para análise do perfil basal de moléculas imunomoduladoras. GW-CTM foram cocultivadas com amostras de duas células mononucleares de sangue periférico (PBMC), obtidas de doadores de plaquetas saudáveis. PBMC foi estimulado com fitohemaglutinina (PHA) durante 72 horas e cocultivado com três amostras de GW-CTM diferentes para medir a supressão da proliferação das células T. Os experimentos foram realizados utilizando as passagens P5 e P10. As análises foram feitas por PCR em tempo real, western blot e citometria de fluxo. RESULTADOS: Nossos resultados mostram que a expressão gênica e a secreção de moléculas imunomoduladoras variam entre amostras de GW-CTM, sem padrão específico. Em cocultura, todas as GW-CTM foram capazes de inibir a proliferação de células T CD3+ ativadas por mitogéno, embora em diferentes graus. E cada PBMC respondeu à cocultura com um nível diferente de inibição. Além disso, o perfil imunomodulador de todas as GW-CTM foi essencialmente mantido, mesmo após várias passagens. CONCLUSÃO: Nossos dados indicam que cada GW-CTM exibe um comportamento único, diferindo nos padrões de expressão e secreção de citocinas e capacidade imunomoduladora. Essa variabilidade intrínseca entre amostras pode influenciar a eficácia de GW-CTM quando utilizadas em terapia celular / INTRODUCTION: Wharton\'s jelly mesenchymal stem cells (WJ-MSC) exhibit the ability to modulate T cell responses and these immunomodulatory effects are usually anti-inflammatory. Due to their immunosuppressive potential, MSC have recently emerged as a promising tool for cell therapy. However, MSC have a limited lifespan in vitro, with a progressive reduction in their capacity for selfrenewal leading to irreversible arrest of cell division. The result of this process is the loss of stem cell functionality, which limits its use for therapeutic purposes. Information on the variability of individual cell samples impacting upon in vitro expansion, immunomodulatory potential, and aging processes is still lacking. In this study, we evaluated the immunomodulatory cytokine profile and capacity to inhibit T cell proliferation of WJ-MSC progressing to replicative senescence to determine if the expected response is affected. METHODS: WJ-MSC were cultured until replicative senescence was reached and the samples were collected at an early stage (passage 5), at an intermediate stage (passage 15), and in replicative senescence (passage generally between 20 and 25) to analyze the basal profile of immunomodulatory molecules. WJ-MSC were co-cultured with samples from the same two peripheral blood mononuclear cells (PBMC), obtained from healthy platelet donors. PBMC were stimulated with phytohemagglutinin (PHA) for 72 hours and tested against 3 different WJ-MSC to measure suppression of T cell proliferation. The experiments were performed using passages P5 and P10. Analyses were done by real-time PCR, western blot, and flow cytometry. RESULTS: Our results show that gene expression and secretion of immunomodulatory molecules varied among WJ-MSC samples with no specific pattern discernible. In co-culture all WJ-MSC were capable of inhibiting mitogen-activated CD3+ T cell proliferation, although to different extents and each PBMC responded with its unique level of inhibition. In addition, the immunomodulatory profile of each WJ-MSC sample was essentially maintained even after several passages. CONCLUSION: Our results indicate that each WJMSC displays a unique behavior, differing in patterns of cytokine mRNA expression and immunomodulatory capacity. The intrinsic variability between samples may influence the effectiveness of WJ-MSC when employed therapeutically

INTRODUÇÃO: Células-tronco mesenquimais da geleia de Wharton (GW-CTM) exibem a capacidade de modular a resposta das células T e geralmente esses efeitos imunomoduladores são anti-inflamatórios. Devido ao seu potencial imunossupressor, as CTM emergiram recentemente como uma ferramenta promissora para terapia celular. No entanto, essas células têm uma vida útil limitada in vitro, com redução progressiva da sua capacidade de autorrenovação e parada irreversível do ciclo celular. O resultado deste processo é a perda da funcionalidade das CTM, o que limita a sua utilização para fins terapêuticos. Pouco se sabe sobre a variabilidade individual das amostras de GW-CTM e como isso poderia afetar sua expansão in vitro, seu potencial imunomodulador e o processo de envelhecimento. Neste estudo, avaliamos o perfil de citocinas imunomoduladoras e a capacidade das GW-CTM inibir a proliferação de células T durante o processo de senescência replicativa para determinar se a resposta esperada é afetada. MÉTODOS: GW-CTM foram cultivadas até a senescência replicativa ser atingida; as amostras foram coletadas numa fase inicial (passagem 5), numa etapa intermediária (passagem 15) e na senescência replicativa (passagem geralmente entre 20 e 25) para análise do perfil basal de moléculas imunomoduladoras. GW-CTM foram cocultivadas com amostras de duas células mononucleares de sangue periférico (PBMC), obtidas de doadores de plaquetas saudáveis. PBMC foi estimulado com fitohemaglutinina (PHA) durante 72 horas e cocultivado com três amostras de GW-CTM diferentes para medir a supressão da proliferação das células T. Os experimentos foram realizados utilizando as passagens P5 e P10. As análises foram feitas por PCR em tempo real, western blot e citometria de fluxo. RESULTADOS: Nossos resultados mostram que a expressão gênica e a secreção de moléculas imunomoduladoras variam entre amostras de GW-CTM, sem padrão específico. Em cocultura, todas as GW-CTM foram capazes de inibir a proliferação de células T CD3+ ativadas por mitogéno, embora em diferentes graus. E cada PBMC respondeu à cocultura com um nível diferente de inibição. Além disso, o perfil imunomodulador de todas as GW-CTM foi essencialmente mantido, mesmo após várias passagens. CONCLUSÃO: Nossos dados indicam que cada GW-CTM exibe um comportamento único, diferindo nos padrões de expressão e secreção de citocinas e capacidade imunomoduladora. Essa variabilidade intrínseca entre amostras pode influenciar a eficácia de GW-CTM quando utilizadas em terapia celular / INTRODUCTION: Wharton\'s jelly mesenchymal stem cells (WJ-MSC) exhibit the ability to modulate T cell responses and these immunomodulatory effects are usually anti-inflammatory. Due to their immunosuppressive potential, MSC have recently emerged as a promising tool for cell therapy. However, MSC have a limited lifespan in vitro, with a progressive reduction in their capacity for selfrenewal leading to irreversible arrest of cell division. The result of this process is the loss of stem cell functionality, which limits its use for therapeutic purposes. Information on the variability of individual cell samples impacting upon in vitro expansion, immunomodulatory potential, and aging processes is still lacking. In this study, we evaluated the immunomodulatory cytokine profile and capacity to inhibit T cell proliferation of WJ-MSC progressing to replicative senescence to determine if the expected response is affected. METHODS: WJ-MSC were cultured until replicative senescence was reached and the samples were collected at an early stage (passage 5), at an intermediate stage (passage 15), and in replicative senescence (passage generally between 20 and 25) to analyze the basal profile of immunomodulatory molecules. WJ-MSC were co-cultured with samples from the same two peripheral blood mononuclear cells (PBMC), obtained from healthy platelet donors. PBMC were stimulated with phytohemagglutinin (PHA) for 72 hours and tested against 3 different WJ-MSC to measure suppression of T cell proliferation. The experiments were performed using passages P5 and P10. Analyses were done by real-time PCR, western blot, and flow cytometry. RESULTS: Our results show that gene expression and secretion of immunomodulatory molecules varied among WJ-MSC samples with no specific pattern discernible. In co-culture all WJ-MSC were capable of inhibiting mitogen-activated CD3+ T cell proliferation, although to different extents and each PBMC responded with its unique level of inhibition. In addition, the immunomodulatory profile of each WJ-MSC sample was essentially maintained even after several passages. CONCLUSION: Our results indicate that each WJMSC displays a unique behavior, differing in patterns of cytokine mRNA expression and immunomodulatory capacity. The intrinsic variability between samples may influence the effectiveness of WJ-MSC when employed therapeutically

A tolerância operacional (TO) é um raro fenômeno que ocorre em indivíduos transplantados, que permanecem com função estável do aloenxerto, sem rejeição, após a suspensão de drogas imunossupressoras, por pelo menos um ano. A compreensão de mecanismos envolvidos na tolerância operacional poderá contribuir para a elaboração de novas terapias imunorreguladoras, na clínica do transplante. Investigamos se, no estado de tolerância operacional, há um perfil funcional diferencial de resposta imune celular antígeno-específica, dirigida a três grupos de antígenos relevantes no alotransplante: aloantígenos do doador (peptídeos HLA-DR), antígenos de patógenos (peptídeos do CMV - citomegalovírus) e autoantígenos (peptídeos da Hsp60 - Proteína de choque térmico 60, com funções imunológicas, imunorreguladora (REGULA) e pró-inflamatória (INFLAMA). Analisamos a produção de citocinas (por Luminex) e a proliferação de diferentes subpopulações de células T CD4+ (por FACS), com funções, predominantemente, REGULA ou INFLAMA, frente aos três tipos de antígenos, comparativamente entre TO (n=6) e Rejeição Crônica (RC: n=8), indivíduos com função estável do enxerto, usando imunossupressores (EST: n=8) e indivíduos saudáveis (SAU: n=7). Em concordância com nossa hipótese, a resposta celular é modulada, de forma diferencial, na tolerância operacional, ocorrendo um desvio funcional da resposta a peptídeos HLA-DR do doador para um perfil REGULA, enquanto é preservado o perfil INFLAMA na resposta a peptídeos do patógeno (CMV). Apesar das diferenças nas respostas aos peptídeos do CMV entre TO e RC (p=0,02 e p=0,02 para citocinas e subpopulações regula e p=0,008 e p=0,003 para citocinas e subpopulações inflama), houve preservação do perfil INFLAMA na TO, em relação ao estado fisiológico, com indução/aumento das citocinas inflamatórias IL-1B, IL-17, IFNy, MCP-1 e MIP-1B, com algum grau de inibição de citocinas imunorreguladoras, e inibição da proliferação de células Tregs, sugerindo serem importantes mecanismos na preservação da imunocompetência, na tolerância operacional. Na resposta celular a autoantígenos, destacamos o peptídeo N6 que induziu um perfil significativamente diferente na TO (mais REGULA), em relação à RC (mais INFLAMA) (p=0,001 para citocinas regula; p=0,04 para citocinas inflama), principalmente pelo aumento/indução da produção de IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13, na TO, sugerindo que o peptídeo N6 possa ter uma contribuição nos mecanismos na TO, favorecendo a produção dessas citocinas com atividade imunorreguladora. Considerando a diferença significativa do perfil funcional de resposta aos aloantígenos do doador entre TO (REGULA) e RC (INFLAMA) (p=0,0007 para citocinas regula e p < 0,0001 para citocinas inflama), principalmente pela inibição das citocinas próinflamatórias, como IL-1B, IL-8, IL-12, IL-17, G-CSF, IFN-y e MCP-1, na TO, concluímos que o desvio REGULA da via indireta de alorreconhecimento dirigida a peptídeos HLA-DR do doador, com inibição dessas citocinas, tenha um papel importante nos mecanismos envolvidos na tolerância operacional. Em conclusão os mecanismos em curso na tolerância operacional, modulam a resposta celular antígeno-específica dirigida a desafios antigênicos no transplante, envolvendo o desvio REGULA da resposta a peptídeos HLA-DR do doador, a participação da autoimunidade imunorreguladora à Hsp60, ao mesmo tempo em que há preservação da resposta inflamatória a patógenos / Operational tolerance (OT) is a rare phenomenon, taking place in transplanted individual who do not reject, following the complete withdrawal of immunosuppressive drugs for at least one year. Understanding the mechanisms involved in operational tolerance will contribute to opening new pathways for the development of novel immunoregulatory therapies, in transplantation. We investigated whether the state of operational tolerance displays a functionally differential profile of the antigen-specific cellular response, directed to three groups of antigens, relevant in the context of allotransplantation: donor alloantigens (HLA-DR peptides), pathogen-derived antigens (cytomegalovirus peptides - CMV) and autoantigens (peptides derived from the Hsp60 - selfantigen displaying immunoregularory (REG) and proinflammatory (INFLAMMA) properties). We determined cytokine production (by Luminex) and the proliferative response of different CD4+ T cell subsets (by FACS), displaying predominantly REG or INFLAMMA activities, in response to the three types of antigens, comparing OT (n=6) with Chronic Rejection (CR: n=8), individual with stable graft function, taking conventional immunosuppression (Sta: n=8), and healthy individuals (HI: n=7). In concordance with our hypothesis, the cellular immune response is differentially modulated in operational tolerance, giving rise to an immunoregulatory deviation in the response to HLA-DR donor peptides, preserving the proinflammatory response to pathogen peptides (CMV). Despite significant differences in the responses to CMV peptides, between OT and CR (p=0.02 and p=0.02 for REG cytokines and CD4+ subsets; p=0.008 and p=0.003 for INFLAMMA cytokines and CD4+ subsets), OT is able to preserve the INFLAMMA response in relation to the physiologic state (HI). This INFLAMMA profile of the response to CMV peptides is maintained by the induction/increase of the proinflammatory cytokines, IL-1B, IL-17, IFN-y, MCP-1 and MIP-1B, some inhibition of REG cytokines and inhibition of Treg proliferation, suggesting that these are important mechanisms in the preservation of immunocompetence to deal with pathogens, in OT. In the cellular response to autoantigens, we highlight the N6 peptide that induced a differential profile in OT (REG profile) compared to CR (INFLAMMA profile) (p=0.001 for REG cytokines; p=0.04 for INFLAMMA cytokines), due to the induction/increase of IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13, in OT, suggesting that N6 may contribute to the underlying mechanisms in OT, favoring the production of these immunoregulatory cytokines. Taken the marked differences in the response to donor alloantigens, between OT (predominantly REG) and CR (predominantly INFLAMMA) (p=0.0007 for REG cytokines and p < 0.0001 for INFLAMMA cytokines), due to the inhibition of the proinflammatory cytokines, IL-1B, IL-8, IL- 12, IL-17, G-CSF, IFN-y and MCP-1, in OT, we conclude that the immunoregulatory deviation in the indirect pathway of allorecognition, directed to donor HLA-DR peptides, leading to the inhibition of these cytokines, has an important role in the mechanisms of tolerance. In conclusion, the ongoing immunoregulatory mechanisms in operational tolerance, modulate the antigenspecific cellular response to relevant antigenic challenges in allotransplantation, involving a REG deviation in the response to donor HLA-DR peptides, together with the participation of immunoregulatory autoimmunity to Hsp60, while preserving the proinflmammatory response to pathogens

INTRODUÇÃO: A incidência de câncer da glândula tireoide é a que mais vem crescendo nas últimas décadas. Dentro desse grupo de diferentes neoplasias, o carcinoma papilífero, um dos carcinomas bem diferenciados, representa a maioria e tem prognóstico favorável, com sobrevida acima dos 90% em 5 anos. Embora sejam utilizadas diversas classificações de risco baseadas em diferentes fatores prognósticos, ainda não se consegue predizer quais pacientes terão maior chance de recorrência, metástases linfonodais e desfecho desfavorável, que se beneficiariam de um tratamento mais agressivo. Já foi demonstrado em diversos tipos de neoplasias que diferenças no perfil do infiltrado imune tumoral têm relação com prognóstico e resposta ao tratamento. Neste estudo caracterizou-se o microambiente imune do carcinoma papilífero através de marcadores imuno-histoquímicos de células inflamatórias e relacionou-se este perfil de infiltração com fatores prognósticos clínico-patológicos e com sobrevida livre de recorrência. MÉTODOS: Foram incluídos 151 casos selecionados com base em um banco de dados que incluiu todos os pacientes submetidos a tratamento cirúrgico para câncer de tireoide no A.C.Camargo Cancer Center entre 2008 e 2010. Casos com tireoidite significante foram excluídos. Estes tumores selecionados foram então submetidos a reação imuno-histoquímica com marcadores de células inflamatórias e foram analisados por dois patologistas experientes. As características clínicas e patológicas foram avaliadas, assim como as recorrências e sobrevida, relacionando-as com as leituras de células marcadas. As análises de sobrevida global e livre de doença foram realizadas pelo método de Kaplan-Meier, com comparação de curvas de sobrevida pelo teste de Logrank. RESULTADOS: Cento e cinquenta e um pacientes foram incluídos, sendo 130 (86,1%) mulheres e 21 (13.9%) homens. Multifocalidade foi encontrada em 41 (27.2%), extensão extratireoidiana em 43 (28.5%) e metástase linfonodal em 36 (23.8%) casos. Apenas dois pacientes apresentaram metástase a distância. O tempo de seguimento médio foi 65,1 meses e observou-se nove (6%) pacientes com recorrências de neoplasia. Os pacientes com tumores com metástase linfonodal e/ou extensão extratireoidiana apresentaram maior risco de recorrência. Dos marcadores analisados, uma maior densidade de CD8 (que marca linfócitos citotóxicos) na área peritumoral esteve associada a uma tendência a melhor sobrevida livre de recorrência: 97,1% versus 87,5% (p=0,057), além de significativos menores índices de multifocalidade tumoral e de metástase linfonodal. A maior infiltração de linfócitos T CD8+ no tumor também se relacionou com menor ocorrência de metástase linfonodal nesta amostra (18,4% versus 38,1%, p=0,011). Além disso, a densidade desta marcação, tanto no interior da lesão neoplásica como em área peritumoral foi significativamente maior nos casos de carcinomas papilíferos restritos à tireoide, ou seja, sem extensão extratireoidiana e sem metástases. Os demais marcadores analisados não apresentaram relação significativa e consistente com recorrência ou outros fatores prognósticos. CONCLUSÕES: Nas neoplasias malignas de tireoide, o microambiente imune parece ter uma relação com características patológicas de agressividade. Este estudo mostrou que em carcinoma papilífero de tireoide quando não associado à tireoidite significativa, a densidade do infiltrado tumoral e peritumoral por linfócitos T CD8+ está inversamente relacionada com chance de disseminação metastática linfonodal e, provavelmente, com recidiva da doença, sendo, portanto, um marcador de melhor prognóstico. Este dado sugere que estes linfócitos exercem efeito antitumoral no carcinoma papilífero de tireoide, corroborando a importância da resposta imune na evolução desta neoplasia / INTRODUCTION: Within the last few decades thyroid cancer has the fastest rising incidence rate among all malignancies. In this group of different neoplasms, the papillary carcinoma, one of the well-differentiated carcinomas, represents the great majority and has favorable prognosis, with overall survival rates above 90% in five years. Although several risk classifications based on different prognostic features have been used, they are not accurate to predict which patients will have higher chance of recurrence, lymphatic metastasis and worse outcome, benefiting from more aggressive treatment. It has been described in several kinds of malignancies that tumor related immune infiltration has relation with prognosis and response to treatment. In this study, we characterize the immune microenvironment in papillary thyroid carcinomas, using immunohistochemical markers to inflammatory cells, and relate it with clinical and pathological prognostic features and with recurrence free survival rates. METHODS: The 151 included cases were selected from a database that included all patients who underwent surgical treatment for thyroid cancer at A.C.Camargo Cancer Center between the years 2008 and 2010. Tumor with significant thyroiditis were excluded. The selected tumors were submitted to immunohistochemical reactions with markers of inflammatory cells and analysis in complete slides by two experienced pathologists. Clinical and pathological features were evaluated, as well as recurrence and survival, relating them with the reading of marked cells. Survival analysis were made using Kaplan-Meier method, comparing survival curves with the Logrank test. RESULTS: One hundred and fifty one patients were included, of which 130 (86.1%) were females and 21 (13.9%) males. Multifocal disease was found in 41 cases (27.2%), extrathyroidal extension in 43 (28.5%) and lymph node metastasis in 36 (23.8%). Only two patients had distant metastasis. The mean follow-up time was 65.1 months and we observed nine (6%) tumor recurrences. Tumors with lymph node metastasis and/or extrathyroidal extension showed significantly higher recurrence rates. Of the analyzed markers, the cases with a higher density of CD8 (which marks cytotoxic T lymphocytes) in peritumoral areas presented a trend to better recurrence-free survival: 97.1% versus 87.5% (p=0.057), in addition to lower rates of mutifocal tumors and lymph node metastasis. A higher infiltration rate of CD8+ T lymphocytes in the tumor also correlated with less risk of lymph node metastasis in this sample (18.4% versus 38.1%, p=0.011). Besides that, the density of this marking both in the tumor and in peritumoral areas, was significantly higher in the papillary carcinomas limited to the thyroid gland (without extrathyroidal extension or metastasis). The other markers analyzed did not presented significant or consistent relation with recurrence or other prognostic factors. CONCLUSIONS: In thyroid cancer, the immune microenvironment seems to relate with pathological features of aggressiveness. This study showed that in papillary thyroid carcinomas without significant thyroiditis, the density of tumoral and peritumoral infiltration by CD8+ T lymphocytes is inversely related with lymph node metastasis rate and probably with recurrence, being therefore a marker of better prognosis. These data suggest that these lymphocytes play an anti-tumoral role in papillary thyroid carcinoma, supporting the implication of immune response in the progression of this neoplasm

A tolerância operacional (TO) é um raro fenômeno que ocorre em indivíduos transplantados, que permanecem com função estável do aloenxerto, sem rejeição, após a suspensão de drogas imunossupressoras, por pelo menos um ano. A compreensão de mecanismos envolvidos na tolerância operacional poderá contribuir para a elaboração de novas terapias imunorreguladoras, na clínica do transplante. Investigamos se, no estado de tolerância operacional, há um perfil funcional diferencial de resposta imune celular antígeno-específica, dirigida a três grupos de antígenos relevantes no alotransplante: aloantígenos do doador (peptídeos HLA-DR), antígenos de patógenos (peptídeos do CMV - citomegalovírus) e autoantígenos (peptídeos da Hsp60 - Proteína de choque térmico 60, com funções imunológicas, imunorreguladora (REGULA) e pró-inflamatória (INFLAMA). Analisamos a produção de citocinas (por Luminex) e a proliferação de diferentes subpopulações de células T CD4+ (por FACS), com funções, predominantemente, REGULA ou INFLAMA, frente aos três tipos de antígenos, comparativamente entre TO (n=6) e Rejeição Crônica (RC: n=8), indivíduos com função estável do enxerto, usando imunossupressores (EST: n=8) e indivíduos saudáveis (SAU: n=7). Em concordância com nossa hipótese, a resposta celular é modulada, de forma diferencial, na tolerância operacional, ocorrendo um desvio funcional da resposta a peptídeos HLA-DR do doador para um perfil REGULA, enquanto é preservado o perfil INFLAMA na resposta a peptídeos do patógeno (CMV). Apesar das diferenças nas respostas aos peptídeos do CMV entre TO e RC (p=0,02 e p=0,02 para citocinas e subpopulações regula e p=0,008 e p=0,003 para citocinas e subpopulações inflama), houve preservação do perfil INFLAMA na TO, em relação ao estado fisiológico, com indução/aumento das citocinas inflamatórias IL-1B, IL-17, IFNy, MCP-1 e MIP-1B, com algum grau de inibição de citocinas imunorreguladoras, e inibição da proliferação de células Tregs, sugerindo serem importantes mecanismos na preservação da imunocompetência, na tolerância operacional. Na resposta celular a autoantígenos, destacamos o peptídeo N6 que induziu um perfil significativamente diferente na TO (mais REGULA), em relação à RC (mais INFLAMA) (p=0,001 para citocinas regula; p=0,04 para citocinas inflama), principalmente pelo aumento/indução da produção de IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13, na TO, sugerindo que o peptídeo N6 possa ter uma contribuição nos mecanismos na TO, favorecendo a produção dessas citocinas com atividade imunorreguladora. Considerando a diferença significativa do perfil funcional de resposta aos aloantígenos do doador entre TO (REGULA) e RC (INFLAMA) (p=0,0007 para citocinas regula e p < 0,0001 para citocinas inflama), principalmente pela inibição das citocinas próinflamatórias, como IL-1B, IL-8, IL-12, IL-17, G-CSF, IFN-y e MCP-1, na TO, concluímos que o desvio REGULA da via indireta de alorreconhecimento dirigida a peptídeos HLA-DR do doador, com inibição dessas citocinas, tenha um papel importante nos mecanismos envolvidos na tolerância operacional. Em conclusão os mecanismos em curso na tolerância operacional, modulam a resposta celular antígeno-específica dirigida a desafios antigênicos no transplante, envolvendo o desvio REGULA da resposta a peptídeos HLA-DR do doador, a participação da autoimunidade imunorreguladora à Hsp60, ao mesmo tempo em que há preservação da resposta inflamatória a patógenos / Operational tolerance (OT) is a rare phenomenon, taking place in transplanted individual who do not reject, following the complete withdrawal of immunosuppressive drugs for at least one year. Understanding the mechanisms involved in operational tolerance will contribute to opening new pathways for the development of novel immunoregulatory therapies, in transplantation. We investigated whether the state of operational tolerance displays a functionally differential profile of the antigen-specific cellular response, directed to three groups of antigens, relevant in the context of allotransplantation: donor alloantigens (HLA-DR peptides), pathogen-derived antigens (cytomegalovirus peptides - CMV) and autoantigens (peptides derived from the Hsp60 - selfantigen displaying immunoregularory (REG) and proinflammatory (INFLAMMA) properties). We determined cytokine production (by Luminex) and the proliferative response of different CD4+ T cell subsets (by FACS), displaying predominantly REG or INFLAMMA activities, in response to the three types of antigens, comparing OT (n=6) with Chronic Rejection (CR: n=8), individual with stable graft function, taking conventional immunosuppression (Sta: n=8), and healthy individuals (HI: n=7). In concordance with our hypothesis, the cellular immune response is differentially modulated in operational tolerance, giving rise to an immunoregulatory deviation in the response to HLA-DR donor peptides, preserving the proinflammatory response to pathogen peptides (CMV). Despite significant differences in the responses to CMV peptides, between OT and CR (p=0.02 and p=0.02 for REG cytokines and CD4+ subsets; p=0.008 and p=0.003 for INFLAMMA cytokines and CD4+ subsets), OT is able to preserve the INFLAMMA response in relation to the physiologic state (HI). This INFLAMMA profile of the response to CMV peptides is maintained by the induction/increase of the proinflammatory cytokines, IL-1B, IL-17, IFN-y, MCP-1 and MIP-1B, some inhibition of REG cytokines and inhibition of Treg proliferation, suggesting that these are important mechanisms in the preservation of immunocompetence to deal with pathogens, in OT. In the cellular response to autoantigens, we highlight the N6 peptide that induced a differential profile in OT (REG profile) compared to CR (INFLAMMA profile) (p=0.001 for REG cytokines; p=0.04 for INFLAMMA cytokines), due to the induction/increase of IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13, in OT, suggesting that N6 may contribute to the underlying mechanisms in OT, favoring the production of these immunoregulatory cytokines. Taken the marked differences in the response to donor alloantigens, between OT (predominantly REG) and CR (predominantly INFLAMMA) (p=0.0007 for REG cytokines and p < 0.0001 for INFLAMMA cytokines), due to the inhibition of the proinflammatory cytokines, IL-1B, IL-8, IL- 12, IL-17, G-CSF, IFN-y and MCP-1, in OT, we conclude that the immunoregulatory deviation in the indirect pathway of allorecognition, directed to donor HLA-DR peptides, leading to the inhibition of these cytokines, has an important role in the mechanisms of tolerance. In conclusion, the ongoing immunoregulatory mechanisms in operational tolerance, modulate the antigenspecific cellular response to relevant antigenic challenges in allotransplantation, involving a REG deviation in the response to donor HLA-DR peptides, together with the participation of immunoregulatory autoimmunity to Hsp60, while preserving the proinflmammatory response to pathogens

INTRODUÇÃO: A incidência de câncer da glândula tireoide é a que mais vem crescendo nas últimas décadas. Dentro desse grupo de diferentes neoplasias, o carcinoma papilífero, um dos carcinomas bem diferenciados, representa a maioria e tem prognóstico favorável, com sobrevida acima dos 90% em 5 anos. Embora sejam utilizadas diversas classificações de risco baseadas em diferentes fatores prognósticos, ainda não se consegue predizer quais pacientes terão maior chance de recorrência, metástases linfonodais e desfecho desfavorável, que se beneficiariam de um tratamento mais agressivo. Já foi demonstrado em diversos tipos de neoplasias que diferenças no perfil do infiltrado imune tumoral têm relação com prognóstico e resposta ao tratamento. Neste estudo caracterizou-se o microambiente imune do carcinoma papilífero através de marcadores imuno-histoquímicos de células inflamatórias e relacionou-se este perfil de infiltração com fatores prognósticos clínico-patológicos e com sobrevida livre de recorrência. MÉTODOS: Foram incluídos 151 casos selecionados com base em um banco de dados que incluiu todos os pacientes submetidos a tratamento cirúrgico para câncer de tireoide no A.C.Camargo Cancer Center entre 2008 e 2010. Casos com tireoidite significante foram excluídos. Estes tumores selecionados foram então submetidos a reação imuno-histoquímica com marcadores de células inflamatórias e foram analisados por dois patologistas experientes. As características clínicas e patológicas foram avaliadas, assim como as recorrências e sobrevida, relacionando-as com as leituras de células marcadas. As análises de sobrevida global e livre de doença foram realizadas pelo método de Kaplan-Meier, com comparação de curvas de sobrevida pelo teste de Logrank. RESULTADOS: Cento e cinquenta e um pacientes foram incluídos, sendo 130 (86,1%) mulheres e 21 (13.9%) homens. Multifocalidade foi encontrada em 41 (27.2%), extensão extratireoidiana em 43 (28.5%) e metástase linfonodal em 36 (23.8%) casos. Apenas dois pacientes apresentaram metástase a distância. O tempo de seguimento médio foi 65,1 meses e observou-se nove (6%) pacientes com recorrências de neoplasia. Os pacientes com tumores com metástase linfonodal e/ou extensão extratireoidiana apresentaram maior risco de recorrência. Dos marcadores analisados, uma maior densidade de CD8 (que marca linfócitos citotóxicos) na área peritumoral esteve associada a uma tendência a melhor sobrevida livre de recorrência: 97,1% versus 87,5% (p=0,057), além de significativos menores índices de multifocalidade tumoral e de metástase linfonodal. A maior infiltração de linfócitos T CD8+ no tumor também se relacionou com menor ocorrência de metástase linfonodal nesta amostra (18,4% versus 38,1%, p=0,011). Além disso, a densidade desta marcação, tanto no interior da lesão neoplásica como em área peritumoral foi significativamente maior nos casos de carcinomas papilíferos restritos à tireoide, ou seja, sem extensão extratireoidiana e sem metástases. Os demais marcadores analisados não apresentaram relação significativa e consistente com recorrência ou outros fatores prognósticos. CONCLUSÕES: Nas neoplasias malignas de tireoide, o microambiente imune parece ter uma relação com características patológicas de agressividade. Este estudo mostrou que em carcinoma papilífero de tireoide quando não associado à tireoidite significativa, a densidade do infiltrado tumoral e peritumoral por linfócitos T CD8+ está inversamente relacionada com chance de disseminação metastática linfonodal e, provavelmente, com recidiva da doença, sendo, portanto, um marcador de melhor prognóstico. Este dado sugere que estes linfócitos exercem efeito antitumoral no carcinoma papilífero de tireoide, corroborando a importância da resposta imune na evolução desta neoplasia / INTRODUCTION: Within the last few decades thyroid cancer has the fastest rising incidence rate among all malignancies. In this group of different neoplasms, the papillary carcinoma, one of the well-differentiated carcinomas, represents the great majority and has favorable prognosis, with overall survival rates above 90% in five years. Although several risk classifications based on different prognostic features have been used, they are not accurate to predict which patients will have higher chance of recurrence, lymphatic metastasis and worse outcome, benefiting from more aggressive treatment. It has been described in several kinds of malignancies that tumor related immune infiltration has relation with prognosis and response to treatment. In this study, we characterize the immune microenvironment in papillary thyroid carcinomas, using immunohistochemical markers to inflammatory cells, and relate it with clinical and pathological prognostic features and with recurrence free survival rates. METHODS: The 151 included cases were selected from a database that included all patients who underwent surgical treatment for thyroid cancer at A.C.Camargo Cancer Center between the years 2008 and 2010. Tumor with significant thyroiditis were excluded. The selected tumors were submitted to immunohistochemical reactions with markers of inflammatory cells and analysis in complete slides by two experienced pathologists. Clinical and pathological features were evaluated, as well as recurrence and survival, relating them with the reading of marked cells. Survival analysis were made using Kaplan-Meier method, comparing survival curves with the Logrank test. RESULTS: One hundred and fifty one patients were included, of which 130 (86.1%) were females and 21 (13.9%) males. Multifocal disease was found in 41 cases (27.2%), extrathyroidal extension in 43 (28.5%) and lymph node metastasis in 36 (23.8%). Only two patients had distant metastasis. The mean follow-up time was 65.1 months and we observed nine (6%) tumor recurrences. Tumors with lymph node metastasis and/or extrathyroidal extension showed significantly higher recurrence rates. Of the analyzed markers, the cases with a higher density of CD8 (which marks cytotoxic T lymphocytes) in peritumoral areas presented a trend to better recurrence-free survival: 97.1% versus 87.5% (p=0.057), in addition to lower rates of mutifocal tumors and lymph node metastasis. A higher infiltration rate of CD8+ T lymphocytes in the tumor also correlated with less risk of lymph node metastasis in this sample (18.4% versus 38.1%, p=0.011). Besides that, the density of this marking both in the tumor and in peritumoral areas, was significantly higher in the papillary carcinomas limited to the thyroid gland (without extrathyroidal extension or metastasis). The other markers analyzed did not presented significant or consistent relation with recurrence or other prognostic factors. CONCLUSIONS: In thyroid cancer, the immune microenvironment seems to relate with pathological features of aggressiveness. This study showed that in papillary thyroid carcinomas without significant thyroiditis, the density of tumoral and peritumoral infiltration by CD8+ T lymphocytes is inversely related with lymph node metastasis rate and probably with recurrence, being therefore a marker of better prognosis. These data suggest that these lymphocytes play an anti-tumoral role in papillary thyroid carcinoma, supporting the implication of immune response in the progression of this neoplasm

Há um amplo espectro de doenças causadas por estreptococos do grupo A (GAS), e são consideradas um problema de saúde pública em vários países, principalmente os em desenvolvimento, com aproximadamente 600 milhões de casos/ano. As infecções causadas por GAS podem ocasionar doenças invasivas como faringite e pioderma com seqüelas auto-imunes graves como a febre reumática (FR) e glomerulonefrite. A FR acomete principalmente crianças e jovens adultos. A FR apresenta diversas manifestações, sendo a doença reumática cardíaca (DRC) a seqüela mais grave, caracterizada por lesões cardíacas valvares progressivas e permanentes. O tratamento, frequentemente envolve cirurgia cardíaca para a correção de lesões valvulares, o que acarreta alto custo para o Sistema Único de Saúde no Brasil e em vários países. Em trabalhos anteriores sobre os mecanismos desencadeadores das lesões reumáticas no coração, foi possível identificar o papel do linfócito T como mediador principal da autoimunidade, através da análise do receptor de células T infiltrantes de lesão cardíaca de indivíduos com DRC. Várias expansões oligoclonais com diferentes tamanhos da região que reconhece o antígeno, CDR3 foram encontradas. No presente trabalho, analisou-se a atividade tímica através da quantificação de fragmentos circulares excisados pelo rearranjo do gene do receptor do linfócito T (TREC) em linfócitos T de sangue periférico de indivíduos com FR e DRC. Também foi avaliada a presença de células T naïve e de memória através de citometria de fluxo. Os resultados do presente trabalho mostraram que a quantidade de TREC em amostras de sangue periférico do grupo de pacientes com FR/DRC foi significantemente menor quando comparada a observada em indivíduos saudáveis. Interessantemente, em ambos os grupos a quantidade de TREC apresentou correlação negativa com a idade dos indivíduos estudados. Os resultados indicaram diferenças na atividade tímica em pacientes com FR/DRC, provavelmente decorrente do processo autoimune que envolve linfócitos T / There is a wide spectrum of diseases caused by group A streptococci (GAS), that still being considered a public health problem in developing countries, with about 600 million cases per year. Infections by GAS can cause invasive diseases such as pharyngitis and pyoderma leading to serious autoimmune complications such as rheumatic fever (RF) and glomerulonephritis. RF mainly affects children and young adults, and presents different manifestations. Rheumatic heart disease (RHD) is considered the most serious complication leading to valvular lesions that are characterized by progressive and permanent heart damage, which entails high cost to the Public Health System in Brazil and worldwide. In previous works that focused on the mechanisms leading to rheumatic heart lesions, we identified the role of T lymphocytes as principal mediator of autoimmune reactions. Through the in deep analysis of infiltrating T-cell receptor repertoire of patients with RHD, we identified oligoclonal expansions with different sizes of CDR3 that is the region of antigen recognition. In the present study we analyzed the thymic activity through T cell receptor excision circles (TREC) quantification in T cells from peripheral blood of RF/RHD patients. We also evaluated naïve and memory T cells from peripheral blood by flow cytometry. Our results showed that the amount of TREC in the peripheral blood of patients was significantly lower when compared to the healthy individuals. In addition, both groups showed that the amount of TREC is negatively correlated with age. These results indicated that the thymic activity in RF/RHD patients is altered probably due to the autoimmune process that involves T lymphocytes

Há um amplo espectro de doenças causadas por estreptococos do grupo A (GAS), e são consideradas um problema de saúde pública em vários países, principalmente os em desenvolvimento, com aproximadamente 600 milhões de casos/ano. As infecções causadas por GAS podem ocasionar doenças invasivas como faringite e pioderma com seqüelas auto-imunes graves como a febre reumática (FR) e glomerulonefrite. A FR acomete principalmente crianças e jovens adultos. A FR apresenta diversas manifestações, sendo a doença reumática cardíaca (DRC) a seqüela mais grave, caracterizada por lesões cardíacas valvares progressivas e permanentes. O tratamento, frequentemente envolve cirurgia cardíaca para a correção de lesões valvulares, o que acarreta alto custo para o Sistema Único de Saúde no Brasil e em vários países. Em trabalhos anteriores sobre os mecanismos desencadeadores das lesões reumáticas no coração, foi possível identificar o papel do linfócito T como mediador principal da autoimunidade, através da análise do receptor de células T infiltrantes de lesão cardíaca de indivíduos com DRC. Várias expansões oligoclonais com diferentes tamanhos da região que reconhece o antígeno, CDR3 foram encontradas. No presente trabalho, analisou-se a atividade tímica através da quantificação de fragmentos circulares excisados pelo rearranjo do gene do receptor do linfócito T (TREC) em linfócitos T de sangue periférico de indivíduos com FR e DRC. Também foi avaliada a presença de células T naïve e de memória através de citometria de fluxo. Os resultados do presente trabalho mostraram que a quantidade de TREC em amostras de sangue periférico do grupo de pacientes com FR/DRC foi significantemente menor quando comparada a observada em indivíduos saudáveis. Interessantemente, em ambos os grupos a quantidade de TREC apresentou correlação negativa com a idade dos indivíduos estudados. Os resultados indicaram diferenças na atividade tímica em pacientes com FR/DRC, provavelmente decorrente do processo autoimune que envolve linfócitos T / There is a wide spectrum of diseases caused by group A streptococci (GAS), that still being considered a public health problem in developing countries, with about 600 million cases per year. Infections by GAS can cause invasive diseases such as pharyngitis and pyoderma leading to serious autoimmune complications such as rheumatic fever (RF) and glomerulonephritis. RF mainly affects children and young adults, and presents different manifestations. Rheumatic heart disease (RHD) is considered the most serious complication leading to valvular lesions that are characterized by progressive and permanent heart damage, which entails high cost to the Public Health System in Brazil and worldwide. In previous works that focused on the mechanisms leading to rheumatic heart lesions, we identified the role of T lymphocytes as principal mediator of autoimmune reactions. Through the in deep analysis of infiltrating T-cell receptor repertoire of patients with RHD, we identified oligoclonal expansions with different sizes of CDR3 that is the region of antigen recognition. In the present study we analyzed the thymic activity through T cell receptor excision circles (TREC) quantification in T cells from peripheral blood of RF/RHD patients. We also evaluated naïve and memory T cells from peripheral blood by flow cytometry. Our results showed that the amount of TREC in the peripheral blood of patients was significantly lower when compared to the healthy individuals. In addition, both groups showed that the amount of TREC is negatively correlated with age. These results indicated that the thymic activity in RF/RHD patients is altered probably due to the autoimmune process that involves T lymphocytes