L‟eutrophisation croissante des écosystèmes aquatiques favorise le développement des cyanobactéries, parmi lesquelles Microcystis est la plus représentée dans les régions tempérées. La capacité de Microcystis à produire une puissante hépatotoxine, la microcystine, est à l‟origine de diverses perturbations écologiques, et de nombreuses nuisances sanitaires. La compréhension des facteurs déterminant la toxicité des efflorescences de Microcystis constitue, de fait, un enjeu majeur des recherches actuelles. Dans ce contexte, l‟objectif premier de ce travail de thèse était d‟étudier la variabilité temporelle et l‟implication potentielle de la toxicité de Microcystis à l‟échelle de son cycle de développement annuel. Pour cela, il était nécessaire de considérer, en particulier, les parties les moins connues du cycle de développement : la phase de survie benthique, et les transitions entre les phases benthique et planctonique, via les processus de recrutement et de sédimentation. Nous avons alors étudié le potentiel toxique des populations de Microcystis grâce à des approches complémentaires menées à différentes échelles spatio-temporelles, en considérant à la fois les gènes impliqués dans la synthèse de microcystines, leur transcription et les concentrations en microcystines. Cette étude s‟est appuyée, en parallèle, sur la caractérisation de la structure génétique des populations de Microcystis dans les compartiments benthique et planctonique. La prise en compte systématique de la phase de vie benthique a tout d‟abord permis d‟améliorer nos connaissances sur cette phase du cycle de développement de Microcystis. Ainsi, Microcystis peut survivre plusieurs années en profondeur dans les sédiments, sans que les populations ne perdent leur potentiel toxique, ou que leur structure génétique soit altérée. En revanche, en surface des sédiments, le potentiel toxique et la structure génétique des populations sont variables, de manière similaire à ce qui peut être observé dans la colonne d‟eau. Enfin, ces travaux ont également mis en évidence l‟influence des phases de transition entre l‟eau et les sédiments dans la variabilité du potentiel toxique et de la structure génétique des populations de Microcystis. Les processus de recrutement benthique et de sédimentation occasionnent, en effet, une sélection génétique, qui, bien que paraissant indépendante du potentiel toxique des génotypes, peut grandement affecter le potentiel toxique des sous-populations benthiques et planctoniques de Microcystis.

Notre laboratoire a développé une stratégie d'isolement de fragments d'anticorps recombinants à partir de primates non humains (Macaca fascicularis) immunisés, en utilisant la technologie des phages. Dans le cadre de cette thèse, une comparaison des séquences d'anticorps de macaques (Macaca Mulatta) et d'anticorps humains a toutefois montré que les anticorps des deux espèces présentent des différences qui rendent souhaitable une étape d'humanisation des anticorps de macaques. Cette stratégie a été utilisée dans le cadre du projet Européen AntiBotABE (www.antibotabe.com) et l'étape de criblage a été adaptée pour isoler des scFv neutralisant de façon croisée les toxines botuliques BoNT/B des sous-types B1 et B2, en utilisant séquentiellement l'holotoxine BoNT/B1 et un fragment recombinant représentant la région C-terminale de la chaîne lourde de BoNT/B2. Le meilleur scFv ciblant les régions C-terminales des chaînes lourdes de BoNT/B1 et BoNT/B2, B2-7, a montré une bonne capacité de neutralisation de BoNT/B1 et BoNT/B2 dans le test ex vivo de paralysie hémidiaphragmatique. Les régions charpentes du scFv B2-7 ont un pourcentage d'identité élevé (80 %) avec leurs homologues humains. Des scFv neutralisant BoNT/A1 en ciblant sa chaîne légère ont aussi été isolés, dont le scFv le plus efficace, 2H8, induit une diminution de 50% de l'activité endopeptidasique à une concentration correspondant à un rapport molaire 2H8/BoNT/A1 de 64000. Les régions charpentes de 2H8 ont également un pourcentage d'identité élevée (88%) avec leurs homologues humains. La versatilité de cette stratégie en fait un outil permettant l'isolement de nombreux autres fragments d'anticorps à visée thérapeutique. / Our laboratory has developed a strategy to isolate recombinant antibody fragments technology from immunized non human primates (Macaca fascicularis) by phage display. In the course of the present thesis, a comparison between macaque (Macaca mulatta) and human antibody sequences has demonstrated that antibodies of the two species are different. This difference makes the humanization of macaque antibodies desirable. The strategy was used in the framework of the European AntiBotABE project, and the screening was adapted to isolate antibody fragments cross neutralizing the B1 and B2 subtypes of botulinum B neurotoxin, by using sequentially the holotoxin BoNT/B1 and a recombinant fragment representing the C-terminal region of the heavy chain of BoNTB2. The best scFv targeting the C-terminal region of BoNT/B1 and BoNTB2 heavy chains, B2-7, demonstrated a high capacity to neutralize BoNT/B1 and BoNT/B2 in the ex vivo hemidiaphragmatic assay. A high identity (80%) between the framework regions of B2-7 and their human homologs was observed. ScFvs neutralizing BoNT/A1 by targeting its light chain were also isolated and among them, the scFv 2H8 induced a decrease of 50% in the endopeptidase activity at a concentration corresponding to a molar ratio of 2H8/BoNT/A1 of 64000. A high identity (88%) between the framework regions of 2H8 and their human homologs was also observed. Our strategy can be used to isolate other therapeutic antibody fragments.

L‟eutrophisation croissante des écosystèmes aquatiques favorise le développement des cyanobactéries, parmi lesquelles Microcystis est la plus représentée dans les régions tempérées. La capacité de Microcystis à produire une puissante hépatotoxine, la microcystine, est à l‟origine de diverses perturbations écologiques, et de nombreuses nuisances sanitaires. La compréhension des facteurs déterminant la toxicité des efflorescences de Microcystis constitue, de fait, un enjeu majeur des recherches actuelles. Dans ce contexte, l‟objectif premier de ce travail de thèse était d‟étudier la variabilité temporelle et l‟implication potentielle de la toxicité de Microcystis à l‟échelle de son cycle de développement annuel. Pour cela, il était nécessaire de considérer, en particulier, les parties les moins connues du cycle de développement : la phase de survie benthique, et les transitions entre les phases benthique et planctonique, via les processus de recrutement et de sédimentation. Nous avons alors étudié le potentiel toxique des populations de Microcystis grâce à des approches complémentaires menées à différentes échelles spatio-temporelles, en considérant à la fois les gènes impliqués dans la synthèse de microcystines, leur transcription et les concentrations en microcystines. Cette étude s‟est appuyée, en parallèle, sur la caractérisation de la structure génétique des populations de Microcystis dans les compartiments benthique et planctonique. La prise en compte systématique de la phase de vie benthique a tout d‟abord permis d‟améliorer nos connaissances sur cette phase du cycle de développement de Microcystis. Ainsi, Microcystis peut survivre plusieurs années en profondeur dans les sédiments, sans que les populations ne perdent leur potentiel toxique, ou que leur structure génétique soit altérée. En revanche, en surface des sédiments, le potentiel toxique et la structure génétique des populations sont variables, de manière similaire à ce qui peut être observé dans la colonne d‟eau. Enfin, ces travaux ont également mis en évidence l‟influence des phases de transition entre l‟eau et les sédiments dans la variabilité du potentiel toxique et de la structure génétique des populations de Microcystis. Les processus de recrutement benthique et de sédimentation occasionnent, en effet, une sélection génétique, qui, bien que paraissant indépendante du potentiel toxique des génotypes, peut grandement affecter le potentiel toxique des sous-populations benthiques et planctoniques de Microcystis. / The increasing eutrophication of aquatic ecosystems promotes the development of cyanobacteria, among which Microcystis is the most widespread in temperate regions. The ability of this cyanobacterium to produce a potent hepatotoxin, called the microcystin, represent a serious threat for both natural life and human health. Thus, understanding the factors determining the toxicity of Microcystis blooms is a major challenge of actual research. In this context, the main goal of this work was to study the temporal variability and the potential implication of Microcystis toxicity, at the scale of its annual life cycle. For that, it was necessary to consider more particularly, the least known parts of the cycle : the benthic survival phase, and the transition between the benthic and the planktonic phases, through the benthic recruitment and the sedimentation processes. Then, we studied the toxic potential of Microcystis populations through complementary approaches conducted at different spatio-temporal scales, by considering the genes controlling the synthesis of the microcystin, their transcription and the concentrations of microcystin. In parallel, the genetic structure of Microcystis populations was characterized in both benthic and planktonic compartments. By considering systematically the benthic life stage, we were first able to improve our knowledge on this phase of Microcystis development cycle. Thus, Microcystis is able to survive several years in deep sediments, without the population‟s toxic potential or genetic structure being degraded. On the other hand, at the sediment surface, the toxic potential and the genetic structure of the populations vary, in a similar range to what observed in the water column. Furthermore, this work also shed the light on the influence of benthic-pelagic transitions in the variability of the genetic structure and the toxic potential of the populations of Microcystis. Indeed, a genetic selection occurs during the benthic recruitment and the sedimentation processes. Although such a selection does not seem to rely on the toxic potential of the genotypes, it can greatly modify the toxic potential of both benthic and planktonic sub-populations of Microcystis.

Notre système immunitaire détecte les microorganismes via des molécules absentes de l’hôte appelées MAMPs. Mais étant donné que les MAMPs sont exprimés par tous les microorganismes indépendamment de leur potentiel pathogène, ce mécanisme n’explique pas comment le système immunitaire distingue les microorganismes pathogènes des non-pathogènes. De récents travaux ont mis en évidence un mécanisme de détection de l’activité des facteurs de virulence bactériens. En utilisant la drosophile, notre laboratoire a précédemment démontré que l’activation de la Rho GTPase Rac2 par la toxine CNF1 d’Escherichia coli induisait une réponse immunitaire innée conservée au cours de l’évolution chez le mammifère et similaire à l’immunité induite par les effecteurs chez la plante. Par la suite, nous avons évalué l’importance de cette réponse immunitaire au cours de la bactériémie chez la souris et démontré le rôle central de la cytokine IL-1β dans l’élimination des bactéries en réponse à la détection de CNF1. Des expériences in vitro nous ont permis d’identifier les mécanismes moléculaires mis en jeu et l’inflammasome responsable de l’activation de la caspase-1 et du clivage de l’IL-1β. De manière intéressante, CNF1 est toujours co-exprimée avec la toxine hémolysine-α (HlyA) dans les souches pathogènes d’E. coli. En outre, nous avons découvert que l’HlyA bloquait l’élimination des bactéries induite par CNF1 au cours de la bactériémie et inhibait la sécrétion de l’IL-1β. Ici, nous avons rapporté le premier exemple d’immunité induite par une toxine (CNF1) et contrecarrée par une autre (HlyA). / Our immune system detects microorganisms via molecules absent from the host called MAMPs. Since MAMPs are shared by all microorganisms regardless of their pathogenic potential, this mechanism does not explain how the immune system distinguishes between pathogenic and non pathogenic microorganisms. The detection of the activities of pathogen-encoded virulence factors has emerged as a new paradigm of pathogen recognition. Using Drosophila we previously demonstrated that the Escherichia coli CNF1 toxin-induced activation of the Rho GTPase Rac2 is sufficient to initiate a defense signal evolutionarily conserved from flies to mammals and similar to Effector-Triggered Immunity in plants. We further addressed the importance of this innate immune mechanism during bacteremia in mice and demonstrated the central role of the IL-1β cytokine in the clearance of bacteria in response to the detection of CNF1. In vitro experiments allowed us to identify the involved molecular mechanisms and the inflammasome responsible of caspase-1 activation and IL-1β maturation. Interestingly, CNF1 is always co-expressed with α-hemolysin toxin in pathogenic E. coli. In addition, we found that HlyA blocked the elimination of bacteria induced by CNF1 during bacteremia and inhibited the secretion of IL-1β. Here, we have reported the first example of immunity induced by a toxin (CNF1) and counteracted by another (HlyA).

Des produits efficaces pour stimuler le système immunitaire auraient de très nombreuses applications dans le domaine de la santé publique : lutte contre la résistance aux antibiotiques, épidémies, protection des personnels de secours et des populations en cas de crise sanitaire ou d’attentat biologique. Aujourd’hui, les rares produits immunostimulants efficaces sont coûteux, dangereux, et donc réservés au traitement de pathologies graves ciblées comme les cancers, aplasies ou infections virales chroniques. La petite protéine G Rac1 fut identifiée comme une potentielle cible thérapeutique. Activée par de nombreux pathogènes, elle contrôle l’inflammation et la mise en place des défenses de l’hôte. CNF1 est une toxine bactérienne activant fortement Rac1, ce qui conduit à sa dégradation protéasomale. Le maintien d’un pool de Rac1 activé permettrait d’augmenter les défenses immunitaires. En utilisant CNF1 comme un outil permettant de diminuer celui-ci, un test cellulaire fut mis au point pour cribler 17 680 composés. A l’aide de différents paramètres de tri, un ensemble de molécules fut identifié comme capable de prévenir la dégradation de Rac1 médiée par CNF1.De manière inattendue, la plupart des composés semblent posséder un effet anti-inflammatoire, en baissant la sécrétion de cytokines de cellules stimulées. Le potentiel thérapeutique et en recherche de tels composés doit être évalué. En parallèle, deux autres composés montrent une protection anti-toxines large spectre (CNF1, toxine diphtérique, toxine de Shiga, toxine B de C. difficile). De même, leur mécanisme d’action, encore inconnu, pourrait permettre le traitement d’infections variées. / Immune system boosters could have many applications in public health: fighting antibiotics resistance, epidemics, protection of health care staff and populations during health crisis or biological warfare. Currently, the rare efficient immune stimulants are costly and dangerous; hence, they are earmarked to severe and targeted pathologies such as cancers, aplasia, or chronic viral infections. The small G protein Rac1 was identified as a potential therapeutic target. Once activated by various pathogens, it controls inflammation and host defenses establishment. CNF1 is a bacterial toxin that strongly activating Rac1, leading to its proteasomal degradation. Maintaining an activated Rac1 pool could enhance immune defenses. By using CNF1 as a tool to reduce it, a cellular bioassay was developed and optimized to screen 17 680 compounds. Through various filters, a group of molecules was identified to prevent CNF1-mediated Rac1 depletion. Unexpectedly, most of them seems to possess anti-inflammatory properties, down-regulating cytokines production from stimulated cells. The therapeutic potential of such compounds must be now evaluated. In parallel, two other molecules show a broad-spectrum anti-toxins protection (CNF1, diphtheria toxin, Shiga toxin, toxin B from C. difficile). Their unknown mode of action may allow the treatment of various infections.

L’objectif de ma thèse était d’identifier, comme agents antinociceptifs potentiels, des toxines de venins originales par leur séquence et/ou leur provenance. Dans cette optique, un criblage à haut débit de deux banques de venins a été réalisé par des méthodes électrophysiologiques de "patch-clamp" automatique, sur des lignées cellulaires exprimant le sous-type neuronal hNaV1.7 de canaux sodium (versus celles exprimant le sous-type cardiaque hNaV1.5), une cible antidouleur validée génétiquement et fortement exprimée au niveau des neurones sensoriels primaires des ganglions de la racine dorsale, premier support de la transmission du message nociceptif.Le criblage de la première banque de venins (appartenant à Smartox Biotechnology) a permis l’identification et la caractérisation, par des approches structurales et fonctionnelles multi-échelles (de la cellule in vitro à l’organisme in vivo), de 2 peptides de venins d’araignées ayant des propriétés potentiellement antinociceptives : (1) la cyriotoxine-1a du venin de Cyriopagopus schioedtei, dont les propriétés fonctionnelles sont proches de celles des peptides appartenant à la famille 1 des toxines d’araignées inhibant les canaux sodium, et (2) la poecitoxine-1a du venin de Poecilotheria subfusca, qui présente une meilleure affinité pour le sous-type hCaV1.2 de canaux calcium que pour le sous-type hNaV1.7. Nous avons également mené une étude de "structure-activité" afin d’améliorer le profil de sélectivité de la phlotoxine-1 d’une araignée Phlogiellus, connue pour son activité antinocieptive. Finalement, nous avons mis en évidence une interaction directe entre l’huwentoxine-IV, déjà connue comme agent antinociceptif potentiel, et le sous-type neuronal NaV1.6, responsable d’effets neuromusculaires indésirables. Le criblage de la deuxième banque de venins (appartenant à SANOFI) a permis d’identifier des hits intéressants provenant de venins d’araignées et de scorpions non étudiés jusqu’à présent et ayant une séquence originale présentant peu d’homologie avec les séquences déjà connues. / The aim of my thesis was to identify original venom toxins, by their sequence and/or origin, as potential antinociceptive agents. In this context, a high-throughput screening of two venom libraries was performed, by automated patch-clamp electrophysiology, on cell lines expressing the hNaV1.7 neuronal subtype of sodium channels (versus those expressing the hNaV1.5 cardiac subtype), a genetically-validated and strongly expressed pain target in the primary sensory neurons of dorsal root ganglia, the first support of nociceptive message transmission.The screening of the first venom library (belonging to Smartox Biotechnology) allowed the identification and characterization, by structural and multiscale functional approaches (from the cell in vitro to the organism in vivo), of 2 peptides from spider venoms having potential antinociceptive properties : (1) cyriotoxin-1a from Cyriopagopus schioedtei venom, whose functional properties are close to those of peptides belonging to family 1 of spider toxins inhibiting sodium channels, and (2) poecitoxin-1a from Poecilotheria subfusca venom, which has a better affinity for the hCaV1.2 subtype of calcium channels than for the hNaV1.7 subtype. We also conducted a "structure-activity" study to improve the selectivity profile of phlotoxin-1 from a Phlogiellus spider, known for its antinociceptive activity. Finally, we evidenced a direct interaction between huwentoxin-IV, already known as a potential antinociceptive agent, and the NaV1.6 neuronal subtype which is the main cause of undesirable neuromuscular effects. The screening of the second venom library (belonging to SANOFI) allowed to identify interesting hits from spider and scorpion venoms, not studied until now, having an original sequence with little homology with already known sequences.

Les Ranunculales sont un ordre d’angiospermes d’environ 4500 espèces, incluant des plantes communes comme les boutons d’or et les coquelicots. Leurs fleurs sont très diversifiées et ont piqué l’intérêt des botanistes depuis des décennies. Les sept familles de l’ordre sont faciles à reconnaître sur le terrain, mais paradoxalement, certaines familles n’ont pas de synapomorphies et ont des états ancestraux peu clairs, comme les Ranunculaceae (~ 2500 espèces). Cette diversité florale peut être liée à la pollinisation et des innovations ont pu être guidées par cette interaction. De plus, les plantes de ce groupe produisent une grande variété de composés secondaires, certains dont les propriétés sont connues depuis fort longtemps (comme la morphine et le curare). Ces substances pourraient jouer un rôle dans la défense contre les herbivores. Les caractères floraux et chimiques sont donc de bons candidats pour produire des hypothèses adaptatives. Ici nous utilisons des méthodes analytiques modernes pour comprendre les patrons d’évolution expliquant la distribution actuelle de la diversité et l’évolution des fleurs et des toxines de Ranunculales. Un nouveau cadre phylogénétique synthétique a été produit avec des séquences publiées de 144 espèces. Seize caractères floraux et la présence de certains composés métaboliques ont été reconstruits sur cet arbre avec la méthode de parcimonie et la méthode de « Reversible Jump Monte Carlo Markov Chains ». Un nouveau scénario d’évolution florale a été produit, où les Ranunculales avaient une fleur ancestrale trimère avec trois cycles de tépales et où les ancêtres des familles ont évolué en perdant ou en différenciant des cycles du périanthe. Les patrons d’évolution des toxines montrent de la variabilité, certaines apparaissant et disparaissant aléatoirement (comme les saponines), d’autres étant des synapomorphies bien soutenues de certains clades (comme les diterpènes de type aconitine pour la tribu des Delphinieae). Ces résultats offrent une meilleure compréhension de l’histoire naturelle des Ranunculales. En outre, cet ordre est le groupe-frère de toutes les autres eudicotylédones, et a donc une position clef pour comprendre l’évolution précoce de ce clade. Ces résultats vont fournir une compréhension plus profonde des changements floraux et phytochimiques qui ont eu lieu à la base des eudicotylédones, qui contiennent 70% des angiospermes actuelles. / Ranunculales are an order of angiosperms comprising ca. 4,500 species including common plants like buttercups and poppies. Their flowers are highly diversified and have raised the interest of botanists for decades. Each of the seven families of the order is easily recognizable in the field, but paradoxically some families lack floral synapomorphies and have unclear ancestral states, like Ranunculaceae (ca. 2,500 species). This floral diversity may be linked to pollination and innovations may have been driven by this interaction. In addition, the plants of this group produce a variety of secondary compounds, some of which having been known for ages for their properties, like morphine or curare. Those substances could play a role in defense against herbivores. Both floral and chemical characters are thus good candidates to produce adaptive hypotheses. Here we used modern analytical methods to understand the the evolutionary patterns accounting for the extant distribution of diversity and evolution of Ranunculales flowers and toxins. A new synthetic phylogenetic framework of the Ranunculales based on already available sequences of 144 species was produced. Sixteen characters of the flower, and the presence of selected secondary metabolites were reconstructed on this tree using parsimony, and Reversible Jump Monte Carlo Markov Chains. A new scenario for floral evolution was produced, where Ranunculales had a trimerous perianth with three whorls of tepals ancestor, and the ancestors of the families evolved by losing and/or differentiating perianth whorls. The evolutionary patterns of toxins showed variability, some appearing and disappearing randomly (such as saponins), others being well-supported synapomorphies (such as aconitine-like diterpens for the tribe Delphinieae). These results offer a better understanding of the natural history of Ranunculales. Furthermore, this order is the sister-group of all other eudicots, and thus has a key position to understand the early evolution of this clade. These results will provide a deeper understanding of the floral and chemical changes that took place at the base of eudicots, which contains 70% of living angiosperms.

L’overdose au paracétamol est l’une des intoxications médicamenteuses la plus fréquente au monde, caractérisée par une atteinte hépatique dont l’issue peut être fatale. Les études réalisées sur ce phénomène ont montré que la phase initiale de la toxicité est induite par le métabolite actif du paracétamol, le N-acétyl-p-benzoquinone imine (NAPQI). Ce dernier, en l’absence de quantité suffisante de glutathion, s’accumulent dans la cellule et finit par se lier à d’autres protéines, principalement mitochondriales, formant alors des adduits. Cette liaison va altérer la fonction primaire des protéines et conduire, en cas d’overdose sévère, à la mort des hépatocytes. La mort cellulaire s’accompagne alors de la libération de composants cellulaire dont le rôle sera d’alerter le système immunitaire des lésions tissulaires. Ces composants prennent alors le nom d’«alarmines» ou de « damage-associated molecular patterns » (DAMPs). La protéine HMGB1 (High Mobility Group Box 1) fait partie de cette catégorie.Au cours de cette thèse nous nous sommes intéressés de plus près à la protéine HMGB1, à son origine ainsi qu’à son rôle dans l’amplification et la propagation des lésions hépatiques initialement induites par l’overdose au paracétamol. Nos travaux se sont d’abord portés sur l’étude de la protéine HMGB1 dans un modèle murin d’hépatite au paracétamol. Nos expériences nous permettent, d’une part, de confirmer que la libération d’HMGB1 est liée à la sévérité des lésions hépatiques et d’autre part, de démontrer que l’amplification et la propagation de ces lésions, dans les phases précoces de l’intoxication au paracétamol, peuvent se produire indépendamment des cellules immunitaires. Sur base de ces résultats, nous avons émis l’hypothèse de l’existence d’un dialogue entre la protéine HMGB1 et les hépatocytes plutôt que du dialogue, généralement décrit dans la littérature, entre la protéine HMGB1 et les cellules du système immunitaire Nos travaux se sont donc poursuivis, in vitro, sur une lignée cellulaire d’hépatocytes humains, les cellules HepaRG. Ces expériences nous ont permis, d’une part, de confirmer l’implication de la protéine HMGB1 dans l’hépatotoxicité au paracétamol et de mettre en évidence la capacité de cette protéine à provoquer, sans intermédiaire, la mort des cellules HepaRG. D’autre part, ces expériences nous permettent de suggérer la participation de la protéine HMGB1 dans la propagation et l’amplification de la mort des hépatocytes exposés au paracétamol par une voie de signalisation impliquant l’axe TLR4/TRIF/RIPK3. Finalement, l’inhibition de la protéine HMGB1 semblant être bénéfique, nous avons investigué la potentielle efficacité de l’administration d’une combinaison de N-acétylcystéine et de glycyrrhizine dans notre modèle murin. L’idée était de combiner une drogue qui agit sur l’accumulation du métabolite toxique et une seconde qui agit sur la phase de propagation du signal. Nos résultats, bien que préliminaires, ont démontré l’efficacité de cette combinaison à la fois sur la nécrose hépatique et sur la survie des souris. En conclusion, nos travaux confirment l’importance du rôle joué par la protéine HMGB1 dans l’hépatotoxicité induite par le paracétamol et nous permettent de mettre en évidence un nouveau mécanisme, impliquant la protéine HMGB1, qui pourrait contribuer à l’amplification et la propagation des lésions hépatiques induites par une overdose de paracétamol. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) sont des protéines membranaires impliquées dans la communication entre cellules via des messagers circulants (hormones, neurotransmetteurs) ainsi que dans la perception de notre environnement (vision, odorat, goût). Ils sont essentiels à de nombreuses fonctions physiologiques vitales (cardiaques,respiratoires...) et comportementales (relations sociales et affectives) et sont donc une cible thérapeutique de choix pour la découverte de nouveaux médicaments.Au sein de l'équipe Canaux, de l’Institut de Biologie Structurale, un biocapteur original a été créé se basant sur la fusion de ces RCPG avec un canal ionique (Kir6.2) appelé Ion Channel-Coupled Receptor (ICCR). Les changements conformationnels du récepteur induit par son activité (fixation de ligand, activation des protéines G) sonttraduits par le canal ionique en courant électrique aisément détectable par des techniques électrophysiologiques. Cette nouvelle génération de biocapteurs permet d'étudier en temps réel l’activité des RCPG par des techniques électrophysiologiques très sensibles.Le travail de thèse s’est principalement focalisé sur l’étude du récepteur de l’ocytocine (OXTR) impliqué dans l’accouchement, l’allaitement et le lien social. La technologie ICCR a été utilisée pour trois des projets de cette thèse. Le premier avait pour but l’étude des mécanismes moléculaires de la dépendance au cholestérol du récepteur del’ocytocine, et a ainsi permis d’identifier un nouveau mécanisme de régulation allostérique entre le cholestérol et la fixation des ligands. Un second projet a porté sur l’utilisation de ce biocapteur pour identifier de nouveaux types de ligands, plus spécifiques de certaines voies intracellulaires, appelés ligands biaisés. Enfin, un troisième projet a mis en relief l’effet de certains composés environnementaux sur les RCPG et a permis de mettre en avant de nouveaux récepteurs ciblés par ce type de composés.Pour terminer, un projet parallèle s’est porté sur l'étude de la formation de pores par des protéines bactériennes dépendantes des RCPG. Il s’agit des « pore-forming toxins » (PFTs) de la famille des hémolysines gamma, produitespar un des pathogènes humains les plus virulents, Staphylococcus aureus. Certaines de ces toxines sont capables de sefixer sur des RCPG très spécifiques, les récepteurs aux chimiokines, et ont donc un rôle important dans les infections virales et dans certaines pathologies cancéreuses. Les travaux ont notamment permis d’obtenir des informations nouvelles sur le mécanisme d’insertion de ces pores dans la membrane. / G protein-coupled receptors (GPCRs) are membrane proteins involved in communication between cells via circulatingmessengers (hormones, neurotransmitters) as well as in the perception of the environment (vision, smell, taste). Theyare essential for many physiological functions (cardiac, respiratory...) and behavioral (social and emotional responses)and therefore represent interesting therapeutic targets.Within the Channels team, at the Institute of Structural Biology, an original biosensor was created, based onthe fusion of a GPCR to an ion channel (Kir6.2), called an Ion Channel-Coupled Receptor (ICCR). Conformationalchanges of the receptor induced by its activity (ligand binding, activation of G proteins) are directly transmitted to theion channel and allow the generation of an electrical signal easily detectable by electrophysiological techniques. Thesenew biosensors are powerful tools to study GPCR activity in real time.The main focus of the thesis was the study of the oxytocin receptor (OXTR), involved in childbirth,breastfeeding and social bonding. ICCR technology has been used for three projects during the thesis. The first aimedat studying the molecular mechanisms of cholesterol dependency of the oxytocin receptor and allowed theidentification of a new allosteric regulation mechanism between cholesterol and the ligand binding. A second projectfocused on the use of this biosensor to identify new types of ligands, selective to certain intracellular pathways, calledbiased ligands. Finally, a third project highlighted the effect of certain compounds, known as endocrine disruptors, onGPCRs. Endocrine disruptors are environmental pollutants which have potentially harmful effects on human health.Finally, a parallel project was dedicated to the study of pore formation by GPCR-dependent bacterial toxins.These proteins are called pore-forming toxins (PFTs), from the gamma hemolysin family and are produced by one ofthe most virulent human pathogens Staphylococcus aureus. Some of these toxins are able to bind very specifically tocertain GPCRs, members of the chemokine receptor family. They therefore play a vital role in numerous viralinfections and in some cancerous pathologies. New information concerning the mechanism of membrane insertion ofthese toxins during pore formation was discovered during this work.

La néphropathie aux acides aristolochiques (NAA) est une néphrite tubulo-interstitielle (TI) toxique initialement rapportée chez des patients après la consommation de remèdes à base de plantes chinoises contenant des acides aristolochiques (AA). Histologiquement, elle est caractérisée par une fibrose interstitielle, facilement reconnaissable à son gradient corticomédullaire, et une atrophie tubulaire, responsables d’une dégradation rapide de la fonction rénale conduisant à l’insuffisance rénale terminale. La reproduction de la maladie humaine chez l’animal (rat) dans le laboratoire expérimental de néphrologie a permis de retrouver les adduits d’ADN spécifiques aux AA et de décrire une évolution biphasique de l’atteinte TI :une phase aiguë, caractérisée par une nécrose tubulaire des cellules épithéliales tubulaires proximales (CETP) (en particulier du segment S3) associée à un infiltrat inflammatoire mononucléé et une phase chronique caractérisée par une atrophie tubulaire et une fibrose interstitielle. L’atteinte ciblée des CETP observée dans la NAA a suggéré l’existence de mécanismes physiopathologiques spécifiques à ce segment du néphron. Par ailleurs, l’infiltrat inflammatoire a été proposé comme étant le lien physiopathologique entre la phase aiguë et la phase chronique. La localisation des transporteurs d’anions organiques (ou organic anion transporter, OAT) dans le tubule proximal et leurs rôles dans d’autres néphropathies toxiques ont suggéré leur implication dans la NAA. Des études in vitro ont permis de démontrer leur responsabilité dans l’accumulation intracellulaire des AA, mais leur implication ainsi que l’effet protecteur du probénécide (PBN) un inhibiteur des OAT, n’a jamais été démontrée in vivo. Dans un modèle murin, nous avons confirmé le rôle des OAT dans le transport des AA ainsi que l’effet protecteur du PBN dont l’administration a permis de prévenir l’augmentation de la créatinine plasmatique, de réduire les lésions aiguës et chroniques et de diminuer la sévérité et l’étendue des lésions en microscopie électronique. De plus, la quantité d’adduits d’ADN spécifiques aux AA a été significativement réduite aux temps précoces. Bien qu’un infiltrat inflammatoire ait été démontré dans la NAA chez l’homme et l’animal, le rôle précis des leucocytes n’a jamais été étudié dans ce modèle. Nous avons démontré que la déplétion en lymphocytes T-CD4+ ou CD8+ aggravait l’atteinte rénale aiguë (ARA) (augmentation de la nécrose, de la créatinine plasmatique et de l’urée) induite par les AA. En outre, leur injection prolongée a provoqué une augmentation importante de la mortalité dans le groupe déplété en lymphocytes T-CD4+ par rapport au groupe injecté uniquement avec des AA. L'injection d’AA induisant une augmentation de la proportion de lymphocytes T régulateurs intrarénaux par rapport aux souris contrôles, nous avons également testé les effets de leur déplétion. Etonnamment, aucune augmentation de la créatinine plasmatique, de l’urée ou du score de nécrose n'a été observée. De plus, l’ARA de la NAA s’est accompagnée d’une augmentation de la population CD11bhighF4/80mid et d’une diminution de la population CD11blowF4/80high. La déplétion lymphocytaire CD4+ a provoqué une augmentation encore plus importante de la population CD11bhighF4/80mid et la déplétion T-CD8+ une diminution plus importante de la population CD11blowF4/80high. Les lymphocytes T-CD4+ et CD8+ exercent donc un effet protecteur dans la NAA expérimentale. L’aggravation de l’atteinte rénale consécutive à leur déplétion pourrait être liée à la perte du rétrocontrôle de l’immunité innée par l’immunité adaptative ou à une modification du phénotype des macrophages. Cette hypothèse mériterait d’être confirmée par des données complémentaires. / Doctorat en Sciences médicales (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished