Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a disease of unknown pathogenesis characterized by scarring of the lung and declining respiratory function. Originating from bone marrow, circulating monocytes can be recruited into the lung tissue and polarized toward the alternatively activated (M2) profibrotic macrophage phenotype. Recent literature has shown that cluster of differentiation 14 positive (CD14+) monocytes are more abundant in IPF patient blood and are associated with disease outcome and acute exacerbation. Additionally, a 52-gene risk profile from peripheral blood mononuclear cells for outcome prediction in IPF was recently published. Here, we began by characterizing macrophages in human IPF lung tissue. We then assembled a biobank and examined transcriptomic characteristics of blood-derived circulating monocytes from IPF patients. Various histological assessments were completed on a tissue microarray including lung biopsies from 24 IPF patients and 17 controls, to characterize M2 macrophage expression in human tissue. Whole blood samples were collected from 50 IPF patients and 12 control subjects. CD14+ monocytes were isolated and mRNA was extracted for bulk RNA sequencing. Data were analyzed for differential expression (DE), and Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) was performed to examine enrichment of the previously published 52-gene risk profile in our dataset. We found that M2 macrophage expression was increased in IPF lung tissue compared to controls. CD14+ monocyte levels were significantly elevated in IPF patients in our cohort compared to control participants, and was negatively correlated with forced vital capacity (FVC). DE analysis comparing IPF and control monocytes yielded a 35-gene signature, with 16 up-regulated genes and 19 down-regulated genes. When comparing the signature related to long transplant-free survival from the published dataset to our data, GSEA demonstrated that this signature is enriched in donors from our dataset, supporting concurrence between the meanings of the two datasets. Overall, these results provide insight to identify targets to modulate monocyte/macrophage function in IPF and potentially affect progressive disease. / Thesis / Master of Science (MSc) / Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a disease of unknown cause that results in excessive scarring of the lungs and progressive impairment in lung function. We believe that white blood cells called monocytes and macrophages play a key role in the development and progression of this disease. Overall, it is thought that monocytes, which circulate in the blood, enter the lung tissue and become macrophages. These macrophages then lead to the formation of scar tissue, which is characteristic to IPF. In order to better understand how these cells contribute to IPF, we studied their properties in blood and lung biopsies from IPF patients. We found significant differences between monocytes/macrophages in IPF than those in healthy controls, that may help explain disease progression. We hope that these findings will provide insight into causes of the IPF, and potential avenues for therapeutic intervention.

Erwinia amylovora, a quarantine organism of the European Union (EU), is the causal agent of fire blight. This disease causes substantial economic losses in all countries where it is present and its control turns out difficult, due to the absence of effective chemical and biological treatments and the ability of persistence and dissemination of E. amylovora. Cupric treatments constitute the base of the integrated management of fire blight in the European Union countries, because the antibiotics, although have been proved useful against this disease, are forbidden in the EU for plant treatments. This thesis, mostly performed in a P2 security lab, is aimed to dilucidate molecular mechanisms implicated in the response of E. amylovora to copper sulfate as a stress factor, considering that copper is a well known toxic element for bacterial cells over a certain threshold concentration. The global objective was first addressed with the study of a selection of genes that have been related in other bacterial models with copper stress or with stress in general. The quantification of the rpoS gene expression in presence of copper showed that, at least in long-term survival, this gene may be involved in the E. amylovora response to copper stress. Second, a transcriptomic study was performed by microarray after subdue the bacteria to a copper shock treatment. The analysis of the microarray results showed that 44 genes were differentially expressed in presence of this metal. Each one of these genes was studied by gene ontology and, after comparing them with databases published in NCBI, they were classified in functional categories. The gene expression of twenty-five out of fourty-four differentially expressed genes was validated by real-time PCR. In the validation, copA gene was expressed more than 19-fold in presence than in absence of copper and, because of that, it was selected together with other seven genes (soxS, yjcE, ygcF, yhhQ, galF, arcB, EAM_3469), which also showed an increased expression, to generate mutants of E. amylovora. The responses of mutants to copper, and the fact that the wild phenotype was restored in the complemented mutants, has shown the role of copA, soxS, yjcE, ygcF, arcB and yhhQ genes in the E. amylovora in vitro survival against copper stress. Besides, the implication of copA gene has also been proved in planta, in copper treated shoots from pear trees. Finally, all the results obtained along this thesis have allowed to elaborate a putative model of the different genetic mechanisms that seem are involved in the interaction between E. amylovora and copper. The most important mechanism seems to be to face up reactive oxygen species (ROS) by the activation of the soxS and yjcE genes. The activity of these genes is supported by CopA protein, which pumps copper from inside the cell out to the periplasmic space. The activation of arcB gene, which allows the change from aerobic metabolism to anaerobic metabolism, would also help E. amylovora to reduce ROS. Taking together, the results of this thesis have allowed an approximation to the genetic basis of E. amylovora response to copper stress and they constitute a start point to move forward in the knowledge of the molecular mechanisms underlying that response. / Erwinia amylovora, organismo de cuarentena en la Unión Europea (UE), es el agente causal del fuego bacteriano. Esta enfermedad produce grandes pérdidas económicas en todos los países en los que está presente y su control resulta muy difícil, debido a la carencia de tratamientos químicos y biológicos eficaces y a la persistencia y facilidad de diseminación de E. amylovora. Los tratamientos con compuestos cúpricos constituyen la base de la gestión integrada del fuego bacteriano en los países de la UE, puesto que el uso de antibióticos, aunque se ha demostrado útil contra esta enfermedad, está prohibido en la UE para el tratamiento de bacteriosis en plantas. Esta tesis, realizada en su mayoría en un laboratorio de seguridad biológica P2, pretende dilucidar mecanismos moleculares implicados en la respuesta de E. amylovora al sulfato de cobre como factor de estrés, ya que este metal es un elemento tóxico para las células bacterianas por encima de una determinada concentración umbral. El objetivo global se abordó, en primer lugar, con el estudio de una selección de genes que se han relacionado en otros modelos bacterianos con el estrés que produce el cobre o con el estrés en general. La cuantificación de la expresión del gen rpoS en presencia de cobre mostró que este gen puede estar implicado en la supervivencia a largo plazo de E. amylovora para combatir el estrés que produce este metal. En una segunda aproximación, se realizó un estudio transcriptómico mediante microarray tras someter a la bacteria a un breve tratamiento de cobre. El análisis de los resultados del microarray reveló que 44 genes se expresaban de forma diferencial en presencia del metal. Cada uno de ellos se estudió mediante gene ontology y por comparación con las bases de datos publicadas en el NCBI, y así se clasificaron en categorías funcionales. Las categorías de estrés y transporte fueron las más abundantes, tanto respecto a los genes que aumentaron su expresión tras la aplicación de cobre como a los que la disminuyeron. De los 44 genes que se expresaron de forma diferencial, se validó la expresión de 25 de ellos por PCR en tiempo real. En dicha validación, el gen copA se expresó 19 veces más en presencia que en ausencia de cobre, por lo que fue seleccionado, junto con siete genes más (soxS, yjcE, ygcF, yhhQ, galF, arcB, EAM_3469), en los que el incremento en la expresión fue menos pronunciado, para generar mutantes de E. amylovora. La respuesta de los mutantes a la presencia de cobre, y la restauración de fenotipos al complementar las mutaciones generadas, han revelado el papel de los genes copA, soxS, yjcE, ygcF, arcB y yhhQ en la supervivencia in vitro de E. amylovora frente al estrés por cobre. Además, la implicación del gen copA se ha demostrado también in planta en brotes de peral tratados con cobre. Finalmente, todos los resultados obtenidos han permitido elaborar un posible modelo de los diferentes mecanismos genéticos que parecen estar implicados en la interacción de E. amylovora con el cobre. El mecanismo más importante parece ser combatir las especies reactivas del oxígeno (ERO), mediante la activación de la expresión de los genes soxS e yjcE. La actividad de estos genes está apoyada, además, por la proteína CopA, que bombea cobre desde el interior celular al espacio periplásmico. La activación del gen arcB, que permite el cambio de un metabolismo aerobio a uno anaerobio, también ayudaría a la reducción de las ERO. En definitiva, los resultados han permitido una aproximación al sustrato genético de la respuesta de E. amylovora al estrés por cobre, y constituyen un punto de partida para avanzar en el conocimiento de los mecanismos moleculares implicados en dicha respuesta. / E. amylovora, organisme de quarantena a la Unió Europea (UE), és l'agent causal del foc bacterià. Aquesta malaltia produeix grans pèrdues econòmiques a tots els països on està present, i el seu control resulta molt difícil, a causa de l' absència de productes químics i biològics eficaços i també per la capacitat de persistència i disseminació d'E. amylovora. Els tractaments amb composts cúprics constitueixen la base de la gestió integrada del foc bacterià als països europeus, ja que l'ús d'antibiòtics, tot i que s'ha demostrat eficaç per a combatre aquesta malaltía, està prohibit a la UE per al tractament de bacteriosi en plantes. Aquesta tesi, realitzada majoritàriament a un laboratori de seguretat biològica P2, pretén dilucidar mecanismes moleculars implicats en la resposta d'E. amylovora davant del coure com a factor d'estrés, ja que el coure és un element tòxic per la cèl.lula per damunt d'una determinada concentració umbral. L'objectiu global es va abordar, en primer lloc, amb l'estudi d'una selecció de gens relacionats en altres models bacterians amb l'estrés que produeix el coure, o amb l'estrés en general. La quantificació de l'expressió del gen rpoS en presència de coure va mostrar que aquest gen pot estar implicat en la supervivència a llarg termini d'E. amylovora per a combatre l'estrés que produeix aquest metall. En una segona aproximació, es va realitzar un estudi transcriptòmic mitjançant microarrays després de sotmetre els bacteris a un breu tractament de coure. L'anàlisi dels resultats dels microarrays va revelar que 44 gens s'expressen de forma diferencial en presència del metall. Cadascun d'ells es va estudiar mitjançant gene ontology i, per comparació amb les bases de dades publicades al NCBI, es van classificar en categories funcionals. Les categories d'estrés i transport van ser les més enriquides, tant en els gens que augmentaren la seua expressió després de l'aplicació de coure com en aquells que la van reduir. Dels 44 gens que s'expressaren de forma diferencial, es va validar l'expressió de 25 d'ells per PCR a temps real. En la validació, el gen copA es va expressar 19 vegades més en presència que en absència de coure, per aquesta raó va ser seleccionat junt amb set gens més (soxS, yjcE, ygcF, yhhQ, galF, arcB, EAM_3469), en els que l'increment de l'expressió va ser menys pronunciada, per a generar mutants d'E. amylovora. La resposta dels mutants a la presència de coure, i la restauració dels fenotips originals al complementar les mutacions generades, han revelat el paper dels gens copA, soxS, yjcE, ygcF, arcB i yhhQ en la supervivència in vitro d'E. amylovora davant a l'estrés per coure. A més a més, la implicació del gen copA s'ha demostrat també in planta, en brots de perera tractats amb coure. Finalment, tots els resultats obtinguts han permès elaborar un possible model dels diferents mecanismes genètics que semblen estar implicats en la interacció d'E. amylovora amb el coure. El mecanisme més important sembla ser combatre les especies reactives de l'oxigen (ERO), mitjançant l'activació de l'expressió dels gens soxS i yjcE. L'activitat d'aquestos gens és recolzada també per l'acció de la proteïna copA, que bombeja coure des de l'interior cel.lular a l'espai periplàsmic. L'activació del gen arcB, que permet el canvi d'un metabolisme aerobi a un metabolisme anaerobi, també ajudaria a reduir la producción de les ERO. En conclusió, els resultats han suposat una aproximació al substrat genètic de la resposta d'E. amylovora a l'estrés per coure, i constitueixen un punt de partida per avançar en el coneixement dels mecanismes moleculars implicats en aquesta resposta. / Águila Clares, B. (2017). Elucidating the molecular basis of copper stress in Erwinia amylovora [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/81658

Vitis vinifera L.(Vv), the European cultivated grapevine is one of the most worldwide important crops but is highly susceptible to the necrotrophic fungus Botrytis cinerea (Bc), the causal agent of bunch rot (BR) disease. In grapevine, as well as in other fruit species, it has been described a primary infection by Bc at full bloom, followed by a quiescence period during the berry development, and the fungal egression after veraison reaching the maximum at harvest. Today, this important disease is mainly controlled by massive use of fungicides, which are applied at different developmental stages that happen to be critical during the grapevine-Bc interaction. During the contact, the fungus must overcome several barriers from the host, which protect it from the pathogen attack and might be also modulated or activated due to the presence of the pathogen itself. The cuticle and the cell wall (CW) represent the first barriers from the plant encountered by the pathogen. To successfully colonize the plant tissue, Bc possesses several virulence factors, and CW modifying enzymes (CWMEs) are part of them. On the other hand, the regulated activity of the CWMEs, expressed both by the host and the pathogen, could alter the plant CW composition and porosity, therefore facilitating, or limiting the penetration of the fungus. Among the CWMEs, Pectin methylesterases (PMEs) regulate the degree of methyl esterification of the pectin homogalacturonan, also modifying the epitopes for the activity of other CWMEs such as polygalacturonases (PGs) and pectate lyases (PLs) by whose action, pectin becomes more susceptible to degradation and the CW more accessible by the pathogen. Previous works both in Arabidopsis thaliana and in crop species identified several PME genes with an altered expression in response to pathogens. A previous report characterizing Atpme17 mutant lines has highlighted a role of AtPME17 in the resistance response to Bc in contrast with the opposite role of AtPME3, suggesting that PME genes could have a completely different action during Bc response depending on the isoform involved. In this context, the main objective of the project was to identify new strategies for Bc BR-control, and specifically i) to identify candidate genes involved in the response to Bc, whose inactivation/overexpression would lead to Bc resistant plants and ii) to set up a molecular method to monitor the Bc load in the field and therefore implement a more sustainable control of the pathogen. To further understand the effects of the Bc primary infection in grapevine flowers at CW level, two contrasting genotypes (Souvignier gris (SG) and Teroldego (TE)) in their resistance to the fungus were considered. An artificial inoculation of different biological replicates, in vase maintained, was performed at full bloom, in controlled conditions, and samples were collected at 24 hours post-inoculation (hpi) with the fungus and post-treatment with the respective control, for the following RNA-seq analysis and biochemical characterization of PME activity and CW composition in the two genotypes before and upon infection. The Bc load was estimated in the flowers using qPCR and as expected, a higher biomass of Bc was found in TE, the susceptible cultivar, than in SG, the resistant one. The analysis of CW composition, PME activity and degree of pectin methyl-esterification, both in treated and control flowers, showed significant differences between the two genotypes, in particular SG showed a significant induction of PME activity with respect to the control, evidence not present in the susceptible genotype. The RNAseq analysis on the same samples showed a total of 4800 genes modulated, out of which 3064 are only modulated in TE, 739 only in SG and a common group of 997 genes. Regardless of the cultivar, upon infection there was a total 2919 genes upregulated vs 1909 genes downregulated. A gene set enrichment analysis (GSEA) indicated several over-represented categories upon infection, including response to pathogens and biosynthesis of secondary metabolites, with a general down-regulation of those genes related to CW organization and pectin modification (CWMEs), mostly in the resistant genotype. Within the down-regulated CWMEs, Pectin methylesterase (PME) genes were found highly represented. Unlike, a larger gene set, in many cases with a higher fold-change of induction, was identified in TE respect to SG. This is the case of genes involved in the defense response and its regulation, and in the modification/reinforcement of the cell wall, therefore attesting for an initial tentative by the susceptible genotype to counteract the pathogen, although at the end without success. This was also the case of the seven VviPME genes previously highlighted by the in-silico co-expression analysis and therefore of VviPME10, the gene with the highest homology to AtPME17. Among the regulators, one WRKY factor (VviWRKY3), known to be related to defense response in grapevine mediated by stilbene synthesis, was also further characterized as putative regulator of VviPME10, whose promoter hosts more than one several predicted binding sites for VviWRKY3. Indeed, luciferase assay results indicate a significant activation of VviPME10 promoter by VviWRKY3 factor. Parallelly, the genome-wide analysis of the last structural annotation of the grapevine genome assembly allowed us to identify 62 VviPME gene members, 15 more than a previous report, and manually curate the gene structure for 39 of them. Then, to corroborate the idea of the role of the CW, and in particular of PME activity, in the grapevine response to the fungus, an in silico co-expression analysis of the 62 VviPME members, considering the publicly available RNA-seq experiments related to grapevine-Bc interactions and the RNAseq experiment conducted in this project, was performed. The analysis highlighted a group of seven genes (VviPME1, VvPME9, VviPME10, VviPME11, VviPME12, VviPME13 and VviPME54) with significant induction upon Bc infection, five of them (VviPME8, VviPME9, VviPME10, VviPME11, and VviPME54) located in the same chromosome (chr06). VviPME10 showed the highest homology and was found to be phylogenetically close to the Arabidopsis thaliana PME17 gene, suggesting being considered as its putative orthologue. Afterward, Therefore, considering the increased VviPME10 expression upon infection, and the reported effect of AtPME17 in A. thaliana, VviPME10 was selected as a potential candidate to study its role in grapevine. In this regard, two strategies were adopted, i. VviPME10 knock-out (KO) with CRISPR/Cas9 and ii. VviPME10 overexpression (OE, under CaMV35S promoter) through embryogenic callus transformation of the grapevine cultivar ‘Sugraone’ mediated by Agrobacterium tumefaciens. More than 100 embryos developed, and around 20 plantlets per transformation were analyzed to check the presence of the transgenic construct. Then, the mutation profile, in the case of KO lines, and the expression analysis of the transgene, in the case of OE lines, were carried out to select the appropriate lines to acclimatize. OE lines were also tested for VviPME10 activity. A total protein extract was obtained from the leaves of the lines, showing a higher protein activity compared to the control, and indicating the functionality of the enzyme. Unfortunately, grapevine OE lines couldn’t be analyzed for their response to Bc, while KO lines showed a significantly larger lesion area when compared to the control at 5 days post fungal inoculation (dpi). However, the effect of VviPME10 overexpression upon Bc infection was evaluated also in Nicotiana benthamiana VviPME10-OE lines, generated in parallel. At 3 dpi a significant reduction was observed in the lesion area compared to the control. These results suggest that pectin modification, mediated by VviPME10, plays an important role in the grapevine response to Bc, in particular it seems to behave more like a resistance gene than a susceptibility one. For this reason, it could be considered as a valuable target to improve resistance to Bc in susceptible grapevine varieties. Finally, a molecular method for Bc detection, based on quantitative RT-PCR assays, was set up and applied to estimate the Bc load in field conditions. Although the method allowed the successful detection of the presence of the fungus in samples at different developmental stages, from two V. vinifera cultivars, in different vineyards, the lack of environmental conditions for the development of the disease might have impaired the correlation between detection and the development of the disease. Nonetheless, the method represents a good alternative for monitoring the Bc load in the field at the early season, to predict the BcBR severity at harvest and eventually apply the disease management protocols based on the real need.

La radiothérapie par microfaisceaux (MRT) synchrotron est une méthode de radiothérapie alternative pour les tumeurs cérébrales, qui présente l'avantage unique de pouvoir déposer de très hautes doses d'irradiation (plusieurs 100aines de Gy) au niveau de la masse tumorale. En effet, le fractionnement spatial des rayons X en microfaisceaux parallèles de quelques dizaines de micromètres s'est montré efficace dans le traitement des tumeurs cérébrales du rongeur tout en préservant le tissu cérébral péritumoral. Pour autant, son mode d'action sur le plan biologique n'est qu'en partie connu. Si l'effet différentiel de cette irradiation sur les vaisseaux sains et tumoraux a pu être démontré ces dernières années, il ne peut expliquer à lui seul l'efficacité de la MRT. Dans ce travail, nous avons établi une description de la réponse transcriptomique précoce des tissus sains et tumoraux (gliosarcome 9L) à la MRT et les fonctions biologiques et voies de signalisation associées. Ces résultats constituent une base de données interrogeable à partir d'hypothèses précises. Cette base a ainsi permis d'identifier des transcrits impliqués dans la réponse de la tumeur à la MRT et dont l'inhibition n'interfèrerait pas avec la réparation des tissus sains : nous avons proposé 3 cibles potentielles qui permettraient d'augmenter l'index thérapeutique de la MRT. (i) L'inhibition radio-induite d'un groupe de 13 gènes (Plk1, Cdc20, Ccnb1, Pttg1, Bub1, Dlgap5, Cenpf, Kif20a, Traf4af1, Depdc1b, Mxd3, Cenpe et Cenpf), participerait au contrôle tumoral précoce après MRT par la perturbation de la division cellulaire et pourrait être amplifié pour prolonger l'inhibition de la croissance tumorale. (ii) La mise à profit de l'activation du promoteur de Clecsf6 au sein des tumeurs irradiées permettrait la surexpression locale, via les monocytes modifiés et infiltrés, de protéine d'intérêt thérapeutique. (iii) Areg (codant pour l'Amphiréguline) est surexprimé au sein du tissu tumoral après MRT et son implication connue dans la chimio/radiorésistance nous conduit à considérer que son inhibition pourrait être une stratégie de renforcement des effets de la MRT. Par ailleurs, nous avons montré que la MRT engendrait de meilleurs résultats sur le contrôle tumoral et la survie animale qu'une irradiation synchrotron en champ plein (avec une dose équivalente à la vallée MRT). Cependant, aucune différence transcriptomique ne pouvant soutenir cet effet n'a pu être mis en évidence. / Synchrotron Microbeam Radiation Therapy (MRT) is a novel form of radiosurgery of brain tumors which allows high dose deposition (few hundreds of Gy) in pathologic tissues. The spatial fractionation of the incident beam into arrays of near-parallel microbeams has shown efficiency on brain tumors implanted in rodents while sparing normal tissues. The preferential effects observed on tumor vessels could not entirely explain the efficiency of MRT and other biological mechanisms might be involved in tumor control. In this work, we described the early whole transcriptomic responses of normal and tumoral (9L gliosarcoma) tissues to MRT and the associated biofunctions and pathways. This provides a questionable data base which can be used by the whole MRT community. This base allows to identify transcripts involved in tumor response to MRT and which inhibition would have no consequence in healthy tissue repair. We identified 3 relevant targets which might increase the therapeutic index of MRT. (i) The radio-induced inhibition of a cluster of 13 genes (Plk1, Cdc20, Ccnb1, Pttg1, Bub1, Dlgap5, Cenpf, Kif20a, Traf4af1, Depdc1b, Mxd3, Cenpe and Cenpf) may be involved in tumor control after MRT through the deregulation of cell division and could be amplified to continue the tumor growth inhibition. (ii) We might benefit from the activation of the Clecsf6 promoter in irradiated tumors by delivering, via modified and injected monocytes, some therapeutic proteins. (iii) Finally, Areg (encoding for Amphiregulin) is overexpressed in tumors after MRT and its involvement described in chimio/radioresistance enable to consider that its inhibition might help in tumor control after irradiation. We also showed that MRT induces a greater tumor control and survival rates compared with similar broad beam irradiations but no differences in transcriptomic responses have been highlighted.

L'amélioration des processus de dégradation de la biomasse lignocellulosique est un enjeu capital du développement des biotechnologies vertes. Au cours de ces travaux de thèse, nous nous sommes intéressés à deux sujets centrés autour de l'exploitation des souches fongiques pour la dégradation de la lignocellulose. Tout d'abord, nous avons étudié la diversité taxonomique et enzymatique d'un environnement original : la mangrove. Une campagne de prélèvement en Nouvelle-Calédonie à été organisée, afin d'étudier la diversité taxonomique des communautés fongiques établies sur les palétuviers. L'utilisation d'une approche « Tag-Pyrosequencing » a permis de mettre en lumière l'existence d'une taxonomiques extrêmement importante puisque plusieurs milliers d'espèces ont été détectées dans les différentes niches écologiques de cet écosystème. Ces travaux ont également permis d'établir le rôle primordial de la spécificité d'hôte dans l'établissement des communautés fongiques. Nous avons par la suite isolé différentes souches de champignons à partir d'échantillons de palétuvier et avons procédé au criblage de leurs activités lignocellulolytiques (oxidase, cellulase, mannanase, xyalanase). A l'issue de ce crible, une souche, identifiée comme un Pestalotiopsis sp, présentant la plus grande polyvalence en termes d'activités enzymatiques a été sélectionnée. / The improvement of lignocellulosic biomass degradation processes is a key aspect of the development of “green” biotechnologies. During this thesis, we focused on two subjects centred on the usage of fungal strains for the degradation of lignocellulose. First, we studied the taxonomic and enzymatic diversity in an original ecosystem: mangroves. A sampling was performed in New-Caledonia in order to study the fungal communities colonizing mangrove trees. By using Tag-Pyrosequencing, we showed the existence of very large communities harbouring several thousand species in the different microhabitats of the ecosystem. This work also revealed the key role of host specificity as a factor driving the fungal colonisation of mangrove trees. We then isolated several fungal strains from various mangrove tree samples, and performed a screening of their lignocellulolytic activities (oxidase, cellulase, mannanase, xylanase). A single strain was selected fromthis screening, identified as Pestalotiopsis sp., which showed the most complete diverse enzymatic activities. A de novo transcriptome was assembled from mRNA sequences, which allowed highlighting a wide array of transcripts encoding biomass degradation enzymes, as well as the existence of a mechanism of adaptation to salt based on the secretion of salt-tolerant lignocellulolytic enzymes. Secondly, we studied the limitations of fungal co-culture linked to competitive interactions mechanisms. The RNA-Seq analysis of genetic expression during the interaction between Pycnoporus coccineus and Coniophora puteana or Botrytis cinerea indicates that different mechanisms are used depending on the opponent.

Parce qu'ils sont constamment en contact avec toutes sortes de microorganismes présents dans leur environnement, les organismes pluricellulaires ont développé un système immunitaire qui leur permet de détecter leur présence et contrôler leur croissance. Les contacts se produisent naturellement au niveau des surfaces de l'animal qui sont exposés à l'environnement extérieur, comme la peau ou les muqueuses. Il existe au minimum deux types d'interactions : dans le premier cas, la présence de l'autre ne cause aucun problème pour chacun, et peut même éventuellement apporter un bénéfice. Dans le second, l'un des partenaires est aggressif envers l'autre, qui doit répondre à cette situation de stress en essayant de préserver son intégrité pour assurer sa survie. Du côté de l'hôte, cette réponse implique le système immunitaire et a généralement pour but de détruire le microorganisme. En utilisant l'insecte drosophila melanogaster comme organisme hôte modèle, j'ai étudié les interactions hôtes - microbes. Dans le cadre d'un premier projet, je me suis interessé aux cellules circulantes de la drosophiles, les plasmatocytes. Nous savions qu'elles sont capables de manifester certaines activités biologiques (sécrétion de cytokine et de facteurs coagulant, phagocytose), mais leur importance dans la résistance aux infections n'a jamais été évaluée. En générant des drosophiles dépourvues de plasmatocytes, j'ai pu montrer que ces cellules sont requises pour assurer la résistance à certaines infections bactériennes systémiques chez l'adulte, dont Staphylococcus aureus et Salmonella typhimurium, mais pas toutes. / Because they are constantly exposed to contact with the various type of microorganisms present in their environment, multicellular organisms have evolved an immune system that allow them to sense their presence and control their growth. Close contact with these microbes naturally occurs in body parts that are exposed to the environment, like external body surfaces and internal mucosa, and at least two diffrerent kind of relations can be described. In the first case both the two parts do not harm the other, eventually allowing the relationship to go for a mutual benefit. In the second case, one part is agressive towards the other and lead it to induce a response to this stressful situation in order to preserve it's integrity and ultimately it's survival. From the host point of view, this response involves the immune system and most frequently aims at the eradication of the microbes. Using the fruitfly drosophila melanogaster as a model for the host side, i was interested in studying host-microbe interactions. A first project i worked on focused on drosophila circulating cells, the plasmatocytes, about which we knew some activities (secretion of cytokines, cloting factors, phagocytosis) but whose functional relevance to resist infection has never been tested. By generating plasmatocytes-depleted flies, I show that these cells are required for the survival of the adult upon some type of systemic bacterial infections, including Staphylococcus aureus and Salmonella typhimurium, but not all.

Toxoplasma gondii est un parasite protozoaire intracellulaire obligatoire, responsable d'une infection cosmopolite très répandue, la toxoplasmose. Les différents schémas de traitement de la toxoplasmose reposent sur l'association de la pyriméthamine et d'un sulfamide qui agissent en synergie pour bloquer la voie de synthèse des folates. Cependant des échecs thérapeutiques ont été rapportés dans la littérature, et trois souches naturellement résistantes à la sulfadiazine, TgA 103001 (Type I), TgH 32006 (Type II) et TgH 32045 (Type II variant), ont été décrites. Notre travail a porté sur l'étude des mécanismes de résistance à la sulfadiazine chez T. gondii. Nous nous sommes intéressés dans un premier temps à l'implication des gènes cibles, dhps et dhfr, ainsi que les ABC transporteurs TgABC.B1, TgABC.B2, TgABC.C1 et TgABC.C2 dans la résistance à la sulfadiazine chez T. gondii. Cependant aucun polymorphisme ni surexpression de ces gènes n'a pu être relié aux mécanismes de résistance. Nous avons ensuite comparé les protéomes des souches naturellement résistantes aux protéomes des souches sensibles RH (Type I) et ME-49 (Type II) par DIGE. Parmi les 31 protéines différentiellement exprimées entre souches sensibles et résistantes, quatre protéines, ROP2, MIC2, ENO2 et IMC1, nous ont semblé intéressantes. Afin de s'affranchir des variations liées aux différences de fond génétique des souches, les souches sensibles RH et ME-49 ont été rendues résistantes in vitro à la sulfadiazine par pression médicamenteuse croissante, résistance validée in vitro grâce à la mise au point d'un nouveau test de chimiosensibilité. Nous avons ensuite, par 2-DE, comparé les protéomes des souches de type II sensible (ME-49), et résistantes (ME-49-RSDZ et TgH 32006) sans identifier le ou les candidat(s) impliqué(s) dans la résistance médicamenteuse. Cependant, l'analyse des souches ME-49 sensible et ME-49-RSDZ résistante, par microarrays, nous a permis d'identifier une cible appartenant à la voie de synthèse des folates : la folylpolyglutamate synthase. / Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan parasite responsible of a widespread infection, toxoplasmosis. Treatment options for toxoplasmosis are generally limited to combinations of sulfonamide and pyrimethamine which have a synergistic action on T. gondii folate synthesis by inhibiting two major enzymes: dihydropteroate synthase (DHPS) and dihydrofolate reductase (DHFR). However treatment failures have been reported, and three naturally sulfadiazine resistant strains, TgA 103001 (Type I), TgH 32006 (Type II) and TgH 32045 (Type II variant), have been described. In this work, we studied resistance mechanisms to sulfadiazine on T. gondii. We are interested, in a first time, on the involvement of target genes, dhps and dhfr, and ABC transporters, TgABC.B1, TgABC.B2, TgABC.C1 and TgABC.C2, in the sulfadiazine resistance on T. gondii. However, neither polymorphisms nor overexpression of these genes has been linked to resistance mechanisms. Then, we compared proteomes of naturally resistant strains to sensitive strains RH (Type I) and ME-49 (Type II) by DIGE. Among the 31 proteins differentially expressed between sensitive and resistant strains, four proteins, ROP2, MIC2, ENO2 and IMC1, seemed to be interesting. In order to avoid variations due to differences from genetic background, sensitive strains RH and ME-49 have been made resistant in vitro by gradual increase in sulfadiazine concentration. This resistance was checked in vitro by the development of a new chemosensitivity assay. We compared then, by 2-DE, proteomes of the type II strains, sensitive (ME-49) and resistant (ME-49-RSDZ and TgH 32006), without identifying candidates implicated in sulfadiazine resistance mechanisms. However, analysis of the sensitive strain ME-49 and the resistant strain ME-49-RSDZ, by microarrays, allowed us to identify a candidate belonging to folate synthesis pathways: folylpolyglutamate synthase.

Le Syndrome de Taybi-Linder (TALS) est une maladie génétique rare affectant le développement embryonnaire, caractérisée par un nanisme microcéphalique sévère et un décès précoce des patients. Le gène muté dans ce syndrome est RNU4ATAC, qui encode un petit ARN nucléaire (snRNA) non-codant : U4atac. Ce snRNA est l’une des briques composant le spliceosome mineur, une machinerie nucléaire dédiée à l’épissage des introns U12, un groupe d’introns peu étudié car présent dans ~1 % des gènes seulement. Dans le TALS, ces introns sont fréquemment retenus dans les transcrits matures, l’épissage correct des introns U12 semble donc capital pour le développement embryonnaire. L’étude du profil transcriptomique des patients TALS permet ainsi d’établir les conséquences moléculaires d’un dysfonctionnement du spliceosome mineur, nous permettant d’en apprendre davantage sur les mécanismes d’épissage des introns U12 en condition physiologique ou pathologique, et sur le rôle de l’épissage mineur dans le développement embryonnaire. Cette thèse présente la première analyse approfondie du transcriptome de cellules provenant de patients TALS. Pour mener cette analyse, nous avons développé un pipeline bioinformatique qui, à partir de données RNA-seq de seconde génération, utilise différentes méthodes dédiées à l’étude différentielle de l’expression des gènes ou de la qualité d’épissage entre patients et contrôles. L’épissage étant particulièrement complexe à analyser à partir de reads courts, deux approches complémentaires ont été utilisées : l’une classique, basée sur l’alignement des reads, et l’autre plus originale, basée sur l’assemblage des reads et permettant de détecter plus d’événements d’épissage non-annotés (KisSplice). Une des conséquences attendue d’un dysfonctionnement du spliceosome mineur est une rétention massive des introns U12 dans les ARN matures. Cependant, la détection et la quantification de rétentions d’intron chez les mammifères constituent encore aujourd’hui un challenge bioinformatique. Nous avons donc utilisé une méthode récente dédiée à l’analyse des rétentions d’introns pour caractériser le plus précisément possible le profil transcriptomique des patients TALS. J’ai ainsi participé au développement de KisSplice et de notre outil d’analyse statistique des différentielles d’épissage, kissDE, et mis en évidence certaines caractéristiques de l’épissage mineur, que ce soit en condition physiologique ou pathologique / The Taybi-Linder Syndrome (TALS) is a rare genetic disorder of the embryonic development leading to a severe microcephaly, a primordial dwarfism and an early/unexpected death. The mutated gene in this syndrome is RNU4ATAC, which encode a non-coding small nuclear RNA (snRNA) named U4atac, involved in the minor spliceosome. This nuclear machinery is dedicated to the splicing of a small number of particular introns : the U12 introns. Because only about 1 % of the Human’s genes display at least one U12 intron, they have not been extensively study and little is known about their function. In TALS patients’ cells, most of the U12 introns are retained in mature transcripts ; hence, splicing of U12 introns seems important for the embryonic development. Studying TALS patients’ cells transcriptomes both in physiological and pathological conditions should enable us to precisely identify most of the molecular consequences of a minor splicing defect and could shed light on the mechanism linking minor splicing and embryonic development. This thesis is the first work to conduct an in depth analysis of TALS patients’ cells transcriptomes. In order to do a precise analysis, we developed a bioinformatic pipeline that uses multiple methods to detect differentially expressed or spliced genes between patients and controls and from second generation RNA-seq data. Splicing analysis is a very complex task complete with short reads ; hence, we used two complementary approaches. The first one is based on reads alignement to a reference genome, method conventionnally used to work on splicing, and the second one is based on reads assembly (KisSplice), a original method enabling to find more non-annotated splicing events. One of the expected consequences of a minor splicing malfunction is a global U12 introns retention in mature transcripts. However, intron retention detection and quantification in mammals is particulary difficult task in mammals, thus we used a new method dedicated to intron retentions analysis to study the transcriptomic profile of TALS patients. During my thesis, I was one of the developer of KisSplice and kissDE, our differential splicing analysis tool, and I identified important charcteristics of minor splicing either in physiological or pathological conditions

Yersinia pestis, l'agent de la peste, est une bactérie à Gram-négatif classée comme agent pathogène ré-émergent et potentielle arme de bioterrorisme. De plus, l'apparition d'une souche multi-résistance de cette bactérie souligne la nécessité de mieux comprendre comment cette bactérie hyper-virulente interagit avec son hôte. Afin d'identifier des facteurs génétiques de vulnérabilité à la peste, notre laboratoire travaille sur la réponse de souris résistantes versus sensibles à Y. pestis. Notre stratégie pour identifier les facteurs génétiques impliqués dans la résistance/sensibilité à la peste combine une approche de cartographie de QTL (Quantitative Trait Locus) et d'analyse d'expression génique. Nous avons précédemment décrit la lignée SEG/Pas, issue de Mus spretus, comme la première résistante à une souche virulente de Y. pestis, alors que la plupart des lignées murines de laboratoire, telle que la lignée C57BL/6J, sont extrêmement sensible à la bactérie. Des croisements entre SEG/Pas et C57BL/6J nous ont permis d'identifier trois QTL impliqués dans la résistance à Y. pestis, localisés sur les chromosomes 3, 4 et 6. Deux des QTL (situés sur les chromosomes 4 et 6) ont pu être confirmés par l'analyse de lignées congéniques. Plus de 40 % des femelles bi-congéniques hétérozygotes pour ces deux QTL ont survécu à l'infection, alors que tous les témoins C57BL/6J ont succombé. La dissection de ces deux QTL par l'analyse de lignées sous-congéniques, nous a permis d'affiner l'architecture génétique de la résistance à la peste chez SEG/Pas. Nous avons conclu qu'un minimum de quatre facteurs génétiques, au sein de ces deux QTL, sont nécessaires pour augmenter la résistance à Y. pestis chez la Souris. Cependant, la production de plusieurs lignées congéniques portant le QTL situé sur le chromosome 3, dont une lignée triple congénique, ne nous a pas permis de confirmer l'existence de ce QTL. En parallèle de l'analyse génétique, nous avons déterminé que les macrophages de SEG/Pas et de C57BL/6J présentaient des caractéristiques différentes après exposition à Y. pestis. Une analyse différentielle du profil transcriptionnel des macrophages de ces deux lignées a été réalisée à l'aide de puces à ADN. Nos résultats montrent une forte activation de la production cytokinique dans les macrophages de SEG/Pas en réponse à la bactérie, activation qui n'est pas observée dans la lignée C57BL/6J. Ces résultats suggèrent que les souris SEG/Pas sont capables de mettre en place une réponse immune innée plus forte ou peut-être plus précoce que C57BL/6J. Nous avons ensuite étudié par qRT-PCR l'expression en cinétique de 44 gènes dans des macrophages de SEG/Pas, C57BL/6J et des bi-congéniques portant les QTL sur les chromosomes 4 et 6. Cette étude nous a permis de confirmer que les souris SEG/Pas sont capables se mettre en place une forte réponse inflammatoire lors de l'infection. Cependant, aucune différence significative n'a été observée entre la lignée bicongénique et la lignée parentale C57BL/6J. D'autres expériences seront nécessaires afin de mieux comprendre les mécanismes biologiques impliqués dans la résistance intermédiaire de cette lignée. La dissection génétique associée à l'analyse de l'expression génique de ces lignées résistante et sensible permet d'augmenter notre compréhension de la réponse de l'hôte à Y. pestis. / Yersinia pestis, the agent of plague, is a deadly gram-negative bacterium classified as a re-emerging pathogen and class A biological weapon. The appearance of a multi-resistant strain highlights the need to better understand how this pathogen kills its host. To identify genetic factors of host susceptibility to plague, our laboratory is investigating the response of resistant versus susceptible mice to Y. pestis. Our strategy to decipher genetic determinants involved in resistance to plague combines Quantitative Trait Loci (QTL) mapping with gene expression analysis. We previously described the Mus spretus-derived SEG/Pas strain as the first to resist fully virulent Y. pestis, while most inbred strains, such as C57BL/6, are highly susceptible. Crosses between these two strains identified three QTLs (located on chromosome 3, 4 and 6) contributing to resistance. Two of the QTLs (on chromosome 4 and 6) were confirmed through creation of congenic mice. Up to 40% of the congenic mice heterozygous at these two QTLs, on a C57BL/6J background, survived the infection while all C57BL/6J mice died. Further dissection of these two QTLs, through the use of subcongenic strains, enabled us to refine the genetic architecture of resistance to plague in SEG/Pas mice. We concluded that a minimum of four genetic factors, within these two QTLs, are required to increased resistance to Y. pestis in mice. Despite production of numerous congenic strains, including triple congenic mice, we were not able to confirm the existence of the third QTL identified on chromosome 3. In parallel to genetic studies, we determined that SEG/Pas and C57BL/6J macrophages exhibit distinct characteristics upon in vitro exposure to Y. pestis. The underlying molecular differences were investigated by using microarrays. Our results show strong activation of cytokines in SEG/Pas macrophages in response to Y. pestis, which is not found in C57BL/6J macrophages. These results suggest that SEG/Pas mice are able to better activate innate immune response to Y. pestis than C57BL/6J mice.We further studied the expression of 44 genes in a kinetic study on macrophages in vitro of SEG/Pas, C57BL/6J and bicongenic mice (carrying QTLs on chromosome 4 and 6). This study confirmed that SEG/Pas mice are able to build a stronger inflammatory response at early time of infection. Nevertheless no significant differences were observed in the bicongenic strain compared to C57BL/6J. Further studies will be required to understand the mechanisms involved in the intermediate resistance of this strain. This combination of genetic dissection and gene expression analysis of resistant and susceptible mouse strains will enhance our ability to better understand the host response to plague.

Les nouvelles biotechnologies offrent aujourd'hui la possibilité de récolter une très grande variété et quantité de données biologiques (génomique, protéomique, métagénomique...), ouvrant ainsi de nouvelles perspectives de recherche pour la compréhension des processus biologiques. Dans cette thèse, nous nous sommes plus spécifiquement intéressés aux données transcriptomiques, celles-ci caractérisant l'activité ou le niveau d'expression de plusieurs dizaines de milliers de gènes dans une cellule donnée. L'objectif était alors de proposer des outils statistiques adaptés pour analyser ce type de données qui pose des problèmes de "grande dimension" (n<<p), car collectées sur des échantillons de tailles très limitées au regard du très grand nombre de variables (ici l'expression des gènes).La première partie de la thèse est consacrée à la présentation de méthodes d'apprentissage supervisé, telles que les forêts aléatoires de Breiman et les modèles de régressions pénalisées, utilisées dans le contexte de la grande dimension pour sélectionner les gènes (variables d'expression) qui sont les plus pertinents pour l'étude de la pathologie d'intérêt. Nous évoquons les limites de ces méthodes pour la sélection de gènes qui soient pertinents, non pas uniquement pour des considérations d'ordre statistique, mais qui le soient également sur le plan biologique, et notamment pour les sélections au sein des groupes de variables fortement corrélées, c'est à dire au sein des groupes de gènes co-exprimés. Les méthodes d'apprentissage classiques considèrent que chaque gène peut avoir une action isolée dans le modèle, ce qui est en pratique peu réaliste. Un caractère biologique observable est la résultante d'un ensemble de réactions au sein d'un système complexe faisant interagir les gènes les uns avec les autres, et les gènes impliqués dans une même fonction biologique ont tendance à être co-exprimés (expression corrélée). Ainsi, dans une deuxième partie, nous nous intéressons aux réseaux de co-expression de gènes sur lesquels deux gènes sont reliés si ils sont co-exprimés. Plus précisément, nous cherchons à mettre en évidence des communautés de gènes sur ces réseaux, c'est à dire des groupes de gènes co-exprimés, puis à sélectionner les communautés les plus pertinentes pour l'étude de la pathologie, ainsi que les "gènes clés" de ces communautés. Cela favorise les interprétations biologiques, car il est souvent possible d'associer une fonction biologique à une communauté de gènes. Nous proposons une approche originale et efficace permettant de traiter simultanément la problématique de la modélisation du réseau de co-expression de gènes et celle de la détection des communautés de gènes sur le réseau. Nous mettons en avant les performances de notre approche en la comparant à des méthodes existantes et populaires pour l'analyse des réseaux de co-expression de gènes (WGCNA et méthodes spectrales). Enfin, par l'analyse d'un jeu de données réelles, nous montrons dans la dernière partie de la thèse que l'approche que nous proposons permet d'obtenir des résultats convaincants sur le plan biologique, plus propices aux interprétations et plus robustes que ceux obtenus avec les méthodes d'apprentissage supervisé classiques. / Today's, new biotechnologies offer the opportunity to collect a large variety and volume of biological data (genomic, proteomic, metagenomic...), thus opening up new avenues for research into biological processes. In this thesis, what we are specifically interested is the transcriptomic data indicative of the activity or expression level of several thousands of genes in a given cell. The aim of this thesis was to propose proper statistical tools to analyse these high dimensional data (n<<p) collected from small samples with regard to the very large number of variables (gene expression variables). The first part of the thesis is devoted to a description of some supervised learning methods, such as random forest and penalized regression models. The following methods can be used for selecting the most relevant disease-related genes. However, the statistical relevance of the selections doesn't determine the biological relevance, and particularly when genes are selected within a group of highly correlated variables or co-expressed genes. Common supervised learning methods consider that every gene can have an isolated action in the model which is not so much realistic. An observable biological phenomenum is the result of a set of reactions inside a complex system which makes genes interact with each other, and genes that have a common biological function tend to be co-expressed (correlation between expression variables). Then, in a second part, we are interested in gene co-expression networks, where genes are linked if they are co-expressed. More precisely, we aim to identify communities of co-expressed genes, and then to select the most relevant disease-related communities as well as the "key-genes" of these communities. It leads to a variety of biological interpretations, because a community of co-expressed genes is often associated with a specific biological function. We propose an original and efficient approach that permits to treat simultaneously the problem of modeling the gene co-expression network and the problem of detecting the communities in network. We put forward the performances of our approach by comparing it to the existing methods that are popular for analysing gene co-expression networks (WGCNA and spectral approaches). The last part presents the results produced by applying our proposed approach on a real-world data set. We obtain convincing and robust results that help us make more diverse biological interpretations than with results produced by common supervised learning methods.